(1)

Στο Μέρος Α, προστίθεται το ακόλουθο κεφάλαιο:

«A.25   ΣΤΑΘΕΡΕΣ ΔΙΑΣΤΑΣΗΣ ΣΤΟ ΝΕΡΟ (ΤΙΤΛΟΔΟΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ — ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ — ΑΓΩΓΙΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ)

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών 112 του ΟΟΣΑ (1981).

Προϋποθέσεις

Πληροφορίες καθοδήγησης

Διευκρινίσεις

Έγγραφα αναφοράς

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών βασίζεται σε μεθόδους που αναφέρονται στις παραπομπές που περιλαμβάνονται στο τμήμα «Βιβλιογραφία» και στο προσχέδιο καθοδήγησης για τις κοινοποιήσεις πριν από τη βιομηχανική παραγωγή της Υπηρεσίας Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ (Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA), της 18ης Αυγούστου 1978.

Η ΜΕΘΟΔΟΣ — ΕΙΣΑΓΩΓΗ, ΣΚΟΠΟΣ, ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ, ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΤΗΤΑ, ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΑΙ ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

Η διάσταση μιας ουσίας στο νερό είναι σημαντική για την εκτίμηση των επιπτώσεών της στο περιβάλλον. Ελέγχει τη μορφή της ουσίας, η οποία με τη σειρά της καθορίζει τη συμπεριφορά και τη μεταφορά της. Μπορεί να επηρεάσει την απορρόφηση της χημικής ουσίας, αφενός από τα εδάφη και τα ιζήματα και, αφετέρου, από τα βιολογικά κύτταρα.

Ορισμοί και μονάδες

Διάσταση είναι ο αναστρέψιμος διαχωρισμός σε δύο ή περισσότερα χημικά είδη που μπορεί να είναι ιονικά. Η διεργασία αυτή δηλώνεται συνήθως με τη χημική εξίσωση

RX ⇌ R ++ X –

και η σταθερά ισορροπίας της συγκέντρωσης, που ρυθμίζει την αντίδραση, είναι

Για παράδειγμα, στη συγκεκριμένη περίπτωση όπου R είναι το υδρογόνο (η ουσία είναι οξύ), η σταθερά είναι

ή

Ουσίες αναφοράς

Οι κατωτέρω ουσίες αναφοράς δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται σε όλες τις περιπτώσεις που εξετάζεται μια νέα ουσία. Παρέχονται, κυρίως, για να μπορεί να γίνεται διακρίβωση της μεθόδου κατά περιόδους και για να υπάρχει δυνατότητα σύγκρισης με τα αποτελέσματα από την εφαρμογή άλλης μεθόδου.

Μπορούν να φανούν χρήσιμες οι ουσίες με περισσότερες από μία pK, όπως αναφέρεται στο τμήμα «Αρχή της μεθόδου» κατωτέρω. Μια τέτοια ουσία θα μπορούσε να είναι το:

Αρχή της μεθόδου δοκιμών

Κατά κανόνα, η περιγραφόμενη χημική διεργασία εξαρτάται ελάχιστα από τη θερμοκρασία στο θερμοκρασιακό εύρος που συναντάται στο περιβάλλον. Ο προσδιορισμός της σταθεράς διάστασης απαιτεί μέτρηση των συγκεντρώσεων της διασταθείσας και της μη διασταθείσας μορφής της χημικής ουσίας. Από τη γνώση της στοιχειομετρίας της αντίδρασης διάστασης, που αναφέρεται στην ενότητα «Ορισμοί και μονάδες» ανωτέρω, μπορεί να προσδιοριστεί η κατάλληλη σταθερά. Στην ειδική περίπτωση που περιγράφεται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών, η ουσία συμπεριφέρεται ως οξύ ή βάση και ο ευχερέστερος τρόπος προσδιορισμού είναι ο προσδιορισμός των σχετικών συγκεντρώσεων των ιονισμένων και μη ιονισμένων μορφών της ουσίας, καθώς και του pH του διαλύματος. Η σχέση μεταξύ των όρων αυτών παρέχεται στην εξίσωση για την pKa στην ενότητα «Ορισμοί και μονάδες» ανωτέρω. Ορισμένες ουσίες παρουσιάζουν περισσότερες από μία σταθερές διάστασης και μπορούν να αναπτυχθούν παρόμοιες εξισώσεις. Ορισμένες από τις μεθόδους που περιγράφονται στο παρόν κεφάλαιο είναι επίσης κατάλληλες για άλλες διαστάσεις εκτός των οξέων/βάσεων.

Ποιοτικά κριτήρια

Επαναληψιμότητα

Η σταθερά διάστασης θα πρέπει να αναπαράγεται (σε τουλάχιστον τρεις προσδιορισμούς) με ακρίβεια ± 0,1 λογαριθμικές μονάδες.

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΩΝ ΔΟΚΙΜΗΣ

Υπάρχουν δύο βασικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό της pKa. Η μία συνίσταται στην τιτλοδότηση γνωστής ποσότητας της ουσίας με πρότυπο οξύ ή βάση, κατά περίπτωση. Η άλλη συνίσταται στον προσδιορισμό των σχετικών συγκεντρώσεων των ιονισμένων και μη ιονισμένων μορφών της ουσίας και της εξάρτησής τους από το pH.

Προετοιμασίες

Οι μέθοδοι που βασίζονται στις αρχές αυτές μπορούν να χαρακτηρισθούν ως τιτλοδοτική, φασματοφωτομετρική και αγωγιμομετρική διαδικασία.

Διαλύματα δοκιμής

Για την τιτλοδοτική και την αγωγιμομετρική μέθοδο, η χημική ουσία θα πρέπει να διαλύεται σε απεσταγμένο νερό. Για τη φασματοφωτομετρική και τις άλλες μεθόδους χρησιμοποιούνται ρυθμιστικά διαλύματα. Η συγκέντρωση της υπό δοκιμή ουσίας δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τη μικρότερη από τις τιμές 0,01 M ή 1/2 της συγκέντρωσης κορεσμού και για την παρασκευή των διαλυμάτων θα πρέπει να χρησιμοποιείται η καθαρότερη διαθέσιμη μορφή της ουσίας. Εάν η ουσία είναι μετρίως διαλυτή στο νερό, μπορεί να διαλυθεί σε μικρή ποσότητα αναμείξιμου με το νερό διαλύτη, πριν προστεθεί στις προαναφερόμενες συγκεντρώσεις.

Τα διαλύματα θα πρέπει να ελέγχονται για την παρουσία γαλακτωμάτων με τη χρήση δέσμης Tyndall, ιδίως εάν έχει χρησιμοποιηθεί συνδιαλύτης για την ενίσχυση της διαλυτότητας. Όταν χρησιμοποιούνται ρυθμιστικά διαλύματα, η συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 0,05 M.

Συνθήκες δοκιμής

Θερμοκρασία

Η θερμοκρασία θα πρέπει να ρυθμίζεται με ακρίβεια τουλάχιστον ± 1°C. Ο προσδιορισμός θα πρέπει να εκτελείται κατά προτίμηση στους 20°C.

Εάν υπάρχουν υπόνοιες σημαντικής θερμοκρασιακής εξάρτησης, θα πρέπει να εκτελείται προσδιορισμός σε τουλάχιστον δύο ακόμη θερμοκρασίες. Τα διαστήματα θερμοκρασίας θα πρέπει να είναι 10°C σε αυτή την περίπτωση και η ακρίβεια ρύθμισης της θερμοκρασίας ± 0,1°C.

Αναλύσεις

Η μέθοδος καθορίζεται από τη φύση της υπό δοκιμή ουσίας. Θα πρέπει να έχει επαρκή ευαισθησία ώστε να επιτρέπει τον προσδιορισμό των διαφόρων χημικών ειδών σε κάθε συγκέντρωση του διαλύματος δοκιμής.

Εκτέλεση της δοκιμής

Τιτλοδοτική μέθοδος

Το διάλυμα δοκιμής προσδιορίζεται με τιτλοδότηση με πρότυπο διάλυμα βάσης ή οξέος, κατά περίπτωση, και μέτρηση του pH μετά από κάθε προσθήκη τιτλοδότη. Θα πρέπει να γίνονται τουλάχιστον 10 διαδοχικές προσθήκες πριν από το σημείο ισοδυναμίας. Εάν επιτυγχάνεται ισορροπία αρκετά γρήγορα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί καταγραφικό ποτενσιόμετρο. Για την παρούσα μέθοδο, πρέπει να είναι επακριβώς γνωστά τόσο η συνολική ποσότητα της ουσίας όσο και η συγκέντρωσή της. Πρέπει να λαμβάνονται προφυλάξεις για τον αποκλεισμό του διοξειδίου του άνθρακα. Λεπτομέρειες για τη διαδικασία, τις προφυλάξεις και τους υπολογισμούς παρέχονται σε πρότυπες δοκιμές, π.χ. στις βιβλιογραφικές παραπομπές (1), (2), (3), (4).

Φασματοφωτομετρική μέθοδος

Εντοπίζεται το μήκος κύματος στο οποίο οι ιονισμένες και μη ιονισμένες μορφές της ουσίας έχουν αισθητά διαφορετικούς συντελεστές απόσβεσης. Λαμβάνεται το φάσμα απορρόφησης στο υπεριώδες/ορατό τμήμα από διαλύματα σταθερής συγκέντρωσης σε συνθήκες pH στις οποίες η ουσία είναι ουσιαστικά μη ιονισμένη και πλήρως ιονισμένη, καθώς και σε διάφορα ενδιάμεσα pH. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί είτε με τη διαδοχική προσθήκη πυκνού οξέος (πυκνής βάσης) σε σχετικά μεγάλο όγκο διαλύματος της ουσίας σε πολυσυστατικό ρυθμιστικό διάλυμα, αρχικά σε υψηλό (χαμηλό) pH (βιβλιογραφική παραπομπή αριθ. 5), είτε με την προσθήκη ίσων όγκων διαλύματος παρακαταθήκης της ουσίας, π.χ. σε νερό ή μεθανόλη, σε σταθερούς όγκους διαφόρων ρυθμιστικών διαλυμάτων που καλύπτουν το επιθυμητό εύρος τιμών pH. Από τις τιμές pH και απορρόφησης στο επιλεγμένο μήκος κύματος υπολογίζεται επαρκής αριθμός τιμών pKa με τη χρήση δεδομένων από τουλάχιστον 5 pH, όπου η ουσία είναι ιονισμένη σε ποσοστό από τουλάχιστον 10 % έως λιγότερο από 90 %. Πρόσθετες λεπτομέρειες για το πείραμα και η μέθοδος υπολογισμού παρατίθενται στη βιβλιογραφική παραπομπή (1).

Αγωγιμομετρική μέθοδος

Με τη χρήση κυψελίδας μικρής και γνωστής σταθεράς, μετράται η αγωγιμότητα διαλύματος της ουσίας περίπου 0,1 M σε νερό χαμηλής αγωγιμότητας. Μετράται επίσης η αγωγιμότητα ορισμένων αραιώσεων του διαλύματος αυτού που παρασκευάζονται με ακρίβεια. Η συγκέντρωση υποδιπλασιάζεται σε κάθε αραίωση και η σειρά θα πρέπει να καλύπτει τουλάχιστον μία τάξη μεγέθους της συγκέντρωσης. Η περιοριστική αγωγιμότητα σε άπειρη αραίωση υπολογίζεται με την εκτέλεση παρόμοιου πειράματος με το άλας νατρίου και προεκβολή. Από την αγωγιμότητα κάθε διαλύματος μπορεί στη συνέχεια να υπολογιστεί ο βαθμός διάστασης με τη χρήση της εξίσωσης Onsager και, κατ' επέκταση, η σταθερά διάστασης με εφαρμογή του νόμου αραίωσης του Ostwald ως K = α2C/(1 – α)όπου C είναι η συγκέντρωση, σε γραμμομόρια ανά λίτρο και α το διασταθέν κλάσμα. Πρέπει να λαμβάνονται προφυλάξεις για τον αποκλεισμό του CO2. Πρόσθετες λεπτομέρειες σχετικά με το πείραμα και η μέθοδος υπολογισμού παρατίθενται στα έγγραφα αναφοράς και στις βιβλιογραφικές παραπομπές (1), (6) και (7).

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Επεξεργασία αποτελεσμάτων

Τιτλοδοτική μέθοδος

Η pKa υπολογίζεται για 10 σημεία που έχουν μετρηθεί στην καμπύλη τιτλοδότησης. Υπολογίζονται ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση αυτών των τιμών pKa. Θα πρέπει να περιλαμβάνεται διάγραμμα του pH σε συνάρτηση με τον όγκο της πρότυπης βάσης ή του πρότυπου οξέος, συνοδευόμενο από παρουσίαση σε πίνακα.

Φασματοφωτομετρική μέθοδος

Για κάθε φάσμα παρουσιάζονται σε πίνακα η απορρόφηση και το pH. Υπολογίζονται τουλάχιστον πέντε τιμές pKa από τα σημεία ενδιάμεσων φασματικών δεδομένων, καθώς επίσης η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση των αποτελεσμάτων αυτών.

Αγωγιμομετρική μέθοδος

Υπολογίζεται η ισοδύναμη αγωγιμότητα Λ για κάθε συγκέντρωση οξέος και για κάθε συγκέντρωση μείγματος ενός ισοδυνάμου οξέος συν 0,98 ισοδύναμα υδροξειδίου του νατρίου χωρίς ανθρακικό άλας. Το οξύ βρίσκεται σε περίσσεια ώστε να αποτρέπεται η περίσσεια OH– λόγω υδρόλυσης. Σχεδιάζεται διάγραμμα του λόγου 1/Λ σε συνάρτηση με την √C ενώ η τιμή του Λo του άλατος μπορεί να υπολογιστεί με προεκβολή στη μηδενική συγκέντρωση.

Η τιμή Λo του οξέος μπορεί να υπολογιστεί από τις τιμές της βιβλιογραφίας για τα ιόντα για H+ και Na+. Η τιμή pKa μπορεί να υπολογιστεί από τις εξισώσεις α = Λi /Λo και Ka = α2C/(1 – α)για κάθε συγκέντρωση. Καλύτερες τιμές Ka μπορούν να ληφθούν με διορθώσεις για να ληφθούν υπόψη η κινητικότητα και η ενεργότητα. Θα πρέπει να υπολογίζονται η μέση τιμή και οι τυπικές αποκλίσεις των τιμών pKa.

Έκθεση δοκιμής

Θα πρέπει να υποβάλλονται όλα τα ανεπεξέργαστα δεδομένα και οι υπολογισμένες τιμές pKa συνοδευόμενα από τη μέθοδο υπολογισμού (κατά προτίμηση σε πίνακα, όπως προτείνεται στη βιβλιογραφική παραπομπή αριθ. 1), καθώς και οι στατιστικές παράμετροι που περιγράφονται ανωτέρω. Για την τιτλοδοτική μέθοδο, θα πρέπει να παρέχονται λεπτομέρειες σχετικά με την τυποποίηση των τιτλοδοτών.

Για τη φασματοφωτομετρική μέθοδο, θα πρέπει να υποβάλλονται όλα τα φάσματα. Για την αγωγιμομετρική μέθοδο, θα πρέπει να αναφέρονται λεπτομέρειες για τον προσδιορισμό της σταθεράς της κυψελίδας. Θα πρέπει να υποβάλλονται στοιχεία σχετικά με τη χρησιμοποιούμενη τεχνική, τις αναλυτικές μεθόδους και το είδος των τυχόν χρησιμοποιούμενων ρυθμιστικών διαλυμάτων.

Θα πρέπει να αναφέρονται οι θερμοκρασίες της δοκιμής.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(2)

Στο μέρος B, το Κεφάλαιο 2 αντικαθίσταται από το ακόλουθο κείμενο:

«Β.5   ΟΞΕΙΑΣ ΜΟΡΦΗΣ ΕΡΕΘΙΣΜΟΣ/ΔΙΑΒΡΩΣΗ ΤΩΝ ΟΦΘΑΛΜΩΝ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 405 του ΟΟΣΑ (2012). Οι κατευθυντήριες γραμμές του ΟΟΣΑ για τον έλεγχο των χημικών ουσιών επανεξετάζονται περιοδικά για να εξασφαλίζεται ότι αντανακλούν τις βέλτιστες διαθέσιμες επιστημονικές γνώσεις. Στις προηγούμενες επανεξετάσεις της παρούσας κατευθυντήριας γραμμής δοκιμών, δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στις δυνατότητες βελτίωσης μέσω της αξιολόγησης όλων των υφιστάμενων στοιχείων σχετικά με τις υπό δοκιμή ουσίες, ώστε να μη διεξάγονται περιττές δοκιμές σε πειραματόζωα και, κατ' επέκταση, να λαμβάνονται υπόψη οι ανησυχίες σχετικά με την καλή μεταχείριση των ζώων. Η TG 405 (που εγκρίθηκε το 1981 και επικαιροποιήθηκε το 1987, το 2002 και το 2012) περιλαμβάνει τη σύσταση να διενεργείται ανάλυση βάρους της απόδειξης (1) για τα υφιστάμενα σχετικά δεδομένα, πριν από τη διεξαγωγή της περιγραφόμενης δοκιμής in vivo για οξείας μορφής ερεθισμό/διάβρωση των οφθαλμών. Όταν τα διαθέσιμα δεδομένα είναι ανεπαρκή, συνιστάται να συμπληρώνονται με την εφαρμογή στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών (2) (3). Η στρατηγική δοκιμών περιλαμβάνει τη διεξαγωγή επικυρωμένων και αποδεκτών δοκιμών in vitro και παρέχεται ως συμπλήρωμα της παρούσας μεθόδου. Για τους σκοπούς του κανονισμού (ΕΚ) αριθ., 1907/2006 για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών προϊόντων (REACH) (2), μια στρατηγική ολοκληρωμένων δοκιμών περιλαμβάνεται επίσης στο σχετικό έγγραφο καθοδήγησης του ECHA (21). Οι δοκιμές σε ζώα θα πρέπει να διεξάγονται μόνον αν αυτό κρίνεται απαραίτητο μετά από εξέταση των διαθέσιμων εναλλακτικών μεθόδων, και να χρησιμοποιούν εκείνες που κρίνονται κατάλληλες. Κατά τον χρόνο σύνταξης της παρούσας επικαιροποιημένης μεθόδου δοκιμών, υπάρχουν περιπτώσεις κατά τις οποίες αυτή εξακολουθεί να είναι αναγκαία ή να απαιτείται βάσει ορισμένων κανονιστικών πλαισίων.

Η πιο πρόσφατη επικαιροποίηση επικεντρώθηκε κυρίως στη χρήση αναλγητικών και αναισθητικών χωρίς να επηρεάζεται η βασική ιδέα και δομή της κατευθυντήριας γραμμής δοκιμών. Η ICCVAM (3) και μια διεθνής ανεξάρτητη επιστημονική επιτροπή αξιολόγησης από ομότιμους κριτές εξέτασαν τη χρησιμότητα και τους περιορισμούς της χρήσης τοπικών αναισθητικών, συστημικών αναλγητικών και τελικών σημείων ευθανασίας ως συνήθη πρακτική κατά τις δοκιμές ασφάλειας έναντι οφθαλμικού ερεθισμού in vivo (12). Η επανεξέταση κατέληξε στο συμπέρασμα ότι με τη χρήση τοπικών αναισθητικών και συστημικών αναλγητικών μπορούν να αποφευχθούν κατά μεγάλο βαθμό ή και τελείως ο πόνος και η δυσφορία, χωρίς να επηρεάζεται το αποτέλεσμα της δοκιμής, και στη διατύπωση της σύστασης να χρησιμοποιούνται πάντοτε οι εν λόγω ουσίες. Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών έχει ληφθεί υπόψη αυτή η επανεξέταση. Κατά τη διάρκεια των δοκιμών in vivo για οξείας μορφής ερεθισμό και διάβρωση των οφθαλμών, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως συνήθης πρακτική τοπικά αναισθητικά, συστημικά αναλγητικά και τελικά σημεία ευθανασίας. Οι εξαιρέσεις στη χρήση τους θα πρέπει να αιτιολογούνται. Οι βελτιώσεις που περιγράφονται στην παρούσα μέθοδο θα περιορίσουν σημαντικά ή ακόμη και θα αποτρέψουν τον πόνο και τη δυσφορία των ζώων στις περισσότερες περιπτώσεις όπου εξακολουθεί να είναι αναγκαία η διεξαγωγή δοκιμών in vivo για την οφθαλμική ασφάλεια.

Η ισόρροπη προληπτική διαχείριση του πόνου θα πρέπει να περιλαμβάνει i) ως συνήθη πρακτική, προκαταρτική αγωγή με τοπικό αναισθητικό (π.χ. προπαρακαΐνη ή τετρακαΐνη) και συστημικό αναλγητικό (π.χ. βουπρενορφίνη), ii) ως συνήθη πρακτική, πρόγραμμα χορήγησης συστημικών αναλγητικών μετά τη μεταχείριση (π.χ. βουπρενορφίνη και μελοξικάμη), iii) προγραμματισμένη παρατήρηση, παρακολούθηση και καταγραφή των ζώων για κλινικά σημεία πόνου και/ή δυσφορίας και iv) προγραμματισμένη παρατήρηση, παρακολούθηση και καταγραφή του είδους, της σοβαρότητας και της πορείας όλων των κακώσεων των οφθαλμών. Περισσότερες λεπτομέρειες περιέχονται στις επικαιροποιημένες διαδικασίες που περιγράφονται κατωτέρω. Μετά τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, δεν θα πρέπει να εφαρμόζονται τοπικά αναισθητικά ή αναλγητικά ώστε να αποφεύγονται οι παρεμβολές στη μελέτη. Αναλγητικά με αντιφλεγμονώδη δράση (π.χ. μελοξικάμη) δεν θα πρέπει να εφαρμόζονται τοπικά και οι δόσεις που χρησιμοποιούνται συστημικά δεν θα πρέπει να επηρεάζουν τις επιδράσεις στους οφθαλμούς.

Οι ορισμοί παρατίθενται στο προσάρτημα της παρούσας μεθόδου δοκιμών.

ΑΡΧΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ ΠΡΟΣ ΕΞΕΤΑΣΗ

Προς όφελος τόσο της ορθότητας του επιστημονικού έργου, όσο και της καλής μεταχείρισης των ζώων, δεν θα πρέπει να διεξάγονται δοκιμές in vivo πριν αξιολογηθούν, με ανάλυση βάρους της απόδειξης, όλα τα διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με την πιθανή διαβρωτική/ερεθιστική επίδραση των ουσιών στους οφθαλμούς. Τα εν λόγω δεδομένα περιλαμβάνουν στοιχεία από προηγούμενες μελέτες στον άνθρωπο και/ή σε πειραματόζωα, στοιχεία που αποδεικνύουν ότι μια ή περισσότερες ουσίες με ανάλογη χημική δομή ή μείγματα τέτοιων ουσιών προκαλούν διάβρωση/ερεθισμό στους οφθαλμούς, δεδομένα που αποδεικνύουν υψηλή οξύτητα ή αλκαλικότητα της χημικής ουσίας (4) (5) και αποτελέσματα έγκυρων και αποδεκτών δοκιμών in vitro ή ex vivo για διάβρωση του δέρματος και διάβρωση/ερεθισμό των οφθαλμών 6) (13) (14) (15) (16) (17). Οι μελέτες αυτές μπορεί να έχουν διεξαχθεί πριν από την ανάλυση βάρους της απόδειξης ή ως επακόλουθό της.

Από την ανωτέρω ανάλυση ενδέχεται να προκύπτει ανάγκη μελετών in vivo του διαβρωτικού/ερεθιστικού για τους οφθαλμούς δυναμικού ορισμένων χημικών ουσιών. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις, πριν εξεταστεί το ενδεχόμενο εκτέλεσης της οφθαλμικής δοκιμής in vivo, θα πρέπει κατά προτίμηση να προηγείται μελέτη των διαβρωτικών επιδράσεων της χημικής ουσίας στο δέρμα in vitro και/ή in vivo και η μελέτη να αξιολογείται σύμφωνα με τη στρατηγική διαδοχικών δοκιμών που προβλέπεται στη μέθοδο δοκιμών B.4 (7) ή τη στρατηγική ολοκληρωμένων δοκιμών που περιγράφεται στο έγγραφο καθοδήγησης του ECHA (21).

Η στρατηγική διαδοχικών δοκιμών, που περιλαμβάνει τη διεξαγωγή επικυρωμένων δοκιμών διάβρωσης/ερεθισμού των οφθαλμών in vitro ή ex vivo, συμπεριλαμβάνεται ως συμπλήρωμα στην παρούσα μέθοδο δοκιμών και, για τους σκοπούς του κανονισμού REACH, στο έγγραφο καθοδήγησης του ECHA (21). Συνιστάται η εφαρμογή της εν λόγω στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών πριν από τη διεξαγωγή δοκιμών in vivo. Για τις νέες χημικές ουσίες, συνιστάται κλιμακωτή προσέγγιση δοκιμών για τη συλλογή επιστημονικώς ορθών δεδομένων σχετικά με τη διαβρωτική/ερεθιστική δράση της χημικής ουσίας. Για τις υφιστάμενες χημικές ουσίες, για τις οποίες δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα όσον αφορά τη δερματική και οφθαλμική διάβρωση/ερεθισμό, η στρατηγική μπορεί να χρησιμοποιείται για να συμπληρωθούν τα κενά στα δεδομένα. Η εφαρμογή διαφορετικής στρατηγικής ή διαδικασίας δοκιμών ή τυχόν απόφαση να μην εφαρμοστεί κλιμακωτή προσέγγιση δοκιμών θα πρέπει να αιτιολογείται.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ IN VIVO

Μετά από προκαταρτική αγωγή με συστημικό αναλγητικό και επαγωγή της κατάλληλης τοπικής αναισθησίας, η προς δοκιμή χημική ουσία εφαρμόζεται εφάπαξ σε έναν από τους οφθαλμούς του πειραματόζωου. Ο οφθαλμός που δεν υποβάλλεται σε αγωγή χρησιμεύει ως μάρτυρας. Ο βαθμός ερεθισμού/διάβρωσης του οφθαλμού αξιολογείται με βαθμολόγηση των βλαβών του επιπεφυκότα, του κερατοειδούς και της ίριδας σε συγκεκριμένα διαστήματα. Περιγράφονται επίσης τυχόν άλλες επιδράσεις στους οφθαλμούς και συστημικές δυσμενείς επιδράσεις με σκοπό την πλήρη αξιολόγηση των επιδράσεων. Η διάρκεια της μελέτης θα πρέπει να είναι επαρκής για να εκτιμηθεί αν οι επιδράσεις είναι αναστρέψιμες ή μη.

Τα ζώα που εμφανίζουν σημεία έντονης δυσφορίας και/ή πόνου σε οποιοδήποτε στάδιο της δοκιμής ή βλάβες συμβατές με τα τελικά σημεία ευθανασίας που περιγράφονται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών (βλ. παράγραφο 26) θα πρέπει να θανατώνονται ανώδυνα και η χημική ουσία να αξιολογείται ανάλογα. Τα κριτήρια για τη λήψη απόφασης σχετικά με την ανώδυνη θανάτωση ετοιμοθάνατων ή βαρέως πασχόντων ζώων αποτελούν το αντικείμενο εγγράφου καθοδήγησης του ΟΟΣΑ (8).

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΟΚΙΜΗ IN VIVO

Επιλογή ζωικού είδους

Το προτιμώμενο πειραματόζωο είναι το αλφικό κουνέλι και χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα ζώα. Η χρήση άλλων φυλών ή ειδών θα πρέπει να αιτιολογείται.

Προετοιμασία των ζώων

Κάθε πειραματόζωο που επιλέγεται αρχικά για τη δοκιμή θα πρέπει, εντός των 24 ωρών που προηγούνται της έναρξής της, να υποβάλλεται σε οφθαλμολογική εξέταση και των δύο οφθαλμών. Δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ζώα που εμφανίζουν ερεθισμένους οφθαλμούς, οφθαλμικές ανωμαλίες ή προϋπάρχουσες κακώσεις του κερατοειδούς.

Συνθήκες στέγασης και σίτισης

Τα ζώα θα πρέπει να στεγάζονται χωριστά. Η θερμοκρασία στην αίθουσα πειραματόζωων θα πρέπει να είναι 20°C (± 3°C) για τα κουνέλια. Αν και η σχετική υγρασία θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 30 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού της αίθουσας, εν τούτοις θα πρέπει να επιδιώκεται μια τιμή 50-60 %. Ο φωτισμός θα πρέπει να είναι τεχνητός, με φωτοπερίοδο 12 ωρών. Θα πρέπει να αποφεύγεται η υπερβολική φωτεινή ένταση. Για τη διατροφή των ζώων μπορούν να χρησιμοποιούνται τα συνήθη εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού.

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ

Χρήση τοπικών αναισθητικών και συστημικών αναλγητικών

Συνιστώνται οι ακόλουθες διαδικασίες για την αποφυγή ή την ελαχιστοποίηση του πόνου και της δυσφορίας σε διαδικασίες δοκιμών οφθαλμικής ασφάλειας. Εναλλακτικά, επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται υποκατάστατες διαδικασίες που αποδεδειγμένα εξασφαλίζουν εξίσου αποτελεσματική ή και αποτελεσματικότερη πρόληψη ή ανακούφιση από τον πόνο και τη δυσφορία.

Εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας

Η υπό δοκιμή χημική ουσία θα πρέπει να τοποθετείται στο θόλο του επιπεφυκότα του ενός οφθαλμού κάθε ζώου, αφού αποτραβηχτεί, με απαλές κινήσεις, το κάτω βλέφαρο από το βολβό. Στη συνέχεια, με απαλές κινήσεις, τα βλέφαρα διατηρούνται κλειστά για ένα περίπου δευτερόλεπτο, για να αποφευχθεί η απώλεια υλικού. Ο άλλος οφθαλμός, που δεν υποβάλλεται σε μεταχείριση, χρησιμεύει ως μάρτυρας.

Έκπλυση

Οι οφθαλμοί των πειραματόζωων δεν θα πρέπει να εκπλένονται για 24 ώρες τουλάχιστον μετά την ενστάλαξη της υπό δοκιμή ουσίας, εκτός εάν αυτή είναι στερεό (βλ. παράγραφο 18) ή εάν εκδηλωθούν αμέσως διαβρωτικές ή ερεθιστικές επιδράσεις. Σε 24 ώρες μπορεί να γίνει έκπλυση, εάν θεωρηθεί σκόπιμο.

Δεν συνιστάται η χρήση δορυφορικής ομάδας ζώων για τη διερεύνηση της επίδρασης της έκπλυσης, εκτός εάν το επιβάλλουν επιστημονικοί λόγοι. Στις περιπτώσεις όπου απαιτείται δορυφορική ομάδα, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται δύο κουνέλια. Πρέπει να τεκμηριώνονται επιμελώς οι συνθήκες έκπλυσης, π.χ. χρόνος έκπλυσης, σύνθεση και θερμοκρασία του διαλύματος, διάρκεια, όγκος και ταχύτητα εφαρμογής.

Επίπεδα δόσεων

(1)   Δοκιμή υγρών

Για τη δοκιμή υγρών χρησιμοποιείται μία δόση 0,1 ml. Τα εκνεφώματα (σπρέι) δεν θα πρέπει να ενσταλάζονται απευθείας από τον ψεκαστήρα στον οφθαλμό. Το υγρό θα πρέπει να εκβάλλεται από τον περιέκτη, να συλλέγεται σε άλλο δοχείο και κατόπιν να λαμβάνονται 0,1 ml για ενστάλαξη στον οφθαλμό.

(2)   Δοκιμή στερεών

Για τη δοκιμή στερεών, αλοιφών και κοκκωδών χημικών ουσιών, η χρησιμοποιούμενη ποσότητα θα πρέπει να έχει όγκο 0,1 ml ή βάρος που δεν υπερβαίνει τα 100 mg. Η υπό δοκιμή χημική ουσία θα πρέπει να λειοτριβείται σε λεπτή σκόνη. Ο όγκος των στερεών υλικών θα πρέπει να μετριέται αφού αυτά συμπυκνωθούν ελαφρά, π.χ. με μικρά κτυπήματα στο δοχείο μέτρησης. Εάν η στερεά υπό δοκιμή χημική ουσία δεν έχει απομακρυνθεί από τον οφθαλμό του πειραματόζωου με τους φυσιολογικούς μηχανισμούς κατά τον πρώτο χρόνο παρατήρησης, που είναι μία ώρα μετά την εφαρμογή, ο οφθαλμός μπορεί να εκπλυθεί με φυσιολογικό ορό ή απεσταγμένο νερό.

(3)   Δοκιμή αερολυμάτων

Συνιστάται όλα τα εκνεφώματα και αερολύματα να συλλέγονται σε άλλο δοχείο πριν από την ενστάλαξή τους στον οφθαλμό. με μόνη εξαίρεση τις χημικές ουσίες που περιέχονται σε δοχεία υπό πίεση, οι οποίες δεν είναι δυνατόν να συλλεχθούν επειδή εξατμίζονται. Στις περιπτώσεις αυτές, ο οφθαλμός θα πρέπει να κρατείται ανοικτός και η υπό δοκιμή χημική ουσία να χορηγείται με έναν μόνο ψεκασμό διάρκειας ενός δευτερολέπτου περίπου από απόσταση 10 cm, ακριβώς απέναντι από τον οφθαλμό. Αυτή η απόσταση μπορεί να διαφέρει ανάλογα με την πίεση του εκνεφώματος και τα συστατικά του. Θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε ο οφθαλμός να μην υφίσταται βλάβη από την πίεση ψεκασμού. Σε ειδικές περιπτώσεις, ενδέχεται να είναι αναγκαία η εκτίμηση της πιθανότητας να προκληθεί «μηχανική» βλάβη στον οφθαλμό από τη δύναμη του αερολύματος.

Η δόση του αερολύματος είναι δυνατόν να υπολογιστεί κατά προσέγγιση με την ακόλουθη προσομοίωση της δοκιμής: η χημική ουσία ψεκάζεται διαμέσου οπής μεγέθους ίσου με τον οφθαλμό του κουνελιού επάνω σε χαρτί ζύγισης τοποθετημένο ακριβώς πίσω από την οπή. Η αύξηση του βάρους του χαρτιού παρέχει μια εκτίμηση της ποσότητας που θα ψεκαστεί στον οφθαλμό. Στην περίπτωση των πτητικών χημικών ουσιών, η δόση μπορεί να υπολογιστεί κατά προσέγγιση με ζύγιση του δοχείου που περιέχει την υπό δοκιμή χημική ουσία πριν και μετά την αφαίρεσή της.

Αρχική δοκιμή (δοκιμή ερεθισμού/διάβρωσης των οφθαλμών in vivo σε ένα ζώο)

Συνιστάται θερμά να διεξάγεται η δοκιμή in vivo πρώτα σε ένα μόνο ζώο (βλ. συμπλήρωμα της παρούσας μεθόδου δοκιμών: Στρατηγική διαδοχικών δοκιμών ερεθισμού και διάβρωσης των οφθαλμών). Οι παρατηρήσεις θα πρέπει να επιτρέπουν τον προσδιορισμό της σοβαρότητας και της αναστρεψιμότητας πριν από τη διεξαγωγή επιβεβαιωτικής δοκιμής σε δεύτερο ζώο.

Εάν τα αποτελέσματα της δοκιμής αυτής υποδεικνύουν, σύμφωνα με την περιγραφόμενη διαδικασία, ότι η χημική ουσία είναι διαβρωτικό ή ισχυρό ερεθιστικό των οφθαλμών, δεν θα πρέπει να διεξάγονται άλλες δοκιμές ερεθισμού των οφθαλμών.

Επιβεβαιωτική δοκιμή (δοκιμή ερεθισμού των οφθαλμών in vivo σε επιπλέον ζώα)

Εάν δεν έχει παρατηρηθεί διαβρωτική ή σοβαρή ερεθιστική επίδραση κατά την αρχική δοκιμή, η ερεθιστική ή αρνητική απόκριση θα πρέπει να επιβεβαιώνεται με τη χρήση έως δύο επιπλέον ζώων. Εάν έχει παρατηρηθεί ερεθιστική επίδραση κατά την αρχική δοκιμή, συνιστάται η διεξαγωγή της επιβεβαιωτικής δοκιμής σε διαδοχικές φάσεις με χρήση ενός ζώου κάθε φορά αντί της ταυτόχρονης έκθεσης των δύο επιπλέον ζώων. Εάν το δεύτερο ζώο εμφανίσει διαβρωτικές ή ισχυρές ερεθιστικές επιδράσεις, η δοκιμή διακόπτεται. Εάν τα αποτελέσματα από το δεύτερο ζώο είναι επαρκή για την απόφαση σχετικά με την ταξινόμηση κινδύνων, δεν θα πρέπει να διεξάγονται άλλες δοκιμές.

Περίοδος παρατήρησης

Η διάρκεια της περιόδου παρατήρησης θα πρέπει να είναι επαρκής για να εκτιμηθούν πλήρως το μέγεθος και η αναστρεψιμότητα των παρατηρούμενων επιδράσεων. Παρόλα αυτά, το πείραμα θα πρέπει να τερματίζεται αμέσως μόλις το ζώο εμφανίσει σημεία ισχυρού πόνου ή έντονης δυσφορίας (8). Για να κριθεί αν οι επιδράσεις είναι αναστρέψιμες, τα ζώα θα πρέπει να παρατηρούνται κατά κανόνα για χρονικό διάστημα 21 ημερών μετά τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Εάν διαπιστωθεί ότι είναι αναστρέψιμες πριν παρέλθουν 21 ημέρες, το πείραμα θα πρέπει να τερματίζεται τη συγκεκριμένη στιγμή.

Κλινικές παρατηρήσεις και διαβάθμιση των οφθαλμικών αντιδράσεων

Οι οφθαλμοί θα πρέπει να αξιολογούνται πλήρως για την παρουσία ή την απουσία οφθαλμικών βλαβών μία ώρα μετά την ΕΔΧ και να ακολουθούν τουλάχιστον καθημερινές αξιολογήσεις. Τα ζώα θα πρέπει να αξιολογούνται αρκετές φορές την ημέρα κατά τις πρώτες 3 ημέρες για να εξασφαλίζεται η έγκαιρη λήψη αποφάσεων τερματισμού της δοκιμής. Τα υπό δοκιμή ζώα θα πρέπει να αξιολογούνται συστηματικά σε όλη τη διάρκεια της μελέτης για κλινικά σημεία πόνου και/ή δυσφορίας (π.χ. επανειλημμένο άγγιγμα ή τρίψιμο του οφθαλμού με τα οπίσθια ή πρόσθια άκρα, υπερβολικός βλεφαρισμός, υπερβολική δακρύρροια) (9) (10) (11), τουλάχιστον δύο φορές ημερησίως με ελάχιστα διαστήματα 6 ωρών μεταξύ των παρατηρήσεων, ή συχνότερα εάν χρειαστεί. Αυτό είναι αναγκαίο για i) την επαρκή αξιολόγηση των ενδείξεων πόνου και δυσφορίας στα ζώα, έτσι ώστε να λαμβάνονται τεκμηριωμένες αποφάσεις για το αν είναι αναγκαίο να αυξηθεί η δόση των αναλγητικών και ii) την αξιολόγηση της επίτευξης κάποιου από τα καθορισμένα τελικά σημεία ευθανασίας στα ζώα, έτσι ώστε να λαμβάνονται τεκμηριωμένες αποφάσεις για το κατά πόσον είναι σκόπιμη η θανάτωση των ζώων με ευθανασία και να διασφαλίζεται η έγκαιρη λήψη αυτών των αποφάσεων. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως συνήθης πρακτική χρώση φλουορεσκεΐνης και βιομικροσκόπιο σχισμοειδούς λυχνίας, όταν αυτό κρίνεται σκόπιμο (π.χ. κατά την αξιολόγηση του βάθους της κάκωσης σε περίπτωση εξέλκωσης του κερατοειδούς), για να υποβοηθούν τον εντοπισμό και τη μέτρηση της οφθαλμικής βλάβης και για να εκτιμάται αν πληρούνται τα καθορισμένα κριτήρια τελικών σημείων για θανάτωση με ευθανασία. Μπορούν να συλλέγονται ψηφιακές φωτογραφίες των παρατηρούμενων βλαβών ως σημεία αναφοράς και για μια μόνιμη καταγραφή της έκτασης της οφθαλμικής βλάβης. Τα ζώα θα πρέπει να παραμένουν υπό δοκιμή μόνο για όσο χρόνο απαιτείται για να ληφθούν οριστικά στοιχεία. Τα ζώα που εμφανίζουν σημεία ισχυρού πόνου ή έντονης δυσφορίας θα πρέπει να θανατώνονται αμέσως με ευθανασία, οπότε η χημική ουσία αξιολογείται ανάλογα.

Τα ζώα που εμφανίζουν τις ακόλουθες βλάβες των οφθαλμών μετά την ενστάλαξη της χημικής ουσίας θα πρέπει να θανατώνονται με ευθανασία (βλ. πίνακα 1 για περιγραφή της διαβάθμισης των βλαβών): διάτρηση ή σοβαρή εξέλκωση του κερατοειδούς, συμπεριλαμβανομένου του σταφυλώματος· αιμορραγία στον πρόσθιο θάλαμο του οφθαλμού· αδιαφάνεια (θολερότητα) του κερατοειδούς 4ου βαθμού· απουσία φωτοκινητικού αντανακλαστικού (βαθμός απόκρισης ίριδας 2) για 72 ώρες· εξέλκωση του επιπεφυκότα· νέκρωση του επιπεφυκότα ή της σκαρδαμυκτικής μεμβράνης· ή απόπτωση εσχάρας, επειδή οι συγκεκριμένες βλάβες κατά κανόνα δεν είναι αναστρέψιμες. Επιπλέον, συνιστάται να χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες βλάβες των οφθαλμών ως τελικά σημεία ευθανασίας για τον τερματισμό μελετών πριν από τη λήξη της προγραμματισμένης περιόδου παρατήρησης, διάρκειας 21 ημερών. Οι βλάβες αυτές θεωρούνται πρόδρομα σοβαρών ερεθιστικών ή διαβρωτικών κακώσεων και κακώσεων που δεν αναμένεται να αναστραφούν πλήρως μέχρι το τέλος της 21ήμερης περιόδου παρατήρησης: μεγάλο βάθος της κάκωσης (π.χ. επέκταση της εξέλκωσης του κερατοειδούς πέρα από τις επιφανειακές στιβάδες του στρώματος), καταστροφή του σκληροκερατοειδικού ορίου > 50 % (όπως αποδεικνύεται από τη λεύκανση του επιπεφυκότα) και σοβαρή λοίμωξη του οφθαλμού (πυόρροια). Ο συνδυασμός νεοαγγείωσης της επιφάνειας του κερατοειδούς (δηλ. σχηματισμός πάννου), μη συρρίκνωσης της επιφάνειας που χρωματίζεται με τη φλουορεσκεΐνη με την πάροδο του χρόνου βάσει καθημερινής αξιολόγησης και/ή απουσίας επανεπιθηλίωσης 5 ημέρες μετά την εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας θα μπορούσαν επίσης να θεωρηθούν δυνητικά χρήσιμα κριτήρια που επηρεάζουν την κλινική απόφαση για πρόωρο τερματισμό της μελέτης. Ωστόσο, καθένα από αυτά τα ευρήματα δεν αρκεί από μόνο του για να δικαιολογήσει τον πρόωρο τερματισμό της μελέτης. Αφού εντοπιστούν σοβαρές επιδράσεις στους οφθαλμούς, θα πρέπει να καλείται θεράπων ή ειδικευμένος στα πειραματόζωα κτηνίατρος ή προσωπικό εκπαιδευμένο να εντοπίζει τις κλινικές βλάβες για κλινική εξέταση, ώστε να διαπιστώνεται αν ο συνδυασμός αυτών των επιδράσεων δικαιολογεί τον πρόωρο τερματισμό της μελέτης. Οι οφθαλμικές αντιδράσεις (του επιπεφυκότα, του κερατοειδούς και της ίριδας) θα πρέπει να βαθμολογούνται και οι βαθμοί να καταγράφονται 1, 24, 48 και 72 ώρες μετά την εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (πίνακας 1). Τα ζώα που δεν εμφανίζουν οφθαλμικές βλάβες μπορούν να απομακρύνονται από τη δοκιμή το νωρίτερο 3 ημέρες μετά την ενστάλαξη της ουσίας. Τα ζώα που δεν εμφανίζουν σοβαρές οφθαλμικές βλάβες θα πρέπει να παρατηρούνται μέχρι αυτές να εξαλειφθούν ή για χρονικό διάστημα 21 ημερών, οπότε η μελέτη τερματίζεται. Οι παρατηρήσεις θα πρέπει να διενεργούνται και να καταγράφονται τουλάχιστον 1 ώρα, 24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες, 7 ημέρες, 14 ημέρες και 21 ημέρες μετά την ΕΔΧ, με σκοπό να διαπιστώνεται η εξέλιξη των βλαβών και να κρίνεται αν αυτές είναι αναστρέψιμες ή μη. Θα πρέπει να διενεργούνται συχνότερες παρατηρήσεις, εάν είναι αναγκαίο, για να κριθεί αν τα πειραματόζωα θα πρέπει να θανατωθούν με ευθανασία ή να απομακρυνθούν από τη μελέτη λόγω αρνητικών αποτελεσμάτων.

Σε κάθε εξέταση θα πρέπει να καταγράφονται οι βαθμοί των οφθαλμικών βλαβών (πίνακας 1). Θα πρέπει επίσης να αναφέρονται τυχόν άλλες βλάβες του οφθαλμού (π.χ. σχηματισμός πάννου, χρώση, αλλαγές στον πρόσθιο θάλαμο) ή συστημικές δυσμενείς επιδράσεις.

Η εξέταση των αντιδράσεων μπορεί να διευκολυνθεί με τη χρήση διόφθαλμου οφθαλμοσκοπίου, φορητής σχισμοειδούς λυχνίας, βιομικροσκοπίου ή άλλου κατάλληλου οργάνου. Μετά την καταγραφή των παρατηρήσεων του πρώτου 24ώρου, οι οφθαλμοί μπορούν να εξετάζονται περαιτέρω με τη βοήθεια φλουορεσκεΐνης.

Η διαβάθμιση των οφθαλμικών αποκρίσεων είναι κατ' ανάγκη υποκειμενική. Για να διευκολυνθεί η εναρμόνιση της διαβάθμισης των οφθαλμικών αποκρίσεων και να βοηθηθούν, αφενός, τα εργαστήρια δοκιμών και, αφετέρου, το προσωπικό που εκτελεί και ερμηνεύει τις παρατηρήσεις, απαιτείται κατάλληλη εκπαίδευση του εν λόγω προσωπικού στο χρησιμοποιούμενο σύστημα βαθμολόγησης.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων

Η βαθμολογία του οφθαλμικού ερεθισμού θα πρέπει να αξιολογείται σε συνδυασμό με το είδος και τη σοβαρότητα των βλαβών, καθώς και με το κατά πόσον αυτές είναι αναστρέψιμες. Οι επιμέρους βαθμοί δεν αντιπροσωπεύουν ένα απόλυτο πρότυπο για τις ερεθιστικές ιδιότητες των χημικών ουσιών, δεδομένου ότι αξιολογούνται και άλλες επιδράσεις της υπό δοκιμή ουσίας. Αντίθετα, θα πρέπει να θεωρούνται τιμές αναφοράς και έχουν αξία μόνον εφόσον τεκμηριώνονται με πλήρη περιγραφή και αξιολόγηση όλων των παρατηρήσεων.

Έκθεση δοκιμής

Στην έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνονται τα ακόλουθα στοιχεία:

Ερμηνεία των αποτελεσμάτων

Τα αποτελέσματα των μελετών ερεθισμού των οφθαλμών που έχουν διεξαχθεί σε πειραματόζωα μπορούν να μεταφερθούν στον άνθρωπο μόνον ως ένα σημείο. Σε πολλές περιπτώσεις το αλφικό κουνέλι είναι πιο ευαίσθητο από τον άνθρωπο στα ερεθιστικά ή διαβρωτικά των οφθαλμών.

Κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων θα πρέπει να καταβάλλεται προσοχή για να μη λαμβάνεται υπόψη ο ερεθισμός που οφείλεται σε δευτεροπαθείς λοιμώξεις.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Πίνακας 1

Διαβάθμιση των οφθαλμικών κακώσεων

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ Β. 5  (4)

ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΗ ΔΙΑΔΟΧΙΚΩΝ ΔΟΚΙΜΩΝ ΓΙΑ ΕΡΕΘΙΣΜΟ ΚΑΙ ΔΙΑΒΡΩΣΗ ΤΩΝ ΟΦΘΑΛΜΩΝ

Γενικές παρατηρήσεις

Προς όφελος τόσο της ποιότητας του επιστημονικού έργου, όσο και της καλής μεταχείρισης των ζώων, έχει μεγάλη σημασία να αποφεύγεται η περιττή χρήση πειραματόζωων και να ελαχιστοποιείται η διεξαγωγή δοκιμών που είναι πιθανόν να τους προκαλέσουν σοβαρές αντιδράσεις. Πριν αντιμετωπιστεί το ενδεχόμενο διεξαγωγής δοκιμών in vivo, θα πρέπει να αξιολογούνται όλα τα στοιχεία που αφορούν τις πιθανές διαβρωτικές/ερεθιστικές επιδράσεις των χημικών ουσιών στους οφθαλμούς. Ενδέχεται να υπάρχουν ήδη αποδεικτικά στοιχεία που επαρκούν για την ταξινόμηση μιας υπό δοκιμή χημικής ουσίας από πλευράς διαβρωτικού ή ερεθιστικού για τους οφθαλμούς δυναμικού, χωρίς να είναι αναγκαία η διεξαγωγή δοκιμών σε πειραματόζωα. Η χρησιμοποίηση επομένως της ανάλυσης βάρους της απόδειξης και μιας στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών ελαχιστοποιεί την ανάγκη διεξαγωγής δοκιμών in vivo, ιδίως εάν πιθανολογείται ότι η ουσία προκαλεί ισχυρές αντιδράσεις.

Συνιστάται η χρήση της ανάλυσης βάρους της απόδειξης για την αξιολόγηση των διαθέσιμων στοιχείων σχετικά με τον ερεθισμό και τη διάβρωση των οφθαλμών από χημικές ουσίες και για να κριθεί αν πρέπει να διεξαχθούν συμπληρωματικές μελέτες, εκτός από τις οφθαλμικές μελέτες in vivo, ώστε να διευκολυνθεί ο χαρακτηρισμός των συγκεκριμένων ιδιοτήτων. Εάν χρειάζονται περαιτέρω μελέτες, συνιστάται η εφαρμογή της στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών για τη συλλογή των σχετικών πειραματικών δεδομένων. Στην περίπτωση των ουσιών που δεν έχουν υποβληθεί σε δοκιμές στο παρελθόν, η στρατηγική διαδοχικών δοκιμών θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τη συλλογή των δεδομένων που απαιτεί η αξιολόγηση της διαβρωτικής/ερεθιστικής για τους οφθαλμούς ικανότητας των ουσιών. Η αρχική στρατηγική δοκιμών που περιγράφεται στο παρόν συμπλήρωμα διαμορφώθηκε σε σεμινάριο εργασίας του ΟΟΣΑ (1). Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε και επεκτάθηκε στο Εναρμονισμένο Ολοκληρωμένο Σύστημα Ταξινόμησης Κινδύνων για τις Επιδράσεις των Χημικών Ουσιών στην Υγεία του ανθρώπου και στο Περιβάλλον, το οποίο εγκρίθηκε από την 28η κοινή συνεδρίαση της επιτροπής χημικών προϊόντων και της ομάδας εργασίας για τα χημικά προϊόντα, τον Νοέμβριο του 1998 (2), και επικαιροποιήθηκε από ομάδα εμπειρογνωμόνων του ΟΟΣΑ το 2011.

Η παρούσα στρατηγική δοκιμών δεν αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της μεθόδου δοκιμών Β.5, αλλά εκφράζει τη συνιστώμενη προσέγγιση για τον προσδιορισμό των ερεθιστικών/διαβρωτικών για τους οφθαλμούς ιδιοτήτων. Η προσέγγιση αυτή αντιπροσωπεύει αφενός την ορθή πρακτική και, αφετέρου, ένα δεοντολογικό σημείο αναφοράς για τη διεξαγωγή δοκιμών οφθαλμικής διάβρωσης/ερεθισμού in vivo. Η μεθοδολογία δοκιμών παρέχει κατευθύνσεις για τη διεξαγωγή της δοκιμής in vivo και συγκεφαλαιώνει τους παράγοντες που θα πρέπει να εξετάζονται πριν αποφασιστεί η διενέργεια μιας τέτοιας δοκιμής. Η στρατηγική διαδοχικών δοκιμών παρέχει μια προσέγγιση βασισμένη στην ανάλυση βάρους της απόδειξης για την αξιολόγηση των διαθέσιμων δεδομένων σχετικά με τις ερεθιστικές/διαβρωτικές για τους οφθαλμούς ιδιότητες των χημικών ουσιών, καθώς και μια κλιμακωτή προσέγγιση για τη παραγωγή των σχετικών δεδομένων στην περίπτωση των χημικών ουσιών για τις οποίες χρειάζονται συμπληρωματικές μελέτες ή δεν έχουν εκπονηθεί μελέτες. Η εν λόγω στρατηγική περιλαμβάνει καταρχάς τη διεξαγωγή επικυρωμένων και αποδεκτών δοκιμών in vitro ή ex vivo και, στη συνέχεια, μελετών με τη μέθοδο δοκιμών Β.4 σε συγκεκριμένες περιστάσεις (3) (4).

Περιγραφή της κλιμακωτής στρατηγικής δοκιμών

Πριν από τη διεξαγωγή δοκιμών στο πλαίσιο της στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών (διάγραμμα), θα πρέπει να αξιολογούνται όλα τα διαθέσιμα στοιχεία, προκειμένου να κριθεί αν είναι αναγκαίο να διεξαχθούν οφθαλμικές δοκιμές in vivo. Αν και είναι δυνατόν να προκύψουν σημαντικά στοιχεία από την αξιολόγηση μεμονωμένων παραμέτρων (π.χ. ακραίες τιμές pH), θα πρέπει να εξετάζεται το σύνολο των υφισταμένων στοιχείων. Για να ληφθεί απόφαση με βάση ανάλυση βάρους της απόδειξης, θα πρέπει να αξιολογούνται όλα τα σημαντικά δεδομένα που αφορούν τις επιδράσεις της εκάστοτε χημικής ουσίας και των δομικών αναλόγων της και η απόφαση αυτή θα πρέπει να αιτιολογείται. Θα πρέπει να δίδεται έμφαση πρωτίστως στα διαθέσιμα δεδομένα για τις επιδράσεις χημικών ουσιών στον άνθρωπο και στα ζώα και, κατόπιν, στα αποτελέσματα δοκιμών in vitro ή ex vivo. Θα πρέπει να αποφεύγονται, στο μέτρο του δυνατού, οι μελέτες διαβρωτικών ουσιών in vivo. Οι παράγοντες που λαμβάνονται υπόψη στη στρατηγική δοκιμών περιλαμβάνουν:

ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΗ ΔΟΚΙΜΩΝ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΓΙΑ ΕΡΕΘΙΣΜΟ/ΔΙΑΒΡΩΣΗ ΤΩΝ ΟΦΘΑΛΜΩΝ

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(3)

Στο μέρος B, το Κεφάλαιο Β.10 αντικαθίσταται από το ακόλουθο κείμενο:

«Β.10   Δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών in vitro σε θηλαστικά

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών 473 του ΟΟΣΑ (2016). Αποτελεί μέρος μιας σειράς μεθόδων δοκιμών γενετικής τοξικολογίας. Έχει συνταχθεί ένα έγγραφο του ΟΟΣΑ με συνοπτικές πληροφορίες για τις δοκιμές γενετικής τοξικολογίας και μια επισκόπηση των πρόσφατων αλλαγών που έγιναν σε αυτές τις κατευθυντήριες γραμμές δοκιμών (1).

Σκοπός της δοκιμής χρωμοσωμικών εκτροπών in vitro είναι ο εντοπισμός χημικών ουσιών που προκαλούν δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών (2) (3) (4). Οι δομικές εκτροπές μπορεί να είναι δύο τύπων, χρωμοσωμικές ή χρωματιδικές. Στους προσδιορισμούς χρωμοσωμικών εκτροπών in vitro μπορεί να παρουσιαστεί πολυπλοειδία (συμπεριλαμβανομένου του ενδοαναδιπλασιασμού). Ενώ τα ανευπλοειδογόνα μπορούν να επάγουν πολυπλοειδία, η πολυπλοειδία δεν αποτελεί αφ' εαυτής ένδειξη ανευπλοειδογόνου δυναμικού, αλλά μπορεί να υποδηλώνει απλώς διατάραξη του κυτταρικού κύκλου ή κυτταροτοξικότητα (5). Η παρούσα δοκιμή δεν έχει σχεδιαστεί για τη μέτρηση της ανευπλοειδίας. Για την ανίχνευση ανευπλοειδίας συνιστάται η διεξαγωγή δοκιμής μικροπυρήνων in vitro (6).

Στη δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών in vitro μπορούν να χρησιμοποιούνται καλλιέργειες καθιερωμένων κυτταρικών σειρών ή πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων ανθρώπου ή τρωκτικών. Τα χρησιμοποιούμενα κύτταρα θα πρέπει να επιλέγονται με βάση την ικανότητα ανάπτυξης σε καλλιέργεια, τη σταθερότητα του καρυότυπου (συμπεριλαμβανομένου του χρωμοσωμικού αριθμού) και την αυθόρμητη συχνότητα χρωμοσωμικών εκτροπών (7). Τα μέχρι σήμερα διαθέσιμα δεδομένα δεν επιτρέπουν τη διατύπωση αυστηρών συστάσεων, αλλά υποδηλώνουν ότι είναι σημαντικό να λαμβάνονται υπόψη, κατά την αξιολόγηση των χημικών κινδύνων, η κατάσταση της p53, η γενετική σταθερότητα (καρυότυπος), η ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA και η προέλευση (από τρωκτικά ή τον άνθρωπο) των κυττάρων που επιλέγονται για τη δοκιμή. Ως εκ τούτου, παροτρύνονται οι χρήστες της παρούσας μεθόδου δοκιμών να λαμβάνουν υπόψη την επίδραση αυτών και άλλων κυτταρικών χαρακτηριστικών στις επιδόσεις των κυτταρικών σειρών ως προς την ανίχνευση της επαγωγής χρωμοσωμικών εκτροπών, καθώς εξελίσσεται η επιστημονική γνώση σε αυτόν τον τομέα.

Οι χρησιμοποιούμενοι ορισμοί παρατίθενται στο προσάρτημα 1.

ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ

Οι δοκιμές που διεξάγονται in vitro απαιτούν κατά κανόνα τη χρήση εξωγενούς πηγής μεταβολικής ενεργοποίησης, εκτός εάν τα κύτταρα διαθέτουν ικανότητα μεταβολισμού των υπό δοκιμή χημικών ουσιών. Το εξωγενές σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης δεν μιμείται απόλυτα τις συνθήκες που επικρατούν in vivo. Θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγονται συνθήκες που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε τεχνητά θετικά αποτελέσματα, δηλ. χρωμοσωμική βλάβη που δεν προκαλείται από άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των υπό δοκιμή χημικών ουσιών και των χρωμοσωμάτων· στις συνθήκες αυτές περιλαμβάνονται οι μεταβολές του pH ή της ωσμωμοριακότητας (8) (9) (10), η αλληλεπίδραση με τα συστατικά του θρεπτικού μέσου (11) (12) και τα υπέρμετρα επίπεδα κυτταροτοξικότητας (13) (14) (15) (16).

Η παρούσα δοκιμή χρησιμοποιείται για την ανίχνευση χρωμοσωμικών εκτροπών που μπορεί να προκύψουν από κλαστογόνα συμβάντα. Η ανάλυση της επαγωγής χρωμοσωμικών εκτροπών θα πρέπει να διενεργείται με τη χρήση κυττάρων στο στάδιο της μετάφασης. Είναι, συνεπώς, απαραίτητο να φθάνουν τα κύτταρα στο στάδιο της μίτωσης, τόσο στις καλλιέργειες που υποβάλλονται σε μεταχείριση όσο και σε εκείνες που δεν υποβάλλονται. Για τα βιομηχανικά νανοϋλικά, ενδέχεται να χρειάζονται ειδικές προσαρμογές της παρούσας μεθόδου δοκιμών, οι οποίες όμως δεν περιγράφονται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών.

Πριν από τη χρήση της μεθόδου δοκιμών σε μείγμα για την παραγωγή δεδομένων για συγκεκριμένο ρυθμιστικό σκοπό, θα πρέπει να εξετάζεται αν — και, εάν ναι, για ποιον λόγο — αυτή μπορεί να αποδώσει επαρκή αποτελέσματα για τον επιδιωκόμενο σκοπό. Οι εκτιμήσεις αυτές δεν είναι αναγκαίες όταν οι κανονιστικές ρυθμίσεις επιβάλλουν τον έλεγχο του μείγματος.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

Καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων ή κυττάρων άλλων θηλαστικών εκτίθενται στην υπό δοκιμή χημική ουσία με και χωρίς εξωγενή πηγή μεταβολικής ενεργοποίησης, εκτός εάν χρησιμοποιούνται κύτταρα με επαρκή μεταβολική ικανότητα (βλ. παράγραφο 13). Σε κατάλληλα προκαθορισμένα διαστήματα μετά την έναρξη της έκθεσης των κυτταροκαλλιεργειών στην υπό δοκιμή χημική ουσία, αυτές υποβάλλονται σε μεταχείριση με χημική ουσία διακοπής της μετάφασης (π.χ. Colcemid™ ή κολχικίνη) και ακολουθεί συλλογή, χρώση και μικροσκοπική εξέταση των μεταφασικών κυττάρων για να διαπιστωθεί η παρουσία εκτροπών χρωματιδικού και χρωμοσωμικού τύπου.

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Προετοιμασίες

Κύτταρα

Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες κυτταρικές σειρές (π.χ. κύτταρα ωοθηκών κινεζικού κρικητού (CHO), κύτταρα πνεύμονα κινέζικου κρικητού V79, κύτταρα πνεύμονα κινεζικού κρικητού (CHL)/IU, TK6) ή πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος ανθρώπου ή άλλων θηλαστικών (7). Η επιλογή των χρησιμοποιούμενων κυτταρικών σειρών θα πρέπει να αιτιολογείται επιστημονικά. Για λόγους καλής μεταχείρισης των ζώων, όταν χρησιμοποιούνται πρωτογενή κύτταρα, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο χρησιμοποίησης, εφόσον είναι εφικτή, ανθρώπινων πρωτογενών κυττάρων που έχουν ληφθεί σύμφωνα με τις σχετικές δεοντολογικές αρχές και κανονιστικές ρυθμίσεις. Τα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος θα πρέπει να λαμβάνονται από νεαρά άτομα (ηλικίας περίπου 18-35 ετών), που δεν καπνίζουν, δεν πάσχουν από γνωστή νόσο και δεν έχουν εκτεθεί πρόσφατα σε γονιδιοτοξικούς παράγοντες (π.χ. χημικές ουσίες, ιοντίζουσες ακτινοβολίες) σε επίπεδα τα οποία θα μπορούσαν να αυξήσουν την επίπτωση (incidence) υποβάθρου των χρωμοσωμικών εκτροπών. Με τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται χαμηλή και σταθερή επίπτωση υποβάθρου των χρωμοσωμικών εκτροπών. Η γραμμή βάσης της επίπτωσης των χρωμοσωμικών εκτροπών αυξάνεται με την ηλικία, τάση που είναι εντονότερη στις γυναίκες απ' ό,τι στους άνδρες (17) (18). Εάν συνδυάζονται προς χρήση κύτταρα από περισσότερους του ενός δότες, θα πρέπει να προσδιορίζεται ο αριθμός των δοτών. Είναι αναγκαίο να αποδεικνύεται ότι τα κύτταρα έχουν διαιρεθεί κατά το διάστημα που μεσολαβεί από την έναρξη της μεταχείρισης με την υπό δοκιμή χημική ουσία μέχρι τη δειγματοληψία τους. Οι κυτταροκαλλιέργειες διατηρούνται σε εκθετική φάση ανάπτυξης κυττάρων (κυτταρικές σειρές) ή διεγείρονται για να διαιρεθούν (πρωτογενείς καλλιέργειες λεμφοκυττάρων), ώστε τα κύτταρα να εκτίθενται σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου, δεδομένου ότι μπορεί να μην είναι γνωστή η ευαισθησία κάθε σταδίου στις υπό δοκιμή χημικές ουσίες. Κατά κανόνα, τα πρωτογενή κύτταρα που χρειάζονται διέγερση από μιτογόνους παράγοντες για τη διαίρεσή τους δεν είναι πλέον συγχρονισμένα κατά τη διάρκεια της έκθεσης στην υπό δοκιμή χημική ουσία (π.χ. ανθρώπινα λεμφοκύτταρα μετά από 48ωρη διέγερση με μιτογόνο). Η χρήση συγχρονισμένων κυττάρων κατά τη διάρκεια της μεταχείρισης δεν συνιστάται, αλλά μπορεί να γίνει δεκτή εφόσον αυτό αιτιολογείται.

Θρεπτικά μέσα και συνθήκες καλλιέργειας

Για τη διατήρηση των καλλιεργειών θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλο θρεπτικό μέσο και κατάλληλες συνθήκες επώασης (δοχεία καλλιέργειας, ατμόσφαιρα με ύγρανση και 5 % CO2, κατά περίπτωση, θερμοκρασία επώασης 37 °C). Θα πρέπει να ελέγχονται τακτικά στις κυτταρικές σειρές η σταθερότητα του χαρακτηριστικού χρωμοσωμικού αριθμού και η απουσία μόλυνσης από μυκόπλασμα (7) (19) και τα κύτταρα δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται εάν έχουν μολυνθεί ή έχει μεταβληθεί ο χαρακτηριστικός χρωμοσωμικός αριθμός. Η φυσιολογική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου των κυτταρικών σειρών ή πρωτογενών καλλιεργειών που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο δοκιμών θα πρέπει να καθορίζεται και να είναι συνεπής με τα δημοσιευμένα χαρακτηριστικά των κυττάρων (20).

Παρασκευή των καλλιεργειών

Κυτταρικές σειρές: τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται από αποθεματικές καλλιέργειες, εμβολιαζόμενα σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας σε πυκνότητα τέτοια ώστε τα υπό μορφή εναιωρήματος ή μονοστιβάδας κύτταρα να εξακολουθούν να αναπτύσσονται εκθετικά μέχρι τη συλλογή τους (π.χ. θα πρέπει να αποφεύγεται η συρροή κυττάρων που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδες).

Λεμφοκύτταρα: ολικό αίμα με αντιπηκτικό (π.χ. ηπαρίνη) ή διαχωρισμένα λεμφοκύτταρα καλλιεργούνται (π.χ. για 48 ώρες προκειμένου για ανθρώπινα λεμφοκύτταρα) παρουσία μιτογόνου [π.χ. φυτοαιμοσυγκολλητίνη (PHA) προκειμένου για ανθρώπινα λεμφοκύτταρα], με σκοπό την επαγωγή κυτταρικής διαίρεσης πριν από την έκθεση στην υπό δοκιμή χημική ουσία.

Μεταβολική ενεργοποίηση

Όταν χρησιμοποιούνται κύτταρα με ανεπαρκή ενδογενή μεταβολική ικανότητα, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και εξωγενή συστήματα μεταβολισμού. Το ευρύτερα χρησιμοποιούμενο σύστημα, που συνιστάται ως προεπιλογή, εκτός αντίθετης αιτιολόγησης, είναι ένα μεταμιτοχονδριακό κλάσμα εμπλουτισμένο με συμπαράγοντα (S9), το οποίο παρασκευάζεται από ήπαρ τρωκτικών (κατά κανόνα επιμύων), κατεργασμένο με παράγοντα ενζυμικής επαγωγής, όπως το Aroclor 1254 (21) (22) (23) ή ο συνδυασμός φαινοβαρβιτάλης και β-ναφθοφλαβόνης (24) (25) (26) (27) (28) (29). Ο συνδυασμός αυτός δεν αντιβαίνει στη Σύμβαση της Στοκχόλμης για τους έμμονους οργανικούς ρύπους (30) και έχει αποδειχθεί εξίσου αποτελεσματικός με το Aroclor 1254 στην επαγωγή οξειδασών μεικτής λειτουργίας (24) (25) (26) (28). Το κλάσμα S9 χρησιμοποιείται συνήθως σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 1 έως 2 % (κ.ό.), αλλά οι οποίες επιτρέπεται να αυξηθούν σε 10 % (κ.ό.) στο τελικό δοκιμαστικό θρεπτικό μέσο. Η χρήση προϊόντων που μειώνουν τον μιτωτικό δείκτη, και ιδίως προϊόντων που συμπλοκοποιούν το ασβέστιο (31), θα πρέπει να αποφεύγεται κατά τη μεταχείριση. Η επιλογή του τύπου και της συγκέντρωσης του χρησιμοποιούμενου εξωγενούς συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης ή μεταβολικού επαγωγέα μπορεί να επηρεαστεί από την κατηγορία των υπό δοκιμή χημικών ουσιών.

Παρασκεύασμα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας

Οι στερεές υπό δοκιμή χημικές ουσίες θα πρέπει να διαλύονται σε κατάλληλους διαλύτες και να αραιώνονται, εφόσον χρειάζεται, πριν από τη μεταχείριση των κυττάρων (βλ. παράγραφο 23). Οι υγρές υπό δοκιμή χημικές ουσίες επιτρέπεται να προστίθενται κατευθείαν στο σύστημα δοκιμής και/ή να αραιώνονται πριν από τη μεταχείριση του συστήματος δοκιμής. Οι αέριες ή πτητικές υπό δοκιμή χημικές ουσίες θα πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή με κατάλληλες τροποποιήσεις των τυποποιημένων πρωτοκόλλων, π.χ. μεταχείριση σε σφραγισμένα δοχεία καλλιέργειας (32) (33) (34). Τα παρασκευάσματα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας θα πρέπει να ετοιμάζονται ακριβώς πριν από τη μεταχείριση, εκτός αν τα στοιχεία σχετικά με τη σταθερότητα της ουσίας αποδεικνύουν ότι είναι αποδεκτή η φύλαξη.

Συνθήκες δοκιμής

Διαλύτες

Θα πρέπει να επιλέγεται διαλύτης που να βελτιστοποιεί τη διαλυτότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, χωρίς να επηρεάζει δυσμενώς τη διεξαγωγή της δοκιμής, π.χ. μεταβάλλοντας την ανάπτυξη των κυττάρων, πλήττοντας την ακεραιότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, αντιδρώντας με τα δοχεία καλλιέργειας ή αποδυναμώνοντας το σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης. Συνιστάται να εξετάζεται πρώτα, στο μέτρο του δυνατού, αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί υδατικός διαλύτης (ή θρεπτικό μέσο καλλιέργειας). Καθιερωμένοι διαλύτες είναι, για παράδειγμα, το νερό και το διμεθυλοσουλφοξείδιο. Η συγκέντρωση του διαλύτη στο τελικό θρεπτικό μέσο μεταχείρισης δεν θα πρέπει να υπερβαίνει γενικά το 1 % (κ.ό.), προκειμένου για οργανικούς διαλύτες, και το 10 % (κ.ό.) στην περίπτωση των υδατικών διαλυτών (αλατούχο διάλυμα ή νερό). Εάν χρησιμοποιούνται μη καθιερωμένοι διαλύτες (π.χ. αιθανόλη ή ακετόνη), η χρήση τους θα πρέπει να τεκμηριώνεται με στοιχεία που αποδεικνύουν τη συμβατότητά τους με τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες και με το σύστημα δοκιμής, καθώς και την απουσία γενετικής τοξικότητας στη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση. Εάν δεν υπάρχουν αυτά τα στοιχεία, είναι σημαντικό να συμπεριλαμβάνονται μάρτυρες που δεν υποβάλλονται σε μεταχείριση (βλ. προσάρτημα 1) για να αποδεικνύεται ότι ο επιλεγμένος διαλύτης δεν επάγει επιβλαβείς ή κλαστογόνες επιδράσεις.

Μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταροτοξικότητας και επιλογή των συγκεντρώσεων μεταχείρισης

Κατά τον καθορισμό της υψηλότερης συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας θα πρέπει να αποφεύγονται οι συγκεντρώσεις που μπορούν να οδηγήσουν σε τεχνητά θετικές αποκρίσεις, όπως εκείνες που προκαλούν υπέρμετρη κυτταροτοξικότητα (βλ. παράγραφο 22), καθίζηση στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας (βλ. παράγραφο 23) ή έντονες μεταβολές του pH ή της ωσμωμοριακότητας (βλ. παράγραφο 5). Εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία προκαλεί έντονη μεταβολή του pH του θρεπτικού μέσου κατά την προσθήκη της, το pH μπορεί να ρυθμίζεται με προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος στο τελικό θρεπτικό μέσο δοκιμής, με σκοπό να αποφεύγονται τα τεχνητά θετικά αποτελέσματα και να διατηρούνται κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας.

Μετράται ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός για να εξασφαλίζεται ότι επαρκής αριθμός κυττάρων που υποβάλλονται σε μεταχείριση έχουν φθάσει στο στάδιο της μίτωσης κατά τη διάρκεια της δοκιμής και ότι οι μεταχειρίσεις διεξάγονται σε κατάλληλα επίπεδα κυτταροτοξικότητας (βλ. παραγράφους 18 και 22). Η κυτταροτοξικότητα θα πρέπει να προσδιορίζεται με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση στο κύριο πείραμα, με τη χρήση κατάλληλης ένδειξης θανάτου και ανάπτυξης των κυττάρων. Μολονότι η αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας σε αρχική δοκιμή μπορεί να είναι χρήσιμη για τον ακριβέστερο καθορισμό των συγκεντρώσεων που θα χρησιμοποιηθούν στο κύριο πείραμα, δεν είναι υποχρεωτική η διεξαγωγή αρχικής δοκιμής. Η διεξαγωγή αρχικής δοκιμής δεν θα πρέπει να αντικαθιστά τη μέτρηση της κυτταροτοξικότητας στο κύριο πείραμα.

Ο σχετικός διπλασιασμός του πληθυσμού (Relative Population Doubling/RPD) και η σχετική αύξηση του αριθμού κυττάρων (Relative Increase in Cell Count/RICC) είναι κατάλληλες μέθοδοι εκτίμησης της κυτταροτοξικότητας σε κυτταρογενετικές δοκιμές (13) (15) (35) (36) (55) (βλ. μαθηματικούς τύπους στο προσάρτημα 2). Σε περίπτωση μακροχρόνιας μεταχείρισης και εάν οι χρόνοι δειγματοληψιών μετά την έναρξη της μεταχείρισης είναι μεγαλύτεροι από τη φυσιολογική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, πολλαπλασιαζόμενη επί 1,5 (δηλ. συνολικά υπερτριπλάσιοι της διάρκειας του κυτταρικού κύκλου), η κυτταροτοξικότητα ενδέχεται να υποεκτιμηθεί με τον RPD (37). Υπό αυτές τις συνθήκες, η RICC θα αποτελούσε ενδεχομένως καλύτερο μέσο μέτρησης, ενώ η αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας μετά από χρονικό διάστημα ίσο με το γινόμενο της φυσιολογικής διάρκεια του κυτταρικού κύκλου επί 1,5 θα παρείχε χρήσιμη εκτίμηση με τη βοήθεια του RPD.

Για τα λεμφοκύτταρα σε πρωτογενείς καλλιέργειες, ο μιτωτικός δείκτης (MI) είναι μέτρο των κυτταροτοξικών/κυτταροστατικών επιδράσεων, αλλά επηρεάζεται από τον χρόνο μέτρησής του μετά την αγωγή, τον χρησιμοποιούμενο μιτογόνο παράγοντα και την πιθανή διατάραξη του κυτταρικού κύκλου. Ωστόσο, ο MI είναι αποδεκτός, επειδή άλλες μετρήσεις της κυτταροτοξικότητας μπορεί να είναι περίπλοκες και μη πρακτικές και να μην εφαρμόζονται στον στοχευόμενο πληθυσμό λεμφοκυττάρων που αναπτύσσονται αποκρινόμενα σε διέγερση από τη PHA.

Ενώ η RICC και ο RPD στην περίπτωση των κυτταρικών σειρών και ο MI για τις πρωτογενείς καλλιέργειες λεμφοκυττάρων είναι οι συνιστώμενες παράμετροι κυτταροτοξικότητας, άλλοι δείκτες (π.χ. ακεραιότητα των κυττάρων, απόπτωση, νέκρωση, κυτταρικός κύκλος) θα μπορούσαν να παράσχουν χρήσιμες επιπλέον πληροφορίες.

Θα πρέπει να αξιολογούνται τουλάχιστον τρεις συγκεντρώσεις δοκιμής (χωρίς τον διαλύτη και τους θετικούς μάρτυρες) που πληρούν τα κριτήρια αποδοχής (ενδεδειγμένη κυτταροτοξικότητα, αριθμός κυττάρων, κ.λπ.). Ανεξάρτητα από τα είδη κυττάρων (κυτταρικές σειρές ή πρωτογενείς καλλιέργειες λεμφοκυττάρων), μπορούν να χρησιμοποιούνται σε κάθε συγκέντρωση δοκιμής είτε πολλαπλές πανομοιότυπες καλλιέργειες (επαναλήψεις) είτε μονές καλλιέργειες. Αν και συνιστάται η χρήση διπλών καλλιεργειών, οι μονές καλλιέργειες είναι επίσης αποδεκτές, υπό τον όρο ότι καταμετράται ο ίδιος συνολικός αριθμός κυττάρων, ανεξαρτήτως του αν πρόκειται για μονές ή για διπλές καλλιέργειες. Η χρήση μονών καλλιεργειών ενδείκνυται κατ' εξοχήν όταν αξιολογούνται περισσότερες από 3 συγκεντρώσεις (βλ. παράγραφο 31). Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τις ανεξάρτητες επαναλήψεις σε δεδομένη συγκέντρωση μπορούν να συνενώνονται για την ανάλυση δεδομένων (38). Για τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες με ελάχιστη ή μηδενική κυτταροτοξικότητα, κατάλληλες είναι συνήθως οι συγκεντρώσεις που απέχουν μεταξύ τους κατά παράγοντα ίσο με 2 ή 3 περίπου. Σε περίπτωση κυτταροτοξικότητας, οι επιλεγόμενες συγκεντρώσεις δοκιμής θα πρέπει να καλύπτουν ένα εύρος τιμών κυμαινόμενο από τη συγκέντρωση που προκαλεί την κυτταροτοξικότητα η οποία περιγράφεται στην παράγραφο 22 μέχρι τις συγκεντρώσεις στις οποίες παρατηρείται μέτρια και ελάχιστη ή μηδενική κυτταροτοξικότητα. Πολλές υπό δοκιμή χημικές ουσίες παρουσιάζουν καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης με μεγάλη κλίση και, για να ληφθούν δεδομένα σε χαμηλή ή μέτρια κυτταροτοξικότητα ή για να μελετηθεί λεπτομερώς η σχέση δόσης-απόκρισης, είναι αναγκαία η χρήση συγκεντρώσεων με μικρότερα διαστήματα μεταξύ τους και/ή περισσότερων από τρεις συγκεντρώσεις (μονές καλλιέργειες ή επαναλήψεις), ιδίως σε περιπτώσεις όπου απαιτείται επανάληψη του πειράματος (βλ. παράγραφο 47).

Εάν η μέγιστη συγκέντρωση βασίζεται στην κυτταροτοξικότητα, η υψηλότερη συγκέντρωση θα πρέπει να αποσκοπεί στην επίτευξη κυτταροτοξικότητας 55 ± 5 %, με τη χρήση των συνιστώμενων παραμέτρων κυτταροτοξικότητας (δηλ. μείωση της RICC ή του RPD στην περίπτωση των κυτταρικών σειρών και μείωση του MI προκειμένου για πρωτογενείς καλλιέργειες λεμφοκυττάρων σε 45 ± 5 % του παράλληλου αρνητικού μάρτυρα). Τα θετικά αποτελέσματα που προκύπτουν μόνο στο ανώτερο άκρο του εν λόγω εύρους κυτταροτοξικότητας 55 ± 5 % θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή (13).

Για δυσδιάλυτες υπό δοκιμή χημικές ουσίες που δεν είναι κυτταροτοξικές σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από τη συγκέντρωση μέγιστης διαλυτότητας, η υψηλότερη αναλυόμενη συγκέντρωση θα πρέπει να επιφέρει θολερότητα ή ίζημα ορατό με γυμνό οφθαλμό ή με τη βοήθεια ανεστραμμένου μικροσκοπίου στο τέλος της μεταχείρισης με την υπό δοκιμή χημική ουσία. Ακόμη και αν εμφανίζεται κυτταροτοξικότητα σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από τη συγκέντρωση μέγιστης διαλυτότητας, συνιστάται να διεξάγεται η δοκιμή σε μία μόνο συγκέντρωση που επιφέρει θολερότητα ή ορατό ίζημα, διότι μπορεί να προκύψουν τεχνητές επιδράσεις από το ίζημα. Στη συγκέντρωση που επιφέρει ίζημα, θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να διασφαλίζεται ότι το τελευταίο δεν παρεμποδίζει τη διεξαγωγή της δοκιμής (π.χ. τη χρώση ή την καταμέτρηση). Ο προσδιορισμός της διαλυτότητας στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας πριν από το πείραμα μπορεί να είναι χρήσιμος.

Εάν δεν παρατηρηθεί ίζημα ούτε περιοριστική κυτταροτοξικότητα, η ανώτατη συγκέντρωση δοκιμής θα πρέπει να αντιστοιχεί στη μικρότερη από τις τιμές 10 mM, 2 mg/ml ή 2 μl/ml (39) (40) (41). Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία δεν έχει καθορισμένη σύνθεση, π.χ. ουσίες άγνωστης ή μεταβλητής σύνθεσης, πολύπλοκα προϊόντα αντιδράσεων ή βιολογικά υλικά (UVCB) (42), εκχυλίσματα από το περιβάλλον κλπ., η ανώτατη συγκέντρωση θα πρέπει ενδεχομένως να είναι υψηλότερη (π.χ. 5 mg/ml), ελλείψει επαρκούς κυτταροτοξικότητας, προκειμένου να αυξηθεί η συγκέντρωση του κάθε συστατικού. Επισημαίνεται, ωστόσο, ότι οι απαιτήσεις αυτές μπορεί να διαφέρουν για τα φαρμακευτικά προϊόντα για τον άνθρωπο (43).

Μάρτυρες

Σε κάθε χρόνο συλλογής, θα πρέπει να συμπεριλαμβάνονται παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες (βλ. παράγραφο 15), αποτελούμενοι μόνο από τον διαλύτη στο θρεπτικό μέσο της μεταχείρισης και υποβαλλόμενοι στην ίδια μεταχείριση όπως και οι καλλιέργειες.

Απαιτούνται παράλληλοι θετικοί μάρτυρες για να αποδεικνύεται αφενός η ικανότητα του εργαστηρίου να αναγνωρίζει τα κλαστογόνα υπό τις συνθήκες του χρησιμοποιούμενου πρωτοκόλλου δοκιμής και, αφετέρου, η αποτελεσματικότητα του εξωγενούς συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης, κατά περίπτωση. Παραδείγματα θετικών μαρτύρων παρέχονται κατωτέρω στον πίνακα 1. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικοί θετικοί χημικοί μάρτυρες, εφόσον η χρήση τους αιτιολογείται. Επειδή οι δοκιμές γενετικής τοξικότητας in vitro σε κύτταρα θηλαστικών είναι επαρκώς τυποποιημένες, η χρήση θετικών μαρτύρων μπορεί να περιορίζεται σε κλαστογόνα που απαιτούν μεταβολική ενεργοποίηση. Αυτή η απόκριση ενός μόνο θετικού μάρτυρα καταδεικνύει τόσο τη δραστικότητα του συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης όσο και την αποκρισιμότητα του συστήματος δοκιμής, υπό την προϋπόθεση ότι εκτελείται ταυτόχρονα με τη δοκιμή χωρίς ενεργοποίηση και επί την ίδια διάρκεια μεταχείρισης. Ωστόσο, σε περίπτωση μακροχρόνιας μεταχείρισης (χωρίς S9) θα πρέπει να προβλέπεται χωριστός θετικός μάρτυρας, διότι η διάρκεια της μεταχείρισης διαφέρει από αυτήν της δοκιμής με μεταβολική ενεργοποίηση. Κάθε θετικός μάρτυρας θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε μία ή περισσότερες συγκεντρώσεις που αναμένεται να έχουν ως αποτέλεσμα αναπαραγώγιμη και ανιχνεύσιμη αύξηση σε σχέση με την τιμή υποβάθρου, για να καταδεικνύεται η ευαισθησία του συστήματος δοκιμής (δηλ. σαφείς επιδράσεις, οι οποίες όμως δεν αποκαλύπτουν αμέσως την ταυτότητα των κωδικοποιημένων αντικειμενοφόρων πλακών στον εξεταστή), και η απόκριση δεν θα πρέπει να διακυβεύεται εξαιτίας κυτταροτοξικότητας που υπερβαίνει τα όρια που προβλέπονται στη μέθοδο δοκιμών.

Πίνακας 1

Συνιστώμενες χημικές ουσίες αναφοράς για την αξιολόγηση της τεχνικής ικανότητας του εργαστηρίου και την επιλογή θετικών μαρτύρων

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Μεταχείριση με την υπό δοκιμή χημική ουσία

Πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα υποβάλλονται σε μεταχείριση με την υπό δοκιμή χημική ουσία με και χωρίς σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης.

Χρόνος συλλογής καλλιέργειας

Για την ενδελεχή αξιολόγηση που θα χρειαστεί προκειμένου να αποφασιστεί ότι η έκβαση της δοκιμής είναι αρνητική, θα πρέπει να τηρούνται και οι τρεις ακόλουθες πειραματικές συνθήκες σε βραχυχρόνια μεταχείριση με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση και σε μακροχρόνια μεταχείριση χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση (βλ. παραγράφους 43, 44 και 45):

Σε περίπτωση που οποιαδήποτε από τις ανωτέρω πειραματικές συνθήκες οδηγεί σε θετική απόκριση, μπορεί να μη χρειάζεται να διερευνηθεί άλλο σχήμα μεταχείρισης.

Παρασκευάσματα χρωμοσωμάτων

Οι κυτταροκαλλιέργειες υποβάλλονται σε κατεργασία με Colcemid ή κολχικίνη, συνήθως για μία έως τρεις ώρες πριν από τη συλλογή. Κάθε κυτταροκαλλιέργεια συλλέγεται και υποβάλλεται χωριστά σε κατεργασία για την προετοιμασία των παρασκευασμάτων χρωμοσωμάτων. Η προετοιμασία των παρασκευασμάτων χρωμοσωμάτων περιλαμβάνει κατεργασία των κυττάρων με υπότονο διάλυμα, μονιμοποίηση και χρώση. Στο τέλος της μεταχείρισης διάρκειας 3-6 ωρών είναι πιθανή η παρουσία μιτωτικών κυττάρων (αναγνωρίζονται από το στρογγυλό σχήμα τους και από την απόσπασή τους από την επιφάνεια) στις μονοστιβάδες. Επειδή τα εν λόγω μιτωτικά κύτταρα αποσπώνται εύκολα, είναι πιθανή η απώλειά τους κατά την απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου που περιέχει την υπό δοκιμή χημική ουσία. Εάν υπάρχουν στοιχεία που υποδεικνύουν σημαντική αύξηση του αριθμού των μιτωτικών κυττάρων σε σχέση με τους μάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή διακοπή της μίτωσης, τα κύτταρα θα πρέπει να συλλέγονται με φυγοκέντρηση και να επανεισάγονται στις καλλιέργειες, ώστε να αποφεύγεται η απώλεια κυττάρων που υφίστανται μίτωση και αντιμετωπίζουν κίνδυνο χρωμοσωμικής εκτροπής κατά τον χρόνο της συλλογής.

Ανάλυση

Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες, συμπεριλαμβανομένων των πλακών των θετικών και αρνητικών μαρτύρων, θα πρέπει να κωδικοποιούνται χωριστά, πριν από τη μικροσκοπική εξέταση για τον εντοπισμό χρωμοσωμικών εκτροπών. Επειδή οι διαδικασίες μονιμοποίησης συνεπάγονται συχνά απώλεια χρωμοσωμάτων σε ένα ποσοστό των μεταφασικών κυττάρων, τα καταμετρούμενα κύτταρα θα πρέπει να περιέχουν αριθμό κεντρομεριδίων ίσο με τον χαρακτηριστικό αριθμό ± 2.

Για να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία είναι σαφώς αρνητική, θα πρέπει να καταμετρώνται τουλάχιστον 300 καλώς επιστρωμένα μεταφασικά κύτταρα ανά συγκέντρωση και ανά μάρτυρα (βλ. παράγραφο 45). Το 300 κύτταρα θα πρέπει να κατανέμονται ισομερώς μεταξύ των επαναλήψεων, όταν χρησιμοποιούνται καλλιέργειες επανάληψης. Όταν χρησιμοποιούνται μονές καλλιέργειες ανά συγκέντρωση (βλ. παράγραφο 21), θα πρέπει να καταμετρώνται τουλάχιστον 300 καλώς επιστρωμένα μεταφασικά κύτταρα από κάθε μονή καλλιέργεια. Η καταμέτρηση 300 κυττάρων έχει το πλεονέκτημα ότι αυξάνει τη στατιστική ισχύ της δοκιμής και επιπλέον σπάνια παρατηρούνται μηδενικές τιμές (εκτιμάται ότι το ποσοστό τους είναι μόλις 5 %) (44). Ο αριθμός των καταμετρούμενων μεταφασικών κυττάρων μπορεί να μειωθεί εάν παρατηρηθεί υψηλός αριθμός κυττάρων με χρωμοσωμικές εκτροπές και η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς θετική.

Θα πρέπει να καταμετρώνται τα κύτταρα με δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές, με και χωρίς τα χάσματα. Οι ρήξεις και τα χάσματα ορίζονται στο προσάρτημα 1 σύμφωνα με τις βιβλιογραφικές παραπομπές (45) (46). Οι χρωματιδικού και οι χρωμοσωμικού τύπου εκτροπές θα πρέπει να καταγράφονται χωριστά και να ταξινομούνται σε υποκατηγορίες (ρήξεις, ανταλλαγές). Οι διαδικασίες που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο θα πρέπει να διασφαλίζουν τη διενέργεια της ανάλυσης χρωμοσωμικών εκτροπών από επαρκώς καταρτισμένους εξεταστές και, κατά περίπτωση, την αξιολόγηση της ανάλυσης από ομότιμους κριτές.

Αν και σκοπός της δοκιμής είναι ο εντοπισμός δομικών χρωμοσωμικών εκτροπών, είναι σημαντικό να καταγράφονται οι συχνότητες πολυπλοειδίας και ενδοαναδιπλασιασμού, εφόσον παρατηρηθούν. (βλέπε σημείο 2).

Τεχνική ικανότητα του εργαστηρίου

Για να εξασφαλίσει επαρκή εμπειρία με τη μέθοδο δοκιμών πριν τη χρησιμοποιήσει για δοκιμές ρουτίνας, το εργαστήριο θα πρέπει να έχει εκτελέσει σειρά πειραμάτων με θετικές χημικές ουσίες αναφοράς που δρουν μέσω διαφορετικών μηχανισμών, καθώς και με διάφορους αρνητικούς μάρτυρες (με τη χρήση διαφόρων διαλυτών/φορέων). Οι αποκρίσεις των εν λόγω θετικών και αρνητικών μαρτύρων θα πρέπει να συμφωνούν με τη βιβλιογραφία. Αυτό δεν ισχύει για τα εργαστήρια που έχουν πείρα, δηλ. διαθέτουν βάση ιστορικών δεδομένων, όπως ορίζεται στην παράγραφο 37.

Θα πρέπει να διερευνάται μια σειρά επιλεγμένων χημικών ουσιών που αποτελούν θετικούς μάρτυρες (βλ. πίνακα 1 στην παράγραφο 26), με βραχυχρόνια και μακροχρόνια μεταχείριση χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση, καθώς και με βραχυχρόνια μεταχείριση με μεταβολική ενεργοποίηση, για να καταδεικνύεται η τεχνική ικανότητα ανίχνευσης κλαστογόνων χημικών ουσιών και να διαπιστώνεται η αποτελεσματικότητα του συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Θα πρέπει να επιλέγεται ένα εύρος συγκεντρώσεων των επιλεγμένων χημικών ουσιών που να επιφέρουν αναπαραγώγιμες και σχετιζόμενες με τη συγκέντρωση αυξήσεις σε σχέση με τις τιμές υποβάθρου, για να αποδεικνύονται η ευαισθησία και το δυναμικό εύρος του συστήματος δοκιμής.

Ιστορικά δεδομένα για μάρτυρες

Το εργαστήριο θα πρέπει να καθορίζει:

Κατά την αρχική συγκέντρωση δεδομένων για ιστορική κατανομή όσον αφορά τους αρνητικούς μάρτυρες, οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει να συμφωνούν με τα δημοσιευμένα δεδομένα για μάρτυρες, εφόσον υπάρχουν. Καθώς θα προστίθενται περισσότερα πειραματικά δεδομένα στην κατανομή των μαρτύρων, οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει, στην ιδανική περίπτωση, να βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 % της εν λόγω κατανομής (44) (47). Η βάση ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για αρνητικούς μάρτυρες θα πρέπει αρχικά να δημιουργείται με δεδομένα από τουλάχιστον 10 πειράματα, αν και είναι προτιμότερο να αποτελείται από τουλάχιστον 20 πειράματα που έχουν εκτελεστεί σε συγκρίσιμες πειραματικές συνθήκες. Τα εργαστήρια θα πρέπει να χρησιμοποιούν μεθόδους ποιοτικού ελέγχου, όπως διαγράμματα ελέγχου [π.χ. διαγράμματα C ή X-bar (48)], για να προσδιορίζουν τη μεταβλητότητα των δεδομένων τους που αφορούν τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες και να αποδεικνύουν ότι έχουν «υπό έλεγχο» τη μεθοδολογία (44). Περαιτέρω συστάσεις για τον τρόπο δημιουργίας και χρήσης των ιστορικών δεδομένων (δηλ. κριτήρια προσθήκης στοιχείων στα ιστορικά δεδομένα και αποκλεισμού στοιχείων από αυτά, καθώς και κριτήρια αποδοχής συγκεκριμένου πειράματος) έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (47).

Κάθε αλλαγή του πειραματικού πρωτοκόλλου θα πρέπει να μελετάται υπό το πρίσμα της συμφωνίας της με τις υφιστάμενες βάσεις ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για μάρτυρες. Τυχόν σημαντικές ανακολουθίες θα πρέπει να έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία νέας βάσης ιστορικών δεδομένων για μάρτυρες.

Τα δεδομένα για αρνητικούς μάρτυρες θα πρέπει να είναι η επίπτωση των κυττάρων με χρωμοσωμικές εκτροπές από μονές καλλιέργειες ή από το άθροισμα των καλλιεργειών επανάληψης, όπως περιγράφεται στην παράγραφο 21. Οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει, στην ιδανική περίπτωση, να βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 % της κατανομής της βάσης ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για αρνητικούς μάρτυρες (44) (47). Όταν τα δεδομένα για παράλληλους αρνητικούς μάρτυρες δεν βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 %, μπορεί να είναι αποδεκτή η προσθήκη τους στην ιστορική κατανομή μαρτύρων, εφόσον τα εν λόγω δεδομένα δεν είναι ακραίες έκτοπες τιμές και υπάρχουν στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το σύστημα δοκιμής είναι «υπό έλεγχο» (βλ. παράγραφο 37) και ότι δεν πρόκειται για τεχνικό ή ανθρώπινο σφάλμα.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Παρουσίαση των αποτελεσμάτων

Το ποσοστό κυττάρων με μία ή περισσότερες δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές θα πρέπει να αξιολογείται. Οι χρωματιδικού και οι χρωμοσωμικού τύπου εκτροπές, ταξινομημένες σε υποκατηγορίες (ρήξεις, ανταλλαγές), θα πρέπει να καταγράφονται χωριστά με τον αριθμό και τη συχνότητα με τα οποία εμφανίζονται στις πειραματικές καλλιέργειες και στις καλλιέργειες-μάρτυρες. Τα χάσματα καταγράφονται και αναφέρονται χωριστά, αλλά δεν περιλαμβάνονται στη συνολική συχνότητα εκτροπών. Αναφέρεται το ποσοστό πολυπλοειδίας και/ή ενδοαναδιπλασιασμένων κυττάρων, εφόσον παρατηρούνται.

Θα πρέπει επίσης να καταγράφονται οι παράλληλες μετρήσεις κυτταροτοξικότητας για όλες τις υποβληθείσες σε μεταχείριση καλλιέργειες, καθώς και για τις καλλιέργειες που ήταν αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες στα κύρια πειράματα προσδιορισμού εκτροπών.

Θα πρέπει να παρέχονται δεδομένα για κάθε καλλιέργεια. Επιπλέον, όλα τα δεδομένα θα πρέπει να συγκεφαλαιώνονται σε μορφή πίνακα.

Κριτήρια αποδοχής

Η αποδοχή μιας δοκιμής βασίζεται στα ακόλουθα κριτήρια:

Αξιολόγηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων

Υπό την προϋπόθεση ότι πληρούνται όλα τα κριτήρια αποδοχής, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς θετική εάν, σε οποιαδήποτε από τις πειραματικές συνθήκες που εξετάστηκαν (βλ. παράγραφο 28):

Όταν πληρούνται όλα αυτά τα κριτήρια, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται ικανή να επάγει χρωμοσωμικές εκτροπές σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών σε αυτό το σύστημα δοκιμής. Συστάσεις για τις πλέον κατάλληλες στατιστικές μεθόδους έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (49) (50) (51).

Υπό την προϋπόθεση ότι πληρούνται όλα τα κριτήρια αποδοχής, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς αρνητική εάν, σε όλες τις πειραματικές συνθήκες που εξετάστηκαν (βλ. παράγραφο 28):

Θεωρείται τότε ότι η υπό δοκιμή ουσία δεν είναι ικανή να επάγει χρωμοσωμικές εκτροπές σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών σε αυτό το σύστημα δοκιμής.

Δεν απαιτείται επαλήθευση των σαφώς θετικών ή αρνητικών αποκρίσεων.

Όταν η απόκριση δεν είναι ούτε σαφώς αρνητική ούτε σαφώς θετική, όπως περιγράφεται ανωτέρω, ή για να διαπιστωθεί η βιολογική σημασία ενός αποτελέσματος, τα δεδομένα θα πρέπει να αξιολογούνται με βάση την κρίση των ειδικών και/ή περαιτέρω διερεύνηση. Η καταμέτρηση επιπλέον κυττάρων (κατά περίπτωση) ή η επανάληψη του πειράματος, ενδεχομένως με τη χρήση διαφορετικών πειραματικών συνθηκών [π.χ. διαστήματα μεταξύ των συγκεντρώσεων, άλλες συνθήκες μεταβολικής ενεργοποίησης (δηλ. συγκέντρωση ή προέλευση του S9)] θα μπορούσε να είναι χρήσιμη.

Σε σπάνιες περιπτώσεις, ακόμη και μετά από περαιτέρω διερεύνηση, το σύνολο δεδομένων δεν επιτρέπει την εξαγωγή συμπεράσματος για θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα και, κατά συνέπεια, η απόκριση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας κρίνεται διφορούμενη.

Η αύξηση του αριθμού πολυπλοειδών κυττάρων μπορεί να σημαίνει ότι οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες είναι δυνάμει ικανές να αναστέλλουν τις μιτωτικές διεργασίες και να επάγουν αριθμητικές χρωμοσωμικές εκτροπές (52). Η αύξηση του αριθμού κυττάρων με ενδοαναδιπλασιασμένα χρωμοσώματα μπορεί να σημαίνει ότι οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες είναι δυνάμει ικανές να αναστέλλουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (53) (54) (βλ. παράγραφο 2). Επομένως, η επίπτωση των πολυπλοειδών κυττάρων και των κυττάρων με ενδοαναδιπλασιασμένα χρωμοσώματα θα πρέπει να καταγράφεται χωριστά.

Έκθεση δοκιμής

Στην έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνονται τα ακόλουθα στοιχεία:

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(4)

Στο μέρος B, το Κεφάλαιο Β.11 αντικαθίσταται από το ακόλουθο:

«Β.11   Δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών σε μυελό των οστών θηλαστικών

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών 475 του ΟΟΣΑ (2016). Αποτελεί μέρος μιας σειράς μεθόδων δοκιμών γενετικής τοξικολογίας. Έχει συνταχθεί ένα έγγραφο του ΟΟΣΑ με συνοπτικές πληροφορίες για τις δοκιμές γενετικής τοξικολογίας και μια επισκόπηση των πρόσφατων αλλαγών που έγιναν σε αυτές τις κατευθυντήριες γραμμές δοκιμών (1).

Η δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών in vivo σε μυελό των οστών θηλαστικών είναι ιδιαίτερα σημαντική για την αξιολόγηση της γονιδιοτοξικότητας, διότι οι παράγοντες των διεργασιών μεταβολισμού, φαρμακοκινητικής και επιδιόρθωσης του DΝΑ in vivo, αν και μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των ειδών, είναι ενεργοί και συμβάλλουν στις αποκρίσεις. Οι προσδιορισμοί in vivo είναι επίσης χρήσιμοι για την περαιτέρω διερεύνηση της γονιδιοτοξικότητας που ανιχνεύεται με σύστημα in vitro.

Η δοκιμή χρωμοσωμικών εκτροπών in vivo σε θηλαστικά χρησιμοποιείται για την ανίχνευση δομικών χρωμοσωμικών εκτροπών που επάγονται από τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες στα κύτταρα του μυελού των οστών ζώων, συνήθως τρωκτικών (2) (3) (4) (5). Οι δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές μπορεί να είναι δύο τύπων, χρωμοσωμικές ή χρωματιδικές. Αν και οι περισσότερες γονιδιοτοξικές εκτροπές που επάγονται από χημικές ουσίες είναι χρωματιδικού τύπου, εμφανίζονται, ωστόσο, και εκτροπές χρωμοσωμικού τύπου. Οι χρωμοσωμικές βλάβες και τα συναφή συμβάντα αποτελούν το αίτιο πολλών γενετικών ασθενειών του ανθρώπου και υπάρχουν αρκετά στοιχεία που αποδεικνύουν ότι, όταν αυτές οι βλάβες και τα συναφή συμβάντα προκαλούν αλλοιώσεις σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, συνδέονται με την εμφάνιση καρκίνου στον άνθρωπο και σε πειραματικά συστήματα. Στους προσδιορισμούς χρωμοσωμικών εκτροπών in vivo μπορεί να παρουσιαστεί πολυπλοειδία (συμπεριλαμβανομένου του ενδοαναδιπλασιασμού). Εντούτοις, η αύξηση της πολυπλοειδίας δεν αποτελεί αφ' εαυτής ένδειξη ανευπλοειδογόνου δυναμικού και μπορεί απλώς να υποδηλώνει διατάραξη του κυτταρικού κύκλου ή κυτταροτοξικότητα. Η παρούσα δοκιμή δεν έχει σχεδιαστεί για τη μέτρηση της ανευπλοειδίας. Οι συνιστώμενες δοκιμές για την ανίχνευση ανευπλοειδίας in vivo και in vitro είναι η δοκιμή μικροπυρήνων in vivo σε ερυθροκύτταρα θηλαστικών (κεφάλαιο Β.12 του παρόντος παραρτήματος) και η δοκιμή μικροπυρήνων in vitro σε κύτταρα θηλαστικών (κεφάλαιο Β. 49 του παρόντος παραρτήματος), αντίστοιχα.

Οι ορισμοί των χρησιμοποιούμενων όρων παρατίθενται στο προσάρτημα 1.

ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ

Στην παρούσα δοκιμή χρησιμοποιούνται συνήθως τρωκτικά, αλλά μπορεί, σε ορισμένες περιπτώσεις, να είναι κατάλληλα και άλλα είδη, εφόσον αυτό αιτιολογείται επιστημονικά. Ο στοχευόμενος ιστός στην παρούσα δοκιμή είναι ο μυελός των οστών, επειδή παρουσιάζει έντονη αγγείωση και περιέχει πληθυσμό κυττάρων με ταχύ κυτταρικό κύκλο που μπορούν εύκολα να απομονωθούν και να υποβληθούν σε επεξεργασία. Η επιστημονική αιτιολόγηση της χρήσης άλλων ειδών εκτός από επίμυες και ποντικούς θα πρέπει να περιλαμβάνεται στην έκθεση δοκιμής. Εάν χρησιμοποιούνται άλλα είδη εκτός των τρωκτικών, συνιστάται να ενσωματώνεται η μέτρηση των χρωμοσωμικών εκτροπών μυελού των οστών σε άλλη κατάλληλη δοκιμή τοξικότητας.

Εάν υπάρχουν ενδείξεις ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία ή οι μεταβολίτες της δεν θα φθάσουν στον στοχευόμενο ιστό, μπορεί να μην ενδείκνυται η χρήση της παρούσας δοκιμής.

Πριν από τη χρήση της μεθόδου δοκιμών σε μείγμα για την παραγωγή δεδομένων για συγκεκριμένο ρυθμιστικό σκοπό, θα πρέπει να εξετάζεται αν — και, εάν ναι, για ποιον λόγο — αυτή μπορεί να αποδώσει επαρκή αποτελέσματα για τον επιδιωκόμενο σκοπό. Οι εκτιμήσεις αυτές δεν είναι αναγκαίες όταν οι κανονιστικές ρυθμίσεις επιβάλλουν τον έλεγχο του μείγματος.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ

Τα ζώα εκτίθενται στην υπό δοκιμή χημική ουσία από κατάλληλη οδό έκθεσης και θανατώνονται με ευθανασία σε εύθετο χρόνο μετά τη μεταχείριση. Πριν από την ευθανασία, τα ζώα υποβάλλονται σε μεταχείριση με παράγοντα διακοπής της μετάφασης (π.χ. κολχικίνη ή Colcemid). Ακολουθεί ετοιμασία χρωμοσωμικών παρασκευασμάτων από κύτταρα του μυελού των οστών, χρώση των παρασκευασμάτων και ανάλυση των μεταφασικών κυττάρων για τον εντοπισμό χρωμοσωμικών εκτροπών.

ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ

Έρευνες τεχνικής ικανότητας

Για να τεκμηριώσει πως διαθέτει επαρκή εμπειρία στη διεξαγωγή της δοκιμής πριν τη χρησιμοποιήσει για δοκιμές ρουτίνας, το εργαστήριο θα πρέπει να έχει αποδείξει την ικανότητά του να αναπαράγει τα αναμενόμενα αποτελέσματα με βάση δημοσιευμένα δεδομένα [π.χ. (6)] για συχνότητες χρωμοσωμικών εκτροπών, με τουλάχιστον δύο χημικές ουσίες ως θετικούς μάρτυρες (συμπεριλαμβανομένων των ασθενών αποκρίσεων που επάγονται από χαμηλές δόσεις θετικών μαρτύρων), όπως αυτές που απαριθμούνται στον πίνακα 1, καθώς και με συμβατούς μάρτυρες με φορέα/διαλύτη (βλ. παράγραφο 22). Στα πειράματα αυτά θα πρέπει να χρησιμοποιούνται δόσεις που παρέχουν αναπαραγώγιμες αυξήσεις σχετιζόμενες με τις δόσεις και καταδεικνύουν την ευαισθησία και τη δυναμική περιοχή του συστήματος δοκιμής στον στοχευόμενο ιστό (μυελό των οστών) και να εφαρμόζεται η μέθοδος καταμέτρησης που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί στο εργαστήριο. Η απαίτηση αυτή δεν ισχύει για τα εργαστήρια που έχουν πείρα, δηλ. διαθέτουν βάση ιστορικών δεδομένων, όπως ορίζεται στις παραγράφους 10-14.

Ιστορικά δεδομένα μαρτύρων

Κατά τη διάρκεια των ερευνών τεχνικής ικανότητας, το εργαστήριο θα πρέπει να καθορίζει:

Κατά την αρχική συγκέντρωση ιστορικών δεδομένων για κατανομή όσον αφορά τους αρνητικούς μάρτυρες, οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει να συμφωνούν με τα δημοσιευμένα δεδομένα για μάρτυρες, εφόσον υπάρχουν. Καθώς θα προστίθενται περισσότερα πειραματικά δεδομένα στην κατανομή των ιστορικών δεδομένων μαρτύρων, οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει, στην ιδανική περίπτωση, να βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 % της εν λόγω κατανομής. Η βάση ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για αρνητικούς μάρτυρες θα πρέπει να είναι στατιστικά ανθεκτική για να διασφαλίζει την ικανότητα του εργαστηρίου να αξιολογεί την κατανομή των δεδομένων του που αφορούν τους αρνητικούς μάρτυρες. Από τη βιβλιογραφία συνάγεται ότι ενδέχεται να απαιτούνται τουλάχιστον 10 πειράματα, αν και είναι προτιμότερο η βάση δεδομένων να αποτελείται από τουλάχιστον 20 πειράματα που έχουν εκτελεστεί σε συγκρίσιμες πειραματικές συνθήκες. Τα εργαστήρια θα πρέπει να χρησιμοποιούν μεθόδους ποιοτικού ελέγχου, όπως διαγράμματα ελέγχου [π.χ. διαγράμματα C ή X-bar (7)], για να προσδιορίζουν τη μεταβλητότητα των δεδομένων τους και να αποδεικνύουν ότι έχουν «υπό έλεγχο» τη μεθοδολογία. Περαιτέρω συστάσεις για τον τρόπο δημιουργίας και χρήσης των ιστορικών δεδομένων (δηλ. κριτήρια προσθήκης στοιχείων στα ιστορικά δεδομένα και αποκλεισμού στοιχείων από αυτά, καθώς και κριτήρια αποδοχής συγκεκριμένου πειράματος) έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (8).

Εάν το εργαστήριο δεν συμπληρώσει επαρκή αριθμό πειραμάτων για τον καθορισμό στατιστικά ανθεκτικής κατανομής αρνητικών μαρτύρων (βλ. παράγραφο 11) κατά τη διάρκεια των ερευνών τεχνικής ικανότητας (που περιγράφονται στην παράγραφο 9), είναι αποδεκτή η κατασκευή της κατανομής κατά τις πρώτες δοκιμές ρουτίνας. Κατά την εφαρμογή της προσέγγισης αυτής θα πρέπει να τηρούνται οι συστάσεις που έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (8) και τα αποτελέσματα που προκύπτουν για τους αρνητικούς μάρτυρες στα σχετικά πειράματα θα πρέπει και πάλι να συμφωνούν με τα δημοσιευμένα δεδομένα για αρνητικούς μάρτυρες.

Κάθε αλλαγή του πειραματικού πρωτοκόλλου θα πρέπει να μελετάται υπό το πρίσμα της επίπτωσής της στη διατήρηση της συμφωνίας των δεδομένων που προκύπτουν προς την υφιστάμενη βάση ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για μάρτυρες. Μόνο σημαντικές ανακολουθίες θα πρέπει να έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία νέας βάσης ιστορικών δεδομένων ελέγχου, όταν η κρίση εμπειρογνωμόνων διαπιστώσει ότι διαφέρει από την προηγούμενη κατανομή (βλ. παράγραφο 11). Για τη διεξαγωγή πραγματικής δοκιμής κατά την περίοδο της αντικατάστασης, ενδέχεται να μην είναι αναγκαία μια πλήρης βάση δεδομένων για αρνητικούς μάρτυρες, με την προϋπόθεση ότι το εργαστήριο μπορεί να αποδείξει ότι οι τιμές του για τους παράλληλους αρνητικούς μάρτυρες εξακολουθούν να συμφωνούν είτε με την προηγούμενη βάση δεδομένων του είτε με τα αντίστοιχα δημοσιευμένα δεδομένα.

Τα δεδομένα για αρνητικούς μάρτυρες θα πρέπει να είναι η επίπτωση (incidence) των χρωμοσωμικών εκτροπών (χωρίς τα χάσματα) σε κάθε ζώο. Οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει, στην ιδανική περίπτωση, να βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 % της κατανομής της βάσης ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για αρνητικούς μάρτυρες. Όταν τα δεδομένα για παράλληλους αρνητικούς μάρτυρες δεν βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 %, μπορεί να είναι αποδεκτή η προσθήκη τους στην κατανομή ιστορικών δεδομένων μαρτύρων, εφόσον τα εν λόγω δεδομένα δεν είναι ακραίες έκτοπες τιμές και υπάρχουν στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το σύστημα δοκιμής είναι «υπό έλεγχο» (βλ. παράγραφο 11) και ότι δεν πρόκειται για τεχνικό ή ανθρώπινο σφάλμα.

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Προετοιμασίες

Επιλογή ζωικού είδους

Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα ζώα που ανήκουν σε συνήθεις εργαστηριακές φυλές. Συνήθως χρησιμοποιούνται επίμυες, αλλά μπορεί να είναι κατάλληλοι και οι ποντικοί. Η χρήση άλλων κατάλληλων ειδών θηλαστικών επιτρέπεται, εφόσον αιτιολογείται επιστημονικά στην έκθεση.

Συνθήκες στέγασης και σίτισης των ζώων

Για τα τρωκτικά, η θερμοκρασία στην αίθουσα πειραματόζωων θα πρέπει να είναι 22 °C (± 3 °C). Η σχετική υγρασία, η ιδανική τιμή της οποίας είναι 50-60 %, θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 40 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού της αίθουσας. Ο φωτισμός θα πρέπει να είναι τεχνητός, με φωτοπερίοδο 12 ωρών. Για τη διατροφή των ζώων μπορούν να χρησιμοποιούνται τα κλασικά εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται με την τροφή, η ανάγκη επαρκούς πρόσμειξης της ουσίας είναι δυνατόν να επηρεάσει την επιλογή σιτηρεσίου. Τα τρωκτικά θα πρέπει να στεγάζονται σε μικρές ομάδες (όχι περισσότερα από πέντε ανά κλωβό) του ίδιου φύλου και της ίδιας μεταχείρισης, εφόσον δεν αναμένεται επιθετική συμπεριφορά, κατά προτίμηση σε κλωβούς με συμπαγές δάπεδο με κατάλληλο εμπλουτισμό του περιβάλλοντος. Η ατομική στέγαση των ζώων επιτρέπεται, μόνον εάν αιτιολογείται επιστημονικά.

Προετοιμασία των ζώων

Κατά κανόνα χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα ζώα (για τα τρωκτικά, η ιδανική ηλικία είναι μεταξύ 6 και 10 εβδομάδων κατά την έναρξη της μεταχείρισης, αν και είναι επίσης αποδεκτά ζώα λίγο μεγαλύτερης ηλικίας), τα οποία κατανέμονται τυχαία στις ομάδες μαρτύρων και μεταχείρισης. Τα ζώα ταυτοποιούνται μοναδικά με χρήση ανώδυνης, ελάχιστα επεμβατικής μεθόδου (π.χ. δακτύλιοι, ετικέτες, μικροτσίπ ή βιομετρική ταυτοποίηση, αλλά όχι αποκοπή τμήματος αυτιού ή δακτύλου). Οι κλωβοί θα πρέπει να διατάσσονται με τρόπο ώστε να ελαχιστοποιούνται οι πιθανές επιδράσεις της θέσης τους. Θα πρέπει να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση από τον θετικό μάρτυρα και την υπό δοκιμή χημική ουσία. Στην αρχή της δοκιμής, οι διαφορές βάρους των ζώων θα πρέπει να είναι ελάχιστες και να μην υπερβαίνουν το ± 20 % του μέσου βάρους κάθε φύλου.

Παρασκευή των δόσεων

Οι στερεές υπό δοκιμή χημικές ουσίες θα πρέπει να διαλύονται ή να διασπείρονται (σχηματισμός εναιωρήματος) σε κατάλληλους διαλύτες ή φορείς ή να αναμειγνύονται με την τροφή ή το πόσιμο νερό, πριν χορηγηθούν στα ζώα. Οι υγρές υπό δοκιμή χημικές ουσίες μπορούν να χορηγούνται ως έχουν ή να αραιώνονται πριν από τη χορήγηση. Σε περίπτωση έκθεσης μέσω της εισπνοής, οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες μπορούν να χορηγούνται ως αέριο, ατμοί ή αερόλυμα στερεού/υγρού, ανάλογα με τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, εκτός αν τα στοιχεία σχετικά με τη σταθερότητά της καταδεικνύουν ότι είναι αποδεκτή η φύλαξή της και καθορίζουν τις κατάλληλες συνθήκες φύλαξης.

Διαλύτης/φορέας

Ο διαλύτης/φορέας θα πρέπει να μην έχει τοξικές επιδράσεις στα χρησιμοποιούμενα επίπεδα δόσεων ούτε να υπάρχουν υπόνοιες για χημική αντίδρασή του με τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες. Εφόσον χρησιμοποιείται άλλος διαλύτης/φορέας εκτός των καθιερωμένων, η χρήση του θα πρέπει να τεκμηριώνεται με δεδομένα αναφοράς που αποδεικνύουν τη συμβατότητά του. Συνιστάται, εφόσον είναι δυνατό, να εξετάζεται πρώτα αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί υδατικός διαλύτης/φορέας. Παραδείγματα ευρέως χρησιμοποιούμενων συμβατών διαλυτών/φορέων είναι, μεταξύ άλλων, το νερό, ο φυσιολογικός ορός (ισότονο αλατούχο διάλυμα), το διάλυμα μεθυλοκυτταρίνης, το διάλυμα άλατος της καρβοξυμεθυλοκυτταρίνης με νάτριο, το ελαιόλαδο και το αραβοσιτέλαιο. Εάν δεν υπάρχουν ιστορικά ή δημοσιευμένα δεδομένα για μάρτυρες που να αποδεικνύουν ότι ένας άτυπος διαλύτης/φορέας δεν επάγει δομικές εκτροπές ή άλλες επιβλαβείς επιδράσεις, θα πρέπει να διενεργείται μια αρχική μελέτη για να διαπιστωθεί η δυνατότητα αποδοχής των μαρτύρων με διαλύτη/φορέα.

Μάρτυρες

Θετικοί μάρτυρες

Κάθε δοκιμή θα πρέπει κανονικά να περιλαμβάνει μια ομάδα ζώων που υποβάλλονται σε μεταχείριση με χημική ουσία η οποία χρησιμεύει ως θετικός μάρτυρας. Η εν λόγω ομάδα μπορεί να παραλείπεται, εάν το εργαστήριο δοκιμών έχει αποδείξει την τεχνική του ικανότητα διεξαγωγής της δοκιμής και έχει καθορίσει εύρος ιστορικών δεδομένων για θετικούς μάρτυρες. Εάν δεν συμπεριλαμβάνεται ομάδα παράλληλων θετικών μαρτύρων, κάθε πείραμα θα πρέπει να περιλαμβάνει μάρτυρες καταμέτρησης (μονιμοποιημένες αντικειμενοφόρες πλάκες χωρίς χρώση). Αυτοί μπορούν να ληφθούν με την προσθήκη κατάλληλων δειγμάτων αναφοράς κατά την καταμέτρηση στο πλαίσιο της μελέτης, τα οποία έχουν ληφθεί και φυλαχθεί από χωριστό πείραμα με θετικούς μάρτυρες που εκτελείται σε τακτά διαστήματα (π.χ. ανά 6 έως 18 μήνες) στο εργαστήριο διεξαγωγής της δοκιμής· για παράδειγμα, κατά τον έλεγχο της τεχνικής ικανότητας και, στη συνέχεια, σε τακτική βάση, όποτε είναι αναγκαίο.

Οι χημικές ουσίες που χρησιμεύουν ως θετικοί μάρτυρες θα πρέπει να επιφέρουν με αξιοπιστία ανιχνεύσιμη αύξηση της συχνότητας των κυττάρων με δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές σε σχέση με την αυθόρμητη συχνότητα. Οι δόσεις των θετικών μαρτύρων θα πρέπει να επιλέγονται έτσι ώστε οι επιδράσεις να είναι σαφείς αλλά να μην αποκαλύπτουν αμέσως την ταυτότητα των κωδικοποιημένων δειγμάτων στον εξεταστή. Είναι αποδεκτό να χορηγούνται οι θετικοί μάρτυρες και από οδό διαφορετική από εκείνη της χορήγησης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, με τη χρήση διαφορετικού προγράμματος αγωγής, και να διενεργείται η δειγματοληψία μόνο σε μία χρονική στιγμή. Επιπροσθέτως, μπορεί να εξετάζεται το ενδεχόμενο χρήσης θετικών μαρτύρων συγγενούς χημικής τάξης, κατά περίπτωση. Παραδείγματα χημικών ουσιών που αποτελούν θετικούς μάρτυρες περιλαμβάνονται στον πίνακα 1.

Πίνακας 1

Παραδείγματα χημικών ουσιών που αποτελούν θετικούς μάρτυρες

Αρνητικοί μάρτυρες

Σε κάθε χρόνο δειγματοληψίας θα πρέπει να περιλαμβάνεται ομάδα ζώων ως αρνητικός μάρτυρας, η οποία υφίσταται τους ίδιους χειρισμούς όπως οι ομάδες μεταχείρισης, με μόνη διαφορά το ότι δεν εκτίθεται στην υπό δοκιμή χημική ουσία. Εάν για τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας χρησιμοποιείται διαλύτης/φορέας, αυτός θα πρέπει να χορηγείται και στην ομάδα-μάρτυρα. Ωστόσο, εάν από ιστορικά δεδομένα για τους αρνητικούς μάρτυρες προκύπτουν σταθερές τιμές μεταβλητότητας και συχνότητες κυττάρων με χρωμοσωμικές εκτροπές μεταξύ των ζώων σε κάθε δειγματοληψία για το εργαστήριο δοκιμών, μπορεί να απαιτείται μία μόνο δειγματοληψία για τον αρνητικό μάρτυρα. Σε περίπτωση μίας μόνο δειγματοληψίας για τους αρνητικούς μάρτυρες, αυτή θα πρέπει να διενεργείται κατά τον χρόνο της πρώτης δειγματοληψίας στο πλαίσιο της μελέτης.

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Αριθμός και φύλο των ζώων

Η απόκριση μικροπυρήνων είναι γενικά παρόμοια μεταξύ αρσενικών και θηλυκών ζώων (9) και αναμένεται ότι αυτό θα ισχύει και για τις δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές· ως εκ τούτου, οι περισσότερες μελέτες θα μπορούσαν να διεξαχθούν σε οποιοδήποτε φύλο. Δεδομένα που καταδεικνύουν ουσιαστικές διαφορές μεταξύ αρσενικών και θηλυκών ζώων (π.χ. διαφορές συστημικής τοξικότητας, μεταβολισμού, βιοδιαθεσιμότητας, τοξικότητας για τον μυελό των οστών, κ.λπ., συμπεριλαμβανομένων εκείνων που έχουν προκύψει, π.χ., από μελέτη προσδιορισμού εύρους τιμών) υποστηρίζουν τη χρησιμοποίηση ζώων και των δύο φύλων. Στην περίπτωση αυτή, ίσως είναι σκόπιμο να διεξάγεται μελέτη και στα δύο φύλα, π.χ. στο πλαίσιο μελετών τοξικότητας με επαναλαμβανόμενες δόσεις. Σε περίπτωση χρήσης και των δύο φύλων, θα ήταν ενδεχομένως σκόπιμη η εφαρμογή παραγοντικού σχεδιασμού. Λεπτομέρειες σχετικά με τον τρόπο ανάλυσης των δεδομένων με τη χρήση αυτού του σχεδιασμού παρέχονται στο προσάρτημα 2.

Το μέγεθος των ομάδων κατά την έναρξη της μελέτης θα πρέπει να καθορίζεται με γνώμονα την εξασφάλιση, ανά ομάδα, 5 τουλάχιστον αναλύσιμων ζώων του ίδιου φύλου ή, εάν χρησιμοποιούνται ζώα και των δύο φύλων, από κάθε φύλο. Όταν η έκθεση του ανθρώπου σε μια χημική ουσία αφορά μόνο το ένα φύλο, όπως π.χ. στην περίπτωση ορισμένων φαρμακευτικών προϊόντων, η δοκιμή θα πρέπει να διεξάγεται σε ζώα του αντίστοιχου φύλου. Ενδεικτικά, όσον αφορά τις τυπικές απαιτήσεις για τον μέγιστο αριθμό ζώων, για μια μελέτη σε μυελό των οστών με δύο χρόνους δειγματοληψίας, τρεις ομάδες δόσης και μια ομάδα παράλληλων αρνητικών μαρτύρων, συν μια ομάδα θετικών μαρτύρων (κάθε ομάδα αποτελούμενη από πέντε ζώα του ίδιου φύλου), θα απαιτούνταν 45 ζώα.

Επίπεδα δόσεων

Εάν χρειάζεται προκαταρκτική μελέτη προσδιορισμού εύρους τιμών επειδή δεν υπάρχουν ήδη κατάλληλα δεδομένα για να υποβοηθήσουν την επιλογή δόσεων, η εν λόγω μελέτη θα πρέπει να διεξάγεται στο ίδιο εργαστήριο, με τη χρήση του ίδιου είδους, φυλής, φύλου ζώων και σχήματος μεταχείρισης όπως στην κύρια μελέτη (10). Η μελέτη θα πρέπει να αποσκοπεί στον προσδιορισμό της μέγιστης ανεκτής δόσης (ΜΑΔ), η οποία ορίζεται ως η ανώτατη δόση που μπορεί να γίνει ανεκτή χωρίς εκδήλωση τοξικότητας που περιορίζει τη μελέτη, σε σχέση με τη διάρκεια της μελέτης (π.χ. που προκαλεί μείωση του σωματικού βάρους ή κυτταροτοξικότητα για το αιμοποιητικό σύστημα), αλλά δεν προκαλεί θάνατο ούτε εκδήλωση πόνου, ταλαιπωρίας ή δυσφορίας που καθιστούν αναγκαία τη θανάτωση με ευθανασία (11).

Η ανώτατη δόση μπορεί επίσης να οριστεί ως η δόση που προκαλεί ορισμένες ενδείξεις τοξικότητας για τον μυελό των οστών.

Οι χημικές ουσίες που παρουσιάζουν κορεσμό τοξικοκινητικών ιδιοτήτων ή επάγουν διεργασίες αποτοξίνωσης που μπορεί να επιφέρουν μείωση της έκθεσης μετά από μακροχρόνια αγωγή ίσως αποτελούν εξαιρέσεις από τα κριτήρια καθορισμού των δόσεων και θα πρέπει να αξιολογούνται κατά περίπτωση.

Για να ληφθούν πληροφορίες σχετικά με τη σχέση δόσης-απόκρισης, μια ολοκληρωμένη μελέτη θα πρέπει να περιλαμβάνει ομάδα αρνητικού μάρτυρα και τουλάχιστον τρία επίπεδα δόσεων, τα οποία κατά κανόνα διαφέρουν κατά έναν συντελεστή ίσο με το 2, αλλά πάντως όχι μεγαλύτερο του 4. Εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία δεν προκαλεί τοξικότητα σε μελέτη προσδιορισμού εύρους τιμών ή με βάση τα υπάρχοντα δεδομένα, η ανώτατη δόση για εφάπαξ χορήγηση θα πρέπει να είναι 2 000 mg/kg σωματικού βάρους. Ωστόσο, εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία προκαλεί τοξικότητα, η ΜΑΔ θα πρέπει να είναι η ανώτατη χορηγούμενη δόση και τα χρησιμοποιούμενα επίπεδα δόσεων θα πρέπει, κατά προτίμηση, να καλύπτουν το εύρος από τη μέγιστη δόση μέχρι τη δόση που προκαλεί ελάχιστη ή μηδενική τοξικότητα. Όταν παρατηρείται τοξικότητα στον στοχευόμενο ιστό (μυελό των οστών) σε όλα τα ελεγχόμενα επίπεδα δόσεων, συνιστάται η διεξαγωγή περαιτέρω μελέτης με μη τοξικές δόσεις. Οι μελέτες που αποσκοπούν στον πληρέστερο χαρακτηρισμό των ποσοτικών στοιχείων σχετικά με τη σχέση δόσης-απόκρισης ενδέχεται να απαιτούν πρόσθετες ομάδες δόσης. Για ορισμένα είδη υπό δοκιμή χημικών ουσιών (π.χ. φαρμακευτικά προϊόντα για τον άνθρωπο) που καλύπτονται από ειδικές απαιτήσεις, αυτά τα όρια μπορεί να διαφέρουν.

Οριακή δοκιμή

Εάν τα πειράματα προσδιορισμού εύρους δόσεων ή υφιστάμενα δεδομένα για συγγενείς φυλές ζώων δείχνουν ότι ένα σχήμα μεταχείρισης με τουλάχιστον την οριακή δόση (που περιγράφεται κατωτέρω) δεν επιφέρει παρατηρήσιμες τοξικές επιδράσεις (που περιλαμβάνουν την απουσία μείωσης του πολλαπλασιασμού του μυελού των οστών ή άλλης ένδειξης κυτταροτοξικότητας στον στοχευόμενο ιστό) και δεν αναμένεται γονιδιοτοξικότητα με βάση μελέτες γονιδιοτοξικότητας in vitro ή δεδομένα για χημικές ουσίες παρόμοιας δομής, μπορεί να κριθεί περιττή η διεξαγωγή πλήρους μελέτης με τρία επίπεδα δόσεων, υπό τον όρο ότι έχει αποδειχθεί ότι οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες φθάνουν στον στοχευόμενο ιστό (μυελός των οστών). Σε αυτές τις περιπτώσεις, ενδέχεται να αρκεί ένα μόνο επίπεδο δόσης, ίσο με την οριακή δόση. Για περίοδο χορήγησης > 14 ημερών, η οριακή δόση είναι 1 000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα. Για περιόδους χορήγησης 14 ή λιγότερων ημερών, η οριακή δόση είναι 2 000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα.

Χορήγηση των δόσεων

Κατά τον σχεδιασμό της δοκιμής θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η προβλεπόμενη οδός έκθεσης του ανθρώπου. Επιτρέπεται επομένως η αιτιολογημένη επιλογή οδών έκθεσης όπως μέσω της τροφής ή του πόσιμου νερού, με τοπική εφαρμογή, υποδόρια ή ενδοφλέβια ένεση, από το στόμα (με στομαχικό καθετήρα), μέσω της εισπνοής, η ενδοτραχειακή οδός ή η εμφύτευση. Σε κάθε περίπτωση, η οδός έκθεσης θα πρέπει να επιλέγεται κατά τρόπο ώστε να εξασφαλίζεται επαρκής έκθεση του ή των στοχευόμενων ιστών. Η ενδοπεριτοναϊκή ένεση δεν συνιστάται κατά κανόνα, διότι δεν αποτελεί σκοπούμενη οδό έκθεσης του ανθρώπου, και θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο με ειδική επιστημονική αιτιολόγηση. Εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία αναμειγνύεται με την τροφή ή το πόσιμο νερό, ιδίως στην περίπτωση των εφάπαξ δόσεων, θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε το χρονικό διάστημα μεταξύ της κατανάλωσης τροφής και νερού και της δειγματοληψίας να επαρκεί για την ανίχνευση των επιδράσεων (βλ. παραγράφους 33-34). Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί με στομαχικό καθετήρα ή ένεση κάθε φορά εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Ο όγκος δεν θα πρέπει κανονικά να υπερβαίνει το 1 ml/100 g σωματικού βάρους, εκτός από την περίπτωση των υδατικών διαλυμάτων, όπου επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται κατά μέγιστο όριο 2 ml/100 g σωματικού βάρους. Η χρήση μεγαλύτερων όγκων θα πρέπει να αιτιολογείται. Η μεταβλητότητα των όγκων δοκιμής θα πρέπει να ελαχιστοποιείται με ρύθμιση της συγκέντρωσης, ώστε να εξασφαλίζεται η χορήγηση σταθερού όγκου σε σχέση με το σωματικό βάρος σε όλα τα επίπεδα δόσεων, εκτός από την περίπτωση των ερεθιστικών ή διαβρωτικών χημικών ουσιών, των οποίων οι επιδράσεις κατά κανόνα επιδεινώνονται όταν αυξάνονται οι συγκεντρώσεις.

Πρόγραμμα μεταχείρισης

Οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες χορηγούνται συνήθως εφάπαξ, αλλά μπορούν να χορηγηθούν και σε διαιρεμένες δόσεις (δηλ. δύο ή περισσότερες δόσεις την ίδια ημέρα, που δεν απέχουν χρονικά μεταξύ τους περισσότερο από 2-3 ώρες) για να διευκολύνεται η χορήγηση μεγάλων όγκων. Υπό τις περιστάσεις αυτές ή κατά τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας μέσω της εισπνοής, ο χρόνος δειγματοληψίας θα πρέπει να προγραμματίζεται με βάση τον χρόνο της τελευταίας χορήγησης ή το τέλος της έκθεσης.

Υπάρχουν ελάχιστα διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με την καταλληλότητα ενός πρωτοκόλλου επαναλαμβανόμενων δόσεων για την παρούσα δοκιμή. Ωστόσο, όταν είναι σκόπιμη η ενσωμάτωσή της σε δοκιμή τοξικότητας επαναλαμβανόμενων δόσεων, θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για την αποφυγή της απώλειας μιτωτικών κυττάρων που έχουν υποστεί χρωμοσωμική βλάβη, όπως θα μπορούσε να συμβεί με τοξικές δόσεις. Η ενοποίηση αυτή είναι αποδεκτή, όταν η ανώτατη δόση είναι μεγαλύτερη ή ίση προς την οριακή δόση (βλ. παράγραφο 29) και σε μία ομάδα δόσης χορηγείται η οριακή δόση για τη διάρκεια της περιόδου μεταχείρισης. Η δοκιμή μικροπυρήνων (μέθοδος δοκιμής Β.12) θα πρέπει να θεωρείται η in vivo δοκιμή πρώτης επιλογής για χρωμοσωμικές εκτροπές, όταν κρίνεται σκόπιμη η ενσωμάτωση σε άλλες μελέτες.

Τα δείγματα μυελού των οστών θα πρέπει να λαμβάνονται σε δύο διαφορετικές χρονικές στιγμές μετά τις εφάπαξ μεταχειρίσεις. Για τα τρωκτικά, το πρώτο διάστημα δειγματοληψίας θα πρέπει να είναι ο χρόνος που απαιτείται για τη συμπλήρωση της φυσιολογικής διάρκειας του κυτταρικού κύκλου, πολλαπλασιαζόμενης επί 1,5 (κανονικά 12-18 ώρες μετά την περίοδο μεταχείρισης). Επειδή ο απαιτούμενος χρόνος για την πρόσληψη και τον μεταβολισμό της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, καθώς και η επίδρασή της στην κινητική του κυτταρικού κύκλου, μπορεί να επηρεάσει τον βέλτιστο χρόνο για την ανίχνευση χρωμοσωμικής εκτροπής, συνιστάται η διενέργεια και δεύτερης δειγματοληψίας 24 ώρες μετά την πρώτη. Κατά τον χρόνο της πρώτης δειγματοληψίας, θα πρέπει να υποβάλλονται σε μεταχείριση όλες οι ομάδες δόσης και να συλλέγονται δείγματα για ανάλυση· ωστόσο, κατά τους μεταγενέστερους χρόνους δειγματοληψίας, αρκεί να χορηγηθεί μόνον η ανώτατη δόση. Εάν εφαρμόζεται δοσολογικό σχήμα που εκτείνεται σε περισσότερες από μία ημέρες με βάση επιστημονική αιτιολόγηση, θα πρέπει κατά κανόνα να διενεργείται μία δειγματοληψία σε χρόνο που ισοδυναμεί περίπου με τη φυσιολογική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου επί 1,5 από την τελική μεταχείριση.

Μετά τη μεταχείριση και πριν από τη συλλογή δειγμάτων, χορηγείται στα ζώα με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση κατάλληλη δόση παράγοντα διακοπής της μετάφασης (π.χ. Colcemid ή κολχικίνη) και, στη συνέχεια, συλλέγονται δείγματα μετά την παρέλευση κατάλληλου χρονικού διαστήματος. Για τους ποντικούς, η καταλληλότερη στιγμή είναι περίπου 3-5 ώρες πριν από τη συλλογή και για τους επίμυες είναι 2-5 ώρες. Κύτταρα από το μυελό των οστών συλλέγονται, διογκώνονται, μονιμοποιούνται, χρωματίζονται και εξετάζονται για τον εντοπισμό χρωμοσωμικών εκτροπών (12).

Παρατηρήσεις

Τα πειραματόζωα θα πρέπει να υποβάλλονται σε γενική κλινική εξέταση και τα κλινικά σημεία να καταγράφονται τουλάχιστον μία φορά ημερησίως, κατά προτίμηση την ίδια ώρα και λαμβανομένου υπόψη του χρόνου κορύφωσης των αναμενόμενων επιδράσεων μετά τη χορήγηση της δόσης. Όλα τα ζώα θα πρέπει να εξετάζονται τουλάχιστον δύο φορές ημερησίως κατά την περίοδο της χορήγησης για τη διαπίστωση τυχόν νοσηρότητας και θνησιμότητας. Όλα τα ζώα πρέπει να ζυγίζονται κατά την έναρξη της μελέτης, τουλάχιστον μία φορά την εβδομάδα κατά τη διάρκεια των μελετών για τις επαναλαμβανόμενες δόσεις και κατά την ευθανασία. Σε μελέτες διάρκειας τουλάχιστον μίας εβδομάδας, η κατανάλωση τροφής θα πρέπει να μετράται τουλάχιστον εβδομαδιαίως. Εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται με το πόσιμο νερό, η κατανάλωση νερού θα πρέπει να μετράται σε κάθε αλλαγή νερού και τουλάχιστον εβδομαδιαίως. Τα ζώα που εμφανίζουν μη θανατηφόρους δείκτες υπερβολικής τοξικότητας θα πρέπει να υποβάλλονται σε ευθανασία πριν από τη λήξη της περιόδου δοκιμής (11).

Έκθεση του στοχευόμενου ιστού

Θα πρέπει να λαμβάνεται δείγμα αίματος σε κατάλληλους χρόνους για να είναι δυνατή η διερεύνηση των επιπέδων των υπό δοκιμή χημικών ουσιών στο πλάσμα, ώστε να αποδεικνύεται η έκθεση του μυελού των οστών, όταν αυτό δικαιολογείται και δεν υπάρχουν άλλα δεδομένα έκθεσης (βλ. παράγραφο 44).

Παρασκευάσματα μυελού των οστών και χρωμοσωμάτων

Αμέσως μετά τη θανάτωση με ευθανασία, λαμβάνονται κύτταρα μυελού των οστών από τα μηριαία ή τα κνημιαία οστά των ζώων, εκτίθενται σε υπότονο διάλυμα και μονιμοποιούνται. Τα μεταφασικά κύτταρα επιστρώνονται έπειτα σε αντικειμενοφόρες πλάκες και χρωματίζονται με τη χρήση καθιερωμένων μεθόδων [βλ. (3) (12)].

Ανάλυση

Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες, συμπεριλαμβανομένων των πλακών με τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, θα πρέπει να κωδικοποιούνται χωριστά πριν από την ανάλυση και να τυχαιοποιούνται, έτσι ώστε ο εξεταστής να μη γνωρίζει τη συνθήκη μεταχείρισης.

Θα πρέπει να προσδιορίζεται ο μιτωτικός δείκτης ως παράμετρος κυτταροξικότητας σε 1 000 τουλάχιστον κύτταρα ανά ζώο από όλα τα ζώα που υποβάλλονται σε μεταχείριση (και τους θετικούς μάρτυρες), καθώς και από εκείνα που δεν υποβάλλονται σε μεταχείριση ή χρησιμεύουν ως αρνητικοί μάρτυρες με φορέα/διαλύτη.

Θα πρέπει να αναλύονται τουλάχιστον 200 μεταφασικά κύτταρα ανά ζώο για τη διαπίστωση δομικών χρωμοσωμικών εκτροπών με και χωρίς τα χάσματα (6). Ωστόσο, εάν η βάση δεδομένων για ιστορικούς αρνητικούς μάρτυρες δείχνει ότι η μέση συχνότητα υποβάθρου των δομικών χρωμοσωμικών εκτροπών είναι < 1 % στο εργαστήριο δοκιμών, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο καταμέτρησης πρόσθετων κυττάρων. Οι χρωματιδικού και χρωμοσωμικού τύπου εκτροπές θα πρέπει να καταγράφονται χωριστά και να ταξινομούνται σε υποκατηγορίες (ρήξεις, ανταλλαγές). Οι διαδικασίες που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο θα πρέπει να διασφαλίζουν τη διενέργεια της ανάλυσης χρωμοσωμικών εκτροπών από επαρκώς καταρτισμένους εξεταστές και, κατά περίπτωση, την αξιολόγηση της ανάλυσης από ομότιμους κριτές. Επειδή αναγνωρίζεται ότι οι διαδικασίες ετοιμασίας των αντικειμενοφόρων πλακών προκαλούν συχνά θραύση ενός ποσοστού μεταφασικών κυττάρων με συνακόλουθη απώλεια χρωμοσωμάτων, τα καταμετρούμενα κύτταρα θα πρέπει να περιέχουν αριθμό κεντρομεριδίων τουλάχιστον ίσο με 2n ± 2, όπου n είναι ο απλοειδής αριθμός χρωμοσωμάτων για το εξεταζόμενο ζωικό είδος.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Επεξεργασία των αποτελεσμάτων

Τα δεδομένα για κάθε ζώο θα πρέπει να παρουσιάζονται σε μορφή πίνακα. Ο μιτωτικός δείκτης, ο αριθμός των καταμετρηθέντων μεταφασικών κυττάρων, ο αριθμός εκτροπών ανά μεταφασικό κύτταρο και το ποσοστό των μεταφασικών κυττάρων με δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές θα πρέπει να αξιολογούνται για κάθε ζώο. Οι διάφοροι τύποι δομικών χρωμοσωμικών εκτροπών θα πρέπει να αναφέρονται με τον αριθμό και τη συχνότητά τους για τις ομάδες μεταχείρισης και τις ομάδες μαρτύρων. Τα χάσματα, καθώς και τα πολυπλοειδή κύτταρα και τα κύτταρα με ενδοαναδιπλασιασμένα χρωμοσώματα καταγράφονται χωριστά. Η συχνότητα των χασμάτων αναφέρεται αλλά γενικά δεν περιλαμβάνεται στην ανάλυση της συχνότητας των συνολικών δομικών εκτροπών. Εφόσον δεν υπάρχουν ενδείξεις διαφοράς αποκρίσεως μεταξύ των φύλων, τα δεδομένα μπορούν να συνδυάζονται για στατιστική ανάλυση. Θα πρέπει επίσης να αναφέρονται δεδομένα σχετικά με την τοξικότητα για τα ζώα και με τα κλινικά σημεία.

Κριτήρια αποδοχής

Τα ακόλουθα κριτήρια καθορίζουν την αποδοχή της δοκιμής:

Αξιολόγηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων

Υπό την προϋπόθεση ότι πληρούνται όλα τα κριτήρια αποδοχής, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς θετική εάν:

Εάν εξετάζεται μόνο η ανώτατη δόση σε συγκεκριμένο χρόνο δειγματοληψίας, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς θετική εάν προκύπτει στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τον παράλληλο αρνητικό μάρτυρα και τα αποτελέσματα βρίσκονται εκτός της κατανομής των ιστορικών δεδομένων για αρνητικούς μάρτυρες (π.χ. όρια ελέγχου σε επίπεδο 95 % με βάση την κατανομή Poisson). Συστάσεις για τις πλέον κατάλληλες στατιστικές μεθόδους παρέχονται στη βιβλιογραφία (13). Όταν διενεργείται ανάλυση της σχέσης δόσης-απόκρισης, θα πρέπει να αναλύονται τουλάχιστον τρεις ομάδες που έλαβαν δόσεις. Στις στατιστικές δοκιμασίες θα πρέπει να χρησιμοποιείται το ζώο ως πειραματική μονάδα. Τα θετικά αποτελέσματα της δοκιμής χρωμοσωμικών εκτροπών υποδηλώνουν ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία επάγει δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές στον μυελό των οστών του εξεταζόμενου ζωικού είδους.

Υπό την προϋπόθεση ότι πληρούνται όλα τα κριτήρια αποδοχής, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς αρνητική εάν, σε όλες τις πειραματικές συνθήκες που εξετάστηκαν:

Συστάσεις για τις πλέον κατάλληλες στατιστικές μεθόδους έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (13). Στα στοιχεία που αποδεικνύουν την έκθεση του μυελού των οστών σε υπό δοκιμή χημική ουσία μπορεί να περιλαμβάνονται η μείωση του μιτωτικού δείκτη και η μέτρηση των επιπέδων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο πλάσμα ή στο αίμα. Στην περίπτωση ενδοφλέβιας χορήγησης, δεν απαιτούνται αποδεικτικά στοιχεία της έκθεσης. Εναλλακτικά, για να αποδειχθεί η έκθεση του μυελού των οστών, μπορούν να χρησιμοποιηθούν δεδομένα ADME (απορρόφηση-κατανομή-μεταβολισμός-απέκκριση) που προκύπτουν από ανεξάρτητη μελέτη με τη χρησιμοποίηση της ίδιας οδού χορήγησης και του ίδιου ζωικού είδους. Τα αρνητικά αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι, στις συνθήκες της δοκιμής, η υπό δοκιμή χημική ουσία δεν επάγει δομικές χρωμοσωμικές εκτροπές στον μυελό των οστών του εξεταζόμενου ζωικού είδους.

Δεν απαιτείται επαλήθευση των σαφώς θετικών ή σαφώς αρνητικών αποκρίσεων.

Σε περίπτωση που η απόκριση δεν είναι σαφώς θετική ούτε σαφώς αρνητική και για να διαπιστωθεί η βιολογική σημασία ενός αποτελέσματος (π.χ. ασθενής ή οριακή αύξηση), τα δεδομένα θα πρέπει να αξιολογούνται κατά την κρίση των ειδικών και/ή με περαιτέρω διερεύνηση των υφιστάμενων ολοκληρωμένων πειραμάτων. Σε ορισμένες περιπτώσεις, θα είναι ενδεχομένως χρήσιμη η ανάλυση περισσότερων κυττάρων ή η επανάληψη του πειράματος με τη χρήση τροποποιημένων πειραματικών συνθηκών.

Σε σπάνιες περιπτώσεις, ακόμη και μετά από περαιτέρω διερεύνηση, τα δεδομένα δεν επιτρέπουν την εξαγωγή συμπεράσματος για θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα με την υπό δοκιμή χημική ουσία και, κατά συνέπεια, η μελέτη κρίνεται διφορούμενη.

Οι συχνότητες εμφάνισης μεταφασικών κυττάρων με πολυπλοειδία και ενδοαναδιπλασιασμό επί του συνόλου των μεταφασικών κυττάρων θα πρέπει να καταγράφονται χωριστά. Η αύξηση του αριθμού κυττάρων με πολυπλοειδία και/ή ενδοαναδιπλασιασμό μπορεί να σημαίνει ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία είναι δυνάμει ικανή να αναστέλλει τις μιτωτικές διεργασίες ή την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (βλ. παράγραφο 3).

Έκθεση δοκιμής

Στην έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνονται τα ακόλουθα στοιχεία:

Συνοπτική παρουσίαση

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(5)

Στο μέρος B, το Κεφάλαιο Β.12 αντικαθίσταται από το ακόλουθο κείμενο:

«Β.12   Δοκιμή μικροπυρήνων σε ερυθροκύτταρα θηλαστικών

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών 474 του ΟΟΣΑ (2016). Αποτελεί μέρος μιας σειράς μεθόδων δοκιμών γενετικής τοξικολογίας. Έχει συνταχθεί ένα έγγραφο του ΟΟΣΑ με συνοπτικές πληροφορίες για τις δοκιμές γενετικής τοξικολογίας και μια επισκόπηση των πρόσφατων αλλαγών που έγιναν σε αυτές τις κατευθυντήριες γραμμές δοκιμών (1).

Η δοκιμή μικροπυρήνων in vivo σε θηλαστικά είναι ιδιαίτερα σημαντική για την αξιολόγηση της γονιδιοτοξικότητας, διότι οι παράγοντες των διεργασιών μεταβολισμού, φαρμακοκινητικής και επιδιόρθωσης του DΝΑ in vivo, αν και μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των ειδών, είναι ενεργοί και συμβάλλουν στις αποκρίσεις. Οι προσδιορισμοί in vivo είναι επίσης χρήσιμοι για την περαιτέρω διερεύνηση της γονιδιοτοξικότητας που ανιχνεύεται με σύστημα in vitro.

Η δοκιμή μικροπυρήνων in vivo σε θηλαστικά χρησιμοποιείται για την ανίχνευση βλαβών που επάγει η υπό δοκιμή χημική ουσία στα χρωμοσώματα ή στη μιτωτική άτρακτο των ερυθροβλαστών. Με τη δοκιμή αξιολογείται ο σχηματισμός μικροπυρήνων σε δείγματα ερυθροκυττάρων που λαμβάνονται από τον μυελό των οστών ή το περιφερικό αίμα ζώων, συνήθως τρωκτικών.

Σκοπός της δοκιμής μικροπυρήνων είναι ο εντοπισμός χημικών ουσιών που προκαλούν κυτταρογενετική βλάβη η οποία απολήγει στον σχηματισμό μικροπυρήνων που περιέχουν είτε καθυστερημένα (lagging) χρωμοσωμικά θραύσματα είτε ολόκληρα χρωμοσώματα.

Όταν οι ερυθροβλάστες του μυελού των οστών αναπτυχθούν σε άωρα ερυθροκύτταρα (γνωστά και ως πολυχρωματικά ερυθροκύτταρα ή δικτυοερυθροκύτταρα), ο κύριος πυρήνας εκβάλλεται, ενώ οι μικροπυρήνες που έχουν σχηματιστεί μπορεί να παραμείνουν στο κυτταρόπλασμα. Η απεικόνιση ή ανίχνευση των μικροπυρήνων διευκολύνεται στα κύτταρα αυτά, επειδή δεν έχουν κύριο πυρήνα. Η αύξηση του ποσοστού των άωρων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες στα ζώα που υποβάλλονται σε μεταχείριση αποτελεί ένδειξη επαγόμενων δομικών ή αριθμητικών χρωμοσωμικών εκτροπών.

Τα νεοσχηματισμένα ερυθροκύτταρα με μικροπυρήνες αναγνωρίζονται και ποσοτικοποιούνται με χρώση, την οποία ακολουθεί είτε οπτική καταμέτρηση με μικροσκόπιο είτε αυτόματη ανάλυση. Η καταμέτρηση επαρκούς πλήθους άωρων ερυθροκυττάρων στο περιφερικό αίμα ή στον μυελό των οστών ενήλικων ζώων διευκολύνεται σε μεγάλο βαθμό με τη χρήση συστήματος αυτόματης μέτρησης. Τα συστήματα αυτά είναι αποδεκτές εναλλακτικές επιλογές αντί της μη αυτόματης αξιολόγησης (2). Συγκριτικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι εν λόγω μέθοδοι, με τη χρήση κατάλληλων προτύπων διακρίβωσης, μπορούν να παρέχουν καλύτερη ενδοεργαστηριακή και διεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα και ευαισθησία από τη μη αυτόματη μικροσκοπική μέτρηση (3) (4). Στα αυτόματα συστήματα με τα οποία είναι δυνατόν να μετρηθεί η συχνότητα ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες περιλαμβάνονται, μεταξύ άλλων, τα κυτταρόμετρα ροής (5), τα συστήματα ανάλυσης εικόνων (6) (7) και τα κυτταρόμετρα με σάρωση λέιζερ (8).

Τα χρωμοσωμικά θραύσματα μπορούν να διακριθούν από τα πλήρη χρωμοσώματα με βάση ορισμένα κριτήρια, αν και η διάκριση αυτή κατά κανόνα δεν αποτελεί μέρος της δοκιμής. Στα κριτήρια αυτά περιλαμβάνεται η διαπίστωση της παρουσίας ή απουσίας κινητοχώρου ή κεντρομεριδιακού DNA, στοιχείων που χαρακτηρίζουν τα ακέραια χρωμοσώματα. Η απουσία κινητοχώρου ή κεντρομεριδιακού DNA δείχνει ότι ο μικροπυρήνας περιέχει μόνο θραύσματα χρωμοσωμάτων, ενώ η παρουσία τους είναι ενδεικτική της απώλειας χρωμοσωμάτων.

Οι ορισμοί των χρησιμοποιούμενων όρων παρατίθενται στο προσάρτημα 1.

ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ

Ο ιστός-στόχος των γενετικών βλαβών στην παρούσα δοκιμή είναι ο μυελός των οστών νεαρών ενήλικων τρωκτικών, καθώς τα ερυθροκύτταρα παράγονται σε αυτόν τον ιστό. Η μέτρηση μικροπυρήνων σε άωρα ερυθροκύτταρα του περιφερικού αίματος είναι αποδεκτή σε άλλα είδη θηλαστικών, για τα οποία έχει καταδειχθεί επαρκής ευαισθησία για την ανίχνευση χημικών ουσιών που προκαλούν δομικές ή αριθμητικές χρωμοσωμικές εκτροπές στα κύτταρα αυτά (με επαγωγή μικροπυρήνων σε άωρα ερυθροκύτταρα) και υπό τον όρο ότι παρέχεται επιστημονική αιτιολόγηση. Η συχνότητα άωρων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες είναι το κύριο τελικό σημείο. Η συχνότητα ώριμων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες στο περιφερικό αίμα μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως τελικό σημείο σε είδη χωρίς ισχυρή σπληνική επιλογή κατά των κυττάρων με μικροπυρήνες και όταν τα ζώα υποβάλλονται σε μεταχείριση συνεχώς για περίοδο που υπερβαίνει τη διάρκεια ζωής των ερυθροκυττάρων στο χρησιμοποιούμενο είδος (π.χ. 4 εβδομάδες ή περισσότερο στους ποντικούς).

Εάν υπάρχουν ενδείξεις ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία ή οι μεταβολίτες της δεν θα φθάσουν στον στοχευόμενο ιστό, μπορεί να μην ενδείκνυται η χρήση της παρούσας δοκιμής.

Πριν από τη χρήση της μεθόδου δοκιμών σε μείγμα για την παραγωγή δεδομένων για συγκεκριμένο ρυθμιστικό σκοπό, θα πρέπει να εξετάζεται αν — και, εάν ναι, για ποιον λόγο — αυτή μπορεί να αποδώσει επαρκή αποτελέσματα για τον επιδιωκόμενο σκοπό. Οι εκτιμήσεις αυτές δεν είναι αναγκαίες όταν οι κανονιστικές ρυθμίσεις επιβάλλουν τον έλεγχο του μείγματος.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ

Τα ζώα εκτίθενται στην υπό δοκιμή χημική ουσία μέσω κατάλληλης οδού. Εάν χρησιμοποιείται μυελός των οστών, τα ζώα θανατώνονται με ευθανασία σε κατάλληλο χρόνο μετά τη μεταχείριση, εξάγεται ο μυελός των οστών και ακολουθεί επίστρωση και χρώση παρασκευασμάτων (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Όταν χρησιμοποιείται περιφερικό αίμα, το αίμα συλλέγεται σε κατάλληλο χρόνο μετά τη μεταχείριση και ακολουθεί επίστρωση και χρώση παρασκευασμάτων (12) (16) (17) (18). Σε περίπτωση οξείας εκτέλεσης της μεταχείρισης, είναι σημαντικό να επιλέγονται χρόνοι λήψης μυελού των οστών ή αιμοληψιών κατά τους οποίους μπορεί να ανιχνευθεί η σχετιζόμενη με την αγωγή επαγωγή μικροπύρηνων στα άωρα ερυθροκύτταρα. Στην περίπτωση της λήψης περιφερικού αίματος, πρέπει επίσης να έχει παρέλθει αρκετός χρόνος, ώστε τα συμβάντα αυτά να εμφανιστούν στην κυκλοφορία του αίματος. Τα παρασκευάσματα εξετάζονται για να διαπιστωθεί η παρουσία μικροπυρήνων, με παρατήρηση με τη χρήση μικροσκοπίου, ανάλυση εικόνων, κυτταρομετρία ροής ή κυτταρομετρία με σάρωση λέιζερ.

ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ

Έρευνες τεχνικής ικανότητας

Για να τεκμηριώσει πως διαθέτει επαρκή εμπειρία στη διεξαγωγή της δοκιμής πριν τη χρησιμοποιήσει για δοκιμές ρουτίνας, το εργαστήριο θα πρέπει να έχει αποδείξει την ικανότητα αναπαραγωγής των αναμενόμενων αποτελεσμάτων από δημοσιευμένα δεδομένα στις βιβλιογραφικές παραπομπές (17) (19) (20) (21) (22) για συχνότητες μικροπυρήνων, με τουλάχιστον δύο χημικές ουσίες που αποτελούν θετικούς μάρτυρες (συμπεριλαμβανομένων ασθενών αποκρίσεων που επάγονται από χαμηλές δόσεις θετικών μαρτύρων), όπως αυτές που απαριθμούνται στον πίνακα 1, καθώς και με συμβατούς μάρτυρες με φορέα/διαλύτη (βλ. παράγραφο 26). Στα πειράματα αυτά θα πρέπει να χρησιμοποιούνται δόσεις που επιφέρουν αναπαραγώγιμες και σχετιζόμενες με τη δόση αυξήσεις και να καταδεικνύονται η ευαισθησία και το δυναμικό εύρος του συστήματος δοκιμής στον στοχευόμενο ιστό (μυελός των οστών ή περιφερικό αίμα) και με τη χρήση της μεθόδου καταμέτρησης που πρόκειται να εφαρμοστεί στο εργαστήριο. Αυτή η απαίτηση δεν ισχύει για τα εργαστήρια που έχουν πείρα, δηλ. διαθέτουν βάση ιστορικών δεδομένων, όπως ορίζεται στις παραγράφους 14-18.

Ιστορικά δεδομένα μαρτύρων

Κατά τη διάρκεια των ερευνών τεχνικής ικανότητας, το εργαστήριο θα πρέπει να καθορίζει:

Κατά την αρχική συγκέντρωση ιστορικών δεδομένων για κατανομή όσον αφορά τους αρνητικούς μάρτυρες, οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει να συμφωνούν με τα δημοσιευμένα δεδομένα για μάρτυρες, εφόσον υπάρχουν. Καθώς θα προστίθενται περισσότερα πειραματικά δεδομένα στην κατανομή των ιστορικών δεδομένων μαρτύρων, οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει, στην ιδανική περίπτωση, να βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 % της εν λόγω κατανομής. Η βάση ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για αρνητικούς μάρτυρες θα πρέπει να είναι στατιστικά ανθεκτική για να διασφαλίζει την ικανότητα του εργαστηρίου να αξιολογεί την κατανομή των δεδομένων του που αφορούν τους αρνητικούς μάρτυρες. Από τη βιβλιογραφία συνάγεται ότι ενδέχεται να απαιτούνται τουλάχιστον 10 πειράματα, αν και είναι προτιμότερο η βάση δεδομένων να αποτελείται από τουλάχιστον 20 πειράματα που έχουν εκτελεστεί σε συγκρίσιμες πειραματικές συνθήκες. Τα εργαστήρια θα πρέπει να χρησιμοποιούν μεθόδους ποιοτικού ελέγχου, όπως διαγράμματα ελέγχου [π.χ. διαγράμματα C ή X-bar (23)], για να προσδιορίζουν τη μεταβλητότητα των δεδομένων τους και να αποδεικνύουν ότι έχουν «υπό έλεγχο» τη μεθοδολογία. Περαιτέρω συστάσεις για τον τρόπο δημιουργίας και χρήσης των ιστορικών δεδομένων (δηλ. κριτήρια προσθήκης στοιχείων στα ιστορικά δεδομένα και αποκλεισμού στοιχείων από αυτά, καθώς και κριτήρια αποδοχής συγκεκριμένου πειράματος) έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (24).

Εάν το εργαστήριο δεν συμπληρώσει επαρκή αριθμό πειραμάτων για τον καθορισμό στατιστικά ανθεκτικής κατανομής αρνητικών μαρτύρων (βλ. παράγραφο 15) κατά τη διάρκεια των ερευνών τεχνικής ικανότητας (που περιγράφονται στην παράγραφο 13), είναι αποδεκτή η κατασκευή της κατανομής κατά τις πρώτες δοκιμές ρουτίνας. Κατά την εφαρμογή της προσέγγισης αυτής θα πρέπει να τηρούνται οι συστάσεις που έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (24) και τα αποτελέσματα που προκύπτουν για τους αρνητικούς μάρτυρες στα σχετικά πειράματα θα πρέπει και πάλι να συμφωνούν με τα δημοσιευμένα δεδομένα για αρνητικούς μάρτυρες.

Κάθε αλλαγή του πειραματικού πρωτοκόλλου θα πρέπει να μελετάται υπό το πρίσμα της επίπτωσής της στη διατήρηση της συμφωνίας των δεδομένων που προκύπτουν προς την υφιστάμενη βάση ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για μάρτυρες. Μόνο σημαντικές ανακολουθίες θα πρέπει να έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία νέας βάσης ιστορικών δεδομένων για μάρτυρες, εφόσον οι ειδικοί κρίνουν ότι διαφέρει από την προηγούμενη κατανομή (βλ. παράγραφο 15). Για τη διεξαγωγή πραγματικής δοκιμής κατά την περίοδο της αντικατάστασης, ενδέχεται να μην είναι αναγκαία μια πλήρης βάση δεδομένων για αρνητικούς μάρτυρες, με την προϋπόθεση ότι το εργαστήριο μπορεί να αποδείξει ότι οι τιμές του για τους παράλληλους αρνητικούς μάρτυρες εξακολουθούν να συμφωνούν είτε με την προηγούμενη βάση δεδομένων του είτε με τα αντίστοιχα δημοσιευμένα δεδομένα.

Τα δεδομένα για αρνητικούς μάρτυρες θα πρέπει να είναι η επίπτωση άωρων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες σε κάθε ζώο. Οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει, στην ιδανική περίπτωση, να βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 % της κατανομής της βάσης ιστορικών δεδομένων του εργαστηρίου για αρνητικούς μάρτυρες. Όταν τα δεδομένα για παράλληλους αρνητικούς μάρτυρες δεν βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου σε επίπεδο 95 %, μπορεί να είναι αποδεκτή η προσθήκη τους στην κατανομή των ιστορικών δεδομένων μαρτύρων, εφόσον τα εν λόγω δεδομένα δεν είναι ακραίες έκτοπες τιμές και υπάρχουν στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το σύστημα δοκιμής είναι «υπό έλεγχο» (βλ. παράγραφο 15) και ότι δεν πρόκειται για τεχνικό ή ανθρώπινο σφάλμα.

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Προετοιμασίες

Επιλογή ζωικού είδους

Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα ζώα που ανήκουν σε συνήθεις εργαστηριακές φυλές. Επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται ποντικοί, επίμυες ή άλλο κατάλληλο είδος θηλαστικών. Όταν χρησιμοποιείται περιφερικό αίμα, πρέπει να είναι βέβαιο ότι η απομάκρυνση των μικροπύρηνων κυττάρων από την κυκλοφορία μέσω του σπλήνα δεν υπονομεύει την ανίχνευση επαγόμενων μικροπυρήνων στο επιλεγμένο ζωικό είδος. Αυτό έχει καταδειχθεί σαφώς για το περιφερικό αίμα ποντικών και επίμυων (2). Η επιστημονική αιτιολόγηση της χρήσης άλλων ειδών εκτός από επίμυες και ποντικούς θα πρέπει να περιλαμβάνεται στην έκθεση δοκιμής. Εάν χρησιμοποιούνται άλλα είδη εκτός των τρωκτικών, συνιστάται να ενσωματώνεται η μέτρηση των επαγόμενων μικροπυρήνων σε άλλη κατάλληλη δοκιμή τοξικότητας.

Συνθήκες στέγασης και σίτισης των ζώων

Για τα τρωκτικά, η θερμοκρασία στην αίθουσα των ζώων θα πρέπει να είναι 22 °C (± 3 °C). Η σχετική υγρασία, η ιδανική τιμή της οποίας είναι 50-60 %, θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 40 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού της αίθουσας. Ο φωτισμός θα πρέπει να είναι τεχνητός, με φωτοπερίοδο 12 ωρών. Για τη διατροφή των ζώων μπορούν να χρησιμοποιούνται τα κλασικά εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται με την τροφή, η ανάγκη επαρκούς πρόσμειξης της ουσίας είναι δυνατόν να επηρεάσει την επιλογή σιτηρεσίου. Τα τρωκτικά θα πρέπει να στεγάζονται σε μικρές ομάδες (όχι περισσότερα από πέντε ανά κλωβό) του ίδιου φύλου και της ίδιας μεταχείρισης, εφόσον δεν αναμένεται επιθετική συμπεριφορά, κατά προτίμηση σε κλωβούς με συμπαγές δάπεδο με κατάλληλο εμπλουτισμό του περιβάλλοντος. Η ατομική στέγαση των ζώων επιτρέπεται, μόνον εάν αιτιολογείται επιστημονικά.

Προετοιμασία των ζώων

Κατά κανόνα χρησιμοποιούνται υγιή νεαρά ενήλικα ζώα (για τα τρωκτικά, η ιδανική ηλικία είναι μεταξύ 6 και 10 εβδομάδων κατά την έναρξη της μεταχείρισης, αν και είναι επίσης αποδεκτά ζώα λίγο μεγαλύτερης ηλικίας), τα οποία κατανέμονται τυχαία στις ομάδες μαρτύρων και μεταχείρισης. Τα ζώα ταυτοποιούνται μοναδικά με χρήση ανώδυνης, ελάχιστα επεμβατικής μεθόδου (π.χ. δακτύλιοι, ετικέτες, μικροτσίπ ή βιομετρική ταυτοποίηση, αλλά όχι αποκοπή τμήματος αυτιού ή δακτύλου). Οι κλωβοί θα πρέπει να διατάσσονται με τρόπο ώστε να ελαχιστοποιούνται οι πιθανές επιδράσεις της θέσης τους. Θα πρέπει να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση από τον θετικό μάρτυρα και την υπό δοκιμή χημική ουσία. Στην αρχή της δοκιμής, οι διαφορές βάρους των ζώων θα πρέπει να είναι ελάχιστες και να μην υπερβαίνουν το ± 20 % του μέσου βάρους κάθε φύλου.

Παρασκευή των δόσεων

Οι στερεές υπό δοκιμή χημικές ουσίες θα πρέπει να διαλύονται ή να διασπείρονται (σχηματισμός εναιωρήματος) σε κατάλληλους διαλύτες ή φορείς ή να αναμειγνύονται με την τροφή ή το πόσιμο νερό, πριν χορηγηθούν στα ζώα. Οι υγρές υπό δοκιμή χημικές ουσίες μπορούν να χορηγούνται ως έχουν ή να αραιώνονται πριν από τη χορήγηση. Σε περίπτωση έκθεσης μέσω της εισπνοής, οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες μπορούν να χορηγούνται ως αέριο, ατμοί ή αερόλυμα στερεού/υγρού, ανάλογα με τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, εκτός αν τα στοιχεία σχετικά με τη σταθερότητά της καταδεικνύουν ότι είναι αποδεκτή η φύλαξή της και καθορίζουν τις κατάλληλες συνθήκες φύλαξης.

Συνθήκες δοκιμής

Διαλύτης/φορέας:

Ο διαλύτης/φορέας θα πρέπει να μην έχει τοξικές επιδράσεις στα χρησιμοποιούμενα επίπεδα δόσεων ούτε ικανότητα χημικής αντίδρασης με τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες. Εφόσον χρησιμοποιείται άλλος διαλύτης/φορέας εκτός των καθιερωμένων, η χρήση του θα πρέπει να τεκμηριώνεται με δεδομένα αναφοράς που αποδεικνύουν τη συμβατότητά του. Συνιστάται, εφόσον είναι δυνατό, να εξετάζεται πρώτα αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί υδατικός διαλύτης/φορέας. Παραδείγματα ευρέως χρησιμοποιούμενων συμβατών διαλυτών/φορέων είναι, μεταξύ άλλων, το νερό, ο φυσιολογικός ορός (ισότονο αλατούχο διάλυμα), το διάλυμα μεθυλοκυτταρίνης, το διάλυμα άλατος της καρβοξυμεθυλοκυτταρίνης με νάτριο, το ελαιόλαδο και το αραβοσιτέλαιο. Εάν δεν υπάρχουν ιστορικά ή δημοσιευμένα δεδομένα για μάρτυρες, που να αποδεικνύουν ότι ο επιλεγμένος ασυνήθης διαλύτης/φορέας δεν επάγει μικροπυρήνες ή άλλες επιβλαβείς επιδράσεις, θα πρέπει να διεξάγεται αρχική μελέτη για να διαπιστώνεται αν είναι αποδεκτός ο μάρτυρας με διαλύτη/φορέα.

Μάρτυρες

Θετικοί μάρτυρες

Κάθε δοκιμή θα πρέπει κανονικά να περιλαμβάνει μια ομάδα ζώων που υποβάλλονται σε μεταχείριση με χημική ουσία η οποία χρησιμεύει ως θετικός μάρτυρας. Η εν λόγω ομάδα μπορεί να παραλείπεται, εάν το εργαστήριο δοκιμών έχει αποδείξει την τεχνική του ικανότητα διεξαγωγής της δοκιμής και έχει καθορίσει εύρος ιστορικών δεδομένων για θετικούς μάρτυρες. Εάν δεν συμπεριλαμβάνεται ομάδα παράλληλων θετικών μαρτύρων, κάθε πείραμα θα πρέπει να περιλαμβάνει μάρτυρες καταμέτρησης (μονιμοποιημένες αντικειμενοφόρες πλάκες χωρίς χρώση ή δείγματα κυτταρικών εναιωρημάτων, όπως ενδείκνυται για τη μέθοδο καταμέτρησης). Οι εν λόγω μάρτυρες μπορούν να ληφθούν με την προσθήκη κατάλληλων δειγμάτων αναφοράς κατά την καταμέτρηση στο πλαίσιο της μελέτης, τα οποία έχουν ληφθεί και φυλαχθεί από χωριστό πείραμα με θετικούς μάρτυρες που εκτελείται σε τακτά διαστήματα (π.χ. ανά 6 έως 18 μήνες), για παράδειγμα, κατά τον έλεγχο της τεχνικής ικανότητας και, στη συνέχεια, σε τακτική βάση, όποτε είναι αναγκαίο.

Οι χημικές ουσίες που χρησιμεύουν ως θετικοί μάρτυρες θα πρέπει να προκαλούν με αξιοπιστία ανιχνεύσιμη αύξηση της συχνότητας μικροπυρήνων σε σχέση με την αυθόρμητη συχνότητα. Όταν χρησιμοποιείται μη αυτόματη καταμέτρηση με μικροσκόπιο, οι δόσεις θετικών μαρτύρων θα πρέπει να επιλέγονται κατά τρόπο ώστε οι επιδράσεις να είναι σαφείς, αλλά να μην αποκαλύπτουν αμέσως την ταυτότητα των κωδικοποιημένων δειγμάτων στον εξεταστή. Είναι αποδεκτό να χορηγούνται οι θετικοί μάρτυρες και από οδό διαφορετική από εκείνη της χορήγησης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, με τη χρήση διαφορετικού προγράμματος αγωγής, και να διενεργείται η δειγματοληψία μόνο σε μία χρονική στιγμή. Επιπροσθέτως, μπορεί να εξετάζεται το ενδεχόμενο χρήσης θετικών μαρτύρων συγγενούς χημικής τάξης, κατά περίπτωση. Παραδείγματα χημικών ουσιών που αποτελούν θετικούς μάρτυρες περιλαμβάνονται στον πίνακα 1.

Πίνακας 1

Παραδείγματα χημικών ουσιών που αποτελούν θετικούς μάρτυρες

Χημικές ουσίες και αριθ. CAS (CASRN)

Μεθανοσουλφονικός αιθυλεστέρας [CASRN 62-50-0]

Μεθανοσουλφονικός μεθυλεστέρας [CASRN 66-27-3]

Αιθυλονιτροζουρία [CASRN 759-73-9]

Μιτομυκίνη C [CASRN 50-07-7]

Κυκλοφωσφαμίδιο (μονοένυδρο) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Τριαιθυλενομελαμίνη [CASRN 51-18-3]

Κολχικίνη [CASRN 64-86-8] ή βινβλαστίνη [CASRN 865-21-4] — ως ανευπλοειδογόνες ουσίες

Αρνητικοί μάρτυρες

Σε κάθε χρόνο δειγματοληψίας θα πρέπει να περιλαμβάνεται ομάδα ζώων ως αρνητικός μάρτυρας, η οποία υφίσταται τους ίδιους χειρισμούς όπως οι ομάδες μεταχείρισης, με μόνη διαφορά το ότι δεν εκτίθεται στην υπό δοκιμή χημική ουσία. Εάν για τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας χρησιμοποιείται διαλύτης/φορέας, αυτός θα πρέπει να χορηγείται και στην ομάδα-μάρτυρα. Ωστόσο, εάν από ιστορικά δεδομένα του εργαστηρίου δοκιμών για αρνητικούς μάρτυρες προκύπτει σταθερή μεταβλητότητα και συχνότητα μικροπύρηνων κυττάρων μεταξύ των ζώων σε κάθε δειγματοληψία, μπορεί να απαιτείται μία μόνο δειγματοληψία για τον αρνητικό μάρτυρα. Σε περίπτωση μίας μόνο δειγματοληψίας για τους αρνητικούς μάρτυρες, αυτή θα πρέπει να διενεργείται κατά τον χρόνο της πρώτης δειγματοληψίας στο πλαίσιο της μελέτης.

Εάν χρησιμοποιείται περιφερικό αίμα, τότε αντί του παράλληλου αρνητικού μάρτυρα στις βραχυχρόνιες μελέτες επιτρέπεται να χρησιμοποιηθεί δείγμα που λαμβάνεται πριν από τη μεταχείριση, όταν τα προκύπτοντα δεδομένα συμφωνούν με τη βάση ιστορικών δεδομένων για μάρτυρες του εργαστηρίου δοκιμών. Έχει αποδειχθεί στους επίμυες ότι η προ της μεταχείρισης δειγματοληψία μικρών ποσοτήτων (π.χ. κάτω των 100 μl/ημέρα) έχει ελάχιστο αντίκτυπο στη συχνότητα υποβάθρου των μικροπυρήνων (25).

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Αριθμός και φύλο των ζώων

Σε γενικές γραμμές, η απόκριση μικροπυρήνων είναι παρόμοια μεταξύ των αρσενικών και θηλυκών ζώων και, ως εκ τούτου, οι περισσότερες μελέτες θα μπορούσαν να πραγματοποιούνται σε οποιοδήποτε φύλο (26). Δεδομένα που καταδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ αρσενικών και θηλυκών ζώων (π.χ. διαφορές συστημικής τοξικότητας, μεταβολισμού, βιοδιαθεσιμότητας, τοξικότητας για τον μυελό των οστών, κ.λπ., συμπεριλαμβανομένων, π.χ., δεδομένων από μελέτη προσδιορισμού εύρους τιμών) ενθαρρύνουν τη χρησιμοποίηση ζώων και των δύο φύλων. Στην περίπτωση αυτή, ίσως είναι σκόπιμο να διεξάγεται μελέτη και στα δύο φύλα, π.χ. στο πλαίσιο μελετών τοξικότητας με επαναλαμβανόμενες δόσεις. Σε περίπτωση χρήσης και των δύο φύλων, θα ήταν ενδεχομένως σκόπιμη η εφαρμογή παραγοντικού σχεδιασμού. Λεπτομέρειες σχετικά με τον τρόπο ανάλυσης των δεδομένων με τη χρήση αυτού του σχεδιασμού παρέχονται στο προσάρτημα 2.

Το μέγεθος των ομάδων κατά την έναρξη της μελέτης θα πρέπει να καθορίζεται με γνώμονα την εξασφάλιση, ανά ομάδα, 5 τουλάχιστον αναλύσιμων ζώων του ίδιου φύλου ή, εάν χρησιμοποιούνται ζώα και των δύο φύλων, από κάθε φύλο. Όταν η έκθεση του ανθρώπου σε μια χημική ουσία αφορά μόνο το ένα φύλο, όπως π.χ. στην περίπτωση ορισμένων φαρμακευτικών προϊόντων, η δοκιμή θα πρέπει να διεξάγεται σε ζώα του αντίστοιχου φύλου. Ενδεικτικά, όσον αφορά τις μέγιστες τυπικές απαιτήσεις για τα ζώα, για τη διεξαγωγή μελέτης σε μυελό των οστών σύμφωνα με τις παραμέτρους που καθορίζονται στην παράγραφο 37 με τρεις ομάδες δόσης και παράλληλους αρνητικούς και θετικούς μάρτυρες (κάθε ομάδα αποτελούμενη από πέντε ζώα του ίδιου φύλου) θα απαιτούνταν 25 έως 35 ζώα.

Επίπεδα δόσεων

Εάν χρειάζεται προκαταρκτική μελέτη προσδιορισμού εύρους τιμών επειδή δεν υπάρχουν ήδη κατάλληλα δεδομένα για να υποβοηθήσουν την επιλογή δόσεων, η εν λόγω μελέτη θα πρέπει να διεξάγεται στο ίδιο εργαστήριο, με τη χρήση του ίδιου είδους, φυλής, φύλου ζώων και σχήματος μεταχείρισης όπως στην κύρια μελέτη (27). Η μελέτη θα πρέπει να αποσκοπεί στον προσδιορισμό της μέγιστης ανεκτής δόσης (ΜΑΔ), η οποία ορίζεται ως η ανώτατη δόση που μπορεί να γίνει ανεκτή χωρίς εκδήλωση τοξικότητας η οποία θα περιόριζε τη μελέτη, σε σχέση με τη διάρκεια της μελέτης [π.χ. που προκαλεί μείωση του σωματικού βάρους ή κυτταροτοξικότητα στο αιμοποιητικό σύστημα, αλλά όχι θάνατο ή εκδήλωση πόνου, ταλαιπωρίας ή δυσφορίας που καθιστούν αναγκαία τη θανάτωση με ευθανασία (28)].

Ως ανώτατη δόση μπορεί επίσης να οριστεί η δόση που προκαλεί τοξικότητα στον μυελό των οστών (π.χ. μείωση του ποσοστού άωρων ερυθροκυττάρων επί του συνόλου των ερυθροκυττάρων στον μυελό των οστών ή στο περιφερικό αίμα κατά περισσότερο από 50 %, όχι όμως σε επίπεδα κάτω του 20 % της τιμής του μάρτυρα). Ωστόσο, κατά την ανάλυση των θετικών στον δείκτη CD71 κυττάρων στην περιφερειακή κυκλοφορία του αίματος (δηλ. με κυτταρομετρία ροής), αυτό το πολύ νεαρό κλάσμα άωρων ερυθροκυττάρων αποκρίνεται σε τοξικές προκλήσεις ταχύτερα από ό,τι η μεγαλύτερη κοόρτη άωρων ερυθροκυττάρων που είναι θετική για το RNA. Συνεπώς, ενδέχεται να εκδηλωθεί υψηλότερη φαινομενική τοξικότητα με πειραματικούς σχεδιασμούς οξείας έκθεσης, στους οποίους εξετάζεται το θετικό στον δείκτη CD71 κλάσμα άωρων ερυθροκυττάρων, σε σύγκριση με εκείνους στους οποίους τα άωρα ερυθροκύτταρα ταυτοποιούνται με βάση το RNA που περιέχουν. Για τον λόγο αυτό, όταν στα πειράματα προβλέπονται πέντε ή λιγότερες ημέρες μεταχείρισης, το ανώτατο επίπεδο δόσης για τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες που προκαλούν τοξικότητα μπορεί να οριστεί ως η δόση που προκαλεί στατιστικά σημαντική μείωση του ποσοστού των θετικών στον δείκτη CD71 άωρων ερυθροκυττάρων επί του συνόλου των ερυθροκυττάρων, η οποία πάντως δεν φθάνει σε επίπεδα κάτω του 5 % της τιμής του μάρτυρα (29).

Οι χημικές ουσίες που παρουσιάζουν κορεσμό τοξικοκινητικών ιδιοτήτων ή επάγουν διεργασίες αποτοξίνωσης που μπορεί να επιφέρουν μείωση της έκθεσης μετά από μακροχρόνια χορήγηση ίσως αποτελούν εξαιρέσεις από τα κριτήρια καθορισμού των δόσεων και θα πρέπει να αξιολογούνται κατά περίπτωση.

Για να ληφθούν πληροφορίες σχετικά με τη σχέση δόσης-απόκρισης, μια ολοκληρωμένη μελέτη θα πρέπει να περιλαμβάνει ομάδα αρνητικού μάρτυρα και τουλάχιστον τρία επίπεδα δόσεων, τα οποία κατά κανόνα διαφέρουν κατά έναν συντελεστή ίσο με το 2, αλλά πάντως όχι μεγαλύτερο του 4. Εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία δεν προκαλεί τοξικότητα σε μελέτη προσδιορισμού εύρους τιμών ή με βάση τα υπάρχοντα δεδομένα, η ανώτατη δόση για περίοδο χορήγησης 14 ημερών και άνω θα πρέπει να είναι 1 000 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα ή, για περιόδους χορήγησης που δεν υπερβαίνουν τις 14 ημέρες, 2 000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα. Ωστόσο, εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία προκαλεί τοξικότητα, η ΜΑΔ θα πρέπει να είναι η ανώτατη χορηγούμενη δόση και τα χρησιμοποιούμενα επίπεδα δόσεων θα πρέπει, κατά προτίμηση, να καλύπτουν το εύρος από τη μέγιστη δόση μέχρι τη δόση που προκαλεί ελάχιστη ή μηδενική τοξικότητα. Όταν παρατηρείται τοξικότητα στον στοχευόμενο ιστό (μυελό των οστών) σε όλα τα ελεγχόμενα επίπεδα δόσεων, συνιστάται η διεξαγωγή περαιτέρω μελέτης με μη τοξικές δόσεις. Οι μελέτες που αποσκοπούν στον πληρέστερο χαρακτηρισμό των ποσοτικών στοιχείων σχετικά με τη σχέση δόσης-απόκρισης ενδέχεται να απαιτούν πρόσθετες ομάδες δόσης. Για ορισμένα είδη υπό δοκιμή χημικών ουσιών (π.χ. φαρμακευτικά προϊόντα για τον άνθρωπο) που καλύπτονται από ειδικές απαιτήσεις, αυτά τα όρια μπορεί να διαφέρουν.

Οριακή δοκιμή

Εάν τα πειράματα προσδιορισμού εύρους δόσεων ή υφιστάμενα δεδομένα για συγγενείς φυλές ζώων δείχνουν ότι ένα σχήμα μεταχείρισης με τουλάχιστον την οριακή δόση (που περιγράφεται κατωτέρω) δεν επιφέρει παρατηρήσιμες τοξικές επιδράσεις (που περιλαμβάνουν την απουσία μείωσης του πολλαπλασιασμού του μυελού των οστών ή άλλης ένδειξης κυτταροτοξικότητας στον στοχευόμενο ιστό) και δεν αναμένεται γονιδιοτοξικότητα με βάση μελέτες γονιδιοτοξικότητας in vitro ή δεδομένα για χημικές ουσίες παρόμοιας δομής, μπορεί να κριθεί περιττή η διεξαγωγή πλήρους μελέτης με τρία επίπεδα δόσεων, υπό τον όρο ότι έχει αποδειχθεί ότι οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες φθάνουν στον στοχευόμενο ιστό (μυελός των οστών). Σε αυτές τις περιπτώσεις, ενδέχεται να αρκεί ένα μόνο επίπεδο δόσης, ίσο με την οριακή δόση. Για περιόδους χορήγησης 14 ημερών και άνω, η οριακή δόση είναι 1 000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα. Για περιόδους χορήγησης που δεν υπερβαίνουν τις 14 ημέρες, η οριακή δόση είναι 2 000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα.

Χορήγηση των δόσεων

Κατά τον σχεδιασμό της δοκιμής θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η προβλεπόμενη οδός έκθεσης του ανθρώπου. Επιτρέπεται επομένως η αιτιολογημένη επιλογή οδών έκθεσης όπως μέσω της τροφής ή του πόσιμου νερού, με τοπική εφαρμογή, υποδόρια ή ενδοφλέβια ένεση, από το στόμα (με στομαχικό καθετήρα), μέσω της εισπνοής, η ενδοτραχειακή οδός ή η εμφύτευση. Σε κάθε περίπτωση, η οδός έκθεσης θα πρέπει να επιλέγεται κατά τρόπο ώστε να εξασφαλίζεται επαρκής έκθεση του ή των στοχευόμενων ιστών). Η ενδοπεριτοναϊκή ένεση δεν συνιστάται κατά κανόνα, διότι δεν αποτελεί σκοπούμενη οδό έκθεσης του ανθρώπου, και θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο με ειδική επιστημονική αιτιολόγηση. Εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία αναμειγνύεται με την τροφή ή το πόσιμο νερό, ιδίως στην περίπτωση των εφάπαξ δόσεων, θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε το διάστημα μεταξύ της κατανάλωσης νερού και τροφής και της δειγματοληψίας να επαρκεί για την ανίχνευση των επιδράσεων (βλ. παράγραφο 37). Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί με στομαχικό καθετήρα ή ένεση κάθε φορά εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Ο όγκος δεν θα πρέπει κανονικά να υπερβαίνει το 1 ml/100 g σωματικού βάρους, εκτός από την περίπτωση των υδατικών διαλυμάτων, όπου επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται κατά μέγιστο όριο 2 ml/100 g σωματικού βάρους. Η χρήση μεγαλύτερων όγκων θα πρέπει να αιτιολογείται. Η μεταβλητότητα των όγκων δοκιμής θα πρέπει να ελαχιστοποιείται με ρύθμιση της συγκέντρωσης, ώστε να εξασφαλίζεται η χορήγηση σταθερού όγκου σε σχέση με το σωματικό βάρος σε όλα τα επίπεδα δόσεων, εκτός από την περίπτωση των ερεθιστικών ή διαβρωτικών χημικών ουσιών, των οποίων οι επιδράσεις κατά κανόνα επιδεινώνονται όταν αυξάνονται οι συγκεντρώσεις.

Πρόγραμμα μεταχείρισης

Κατά προτίμηση, εκτελούνται 2 ή περισσότερες μεταχειρίσεις, με μεσοδιαστήματα 24 ωρών, ιδίως στις περιπτώσεις ενσωμάτωσης της παρούσας δοκιμής σε άλλες μελέτες τοξικότητας. Εναλλακτικά, μπορούν να πραγματοποιούνται εφάπαξ μεταχειρίσεις, εάν αυτό αιτιολογείται επιστημονικά (π.χ. υπό δοκιμή χημικές ουσίες που είναι γνωστό ότι παρεμποδίζουν τον κυτταρικό κύκλο). Οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες μπορούν επίσης να χορηγούνται σε διαιρεμένες δόσεις, δηλ. δύο ή περισσότερες δόσεις την ίδια ημέρα, με διαφορά μικρότερη από 2-3 ώρες, για να διευκολύνεται η χορήγηση μεγάλων όγκων. Υπό τις περιστάσεις αυτές ή κατά τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας μέσω της εισπνοής, ο χρόνος δειγματοληψίας θα πρέπει να προγραμματίζεται με βάση τον χρόνο της τελευταίας χορήγησης ή το τέλος της έκθεσης.

Η δοκιμή μπορεί να διεξαχθεί σε ποντικούς ή επίμυες με τρεις τρόπους:

Επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται άλλα σχήματα δοσολογίας ή δειγματοληψίας, εφόσον έχουν σημασία και αιτιολογούνται επιστημονικά, καθώς και για να διευκολυνθεί η ενσωμάτωση σε άλλες τοξικολογικές δοκιμές.

Παρατηρήσεις

Τα πειραματόζωα θα πρέπει να υποβάλλονται σε γενική κλινική εξέταση και τα κλινικά σημεία να καταγράφονται τουλάχιστον μία φορά ημερησίως, κατά προτίμηση την ίδια ώρα και λαμβανομένου υπόψη του χρόνου κορύφωσης των αναμενόμενων επιδράσεων μετά τη χορήγηση της δόσης. Όλα τα ζώα θα πρέπει να εξετάζονται τουλάχιστον δύο φορές ημερησίως κατά την περίοδο της χορήγησης για τη διαπίστωση τυχόν νοσηρότητας και θνησιμότητας. Όλα τα ζώα θα πρέπει να ζυγίζονται κατά την έναρξη της μελέτης, τουλάχιστον μία φορά εβδομαδιαίως κατά τη διεξαγωγή μελετών επαναλαμβανόμενων δόσεων και κατά την ευθανασία. Σε μελέτες διάρκειας τουλάχιστον μίας εβδομάδας, η κατανάλωση τροφής θα πρέπει να μετράται τουλάχιστον εβδομαδιαίως. Εάν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται με το πόσιμο νερό, η κατανάλωση νερού θα πρέπει να μετράται σε κάθε αλλαγή νερού και τουλάχιστον εβδομαδιαίως. Τα ζώα που εμφανίζουν μη θανατηφόρους δείκτες υπερβολικής τοξικότητας θα πρέπει να υποβάλλονται σε ευθανασία πριν από τη λήξη της περιόδου δοκιμής (28). Υπό ορισμένες περιστάσεις, θα μπορούσε να παρακολουθείται η θερμοκρασία σώματος των ζώων, δεδομένου ότι η οφειλόμενη στη μεταχείριση υπερθερμία και υποθερμία έχει ενοχοποιηθεί για λανθασμένα αποτελέσματα (32) (33) (34).

Έκθεση του στοχευόμενου ιστού

Θα πρέπει να λαμβάνεται δείγμα αίματος σε κατάλληλους χρόνους για να είναι δυνατή η διερεύνηση των επιπέδων των υπό δοκιμή χημικών ουσιών στο πλάσμα, ώστε να αποδεικνύεται η έκθεση του μυελού των οστών, όταν αυτό δικαιολογείται και δεν υπάρχουν άλλα δεδομένα έκθεσης (βλ. παράγραφο 48).

Παρασκεύασμα μυελού των οστών/αίματος

Τα κύτταρα μυελού των οστών λαμβάνονται συνήθως από τα μηριαία ή τα κνημιαία οστά των ζώων αμέσως μετά τη θανάτωσή τους με ευθανασία. Τα κύτταρα συνήθως αφαιρούνται και ακολουθεί επίστρωση και χρώση παρασκευασμάτων με τη χρήση καθιερωμένων μεθόδων. Μπορούν να ληφθούν μικρές ποσότητες περιφερικού αίματος, σύμφωνα με τα κατάλληλα πρότυπα καλής μεταχείρισης των ζώων, είτε με τη χρήση μεθόδου που επιτρέπει την επιβίωση του πειραματόζωου, όπως η αιμοληψία από την ουραία φλέβα ή άλλο κατάλληλο αιμοφόρο αγγείο, είτε με καρδιακή παρακέντηση ή δειγματοληψία από μεγάλο αγγείο κατά την ευθανασία του ζώου. Τόσο για τα ερυθροκύτταρα μυελού των οστών όσο και για εκείνα που προέρχονται από περιφερικό αίμα, ανάλογα με την αναλυτική μέθοδο, είναι δυνατή η άμεση υπερζωτική χρώση (16) (17) (18), η παρασκευή επιχρισμάτων ακολουθούμενη από χρώση για μικροσκοπική εξέταση, ή η μονιμοποίηση και κατάλληλη χρώση για ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Με τη χρήση ειδικής για το DNA χρώσης [π.χ. πορτοκαλί της ακριδίνης (35) ή Hoechst 33258 και πυρονίνη-Y (36)] είναι δυνατόν να εξαλειφθούν ορισμένα από τα τεχνητά αποτελέσματα που οφείλονται στη χρήση μη ειδικών για το DNA χρώσεων. Το πλεονέκτημα αυτό δεν αποκλείει τη χρήση συμβατικών χρώσεων (π.χ. Giemsa για μικροσκοπική ανάλυση). Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν πρόσθετα συστήματα [π.χ. στήλες κυτταρίνης για την απομάκρυνση εμπύρηνων κυττάρων (37) (38)], υπό την προϋπόθεση ότι τα συστήματα αυτά έχουν αποδειχθεί συμβατά με την προετοιμασία των δειγμάτων στο εργαστήριο.

Όταν εφαρμόζονται αυτές οι μέθοδοι, μπορούν να χρησιμοποιούνται αντισώματα κατά του κινητοχώρου (39), φθορίζουσα υβριδοποίηση in situ (Fluorescent In Situ Hybridization/FISH) με παγκεντρομεριδιακούς ανιχνευτές DNA (40) ή σήμανση in situ με ειδικούς για τα παγκεντρομερίδια εκκινητές, σε συνδυασμό με κατάλληλη αντίχρωση του DNA (41), με σκοπό την εξακρίβωση του είδους των μικροπυρήνων (χρωμόσωμα/χρωμοσωμικό θραύσμα), ώστε να διαπιστώνεται αν ο μηχανισμός επαγωγής μικροπυρήνων συνδέεται με κλαστογόνο και/ή ανευπλοειδογόνο δράση. Επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται και άλλες μέθοδοι διάκρισης μεταξύ κλαστογόνων και ανευπλοειδογόνων ουσιών, εάν έχει αποδειχθεί η αποτελεσματικότητά τους.

Ανάλυση (μη αυτόματη και αυτόματη)

Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες ή τα δείγματα για ανάλυση, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που αντιστοιχούν στους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, θα πρέπει να λαμβάνουν ανεξάρτητο κωδικό προτού γίνει οποιουδήποτε είδους ανάλυση και να τυχαιοποιούνται, έτσι ώστε ο μη αυτόματος εξεταστής να μη γνωρίζει τη συνθήκη μεταχείρισης· τέτοια κωδικοποίηση δεν είναι απαραίτητη όταν χρησιμοποιούνται αυτόματα συστήματα καταμέτρησης που δεν βασίζονται σε οπτική εξέταση και δεν μπορούν να επηρεαστούν από μεροληψία του χειριστή. Προσδιορίζεται για κάθε ζώο το ποσοστό άωρων ερυθροκυττάρων επί του συνόλου των ερυθροκυττάρων (άωρα + ώριμα), με καταμέτρηση τουλάχιστον 500 ερυθροκυττάρων, προκειμένου για μυελό των οστών, και 2 000 ερυθροκυττάρων στην περίπτωση του περιφερικού αίματος (42). Για τον προσδιορισμό της επίπτωσης (incidence) των άωρων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες θα πρέπει να καταμετρώνται τουλάχιστον 4 000 άωρα ερυθροκύτταρα ανά ζώο (43). Εάν η βάση ιστορικών δεδομένων για αρνητικούς μάρτυρες δείχνει ότι η μέση συχνότητα υποβάθρου των άωρων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες είναι < 0,1 % στο εργαστήριο δοκιμών, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο καταμέτρησης επιπλέον κυττάρων. Κατά την ανάλυση των δειγμάτων, το ποσοστό άωρων ερυθροκυττάρων επί του συνόλου των ερυθροκυττάρων στα ζώα που έχουν υποβληθεί σε μεταχείριση θα πρέπει να μην είναι μικρότερο από το 20 % της τιμής του μάρτυρα με φορέα/διαλύτη κατά την καταμέτρηση με μικροσκόπιο και όχι μικρότερο από το 5 % περίπου της τιμής του μάρτυρα με φορέα/διαλύτη κατά την καταμέτρηση θετικών στον δείκτη CD71 άωρων ερυθροκυττάρων με κυτταρομετρικές μεθόδους (βλ. παράγραφο 31) (29). Για παράδειγμα, στην περίπτωση της δοκιμής σε μυελό των οστών με καταμέτρηση με μικροσκοπία, αν η αναλογία άωρων ερυθροκυττάρων στον μυελό των οστών του μάρτυρα είναι 50 %, το ανώτατο όριο τοξικότητας θα είναι 10 % άωρων ερυθροκυττάρων.

Επειδή ο σπλήνας του επίμυος απομονώνει και καταστρέφει τα ερυθροκύτταρα με μικροπυρήνες, για τη διατήρηση υψηλής ευαισθησίας του προσδιορισμού κατά την ανάλυση περιφερικού αίματος επίμυος, είναι προτιμότερο να περιορίζεται στο νεαρότερο κλάσμα η ανάλυση των άωρων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες. Κατά τη χρήση μεθόδων αυτόματης ανάλυσης, αυτά τα πλέον άωρα ερυθροκύτταρα μπορούν να ταυτοποιούνται με βάση την υψηλή τους περιεκτικότητα σε RNA ή το υψηλό επίπεδο υποδοχέων τρανσφερρίνης (θετικά στον δείκτη CD71) που εκφράζονται στην επιφάνειά τους (31). Ωστόσο, από την άμεση σύγκριση των διαφορετικών μεθόδων χρώσης προέκυψε ότι μπορούν να επιτευχθούν ικανοποιητικά αποτελέσματα με διάφορες μεθόδους, συμπεριλαμβανομένης της συμβατικής χρώσης με πορτοκαλί της ακριδίνης (3) (4).

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Επεξεργασία των αποτελεσμάτων

Τα δεδομένα για κάθε ζώο θα πρέπει να παρουσιάζονται σε μορφή πίνακα. Για κάθε εξεταζόμενο ζώο θα πρέπει να καταγράφεται χωριστά ο αριθμός καταμετρηθέντων άωρων ερυθροκυττάρων, ο αριθμός άωρων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες και η αναλογία των άωρων στο σύνολο των ερυθροκυττάρων. Όταν ποντικοί υποβάλλονται σε μεταχείριση συνεχώς επί 4 εβδομάδες ή περισσότερο, θα πρέπει να παρέχονται και τα δεδομένα που αφορούν τον αριθμό και το ποσοστό των ώριμων ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνες, εάν συλλέγονται. Θα πρέπει επίσης να αναφέρονται δεδομένα σχετικά με την τοξικότητα στα ζώα και με τα κλινικά σημεία.

Κριτήρια αποδοχής

Τα ακόλουθα κριτήρια καθορίζουν την αποδοχή της δοκιμής:

Αξιολόγηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων

Υπό την προϋπόθεση ότι πληρούνται όλα τα κριτήρια αποδοχής, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς θετική εάν:

Εάν εξετάζεται μόνο η ανώτατη δόση σε συγκεκριμένο χρόνο δειγματοληψίας, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς θετική εάν προκύπτει στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τον παράλληλο αρνητικό μάρτυρα και τα αποτελέσματα βρίσκονται εκτός της κατανομής των ιστορικών δεδομένων για αρνητικούς μάρτυρες (π.χ. όρια ελέγχου σε επίπεδο 95 % με βάση την κατανομή Poisson). Συστάσεις για τις πλέον κατάλληλες στατιστικές μεθόδους έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (44) (45) (46) (47). Όταν διενεργείται ανάλυση της σχέσης δόσης-απόκρισης, θα πρέπει να αναλύονται τουλάχιστον τρεις ομάδες που έλαβαν δόσεις. Στις στατιστικές δοκιμασίες θα πρέπει να χρησιμοποιείται το ζώο ως πειραματική μονάδα. Τα θετικά αποτελέσματα στη δοκιμή μικροπυρήνων δείχνουν ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία επάγει τον σχηματισμό μικροπυρήνων, που είναι αποτέλεσμα χρωμοσωμικής βλάβης ή βλάβης στη μιτωτική άτρακτο των ερυθροβλαστών του εξεταζόμενου ζωικού είδους. Σε περίπτωση διεξαγωγής δοκιμής για την ανίχνευση κεντρομεριδίων στο εσωτερικό μικροπυρήνων, η επαγωγή του σχηματισμού μικροπυρήνων που περιέχουν κεντρομερίδια (κεντρομεριδιακό DNA ή κινητοχώρο, ενδεικτικό απώλειας πλήρους χρωμοσώματος) από την υπό δοκιμή ουσία αποδεικνύει ότι αυτή είναι ανευπλοειδογόνο.

Υπό την προϋπόθεση ότι πληρούνται όλα τα κριτήρια αποδοχής, η υπό δοκιμή χημική ουσία θεωρείται σαφώς αρνητική εάν, σε όλες τις πειραματικές συνθήκες που εξετάστηκαν:

Συστάσεις για τις πλέον κατάλληλες στατιστικές μεθόδους έχουν διατυπωθεί στη βιβλιογραφία (44) (45) (46) (47). Τα αποδεικτικά στοιχεία έκθεσης του μυελού των οστών σε υπό δοκιμή χημική ουσία μπορεί να περιλαμβάνουν τη μείωση του λόγου των άωρων προς τα ώριμα ερυθροκύτταρα και τη μέτρηση των επιπέδων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο πλάσμα ή στο αίμα. Σε περίπτωση ενδοφλέβιας χορήγησης, δεν απαιτούνται αποδεικτικά στοιχεία έκθεσης. Εναλλακτικά, για να αποδειχθεί η έκθεση του μυελού των οστών, μπορούν να χρησιμοποιηθούν δεδομένα ADME (απορρόφηση-κατανομή-μεταβολισμός-απέκκριση) που προκύπτουν από ανεξάρτητη μελέτη με τη χρησιμοποίηση της ίδιας οδού χορήγησης και του ίδιου ζωικού είδους. Τα αρνητικά αποτελέσματα δείχνουν ότι, υπό τις συνθήκες της δοκιμής, η υπό δοκιμή χημική ουσία δεν επιφέρει τον σχηματισμό μικροπυρήνων στα άωρα ερυθροκύτταρα του εξεταζόμενου ζωικού είδους.

Δεν απαιτείται επαλήθευση των σαφώς θετικών ή σαφώς αρνητικών αποκρίσεων.

Σε περίπτωση που η απόκριση δεν είναι σαφώς θετική ούτε σαφώς αρνητική και για να διαπιστωθεί η βιολογική σημασία ενός αποτελέσματος (π.χ. ασθενής ή οριακή αύξηση), τα δεδομένα θα πρέπει να αξιολογούνται κατά την κρίση των ειδικών και/ή με περαιτέρω διερεύνηση των υφιστάμενων ολοκληρωμένων πειραμάτων. Σε ορισμένες περιπτώσεις, θα είναι ενδεχομένως χρήσιμη η ανάλυση περισσότερων κυττάρων ή η επανάληψη του πειράματος με τη χρήση τροποποιημένων πειραματικών συνθηκών.

Σε σπάνιες περιπτώσεις, ακόμη και μετά από περαιτέρω διερεύνηση, τα δεδομένα δεν επιτρέπουν την εξαγωγή συμπεράσματος για θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα με την υπό δοκιμή χημική ουσία και, κατά συνέπεια, η μελέτη κρίνεται διφορούμενη.

Έκθεση δοκιμής

Στην έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνονται τα ακόλουθα στοιχεία:

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(6)

Στο μέρος Β, το κεφάλαιο Β.15 απαλείφεται.

(7)

Στο μέρος Β, το κεφάλαιο Β.16 απαλείφεται.

(8)

Στο μέρος Β, το κεφάλαιο Β.18 απαλείφεται.

(9)

Στο μέρος Β, το κεφάλαιο Β.19 απαλείφεται.

(10)

Στο μέρος Β, το κεφάλαιο Β.20 απαλείφεται.

(11)

Στο μέρος Β, το κεφάλαιο Β.24 απαλείφεται.

(12)

Στο μέρος B, το Κεφάλαιο Β.47 αντικαθίσταται από το ακόλουθο:

«B.47   Μέθοδος δοκιμών αδιαφάνειας και διαπερατότητας του βόειου κερατοειδούς για τον προσδιορισμό i) χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη και ii) χημικών ουσιών που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 437 του ΟΟΣΑ (2013). Η μέθοδος δοκιμών αδιαφάνειας και διαπερατότητας του βόειου κερατοειδούς (Bovine Corneal Opacity and Permeability/BCOP) αξιολογήθηκε από τη Διυπηρεσιακή Συντονιστική Επιτροπή για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ICCVAM) των Ηνωμένων Πολιτειών, σε σύμπραξη με το Ευρωπαϊκό Κέντρο για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ECVAM) και το Ιαπωνικό Κέντρο για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (JaCVAM), το 2006 και το 2010 (1)(2). Κατά την πρώτη αξιολόγηση, αξιολογήθηκε η χρησιμότητα της μεθόδου δοκιμών BCOP για τον προσδιορισμό χημικών προϊόντων (ουσιών και μειγμάτων) που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη (1). Κατά τη δεύτερη αξιολόγηση, αξιολογήθηκε η χρησιμότητα της μεθόδου δοκιμών BCOP για τον προσδιορισμό χημικών προϊόντων (ουσιών και μειγμάτων) που δεν ταξινομούνται ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη (2). Η βάση δεδομένων επικύρωσης της BCOP περιείχε συνολικά 113 ουσίες και 100 μείγματα (2) (3). Από τις εν λόγω αξιολογήσεις και την επανεξέτασή τους από ομότιμους κριτές διαπιστώθηκε ότι με τη μέθοδο δοκιμών μπορούν να προσδιοριστούν σωστά τα χημικά προϊόντα (τόσο οι ουσίες όσο και τα μείγματα) που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη (κατηγορίας 1), καθώς και εκείνα που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, όπως ορίζονται στο Παγκοσμίως Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης και Επισήμανσης Χημικών Προϊόντων (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals/GHS) των Ηνωμένων Εθνών (4) και στον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1272/2008 για την ταξινόμηση, την επισήμανση και τη συσκευασία των ουσιών και των μειγμάτων (Classification, Labelling and Packaging/CLP) (7) και, ως εκ τούτου, η μέθοδος εγκρίθηκε ως επιστημονικά έγκυρη και για τους δύο σκοπούς. Σοβαρή οφθαλμική βλάβη είναι η πρόκληση βλάβης στους ιστούς των οφθαλμών ή η σοβαρή μείωση της όρασης, η οποία εμφανίζεται μετά την εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην εμπρόσθια επιφάνεια του οφθαλμού και δεν είναι πλήρως αναστρέψιμη εντός 21 ημερών από την εφαρμογή της ουσίας. Οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη ταξινομούνται ως κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών. Οι χημικές ουσίες που δεν ταξινομούνται ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη ορίζονται ως εκείνες που δεν πληρούν τις απαιτήσεις για να ταξινομηθούν ως κατηγορίας 1 ή 2 (2Α ή 2Β) του GHS των Ηνωμένων Εθνών, δηλ. οι αναφερόμενες ως «καμίας κατηγορίας» του GHS των Ηνωμένων Εθνών. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών περιλαμβάνει τη συνιστώμενη χρήση και τους περιορισμούς της μεθόδου δοκιμών BCOP βάσει των αξιολογήσεών της. Οι βασικές διαφορές μεταξύ του αρχικού κειμένου των κατευθυντήριων γραμμών του ΟΟΣΑ, του 2009, και της επικαιροποιημένης έκδοσης του 2013 περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, τις εξής: τη χρήση της μεθόδου δοκιμών BCOP για τον χαρακτηρισμό χημικών ουσιών για τις οποίες δεν απαιτείται ταξινόμηση σύμφωνα με το GHS των Ηνωμένων Εθνών (παράγραφοι 2 και 7)· διευκρινίσεις σχετικά με την εφαρμοσιμότητα της μεθόδου δοκιμών BCOP στον έλεγχο αλκοολών, κετονών και στερεών (παράγραφοι 6 και 7), καθώς και ουσιών και μειγμάτων (παράγραφος 8)· διευκρινίσεις σχετικά με τον τρόπο ελέγχου των επιφανειοδραστικών (τασιενεργών) ουσιών και των μειγμάτων που περιέχουν επιφανειοδραστικές ουσίες (παράγραφος 28)· επικαιροποιήσεις και διευκρινίσεις σχετικά με τους θετικούς μάρτυρες (παράγραφοι 39 και 40)· επικαιροποίηση των κριτηρίων της μεθόδου δοκιμών BCOP για τη λήψη αποφάσεων (παράγραφος 47)· επικαιροποίηση των κριτηρίων αποδοχής της μελέτης (παράγραφος 48)· επικαιροποίηση των στοιχείων της έκθεσης δοκιμής (παράγραφος 49)· επικαιροποίηση του προσαρτήματος 1 που περιέχει τους ορισμούς· προσθήκη του προσαρτήματος 2 για την ικανότητα πρόβλεψης της μεθόδου δοκιμών BCOP στο πλαίσιο διαφόρων συστημάτων ταξινόμησης· επικαιροποίηση του προσαρτήματος 3 που περιέχει κατάλογο των χημικών ουσιών ελέγχου ικανότητας· και επικαιροποίηση του προσαρτήματος 4 σχετικά με τη διάταξη συγκράτησης κερατοειδούς στη μέθοδο BCOP (παράγραφος 1) και το αδιαφανόμετρο (παράγραφοι 2 και 3).

Επί του παρόντος είναι γενικά αποδεκτό ότι, στο προβλέψιμο μέλλον, καμία μεμονωμένη δοκιμή οφθαλμικού ερεθισμού in vitro δεν θα μπορεί να αντικαταστήσει την in vivo οφθαλμική δοκιμή Draize στην πρόβλεψη σε ολόκληρο το φάσμα ερεθιστικότητας από τις διαφορετικές τάξεις χημικών ουσιών. Εντούτοις, στοχευμένοι συνδυασμοί διαφόρων εναλλακτικών μεθόδων δοκιμών στο πλαίσιο (κλιμακωτής) στρατηγικής δοκιμών θα μπορούσαν ενδεχομένως να αντικαταστήσουν την οφθαλμική δοκιμή Draize (5). Η καθοδική προσέγγιση (top-down) (5) έχει σχεδιαστεί για να χρησιμοποιείται όταν, βάσει των διαθέσιμων πληροφοριών, μια χημική ουσία αναμένεται να έχει υψηλό δυναμικό ερεθιστικότητας, ενώ η ανοδική προσέγγιση (bottom-up) (5) έχει σχεδιαστεί για να χρησιμοποιείται όταν, βάσει των διαθέσιμων πληροφοριών, μια χημική ουσία δεν αναμένεται να προκαλέσει ερεθισμό των οφθαλμών σε βαθμό τέτοιον ώστε να επιβάλλεται η ταξινόμησή της. Η μέθοδος δοκιμών BCOP είναι μέθοδος δοκιμών in vitro που μπορεί να χρησιμοποιείται, υπό ορισμένες περιστάσεις και με ειδικούς περιορισμούς, για την ταξινόμηση και την επισήμανση των χημικών ουσιών ως προς τον κίνδυνο για τους οφθαλμούς. Αν και δεν θεωρείται έγκυρη ως αυτοτελές υποκατάστατο της οφθαλμικής δοκιμής in vivo σε κουνέλια, η μέθοδος δοκιμών BCOP συνιστάται ως πρώτο στάδιο στρατηγικής δοκιμών, όπως η καθοδική προσέγγιση που προτείνουν οι Scott et al. (5), για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη, δηλ. χημικών ουσιών που πρέπει να ταξινομούνται ως κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών, χωρίς περαιτέρω δοκιμή (4). Η μέθοδος δοκιμών BCOP συνιστάται επίσης για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών για τις οποίες δεν απαιτείται ταξινόμηση ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, όπως ορίζονται στο GHS των Ηνωμένων Εθνών («καμίας κατηγορίας» του GHS των Ηνωμένων Εθνών) (4), στο πλαίσιο στρατηγικής δοκιμών όπως η ανοδική προσέγγιση (5). Ωστόσο, για τις χημικές ουσίες οι οποίες, όπως προβλέπεται βάσει της μεθόδου δοκιμών BCOP, δεν προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη ή δεν ταξινομούνται ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό/τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, θα απαιτούνται πρόσθετες δοκιμές (in vitro και/ή in vivo) για να κριθεί η οριστική τους ταξινόμηση.

Σκοπός της παρούσας μεθόδου δοκιμών είναι η περιγραφή των διαδικασιών που εφαρμόζονται για την αξιολόγηση του δυναμικού οφθαλμικού κινδύνου από την υπό δοκιμή ουσία, όπως αυτό μετράται από την ικανότητά της να προκαλεί αδιαφάνεια (θολερότητα) και αύξηση της διαπερατότητας σε απομονωμένο βόειο κερατοειδή. Οι τοξικές επιδράσεις στον κερατοειδή μετρώνται μέσω: i) της μειωμένης οπτικής διαπερατότητας (αδιαφάνεια) και ii) της αυξημένης διέλευσης της χρωστικής νατριούχου φλουορεσκεΐνης (διαπερατότητα). Οι αξιολογήσεις της αδιαφάνειας και της διαπερατότητας του κερατοειδούς κατόπιν έκθεσης σε υπό δοκιμή χημική ουσία συνδυάζονται για να εξαχθεί βαθμολογία ερεθιστικότητας in vitro (In Vitro Irritancy Score/IVIS), η οποία χρησιμοποιείται για την ταξινόμηση του βαθμού ερεθιστικότητας της υπό δοκιμή ουσίας.

Οι ορισμοί παρατίθενται στο προσάρτημα 1.

ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών βασίζεται στο πρωτόκολλο της ICCVAM για τη μέθοδο δοκιμών BCOP (6) (7), το οποίο αναπτύχθηκε αρχικά βάσει στοιχείων που ελήφθησαν από το πρωτόκολλο του ινστιτούτου Institute for In Vitro Sciences (IIVS) και το πρωτόκολλο INVITTOX 124 (8). Το τελευταίο αποτελεί το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη προεπικύρωσης που διενεργήθηκε κατά την περίοδο 1997-1998 με χορηγό την Ευρωπαϊκή Κοινότητα. Και τα δύο αυτά πρωτόκολλα βασίζονται στη μέθοδο δοκιμών BCOP που δημοσιεύτηκε για πρώτη φορά από τους Gautheron et al. (9).

Η μέθοδος δοκιμών BCOP μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη, όπως ορίζονται στο GHS των Ηνωμένων Εθνών, δηλ. χημικών ουσιών που πρέπει να ταξινομούνται ως κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών (4). Όταν χρησιμοποιείται για τον σκοπό αυτό, η μέθοδος δοκιμών BCOP έχει συνολική ορθότητα 79 % (150/191), ποσοστό ψευδοθετικής έκβασης 25 % (32/126) και ποσοστό ψευδοαρνητικής έκβασης 14 % (9/65), σε σύγκριση με την ταξινόμηση βάσει δεδομένων από τη μέθοδο οφθαλμικών δοκιμών in vivo σε κουνέλια σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών (3) (βλ. προσάρτημα 2, πίνακας 1). Όταν εξαιρούνται από τη βάση δεδομένων οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες ορισμένων τάξεων, χημικών (δηλ. αλκοόλες, κετόνες) ή φυσικών (στερεά), η μέθοδος δοκιμών BCOP έχει συνολική ορθότητα 85 % (111/131), ποσοστό ψευδοθετικής έκβασης 20 % (16/81) και ποσοστό ψευδοαρνητικής έκβασης 8 % (4/50) στο σύστημα ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών (3). Οι πιθανές αδυναμίες της μεθόδου δοκιμών BCOP, όταν χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη (κατηγορία 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών), οφείλονται στα υψηλά ποσοστά ψευδοθετικής έκβασης για τις αλκοόλες και τις κετόνες και ψευδοαρνητικής έκβασης για τα στερεά, που παρατηρήθηκαν στη βάση δεδομένων επικύρωσης (1)(2)(3). Επειδή, ωστόσο, η υπερπρόβλεψη με τη μέθοδο δοκιμών BCOP δεν αφορά όλες τις αλκοόλες και κετόνες και ορισμένες προβλέπονται σωστά ως ουσίες της κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών, αυτές οι δύο οργανικές δραστικές ομάδες δεν θεωρούνται εκτός του πεδίου εφαρμογής της μεθόδου δοκιμών. Εναπόκειται στον χρήστη της παρούσας μεθόδου δοκιμών να κρίνει αν η ενδεχόμενη υπερπρόβλεψη για αλκοόλη ή κετόνη είναι αποδεκτή ή αν πρέπει να διεξαχθούν περαιτέρω δοκιμές βασισμένες σε ανάλυση βάρους της απόδειξης. Όσον αφορά τα ποσοστά ψευδοαρνητικής έκβασης για τα στερεά, πρέπει να σημειωθεί ότι τα στερεά μπορεί να οδηγήσουν σε μεταβλητές και ακραίες συνθήκες έκθεσης στην in vivo δοκιμή οφθαλμικού ερεθισμού Draize, με αποτέλεσμα να προκύψουν άστοχες προβλέψεις του πραγματικού ερεθιστικού τους δυναμικού (10). Επισημαίνεται, επίσης, ότι καμία από τις ψευδοαρνητικές αποκρίσεις που εντοπίστηκαν στη βάση δεδομένων επικύρωσης της ICCVAM (2)(3), στο πλαίσιο του προσδιορισμού χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη (κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών), δεν είχε ως αποτέλεσμα τιμή IVIS ≤ 3, η οποία είναι το κριτήριο που χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό μιας υπό δοκιμή ουσίας ως «καμίας κατηγορίας» του GHS των Ηνωμένων Εθνών. Επιπλέον, μια ψευδοαρνητική έκβαση της δοκιμής BCOP στο πλαίσιο αυτό δεν είναι κρίσιμης σημασίας, διότι όλες οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες που δίνουν τιμή 3 < IVIS ≤ 55 υποβάλλονται ακολούθως σε άλλες, επαρκώς επικυρωμένες δοκιμές in vitro ή, ως έσχατη επιλογή, σε δοκιμές σε κουνέλια, ανάλογα με τις κανονιστικές απαιτήσεις, με τη χρήση στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών με βάση ανάλυση βάρους της απόδειξης. Δεδομένου ότι η μέθοδος δοκιμών BCOP προβλέπει σωστά ότι ορισμένες στερεές χημικές ουσίες είναι κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών, ούτε αυτή η φυσική κατάσταση θεωρείται εκτός του πεδίου εφαρμογής της μεθόδου δοκιμών. Οι ερευνητές μπορούν να εξετάζουν το ενδεχόμενο χρήσης της παρούσας μεθόδου δοκιμών για όλους τους τύπους χημικών ουσιών, οπότε και οι τιμές IVIS > 55 θα πρέπει να γίνονται δεκτές ως ενδεικτικές απόκρισης η οποία προκαλεί σοβαρή οφθαλμική βλάβη που θα πρέπει να ταξινομηθεί ως κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών χωρίς περαιτέρω δοκιμή. Πάντως, όπως έχει ήδη αναφερθεί, τυχόν θετικά αποτελέσματα για αλκοόλες ή κετόνες πρέπει να ερμηνεύονται προσεκτικά λόγω πιθανής υπερπρόβλεψης.

Η μέθοδος δοκιμών BCOP μπορεί επίσης να χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών για τις οποίες δεν απαιτείται ταξινόμηση ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη βάσει του συστήματος ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών (4). Όταν χρησιμοποιείται για τον σκοπό αυτό, η μέθοδος δοκιμών BCOP έχει συνολική ορθότητα 69 % (135/196), ποσοστό ψευδοθετικής έκβασης 69 % (61/89) και ποσοστό ψευδοαρνητικής έκβασης 0 % (0/107), σε σύγκριση με την ταξινόμηση βάσει δεδομένων από τη μέθοδο οφθαλμικών δοκιμών in vivo σε κουνέλια σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών (3) (βλ. προσάρτημα 2, πίνακας 2). Το ποσοστό ψευδοθετικής έκβασης που έχει προκύψει (για χημικές ουσίες «καμίας κατηγορίας» του GHS των Ηνωμένων Εθνών in vivo, οι οποίες δίνουν IVIS > 3, βλ. παράγραφο 47) είναι σημαντικά υψηλό, αλλά όχι κρίσιμης σημασίας σε αυτό το πλαίσιο, εφόσον όλες οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες που δίνουν τιμές 3 < IVIS ≤ 55 θα υποβάλλονται στη συνέχεια σε άλλες, επαρκώς επικυρωμένες δοκιμές in vitro ή, ως έσχατη επιλογή, σε δοκιμές σε κουνέλια, ανάλογα με τις κανονιστικές απαιτήσεις, με τη χρήση στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών με βάση ανάλυση βάρους της απόδειξης. Η μέθοδος δοκιμών BCOP δεν παρουσιάζει ειδικές αδυναμίες όσον αφορά τη διεξαγωγή δοκιμών με αλκοόλες, κετόνες και στερεά, όταν ο σκοπός είναι ο χαρακτηρισμός χημικών ουσιών για τις οποίες δεν απαιτείται ταξινόμηση ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη («καμίας κατηγορίας» του GHS των Ηνωμένων Εθνών) (3). Οι ερευνητές μπορούν να εξετάζουν το ενδεχόμενο χρήσης της παρούσας μεθόδου δοκιμών για όλους τους τύπους χημικών ουσιών, οπότε και τα αρνητικά αποτελέσματα (IVIS ≤ 3) θα πρέπει να γίνονται δεκτά ως ένδειξη ότι δεν απαιτείται ταξινόμηση («καμία κατηγορία» του GHS των Ηνωμένων Εθνών). Εφόσον με τη μέθοδο δοκιμών BCOP είναι δυνατόν να προσδιοριστεί σωστά μόνο το 31 % των χημικών ουσιών για τις οποίες δεν απαιτείται ταξινόμηση ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, η μέθοδος αυτή δεν θα πρέπει να είναι η πρώτη επιλογή για την έναρξη μιας ανοδικής προσέγγισης (5), εάν είναι διαθέσιμες άλλες επικυρωμένες και αποδεκτές μέθοδοι in vitro με παρόμοια υψηλή ευαισθησία, αλλά ανώτερη ειδικότητα.

Η βάση δεδομένων επικύρωσης της BCOP περιείχε συνολικά 113 ουσίες και 100 μείγματα (2) (3). Η μέθοδος δοκιμών BCOP κρίνεται, συνεπώς, εφαρμόσιμη στον έλεγχο τόσο ουσιών όσο και μειγμάτων.

Η μέθοδος δοκιμών BCOP δεν συνιστάται για τον προσδιορισμό υπό δοκιμή χημικών ουσιών που θα πρέπει να ταξινομηθούν ως ερεθιστικές για τους οφθαλμούς (κατηγορία 2 ή 2Α του GHS των Ηνωμένων Εθνών) ή ως ήπια ερεθιστικές για τους οφθαλμούς (κατηγορία 2Β του GHS των Ηνωμένων Εθνών), λόγω του σημαντικού αριθμού χημικών ουσιών της κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών που υποταξινομούνται ως κατηγορίας 2, 2Α ή 2Β και χημικών ουσιών «καμίας κατηγορίας» του GHS των Ηνωμένων Εθνών που υπερταξινομούνται ως κατηγορίας 2, 2A ή 2B (2)(3). Για τον σκοπό αυτό, ενδέχεται να απαιτούνται περαιτέρω δοκιμές με άλλη κατάλληλη μέθοδο.

Όλες οι διαδικασίες με βόειους οφθαλμούς και κερατοειδείς θα πρέπει να είναι σύμφωνες προς τους κανονισμούς και τις διαδικασίες που εφαρμόζονται στην εγκατάσταση δοκιμών για τον χειρισμό υλικών ζωικής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων, μεταξύ άλλων, των ιστών και ιστικών υγρών. Συνιστάται η τήρηση των γενικών εργαστηριακών προφυλάξεων (11).

Στη μέθοδο δοκιμών BCOP δεν λαμβάνονται υπόψη οι κακώσεις του επιπεφυκότος και της ίριδας, αλλά εξετάζονται οι επιδράσεις στον κερατοειδή, που είναι ο μείζων παράγων ταξινόμησης in vivo όσον αφορά το GHS των Ηνωμένων Εθνών. Ο αναστρέψιμος χαρακτήρας των βλαβών του κερατοειδούς δεν μπορεί να αξιολογηθεί αυτοτελώς στη μέθοδο δοκιμών BCOP. Έχει προταθεί ως δυνατότητα, βάσει των οφθαλμικών μελετών σε κουνέλια, η χρήση της αξιολόγησης του αρχικού βάθους της κάκωσης του κερατοειδούς για τον εντοπισμό ορισμένων τύπων μη αναστρέψιμων επιδράσεων (12). Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω επιστημονικές γνώσεις για να γίνει κατανοητός ο τρόπος με τον οποίο επέρχονται μη αναστρέψιμες επιδράσεις που δεν συνδέονται με μια αρχική σοβαρή βλάβη. Τέλος, η μέθοδος δοκιμών BCOP δεν καθιστά εφικτή την αξιολόγηση του δυναμικού συστημικής τοξικότητας που συνδέεται με την έκθεση των οφθαλμών.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών θα επικαιροποιείται ανά διαστήματα με βάση τις νέες πληροφορίες και τα δεδομένα. Για παράδειγμα, μια ιστοπαθολογική εξέταση ενδέχεται να είναι χρήσιμη όταν απαιτείται πληρέστερος χαρακτηρισμός της βλάβης του κερατοειδούς. Όπως επισημαίνεται στο έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 160 του ΟΟΣΑ (13), συνιστάται στους χρήστες να φυλάσσουν τους κερατοειδείς και να ετοιμάζουν δείγματα ιστοπαθολογικής εξέτασης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη βάσης δεδομένων και κριτηρίων λήψης αποφάσεων που θα μπορούσαν να βελτιώσουν περαιτέρω την ορθότητα της παρούσας μεθόδου δοκιμών.

Τα εργαστήρια που εφαρμόζουν για πρώτη φορά την παρούσα μέθοδο δοκιμών θα πρέπει να χρησιμοποιούν τις χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας που προβλέπονται στο προσάρτημα 3. Τα εργαστήρια μπορούν να χρησιμοποιούν αυτές τις χημικές ουσίες για να αποδεικνύουν την τεχνική ικανότητά τους όσον αφορά την εφαρμογή της μεθόδου δοκιμών BCOP πριν από την υποβολή δεδομένων που έχουν προκύψει από αυτή για την ταξινόμηση των κινδύνων στο πλαίσιο κανονιστικών ρυθμίσεων.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

Η μέθοδος δοκιμών BCOP είναι οργανοτυπικό μοντέλο που εξασφαλίζει βραχυχρόνια διατήρηση της κανονικής φυσιολογικής και βιοχημικής λειτουργίας του βόειου κερατοειδούς in vitro. Στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμών, η βλάβη που προκαλείται από την υπό δοκιμή χημική ουσία αξιολογείται με ποσοτικές μετρήσεις των μεταβολών της αδιαφάνειας και της διαπερατότητας του κερατοειδούς, με τη χρήση αδιαφανομέτρου και φασματοφωτομέτρου ορατού φωτός, αντιστοίχως. Αμφότερες οι μετρήσεις χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της IVIS, η οποία χρησιμοποιείται για την κατάταξη σε κατηγορία ταξινόμησης κινδύνου ερεθιστικότητας in vitro, με σκοπό την πρόβλεψη του δυναμικού οφθαλμικού ερεθισμού in vivo που ενέχει η υπό δοκιμή χημική ουσία (βλ. κριτήρια λήψης αποφάσεων στην παράγραφο 48).

Στη μέθοδο δοκιμών BCOP χρησιμοποιούνται κερατοειδείς που απομονώνονται από τους οφθαλμούς προσφάτως σφαχθέντων βοοειδών. Η κερατοειδική αδιαφάνεια μετράται ποσοτικά ως η ποσότητα φωτός που διέρχεται μέσω του κερατοειδούς. Η διαπερατότητα μετράται ποσοτικά ως η ποσότητα χρωστικής νατριούχου φλουορεσκεΐνης που διέρχεται από το πλήρες πάχος του κερατοειδούς, όπως ανιχνεύεται στο θρεπτικό μέσο του οπίσθιου θαλάμου. Οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες εφαρμόζονται στην επιθηλιακή επιφάνεια του κερατοειδούς με προσθήκη στον εμπρόσθιο θάλαμο της διάταξης συγκράτησης του κερατοειδούς. Στο προσάρτημα 4 παρατίθεται περιγραφή και διάγραμμα διάταξης συγκράτησης κερατοειδούς που χρησιμοποιείται στη μέθοδο δοκιμών BCOP. Οι διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς κυκλοφορούν στο εμπόριο ή κατασκευάζονται κατά παραγγελία.

Προέλευση και ηλικία των οφθαλμών βοοειδών και επιλογή ζωικού είδους

Τα βοοειδή που αποστέλλονται στα σφαγεία θανατώνονται συνήθως για κατανάλωση από τον άνθρωπο ή για άλλες εμπορικές χρήσεις. Οι κερατοειδείς που χρησιμοποιούνται στη μέθοδο δοκιμών BCOP προέρχονται μόνο από υγιή ζώα που θεωρούνται κατάλληλα για είσοδο στην ανθρώπινη τροφική αλυσίδα. Δεδομένου ότι το βάρος των βοοειδών ποικίλλει ανάλογα με τη φυλή, την ηλικία και το φύλο, δεν υπάρχει συνιστώμενο βάρος του ζώου κατά τη σφαγή.

Όταν χρησιμοποιούνται οφθαλμοί ζώων διαφορετικών ηλικιών ενδέχεται να προκύψουν διακυμάνσεις των διαστάσεων του κερατοειδούς. Κερατοειδείς με οριζόντια διάμετρο > 30,5 mm και κεντρικό πάχος (CCT) ≥ 1100 μm λαμβάνονται γενικά από βοοειδή ηλικίας άνω των οκτώ ετών, ενώ κερατοειδείς με οριζόντια διάμετρο < 28,5 mm και CCT < 900 μm από βοοειδή ηλικίας κάτω των πέντε ετών (14). Για τον λόγο αυτό, συνήθως δεν χρησιμοποιούνται οφθαλμοί βοοειδών ηλικίας άνω των 60 μηνών. Κατά παράδοση δεν χρησιμοποιούνται ούτε οφθαλμοί βοοειδών ηλικίας κάτω των 12 μηνών, διότι αυτοί δεν έχουν αναπτυχθεί πλήρως και το πάχος και η διάμετρος του κερατοειδούς υπολείπονται σημαντικά των τιμών που αναφέρονται για οφθαλμούς ενήλικων βοοειδών. Εντούτοις, επιτρέπεται η χρήση κερατοειδών νεαρών ζώων (δηλ. ηλικίας 6 έως 12 μηνών), επειδή παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα, όπως η αυξημένη διαθεσιμότητα, το περιορισμένο ηλικιακό εύρος και οι μειωμένοι κίνδυνοι πιθανής έκθεσης των εργαζομένων στη σπογγώδη εγκεφαλοπάθεια των βοοειδών (15). Δεδομένου ότι θα είναι χρήσιμη η περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης του μεγέθους ή του πάχους του κερατοειδούς στην αποκρισιμότητα σε διαβρωτικές και ερεθιστικές χημικές ουσίες, συνιστάται στους χρήστες να αναφέρουν την εκτιμώμενη ηλικία και/ή το βάρος των ζώων από τα οποία προέρχονται οι κερατοειδείς που χρησιμοποιούνται στις μελέτες.

Συλλογή και μεταφορά των οφθαλμών στο εργαστήριο

Οι οφθαλμοί συλλέγονται από υπαλλήλους των σφαγείων. Για την αποτροπή μηχανικών και άλλου είδους βλαβών στους οφθαλμούς, οι τελευταίοι θα πρέπει να εξορύσσονται το ταχύτερο δυνατό μετά τον θάνατο του ζώου και να ψύχονται αμέσως μετά την εξόρυξή τους και κατά τη μεταφορά. Για την αποφυγή έκθεσης των οφθαλμών σε πιθανώς ερεθιστικές χημικές ουσίες, οι υπάλληλοι των σφαγείων δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούν απορρυπαντικά κατά την έκπλυση της κεφαλής των ζώων.

Οι οφθαλμοί θα πρέπει να εμβαπτίζονται τελείως σε ψυχρό αλατούχο διάλυμα Hanks (Hanks' Balanced Salt Solution/HBSS) εντός δοχείου κατάλληλου μεγέθους και να μεταφέρονται στο εργαστήριο κατά τρόπο ώστε να ελαχιστοποιείται η φθορά και/ή η βακτηριακή μόλυνση. Επειδή οι οφθαλμοί συλλέγονται κατά τη διαδικασία σφαγής, ενδέχεται να εκτεθούν σε αίμα και άλλα βιολογικά υλικά, συμπεριλαμβανομένων των βακτηρίων και άλλων μικροοργανισμών. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να διασφαλίζεται η ελαχιστοποίηση του κινδύνου μόλυνσης (π.χ. με τη διατήρηση του δοχείου που περιέχει τους οφθαλμούς σε υγρό πάγο κατά τη συλλογή και μεταφορά και με την προσθήκη αντιβιοτικών στο διάλυμα HBSS που χρησιμοποιείται για τη φύλαξη των οφθαλμών κατά τη μεταφορά [π.χ. 100 IU πενικιλίνης/mL και 100 μg στρεπτομυκίνης/mL])

Το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ της συλλογής των οφθαλμών και της χρήσης των κερατοειδών στη μέθοδο δοκιμών BCOP θα πρέπει να είναι το μικρότερο δυνατόν (συνήθως συλλογή και χρήση την ίδια ημέρα) και θα πρέπει να αποδεικνύεται ότι δεν υπονομεύει τα αποτελέσματα της δοκιμής. Τα αποτελέσματα αυτά βασίζονται στα κριτήρια επιλογής των οφθαλμών, καθώς και στις αποκρίσεις των θετικών και των αρνητικών μαρτύρων. Όλοι οι οφθαλμοί που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή θα πρέπει να προέρχονται από την ίδια ομάδα οφθαλμών που συλλέχθηκαν συγκεκριμένη ημέρα.

Κριτήρια επιλογής των οφθαλμών που χρησιμοποιούνται στη μέθοδο δοκιμών BCOP

Μόλις οι οφθαλμοί φτάσουν στο εργαστήριο, εξετάζονται προσεκτικά για ελαττώματα όπως αυξημένη αδιαφάνεια, αμυχές και νεοαγγείωση. Πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο κερατοειδείς χωρίς ελαττώματα αυτού του είδους.

Η ποιότητα κάθε κερατοειδούς αξιολογείται και σε μεταγενέστερα στάδια της δοκιμής. Οι κερατοειδείς με αδιαφάνεια μεγαλύτερη από επτά μονάδες αδιαφάνειας ή ισοδύναμη για τα χρησιμοποιούμενα αδιαφανόμετρα και διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς, μετά από μια αρχική περίοδο εξισορρόπησης μίας ώρας, πρέπει να απορρίπτονται (ΣΗΜΕΙΩΣΗ: το αδιαφανόμετρο θα πρέπει να βαθμονομείται με τα πρότυπα αδιαφάνειας που χρησιμοποιούνται για τον καθορισμό των μονάδων αδιαφάνειας, βλ. προσάρτημα 4).

Κάθε ομάδα μεταχείρισης (υπό δοκιμή χημική ουσία, παράλληλοι αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες) αποτελείται από τουλάχιστον τρεις οφθαλμούς. Στη μέθοδο δοκιμών BCOP, για τους αρνητικούς μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τρεις κερατοειδείς. Δεδομένου ότι όλοι οι κερατοειδείς εκτέμνονται από τον πλήρη βολβό και στερεώνονται στους θαλάμους της διάταξης συγκράτησης κερατοειδούς, υπάρχει το ενδεχόμενο να προκύψουν τεχνητά σφάλματα αδιαφάνειας και διαπερατότητας για τους επιμέρους κερατοειδείς (συμπεριλαμβανομένου του αρνητικού μάρτυρα), λόγω του χειρισμού. Επιπλέον, στους υπολογισμούς της IVIS, οι τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας που λαμβάνονται για τους κερατοειδείς οι οποίοι αποτελούν τους αρνητικούς μάρτυρες χρησιμοποιούνται για τη διόρθωση των τιμών αδιαφάνειας και διαπερατότητας των κερατοειδών που υποβάλλονται σε μεταχείριση με την υπό δοκιμή χημική ουσία και τον θετικό μάρτυρα.

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Προετοιμασία των οφθαλμών

Κερατοειδείς χιτώνες χωρίς ελαττώματα ανατέμνονται κατά τρόπο ώστε να παραμένει δακτύλιος σκληρού χιτώνα 2 έως 3 mm με σκοπό τη διευκόλυνση του μετέπειτα χειρισμού, λαμβανομένης μέριμνας για την αποφυγή φθορών στο κερατοειδικό επιθήλιο και ενδοθήλιο. Οι απομονωθέντες κερατοειδείς στερεώνονται σε ειδικές διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς που αποτελούνται από εμπρόσθιο και οπίσθιο διαμέρισμα, τα οποία εφάπτονται με το επιθήλιο και το ενδοθήλιο του κερατοειδούς, αντιστοίχως. Αμφότεροι οι θάλαμοι πληρούται μέχρι υπερχείλισης με προθερμασμένο θρεπτικό μέσο ελάχιστων τροφικών απαιτήσεων του Eagle χωρίς ερυθρό της φαινόλης (Eagle's Minimum Essential Medium/EMEM) (πρώτα ο οπίσθιος θάλαμος), με τρόπο που εξασφαλίζει ότι δεν σχηματίζονται φυσαλίδες. Η διάταξη αφήνεται εν συνεχεία να σταθεροποιηθεί στους 32 ± 1 °C για τουλάχιστον μία ώρα, ούτως ώστε να εξισορροπηθεί η θερμοκρασία των κερατοειδών με τη θερμοκρασία του θρεπτικού μέσου και να επιτευχθεί, στο μέτρο του δυνατού, φυσιολογική μεταβολική δραστηριότητα (η θερμοκρασία της επιφάνειας του κερατοειδούς in vivo είναι κατά προσέγγιση 32 °C).

Μετά την παρέλευση του διαστήματος εξισορρόπησης, προστίθεται πρόσφατα παρασκευασμένο προθερμασμένο EMEM χωρίς ερυθρό της φαινόλης σε αμφότερους τους θαλάμους και σημειώνονται οι τιμές γραμμής βάσης της αδιαφάνειας για κάθε κερατοειδή. Οι κερατοειδείς που εμφανίζουν μακροσκοπικές βλάβες ιστού (π.χ. αμυχές, μελάγχρωση, νεοαγγείωση) ή αδιαφάνεια μεγαλύτερη από επτά μονάδες αδιαφάνειας, ή ισοδύναμη για τα χρησιμοποιούμενα αδιαφανόμετρα και διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς, απορρίπτονται. Τουλάχιστον τρεις κερατοειδείς επιλέγονται ως αρνητικοί μάρτυρες (ή μάρτυρες με διαλύτη). Οι εναπομένοντες κερατοειδείς κατανέμονται στη συνέχεια σε ομάδες μεταχείρισης ή θετικών μαρτύρων.

Επειδή η θερμοχωρητικότητα του νερού είναι υψηλότερη από του αέρα, το νερό παρέχει πιο σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας για επώαση. Κατά συνέπεια, για τη διατήρηση της διάταξης συγκράτησης κερατοειδούς και του περιεχομένου της σε θερμοκρασία 32 ± 1 °C συνιστάται η χρήση υδατόλουτρου. Εντούτοις, μπορούν να χρησιμοποιούνται και επωαστήρες αέρα, με προφυλάξεις για τη διατήρηση σταθερής θερμοκρασίας (π.χ. με προθέρμανση των διατάξεων συγκράτησης και των θρεπτικών μέσων).

Εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας

Χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πρωτόκολλα μεταχείρισης, ένα για υγρά και επιφανειοδραστικές ουσίες (στερεές ή υγρές) και ένα για μη επιφανειοδραστικά στερεά.

Τα υγρά υποβάλλονται στη δοκιμή χωρίς αραίωση. Τα ημιστερεά, οι κρέμες και οι κηροί υποβάλλονται κατά κανόνα στη δοκιμή ως υγρά. Οι αμιγείς επιφανειοδραστικές ουσίες υποβάλλονται στη δοκιμή σε συγκέντρωση 10 % (κ.β.) σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9 %, απεσταγμένο νερό ή άλλο διαλύτη, για τον οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεν έχει δυσμενείς επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής. Για διαφορετικές αραιώσεις πρέπει να παρέχεται κατάλληλη αιτιολόγηση. Τα μείγματα που περιέχουν επιφανειοδραστικές ουσίες μπορούν να υποβάλλονται σε δοκιμή αναραίωτα ή αραιωμένα σε κατάλληλη συγκέντρωση ανάλογα με τα αντίστοιχα σενάρια έκθεσης in vivo. Θα πρέπει να παρέχεται κατάλληλη αιτιολόγηση για την υπό δοκιμή αραίωση. Οι κερατοειδείς εκτίθενται στα υγρά και στα επιφανειοδραστικά επί 10 λεπτά. Σε περίπτωση διαφορετικής διάρκειας έκθεσης, πρέπει να παρέχεται κατάλληλη επιστημονική αιτιολόγηση. Βλ. προσάρτημα 1 για ορισμό των επιφανειοδραστικών ουσιών και των μειγμάτων που περιέχουν επιφανειοδραστικές ουσίες.

Τα μη επιφανειοδραστικά στερεά υποβάλλονται κατά κανόνα στη δοκιμή ως διαλύματα ή εναιωρήματα σε συγκέντρωση 20 % (κ.β.) σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9 %, απεσταγμένο νερό ή άλλο διαλύτη, για τον οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεν έχει δυσμενείς επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής. Υπό ορισμένες περιστάσεις και με την κατάλληλη επιστημονική αιτιολόγηση, τα στερεά επιτρέπεται να υποβάλλονται στη δοκιμή και ως έχουν, με απευθείας εφαρμογή στην επιφάνεια του κερατοειδούς με τη μέθοδο του ανοικτού θαλάμου (βλ. παράγραφο 32). Οι κερατοειδείς εκτίθενται στα στερεά επί τέσσερις ώρες, αλλά, όπως και στην περίπτωση των υγρών και των επιφανειοδραστικών ουσιών, επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται διαφορετικά διαστήματα έκθεσης κατόπιν κατάλληλης επιστημονικής αιτιολόγησης.

Είναι δυνατόν να χρησιμοποιούνται διαφορετικές μέθοδοι μεταχείρισης, ανάλογα με τη φυσική μορφή και τα χημικά χαρακτηριστικά της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (π.χ. στερεά, υγρά, παχύρευστα έναντι μη παχύρευστων υγρών). Ο κρίσιμος παράγοντας είναι να εξασφαλίζεται ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία καλύπτει επαρκώς την επιφάνεια του επιθηλίου και ότι απομακρύνεται ικανοποιητικά κατά την έκπλυση. Για μη παχύρευστες έως ελαφρώς παχύρευστες υπό δοκιμή χημικές ουσίες χρησιμοποιείται συνήθως μέθοδος κλειστού θαλάμου, ενώ για ημιπαχύρευστες και παχύρευστες, καθώς και για τα στερεά ως έχουν χρησιμοποιείται κατά κανόνα μέθοδος ανοικτού θαλάμου.

Στη μέθοδο κλειστού θαλάμου, ποσότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που επαρκεί για την κάλυψη του επιθηλίου του κερατοειδούς (750 μl), εισάγεται στον εμπρόσθιο θάλαμο μέσω των δοσιμετρικών οπών στην επάνω επιφάνειά του και, εν συνεχεία, οι οπές σφραγίζονται με τα πώματα του θαλάμου καθ' όλη τη διάρκεια της έκθεσης. Είναι σημαντικό να διασφαλίζεται η έκθεση κάθε κερατοειδούς στην υπό δοκιμή χημική ουσία για το ενδεδειγμένο χρονικό διάστημα.

Στη μέθοδο ανοικτού θαλάμου, πριν από τη μεταχείριση αφαιρούνται από τον εμπρόσθιο θάλαμο ο δακτύλιος ασφάλισης της θυρίδας και η γυάλινη θυρίδα. Ο μάρτυρας ή η υπό δοκιμή χημική ουσία (750 μl ή ποσότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που επαρκεί για την πλήρη κάλυψη του κερατοειδούς) εφαρμόζεται απευθείας στην επιφάνεια του επιθηλίου του κερατοειδούς με τη βοήθεια μικροσιφωνίου. Εάν είναι δύσκολο να αναρροφηθεί η υπό δοκιμή χημική ουσία, μπορεί να εισαχθεί υπό πίεση σε σιφώνιο θετικής εκτόπισης για να διευκολυνθεί η δοσιμέτρηση. Το ρύγχος του σιφωνίου θετικής εκτόπισης εισάγεται στο άκρο έκχυσης της σύριγγας κατά τρόπο ώστε το υλικό να φέρεται υπό πίεση στο ρύγχος εκτόπισης. Ταυτοχρόνως, πιέζεται το έμβολο της σύριγγας ενόσω το έμβολο του σιφωνίου έλκεται προς τα επάνω. Εάν εμφανιστούν φυσαλίδες αέρα στο ρύγχος του σιφωνίου, η υπό δοκιμή ουσία απομακρύνεται (εξωθείται) και η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου το ρύγχος πληρωθεί χωρίς να σχηματίζονται φυσαλίδες αέρα. Εάν χρειαστεί, μπορεί να χρησιμοποιηθεί συνήθης σύριγγα (χωρίς βελόνα), η οποία επιτρέπει τη μέτρηση επακριβούς όγκου της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και την ευκολότερη εφαρμογή στο επιθήλιο του κερατοειδούς. Μετά τη δοσιμέτρηση, η γυάλινη θυρίδα επανατοποθετείται στον εμπρόσθιο θάλαμο για να δημιουργηθεί εκ νέου κλειστό σύστημα.

Επώαση μετά την έκθεση

Μετά την παρέλευση του διαστήματος έκθεσης, η υπό δοκιμή χημική ουσία, ο αρνητικός μάρτυρας ή ο θετικός μάρτυρας απομακρύνεται από τον εμπρόσθιο θάλαμο και το επιθήλιο εκπλένεται τουλάχιστον τρεις φορές (ή έως ότου πάψουν να παρατηρούνται οπτικές ενδείξεις παρουσίας της υπό δοκιμή ουσίας) με EMEM (που περιέχει ερυθρό της φαινόλης). Για την έκπλυση χρησιμοποιείται θρεπτικό μέσο που περιέχει ερυθρό της φαινόλης, διότι η αλλαγή του χρώματος του ερυθρού της φαινόλης δείχνει την αποτελεσματικότητα της έκπλυσης όξινων ή αλκαλικών υπό δοκιμή χημικών ουσιών. Οι κερατοειδείς εκπλένονται περισσότερες από τρεις φορές εάν το ερυθρό της φαινόλης εξακολουθεί να αποχρωματίζεται (προς κίτρινο ή ιώδες) ή εάν παραμένει ορατή η υπό δοκιμή χημική ουσία. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία απομακρυνθεί πλήρως από το θρεπτικό μέσο, οι κερατοειδείς υποβάλλονται σε τελική έκπλυση με EMEM (χωρίς ερυθρό της φαινόλης). Το EMEM (χωρίς ερυθρό της φαινόλης) χρησιμοποιείται ως διάλυμα τελικής έκπλυσης ούτως ώστε να διασφαλίζεται η απομάκρυνση του ερυθρού της φαινόλης από τον εμπρόσθιο θάλαμο πριν από τη μέτρηση της αδιαφάνειας. Στη συνέχεια, ο εμπρόσθιος θάλαμος πληρώνεται εκ νέου με φρέσκο EMEM που δεν περιέχει ερυθρό της φαινόλης.

Όσον αφορά τα υγρά και τις επιφανειοδραστικές ουσίες, μετά την έκπλυσή τους οι κερατοειδείς επωάζονται για δύο επιπλέον ώρες στους 32 ± 1 °C. Σε ορισμένες περιπτώσεις ενδέχεται να είναι σκόπιμη η παράταση της επώασης μετά την έκθεση, κάτι το οποίο κρίνεται κατά περίπτωση. Οι κερατοειδείς που υποβάλλονται σε μεταχείριση με στερεά εκπλένονται σχολαστικά στο τέλος του τετράωρου διαστήματος έκθεσης, αλλά δεν απαιτείται περαιτέρω επώαση.

Στο τέλος του διαστήματος επώασης μετά την έκθεση σε υγρά και επιφανειοδραστικά και στο τέλος του τετράωρου διαστήματος έκθεσης σε μη επιφανειοδραστικά στερεά, καταγράφεται η αδιαφάνεια και η διαπερατότητα κάθε κερατοειδούς. Επίσης, κάθε κερατοειδής εξετάζεται οπτικά και καταγράφονται οι σχετικές με τη δοκιμή παρατηρήσεις (π.χ. απογύμνωση ιστού, κατάλοιπα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, ανομοιογενής αδιαφάνεια). Οι παρατηρήσεις αυτές είναι πιθανότατα σημαντικές καθώς ενδέχεται να αντικατοπτρίζονται στις διακυμάνσεις των ενδείξεων του αδιαφανομέτρου.

Χημικές ουσίες που χρησιμεύουν ως μάρτυρες

Σε κάθε πείραμα περιλαμβάνονται παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες ή μάρτυρες με διαλύτη/φορέα και θετικοί μάρτυρες.

Κατά τον έλεγχο υγρής ουσίας χωρίς αραίωση, στη μέθοδο δοκιμών BCOP περιλαμβάνεται παράλληλος αρνητικός μάρτυρας (π.χ. διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9 % ή απεσταγμένο νερό), ούτως ώστε να ανιχνεύονται μη ειδικές αλλαγές στο σύστημα δοκιμής και να παρέχεται γραμμή βάσης για τα τελικά σημεία της δοκιμής. Κατά τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται επίσης ότι οι συνθήκες δοκιμής δεν προκαλούν άτοπη απόκριση ερεθισμού.

Κατά τον έλεγχο αραιωμένου υγρού, επιφανειοδραστικής ουσίας ή στερεού, στη μέθοδο δοκιμών BCOP περιλαμβάνεται παράλληλη ομάδα-μάρτυρας με διαλύτη/φορέα, ούτως ώστε να ανιχνεύονται μη ειδικές αλλαγές στο σύστημα δοκιμής και να παρέχεται γραμμή βάσης για τα τελικά σημεία της δοκιμής. Μπορεί να χρησιμοποιείται μόνο διαλύτης/φορέας για τον οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεν έχει δυσμενείς επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής.

Σε κάθε πείραμα περιλαμβάνεται ως παράλληλος θετικός μάρτυρας μια χημική ουσία που είναι γνωστό ότι επάγει θετική απόκριση, για να επαληθεύεται η ακεραιότητα του συστήματος δοκιμής και η ορθή συμπεριφορά του. Για να διασφαλίζεται, ωστόσο, η δυνατότητα αξιολόγησης της μεταβλητότητας της απόκρισης του θετικού μάρτυρα σε συνάρτηση με τον χρόνο, το μέγεθος της απόκρισης ερεθισμού δεν θα πρέπει να είναι υπερβολικό.

Παραδείγματα θετικών μαρτύρων για υγρές υπό δοκιμή χημικές ουσίες είναι 100 % αιθανόλη ή 100 % διμεθυλοφορμαμίδιο. Παράδειγμα θετικού μάρτυρα για στερεές υπό δοκιμή χημικές ουσίες είναι το διάλυμα ιμιδαζολίου 20 % (κ.β.) σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9 %.

Οι χημικές ουσίες συγκριτικής αξιολόγησης είναι χρήσιμες για την αξιολόγηση του δυναμικού οφθαλμικής ερεθιστικότητας άγνωστων χημικών ουσιών συγκεκριμένης χημικής τάξης ή κατηγορίας προϊόντων ή για την αξιολόγηση του σχετικού δυναμικού ερεθιστικότητας ενός ερεθιστικού των οφθαλμών εντός συγκεκριμένου εύρους αποκρίσεων ερεθισμού.

Μετρούμενα τελικά σημεία

Η αδιαφάνεια προσδιορίζεται από την ποσότητα φωτός που διέρχεται μέσω του κερατοειδούς. Η αδιαφάνεια του κερατοειδούς μετράται ποσοτικά με τη χρήση αδιαφανομέτρου, με το οποίο λαμβάνονται τιμές αδιαφάνειας μετρούμενες σε συνεχή κλίμακα.

Η διαπερατότητα προσδιορίζεται από την ποσότητα χρωστικής νατριούχου φλουορεσκεΐνης που διαπερνά όλες τις κυτταρικές στιβάδες του κερατοειδούς (δηλ. από το επιθήλιο στην εξωτερική επιφάνεια του κερατοειδούς έως το ενδοθήλιο στην εσωτερική επιφάνειά του). Στον εμπρόσθιο θάλαμο της διάταξης συγκράτησης κερατοειδούς, ο οποίος βρίσκεται σε επαφή με το επιθήλιο του κερατοειδούς, προστίθεται 1 ml διαλύματος νατριούχου φλουορεσκεΐνης (4 ή 5 mg/ml κατά τον έλεγχο υγρών και επιφανειοδραστικών ουσιών ή μη επιφανειοδραστικών στερεών, αντιστοίχως), ενώ ο οπίσθιος θάλαμος, που βρίσκεται σε επαφή με το ενδοθήλιο του κερατοειδούς, πληρούται με πρόσφατα παρασκευασμένο EMEM. Η διάταξη συγκράτησης επωάζεται εν συνεχεία σε οριζόντια θέση επί 90 ± 5 min σε θερμοκρασία 32 ± 1 °C. Η ποσότητα νατριούχου φλουορεσκεΐνης που εισέρχεται στον οπίσθιο θάλαμο μετράται ποσοτικά με φασματοφωτομετρία ορατού/υπεριώδους. Οι φασματοφωτομετρικές μετρήσεις που λαμβάνονται στα 490 nm καταγράφονται ως τιμές οπτικής πυκνότητας (OD490) ή απορρόφησης, μετρούμενες σε συνεχή κλίμακα. Οι τιμές διαπερατότητας για τη φλουορεσκεΐνη προσδιορίζονται βάσει των τιμών OD490 που λαμβάνονται με φασματοφωτόμετρο ορατού φωτός με πρότυπο μήκος διαδρομής 1 cm.

Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί συσκευή ανάγνωσης πλακών μικροτιτλοδότησης 96 μικροκοιλοτήτων, υπό τον όρο ότι i) μπορεί να εξακριβωθεί η κλίμακα γραμμικότητας της συσκευής ανάγνωσης πλακών για τον προσδιορισμό τιμών OD490 για τη φλουορεσκεΐνη· και ii) χρησιμοποιείται ο ορθός όγκος δειγμάτων φλουορεσκεΐνης στην πλάκα 96 μικροκοιλοτήτων για την επίτευξη τιμών OD490 ισοδύναμων με το πρότυπο μήκος διαδρομής 1 cm [αυτό απαιτεί ενδεχομένως εντελώς πλήρεις μικροκοιλότητες (συνήθως 360 μL)].

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Αξιολόγηση των δεδομένων

Μετά τη διόρθωση των τιμών αδιαφάνειας και μέσης διαπερατότητας (OD490) για να ληφθούν υπόψη η αδιαφάνεια υποβάθρου και οι τιμές διαπερατότητας OD490 που αντιστοιχούν στον αρνητικό μάρτυρα, οι μέσες τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας OD490 για κάθε ομάδα μεταχείρισης θα πρέπει να συνδυάζονται σε εμπειρικό τύπο για τον υπολογισμό της βαθμολογίας ερεθιστικότητας in vitro (IVIS) για κάθε ομάδα μεταχείρισης, ως εξής:

IVIS = μέση τιμή αδιαφάνειας + (15 × μέση τιμή διαπερατότητας OD490)

Οι Sina et al. (16) αναφέρουν ότι ο συγκεκριμένος τύπος προέκυψε στο πλαίσιο ενδοεργαστηριακών και διεργαστηριακών μελετών. Τα δεδομένα που προέκυψαν για μια σειρά 36 ενώσεων στο πλαίσιο πολυεργαστηριακής μελέτης υποβλήθηκαν σε πολυμεταβλητή ανάλυση για τον καθορισμό της εξίσωσης βέλτιστης προσαρμογής δεδομένων in vivo και in vitro. Η ανάλυση αυτή διενεργήθηκε από επιστήμονες δύο διαφορετικών εταιρειών, οι οποίοι κατέληξαν σε σχεδόν ταυτόσημες εξισώσεις.

Οι τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας θα πρέπει επίσης να αξιολογούνται χωριστά, ούτως ώστε να διαπιστώνεται αν η υπό δοκιμή χημική ουσία προκαλεί διαβρωτικότητα ή σοβαρό ερεθισμό μέσω ενός μόνο από τα δύο τελικά σημεία (βλ. κριτήρια απόφασης).

Κριτήρια απόφασης

Οι τιμές αποκοπής (cut-off values) IVIS για τον χαρακτηρισμό των υπό δοκιμή χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη (κατηγορία 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών) και των υπό δοκιμή χημικών ουσιών για τις οποίες δεν απαιτείται ταξινόμηση ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη («καμίας κατηγορίας» του GHS των Ηνωμένων Εθνών) είναι οι ακόλουθες:

Κριτήρια αποδοχής της μελέτης

Μια δοκιμή θεωρείται αποδεκτή εάν για τον θετικό μάρτυρα προκύπτει IVIS που βρίσκεται εντός δύο τυπικών αποκλίσεων από την τρέχουσα ιστορική μέση τιμή, η οποία πρέπει να επικαιροποιείται τουλάχιστον ανά τρίμηνο ή κάθε φορά που εκτελείται αποδεκτή δοκιμή σε εργαστήρια όπου δεν διεξάγονται συχνά δοκιμές (δηλ. με συχνότητα μικρότερη από μία φορά μηνιαίως). Οι αποκρίσεις του αρνητικού μάρτυρα ή του μάρτυρα με διαλύτη/φορέα θα πρέπει να έχουν ως αποτέλεσμα τιμές αδιαφάνειας και διαπερατότητας μικρότερες από τα καθορισμένα ανώτερα όρια τιμών αδιαφάνειας και διαπερατότητας υποβάθρου για βόειους κερατοειδείς που υποβάλλονται σε μεταχείριση με τον αντίστοιχο αρνητικό μάρτυρα ή μάρτυρα με διαλύτη/φορέα. Για τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες των οποίων η ταξινόμηση δεν επιδέχεται αμφισβήτηση, αρκεί μία μόνο σειρά μετρήσεων (ένας «γύρος»), αποτελούμενη από τρεις τουλάχιστον κερατοειδείς. Ωστόσο, όταν τα αποτελέσματα της πρώτης σειράς μετρήσεων είναι οριακά, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο εκτέλεσης δεύτερης σειράς (χωρίς, ωστόσο, αυτό να είναι υποχρεωτικό) ή ακόμη και τρίτης, σε περίπτωση ασυμφωνίας μεταξύ των μέσων τιμών IVIS των δύο πρώτων σειρών μετρήσεων. Στο πλαίσιο αυτό, ένα αποτέλεσμα πρώτης σειράς μετρήσεων θεωρείται οριακό, εάν οι προβλέψεις από τους 3 κερατοειδείς δεν συμφωνούν μεταξύ τους, με αποτέλεσμα:

Έκθεση δοκιμής

Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία, εφόσον αυτά έχουν σημασία για τη διενέργεια της μελέτης:

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Προσάρτημα 4

ΔΙΑΤΑΞΗ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΣΤΟ ΠΛΑΙΣΙΟ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ BCOP

Οι διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς στο πλαίσιο της μεθόδου δοκιμών BCOP κατασκευάζονται από αδρανές υλικό (π.χ. πολυπροπυλένιο). Οι διατάξεις αποτελούνται από δύο ημίσεα (εμπρόσθιο και οπίσθιο θάλαμο) και διαθέτουν δύο όμοιους κυλινδρικούς εσωτερικούς θαλάμους. Κάθε θάλαμος είναι σχεδιασμένος να έχει χωρητικότητα περίπου 5 ml και καταλήγει σε γυάλινη θυρίδα, μέσω της οποίας καταγράφονται οι μετρήσεις αδιαφάνειας. Καθένας από τους εσωτερικούς θαλάμους έχει διάμετρο 1,7 cm και βάθος 2,2 cm (11). Για την αποφυγή διαρροών χρησιμοποιείται στεγανοποιητικός δακτύλιος στον οπίσθιο θάλαμο. Ο κερατοειδής τοποθετείται με την πλευρά του ενδοθηλίου προς τα κάτω, επάνω στον στεγανοποιητικό δακτύλιο του οπισθίου θαλάμου, ενώ ο εμπρόσθιος θάλαμος τοποθετείται στην πλευρά του επιθηλίου του κερατοειδούς. Οι θάλαμοι συγκρατούνται στη θέση τους με τρεις κοχλίες από ανοξείδωτο χάλυβα που βρίσκονται στα εξωτερικά άκρα τους. Κάθε θάλαμος καταλήγει σε γυάλινη θυρίδα που μπορεί να αποσπάται για εύκολη πρόσβαση στον κερατοειδή. Μεταξύ της γυάλινης θυρίδας και του θαλάμου παρεμβάλλεται επίσης στεγανοποιητικός δακτύλιος για την αποφυγή διαρροών. Δύο οπές στο άνω τμήμα κάθε θαλάμου καθιστούν εφικτή την προσθήκη και αφαίρεση θρεπτικού μέσου και των υπό δοκιμή χημικών ουσιών. Οι οπές αυτές κλείνουν με πώματα από καουτσούκ κατά τη διάρκεια της μεταχείρισης και της επώασης. Η διέλευση του φωτός μέσω των διατάξεων συγκράτησης κερατοειδούς μπορεί να μεταβληθεί, καθώς οι συνέπειες της φθοράς ή της συσσώρευσης ειδικών χημικών καταλοίπων στις οπές των εσωτερικών θαλάμων ή στις γυάλινες θυρίδες μπορούν να επηρεάσουν τη σκέδαση ή την ανάκλαση του φωτός. Το αποτέλεσμα θα μπορούσε να είναι αυξήσεις ή μειώσεις της γραμμής βάσης οπτικής διαπερατότητας των διατάξεων συγκράτησης (και, αντιστρόφως, των ενδείξεων γραμμής βάσης αδιαφάνειας του κερατοειδούς) και να εκδηλώνεται ως σημαντικές αλλαγές στις αναμενόμενες τιμές γραμμής βάσης από τις αρχικές μετρήσεις αδιαφάνειας του κερατοειδούς σε επιμέρους θαλάμους (δηλ. οι αρχικές τιμές αδιαφάνειας του κερατοειδούς σε συγκεκριμένες διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς μπορεί συχνά να διαφέρουν κατά περισσότερο από 2 ή 3 μονάδες αδιαφάνειας από τις αναμενόμενες τιμές γραμμής βάσης). Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να εξετάζει το ενδεχόμενο κατάρτισης προγράμματος για την αξιολόγηση των μεταβολών της οπτικής διαπερατότητας των διατάξεων συγκράτησης του κερατοειδούς, ανάλογα με το είδος των υπό δοκιμή χημικών ουσιών και τη συχνότητα χρήσης των θαλάμων. Για τον καθορισμό των τιμών γραμμής βάσης, οι διατάξεις συγκράτησης του κερατοειδούς μπορούν να ελέγχονται πριν από την εισαγωγή τους σε χρήση, με μέτρηση των τιμών γραμμής βάσης αδιαφάνειας (ή οπτικής διαπερατότητας) των θαλάμων, αφού πληρωθούν με πλήρες θρεπτικό μέσο, χωρίς κερατοειδείς. Στη συνέχεια, οι διατάξεις συγκράτησης κερατοειδούς ελέγχονται περιοδικά για να διαπιστωθούν οι μεταβολές της οπτικής διαπερατότητας κατά τις περιόδους χρήσης. Κάθε εργαστήριο μπορεί να καθορίζει τη συχνότητα ελέγχου των διατάξεων συγκράτησης του κερατοειδούς, με βάση τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες, τη συχνότητα χρήσης και τις παρατηρήσεις αλλαγών στις τιμές γραμμής βάσης αδιαφάνειας του κερατοειδούς. Εάν παρατηρηθούν αξιοσημείωτες αλλαγές στη διέλευση του φωτός μέσω των διατάξεων συγκράτησης του κερατοειδούς, θα πρέπει να μελετηθούν κατάλληλες διαδικασίες καθαρισμού και/ή στίλβωσης της εσωτερικής επιφάνειας των διατάξεων ή η αντικατάστασή τους.

Διάταξη συγκράτησης κερατοειδούς: διάγραμμα σε ανάπτυξη

(13)

Στο μέρος B, το Κεφάλαιο Β.48 αντικαθίσταται από το ακόλουθο κείμενο:

«B.48   Μέθοδος δοκιμών σε απομονωμένους οφθαλμούς ορνιθίων για τον προσδιορισμό i) χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη και ii) χημικών ουσιών που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 438 του ΟΟΣΑ (2013). Η μέθοδος δοκιμών σε απομονωμένους οφθαλμούς ορνιθίων (Isolated Chicken Eye/ICE) αξιολογήθηκε το 2006 και το 2010 από τη Διυπηρεσιακή Συντονιστική Επιτροπή για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ICCVAM) των ΗΠΑ, σε σύμπραξη με το Ευρωπαϊκό Κέντρο για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ECVAM) και το Ιαπωνικό Κέντρο για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (JaCVAM) (1)(2). Κατά την πρώτη αξιολόγηση, η μέθοδος ICE εγκρίθηκε ως επιστημονικά έγκυρη μέθοδος δοκιμών προς χρήση ως δοκιμή διαλογής για τον προσδιορισμό χημικών προϊόντων (ουσιών και μειγμάτων) που επάγουν σοβαρή οφθαλμική βλάβη (κατηγορία 1), όπως ορίζονται στο Παγκοσμίως Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης και Επισήμανσης των Χημικών Προϊόντων (GHS) των Ηνωμένων Εθνών (1) (2) (4) και στον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1272/2008 για την ταξινόμηση, την επισήμανση και τη συσκευασία των ουσιών και των μειγμάτων (Classification, Labelling and Packaging/CLP) (12). Κατά τη δεύτερη αξιολόγηση, η μέθοδος δοκιμών ICE αξιολογήθηκε προς χρήση ως δοκιμή διαλογής για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που δεν ταξινομούνται ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, όπως ορίζονται στο GHS των Ηνωμένων Εθνών (3) (4). Τα αποτελέσματα της μελέτης επικύρωσης και οι συστάσεις της ομάδας αξιολόγησης από ομότιμους κριτές διατήρησαν σε ισχύ την αρχική σύσταση να χρησιμοποιείται η μέθοδος ICE για την ταξινόμηση χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη (κατηγορία 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών), καθώς η διαθέσιμη βάση δεδομένων παρέμεινε αμετάβλητη στο διάστημα που μεσολάβησε από την αρχική επικύρωση από την ICCVAM. Σε εκείνο το στάδιο, δεν διατυπώθηκαν περαιτέρω συστάσεις για επέκταση του πεδίου εφαρμογής της μεθόδου ICE ώστε να συμπεριληφθούν και άλλες κατηγορίες. Το σύνολο δεδομένων in vitro και in vivo που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη επικύρωσης επαναξιολογήθηκε με έμφαση στην αξιολόγηση της χρησιμότητας της μεθόδου ICE για τον χαρακτηρισμό χημικών ουσιών που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη (5). Η εν λόγω επαναξιολόγηση κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η μέθοδος δοκιμών ICE μπορεί επίσης να χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό χημικών ουσιών που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό και τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, όπως ορίζονται στο GHS των Ηνωμένων Εθνών (4) (5). Η παρούσα μέθοδος δοκιμών περιλαμβάνει τις συνιστώμενες χρήσεις και τους περιορισμούς της μεθόδου δοκιμών ICE βάσει αυτών των αξιολογήσεων. Οι βασικές διαφορές μεταξύ του αρχικού κειμένου του 2009 και της επικαιροποιημένης έκδοσης του 2013 των κατευθυντήριων γραμμών δοκιμών του ΟΟΣΑ αφορούν, μεταξύ άλλων, τη χρήση της μεθόδου δοκιμών ICE για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών, καθώς και επικαιροποίηση των στοιχείων της έκθεσης δοκιμής, του προσαρτήματος 1 με τους ορισμούς και του προσαρτήματος 2 για τις χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας.

Επί του παρόντος είναι γενικά αποδεκτό ότι, στο προβλέψιμο μέλλον, καμία μεμονωμένη δοκιμή οφθαλμικού ερεθισμού in vitro δεν θα μπορεί να αντικαταστήσει την in vivo οφθαλμική δοκιμή Draize στην πρόβλεψη σε ολόκληρο το φάσμα ερεθιστικότητας από τις διαφορετικές τάξεις χημικών ουσιών. Εντούτοις, στοχευμένοι συνδυασμοί διαφόρων εναλλακτικών μεθόδων δοκιμών στο πλαίσιο (κλιμακωτής) στρατηγικής δοκιμών θα μπορούσαν ενδεχομένως να αντικαταστήσουν την οφθαλμική δοκιμή Draize (6). Η καθοδική προσέγγιση (top-down) (7) έχει σχεδιαστεί για να χρησιμοποιείται όταν, βάσει των διαθέσιμων πληροφοριών, μια χημική ουσία αναμένεται να έχει υψηλό δυναμικό ερεθιστικότητας, ενώ η ανοδική προσέγγιση (bottom-up) (7) έχει σχεδιαστεί για να χρησιμοποιείται όταν, βάσει των διαθέσιμων πληροφοριών, μια χημική ουσία δεν αναμένεται να προκαλέσει ερεθισμό των οφθαλμών σε βαθμό τέτοιον ώστε να επιβάλλεται η ταξινόμησή της. Η μέθοδος δοκιμών ICE είναι μέθοδος δοκιμών in vitro που μπορεί να χρησιμοποιείται, υπό ορισμένες περιστάσεις και με ειδικούς περιορισμούς, όπως περιγράφεται στις παραγράφους 8 έως 10, για την ταξινόμηση και την επισήμανση των χημικών ουσιών ως προς τον κίνδυνο για τους οφθαλμούς. Αν και δεν θεωρείται έγκυρη ως αυτοτελές υποκατάστατο της οφθαλμικής δοκιμής in vivo σε κουνέλια, η μέθοδος δοκιμών ICE συνιστάται ως πρώτο στάδιο στρατηγικής δοκιμών, όπως η καθοδική προσέγγιση που προτείνουν οι Scott και συν. (7), για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη, δηλ. χημικών ουσιών που πρέπει να ταξινομούνται ως κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών, χωρίς περαιτέρω δοκιμές (4). Η μέθοδος δοκιμών ICE συνιστάται επίσης για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, όπως ορίζονται στο GHS των Ηνωμένων Εθνών («Καμία κατηγορία») (4) και μπορεί, ως εκ τούτου, να χρησιμοποιείται ως αρχικό στάδιο στο πλαίσιο στρατηγικής δοκιμών με ανοδική προσέγγιση (7). Ωστόσο, για τις χημικές ουσίες οι οποίες, όπως προβλέπεται βάσει της μεθόδου δοκιμών ICE, δεν προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη ή δεν ταξινομούνται ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό/τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, θα απαιτούνται πρόσθετες δοκιμές (in vitro και/ή in vivo) για να κριθεί η οριστική τους ταξινόμηση. Επιπλέον, θα πρέπει να ζητείται η γνώμη των αρμόδιων ρυθμιστικών αρχών πριν από τη χρήση της μεθόδου ICE στο πλαίσιο ανοδικής προσέγγισης βάσει άλλων συστημάτων ταξινόμησης εκτός από το GHS των Ηνωμένων Εθνών.

Σκοπός της παρούσας μεθόδου δοκιμών είναι η περιγραφή των διαδικασιών που εφαρμόζονται για την αξιολόγηση του δυναμικού οφθαλμικού κινδύνου που ενέχει η υπό δοκιμή ουσία, όπως αυτό μετράται από την ικανότητά της να προκαλεί ή όχι τοξικότητα σε εξορυγμένο οφθαλμό ορνιθίου. Οι τοξικές επιδράσεις στον κερατοειδή μετρώνται με i) ποιοτική αξιολόγηση της αδιαφάνειας, ii) ποιοτική αξιολόγηση της βλάβης στο επιθήλιο βάσει της εφαρμογής φλουορεσκεΐνης στον οφθαλμό (κατακράτηση φλουορεσκεΐνης), iii) ποσοτική μέτρηση της αύξησης του πάχους (οίδημα), και iv) ποιοτική αξιολόγηση της μακροσκοπικής μορφολογικής βλάβης στην επιφάνεια. Οι αξιολογήσεις της αδιαφάνειας, του οιδήματος και της βλάβης του κερατοειδούς κατόπιν έκθεσης στην υπό δοκιμή χημική ουσία διενεργούνται χωριστά και έπειτα συνδυάζονται για την ταξινόμηση της οφθαλμικής ερεθιστικότητας.

Οι ορισμοί παρατίθενται στο προσάρτημα 1.

ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών βασίζεται στο πρωτόκολλο που προτείνεται στο έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 160 του ΟΟΣΑ (8), το οποίο καταρτίστηκε μετά τη διεθνή μελέτη επικύρωσης της ICCVAM (1) (3) (9), με τη συνεισφορά του Ευρωπαϊκού Κέντρου για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων, του Ιαπωνικού Κέντρου για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων και του Τμήματος Τοξικολογίας και Εφαρμοσμένης Φαρμακολογίας του ερευνητικού οργανισμού ΤΝΟ (Κάτω Χώρες). Το πρωτόκολλο βασίζεται σε στοιχεία που ελήφθησαν από δημοσιευμένα πρωτόκολλα, καθώς και στο πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται επί του παρόντος από τον οργανισμό TNO (10) (11) (12) (13) (14).

Κατά την επικύρωση στην οποία στηρίζεται η παρούσα μέθοδος δοκιμών ελέγχθηκε ένα ευρύ φάσμα χημικών ουσιών και η εμπειρική βάση δεδομένων της μελέτης επικύρωσης καλύπτει 152 χημικά προϊόντα, και συγκεκριμένα 72 ουσίες και 80 μείγματα (5). Η μέθοδος δοκιμών εφαρμόζεται σε στερεά, υγρά, γαλακτώματα και πηκτές. Τα υγρά μπορούν να είναι υδατικά ή μη και τα στερεά μπορεί να είναι υδατοδιαλυτά ή μη. Αέρια και αερολύματα δεν έχουν αξιολογηθεί ακόμη με μελέτη επικύρωσης.

Η μέθοδος δοκιμών ICE μπορεί να χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη, δηλ. χημικών ουσιών που πρέπει να ταξινομούνται ως κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών (4). Οι περιορισμοί που προσδιορίστηκαν για τη μέθοδο δοκιμών ICE, όταν χρησιμοποιείται για τον σκοπό αυτό, βασίζονται στα υψηλά ποσοστά ψευδοθετικής έκβασης για τις αλκοόλες και τα υψηλά ποσοστά ψευδοαρνητικής έκβασης για τα στερεά και τις επιφανειοδραστικές (τασιενεργές) ουσίες (1) (3) (9). Ωστόσο, τα ποσοστά ψευδοαρνητικής έκβασης σε αυτό το πλαίσιο (ουσίες της κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών που κρίνεται ότι δεν κατατάσσονται στην κατηγορία αυτή) δεν έχουν κρίσιμη σημασία, δεδομένου ότι όλες οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες με αρνητικό αποτέλεσμα θα υποβάλλονται στη συνέχεια σε άλλες, επαρκώς επικυρωμένες δοκιμές in vitro ή, ως έσχατη επιλογή, σε δοκιμές σε κουνέλια, ανάλογα με τις κανονιστικές απαιτήσεις, με τη χρήση στρατηγικής διαδοχικών δοκιμών με βάση ανάλυση βάρους της απόδειξης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα στερεά μπορεί να οδηγήσουν σε μεταβλητές και ακραίες συνθήκες έκθεσης στην in vivo δοκιμή οφθαλμικού ερεθισμού Draize, με πιθανό αποτέλεσμα άστοχες προβλέψεις του πραγματικού ερεθιστικού τους δυναμικού (15). Οι ερευνητές μπορούν να εξετάζουν το ενδεχόμενο χρήσης της παρούσας μεθόδου δοκιμών για όλους τους τύπους χημικών ουσιών, οπότε και τα θετικά αποτελέσματα θα πρέπει να γίνονται δεκτά ως ενδεικτικά σοβαρής οφθαλμικής βλάβης, δηλ. ταξινόμηση στην κατηγορία 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών χωρίς περαιτέρω δοκιμές. Πάντως, τα θετικά αποτελέσματα που προκύπτουν με αλκοόλες θα πρέπει να ερμηνεύονται με επιφύλαξη, λόγω κινδύνου υπερπρόβλεψης.

Όταν η μέθοδος δοκιμών ICE χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό χημικών ουσιών που προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη (κατηγορία 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών), έχει συνολική ορθότητα 86 % (120/140), ποσοστό ψευδοθετικής έκβασης 6 % (7/113) και ποσοστό ψευδοαρνητικής έκβασης 48 % (13/27), σε σύγκριση με την ταξινόμηση βάσει δεδομένων από τη μέθοδο οφθαλμικών δοκιμών in vivo σε κουνέλια σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών (4) (5).

Η μέθοδος δοκιμών ICE μπορεί επίσης να χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη βάσει του συστήματος ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών (4). Θα πρέπει να ζητείται η γνώμη των αρμόδιων ρυθμιστικών αρχών πριν από τη χρήση της μεθόδου ICE στο πλαίσιο ανοδικής προσέγγισης βάσει άλλων συστημάτων ταξινόμησης. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών μπορεί να χρησιμοποιείται για όλους τους τύπους χημικών ουσιών, οπότε και τα αρνητικά αποτελέσματα θα μπορούσαν να γίνουν δεκτά για τη μη ταξινόμηση μιας χημικής ουσίας ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό και τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη. Ωστόσο, με βάση ένα αποτέλεσμα από τη βάση δεδομένων επικύρωσης, υπάρχει πιθανότητα υποπρόβλεψης στην περίπτωση των αντιρρυπαντικών επιχρισμάτων που περιέχουν οργανικούς διαλύτες (5).

Όταν η μέθοδος δοκιμών ICE χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό χημικών ουσιών που δεν επιβάλλεται να ταξινομηθούν ως προς τον οφθαλμικό ερεθισμό ή τη σοβαρή οφθαλμική βλάβη, έχει συνολική ορθότητα 82 % (125/152), ποσοστό ψευδοθετικής έκβασης 33 % (26/79) και ποσοστό ψευδοαρνητικής έκβασης 1 % (1/73), σε σύγκριση με την ταξινόμηση βάσει δεδομένων από τη μέθοδο οφθαλμικών δοκιμών in vivo σε κουνέλια σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών (4) (5). Όταν εξαιρούνται από τη βάση δεδομένων ορισμένες κατηγορίες προϊόντων (δηλ. τα αντιρρυπαντικά επιχρίσματα που περιέχουν οργανικούς διαλύτες), η μέθοδος δοκιμών ICE παρουσιάζει ορθότητα 83 % (123/149), ποσοστό ψευδοθετικής έκβασης 33 % (26/78) και ποσοστό ψευδοαρνητικής έκβασης 0 % (0/71) στο σύστημα ταξινόμησης GHS των Ηνωμένων Εθνών (5).

Η μέθοδος δοκιμών ICE δεν συνιστάται για τον προσδιορισμό υπό δοκιμή χημικών ουσιών που θα πρέπει να ταξινομηθούν ως ερεθιστικά των οφθαλμών (κατηγορία 2 ή 2Α του GHS των Ηνωμένων Εθνών) ή ως ήπια ερεθιστικά των οφθαλμών (κατηγορία 2Β του GHS των Ηνωμένων Εθνών), λόγω του σημαντικού αριθμού χημικών ουσιών της κατηγορίας 1 του GHS των Ηνωμένων Εθνών που υποταξινομούνται ως κατηγορίας 2, 2Α ή 2Β και χημικών ουσιών «καμίας κατηγορίας» του GHS των Ηνωμένων Εθνών που υπερταξινομούνται ως κατηγορίας 2, 2A ή 2B. Για τον σκοπό αυτό, ενδέχεται να απαιτούνται περαιτέρω δοκιμές με άλλη κατάλληλη μέθοδο.

Όλες οι διαδικασίες με οφθαλμούς ορνιθίων θα πρέπει να είναι σύμφωνες προς τους κανονισμούς και τις διαδικασίες που εφαρμόζονται στην εγκατάσταση δοκιμών για τον χειρισμό υλικών ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων, μεταξύ άλλων, των ιστών και ιστικών υγρών. Συνιστάται η τήρηση των γενικών εργαστηριακών προφυλάξεων (16).

Στη μέθοδο δοκιμών ICE δεν λαμβάνονται υπόψη οι κακώσεις του επιπεφυκότος και της ίριδας που αξιολογούνται στη μέθοδο δοκιμών οφθαλμικής ερεθιστικότητας σε κουνέλια, αλλά εξετάζονται οι επιδράσεις στον κερατοειδή, που είναι ο μείζων παράγων ταξινόμησης in vivo όσον αφορά το GHS των Ηνωμένων Εθνών. Επίσης, μολονότι η αναστρεψιμότητα των βλαβών του κερατοειδούς δεν μπορεί να αξιολογηθεί αυτοτελώς στη μέθοδο δοκιμών ICE, έχει προταθεί ως δυνατότητα, βάσει των οφθαλμικών μελετών σε κουνέλια, η αξιολόγηση του αρχικού βάθους της κάκωσης του κερατοειδούς για την αναγνώριση ορισμένων τύπων μη αναστρέψιμων επιδράσεων (17). Ειδικότερα, απαιτούνται περισσότερες επιστημονικές γνώσεις για να γίνει κατανοητός ο τρόπος με τον οποίο επέρχονται μη αναστρέψιμες επιδράσεις που δεν συνδέονται με μια αρχική σοβαρή κάκωση. Τέλος, η μέθοδος δοκιμών ICE δεν καθιστά εφικτή την αξιολόγηση του δυναμικού συστημικής τοξικότητας που συνδέεται με την έκθεση των οφθαλμών.

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών θα επικαιροποιείται ανά χρονικά διαστήματα με βάση τις νέες πληροφορίες και τα δεδομένα. Για παράδειγμα, μια ιστοπαθολογική εξέταση ενδέχεται να είναι χρήσιμη όταν απαιτείται πληρέστερος χαρακτηρισμός της βλάβης του κερατοειδούς. Για την αξιολόγηση αυτής της δυνατότητας, συνιστάται στους χρήστες να συντηρούν τους οφθαλμούς και να ετοιμάζουν δείγματα για ιστοπαθολογική εξέταση, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη βάσης δεδομένων και κριτηρίων λήψης αποφάσεων που θα μπορούσαν να βελτιώσουν περαιτέρω την ορθότητα της παρούσας μεθόδου δοκιμών. Ο ΟΟΣΑ έχει εκπονήσει έγγραφο καθοδήγησης σχετικά με τη χρήση των μεθόδων δοκιμών οφθαλμικής τοξικότητας in vitro, το οποίο περιλαμβάνει λεπτομερείς διαδικασίες για τη συλλογή δειγμάτων ιστοπαθολογικής εξέτασης και πληροφορίες σχετικά με την υποβολή δειγμάτων και/ή ιστοπαθολογικών δεδομένων (8).

Τα εργαστήρια που διεξάγουν για πρώτη φορά την παρούσα δοκιμή θα πρέπει να χρησιμοποιούν τις χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας που προβλέπονται στο προσάρτημα 2. Ένα εργαστήριο μπορεί να χρησιμοποιεί αυτές τις χημικές ουσίες για να αποδείξει την τεχνική ικανότητά του όσον αφορά την εφαρμογή της μεθόδου δοκιμών ICE, πριν από την υποβολή δεδομένων που προέρχονται από αυτήν για ταξινόμηση κινδύνων βάσει κανονιστικών ρυθμίσεων.

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

Η μέθοδος δοκιμών ICE είναι οργανοτυπικό μοντέλο που εξασφαλίζει βραχυπρόθεσμη διατήρηση των οφθαλμών ορνιθίων in vitro. Στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμών, η βλάβη που προκαλείται από την υπό δοκιμή χημική ουσία εκτιμάται μέσω προσδιορισμού του οιδήματος και της αδιαφάνειας του κερατοειδούς, καθώς και της κατακράτησης φλουορεσκεΐνης. Με τις δύο τελευταίες παραμέτρους επιτυγχάνεται ποιοτική εκτίμηση, ενώ η ανάλυση του οιδήματος του κερατοειδούς παρέχει ποσοτική εκτίμηση. Κάθε μέτρηση είτε μετατρέπεται σε ποσοτική βαθμολογία που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό συνολικού δείκτη ερεθισμού είτε κατατάσσεται σε ποιοτική κατηγορία, η οποία χρησιμοποιείται για ταξινόμηση ως προς τον οφθαλμικό κίνδυνο in vitro στην κατηγορία 1 ή στην κατηγορία «Δεν ταξινομείται» του GHS των Ηνωμένων Εθνών. Καθεμία από αυτές τις εκβάσεις μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί για να προβλεφθεί ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία μπορεί να προκαλέσει σοβαρή οφθαλμική βλάβη in vivo ή ότι δεν επιβάλλεται να ταξινομηθεί ως προς τον κίνδυνο για τους οφθαλμούς (βλ. κριτήρια απόφασης). Ωστόσο, δεν είναι δυνατή η ταξινόμηση των χημικών ουσιών για τις οποίες δεν προβλέπεται ότι προκαλούν σοβαρή οφθαλμική βλάβη ή δεν ταξινομούνται με τη μέθοδο δοκιμών ICE (βλ. παράγραφο 11).

Προέλευση και ηλικία των οφθαλμών ορνιθίων

Έχει παγιωθεί ιστορικά η χρήση, για την παρούσα δοκιμή, οφθαλμών που συλλέγονται από ορνίθια που θανατώνονται σε σφαγείο για κατανάλωση από τον άνθρωπο, γεγονός που συνεπάγεται ότι δεν απαιτείται η χρήση πειραματόζωων. Χρησιμοποιούνται μόνο οφθαλμοί υγιών ζώων που θεωρούνται κατάλληλα για είσοδο στην ανθρώπινη τροφική αλυσίδα.

Αν και δεν έχει διεξαχθεί ελεγχόμενη μελέτη για την αξιολόγηση της βέλτιστης ηλικίας των ορνιθίων, στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμής χρησιμοποιούνται κατά παράδοση νεαρά ορνίθια που οδηγούνται συνήθως σε σφαγείο πουλερικών (ηλικίας περίπου 7 εβδομάδων και βάρους 1,5-2,5 kg).

Συλλογή και μεταφορά των οφθαλμών στο εργαστήριο

Οι κεφαλές θα πρέπει να αφαιρούνται αμέσως μετά την αναισθητοποίηση των ορνιθίων, συνήθως με ηλεκτροπληξία, και την τομή στον τράχηλο για αφαίμαξη. Τα ορνίθια θα πρέπει να προέρχονται από τοπική πηγή κοντά στο εργαστήριο, ώστε οι κεφαλές τους να μεταφέρονται ταχέως από το σφαγείο στο εργαστήριο για να ελαχιστοποιείται η φθορά ή/και η βακτηριακή μόλυνση. Το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ της συλλογής των κεφαλών των ορνιθίων και της τοποθέτησης των οφθαλμών στον θάλαμο υπερδιαπότισης μετά την εξόρυξη θα πρέπει να περιορίζεται στο ελάχιστο δυνατό (κατά κανόνα δύο ώρες), ώστε να διασφαλίζεται η εκπλήρωση των κριτηρίων αποδοχής της δοκιμής. Όλοι οι οφθαλμοί που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή θα πρέπει να προέρχονται από την ίδια ομάδα οφθαλμών που συλλέχθηκαν συγκεκριμένη ημέρα.

Επειδή οι οφθαλμοί ανατέμνονται στο εργαστήριο, οι κεφαλές μεταφέρονται από το σφαγείο άθικτες, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (κατά κανόνα μεταξύ 18 °C και 25 °C, μέσα σε πλαστικά δοχεία που υγραίνονται με απορροφητικό χαρτί εμποτισμένο με ισότονο αλατούχο διάλυμα (φυσιολογικό ορό).

Κριτήρια επιλογής και αριθμός οφθαλμών που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή ICE

Οι οφθαλμοί με υψηλή αρχική χρώση φλουορεσκεΐνης (> 0,5) ή τη βαθμολογία αδιαφάνειας κερατοειδούς (> 0,5) μετά την εξόρυξή τους, απορρίπτονται.

Κάθε ομάδα μεταχείρισης και ομάδα παράλληλων θετικών μαρτύρων αποτελείται από τρεις τουλάχιστον οφθαλμούς. Η ομάδα αρνητικών μαρτύρων ή μαρτύρων με διαλύτη (εάν δεν χρησιμοποιείται φυσιολογικός ορός ως διαλύτης) αποτελείται από τουλάχιστον έναν οφθαλμό.

Όταν η έκβαση της δοκιμής στερεών υλικών είναι «Δεν ταξινομείται» βάσει του GHS, συνιστάται δεύτερη δοκιμή με τρεις οφθαλμούς για την επιβεβαίωση ή την απόρριψη της αρνητικής έκβασης.

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

Προετοιμασία των οφθαλμών

Τα βλέφαρα εκτέμνονται προσεκτικά κατά τρόπο ώστε να μην προκληθεί βλάβη στον κερατοειδή. Η ακεραιότητα του κερατοειδούς αξιολογείται ταχέως με την ενστάλαξη μιας σταγόνας νατριούχου φλουορεσκεΐνης 2 % (κ.β.) στην επιφάνεια του κερατοειδούς για λίγα δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από έκπλυση του κερατοειδούς με ισότονο αλατούχο διάλυμα. Οι οφθαλμοί που έχουν υποβληθεί σε μεταχείριση με φλουορεσκεΐνη εξετάζονται με σχισμοειδή λυχνία για να διαπιστώνεται αν είναι άθικτος ο κερατοειδής (βαθμολογίες κατακράτησης φλουορεσκεΐνης και αδιαφάνειας κερατοειδούς ≤ 0,5).

Εάν ο κερατοειδής είναι άθικτος, ο οφθαλμός ανατέμνεται περαιτέρω από το κρανίο με προσοχή, ώστε να μην προκληθεί βλάβη στον κερατοειδή. Ο βολβός απομακρύνεται από τον οφθαλμικό κόγχο με χειρουργική λαβίδα, με την οποία συγκρατείται σταθερά η σκαρδαμυκτική μεμβράνη ενώ αποκόπτονται οι οφθαλμικοί μύες με κυρτό αμβλύ ψαλίδι. Είναι σημαντικό να αποφεύγεται η άσκηση υπερβολικής πίεσης ώστε να μην προκαλείται βλάβη στον κερατοειδή (τεχνητά σφάλματα λόγω συμπίεσης).

Κατά την απόσπαση του οφθαλμού από τον οφθαλμικό κόγχο πρέπει να παραμένει συνδεδεμένο ένα ορατό τμήμα του οπτικού νεύρου. Μετά την αφαίρεσή του από τον οφθαλμικό κόγχο, ο οφθαλμός τοποθετείται σε απορροφητικό επίθεμα και αποκόπτονται η σκαρδαμυκτική μεμβράνη και ο λοιπός συνδετικός ιστός.

Ο εξορυγμένος οφθαλμός στερεώνεται σε σφιγκτήρα από ανοξείδωτο χάλυβα με τον κερατοειδή σε κατακόρυφη θέση. Ο σφιγκτήρας μεταφέρεται εν συνεχεία σε θάλαμο της συσκευής υπερδιαπότισης (18). Οι σφιγκτήρες θα πρέπει να τοποθετούνται στη συσκευή υπερδιαπότισης κατά τρόπο ώστε ολόκληρος ο κερατοειδής να αρδεύεται με τη στάγδην παροχή ισότονου αλατούχου διαλύματος (3-4 σταγόνες ανά λεπτό ή 0,1-0,15 ml/min). Η θερμοκρασία των θαλάμων της συσκευής υπερδιαπότισης θα πρέπει να είναι ελεγχόμενη και να ρυθμίζεται στους 32 ± 1,5 °C. Στο προσάρτημα 3 παρατίθεται διάγραμμα τυπικής συσκευής υπερδιαπότισης και σφιγκτήρων για οφθαλμούς, που κυκλοφορούν στο εμπόριο ή κατασκευάζονται κατά παραγγελία. Η συσκευή μπορεί να τροποποιείται ώστε να προσαρμόζεται στις ανάγκες του εκάστοτε εργαστηρίου (π.χ. να δέχεται διαφορετικό αριθμό οφθαλμών).

Μετά την τοποθέτησή τους στη συσκευή υπερδιαπότισης, οι οφθαλμοί επανεξετάζονται με σχισμοειδή λυχνία για να διαπιστωθεί ότι δεν υπέστησαν βλάβη κατά τη διαδικασία ανατομής. Παράλληλα, θα πρέπει επίσης να μετράται το πάχος του κερατοειδούς στην κορυφή του με το παχύμετρο της σχισμοειδούς λυχνίας. Οι οφθαλμοί με i) βαθμολογία κατακράτησης φλουορεσκεΐνης > 0,5, ii) αδιαφάνεια κερατοειδούς > 0,5 ή iii) άλλες ενδείξεις βλάβης θα πρέπει να αντικαθίστανται. Από τους οφθαλμούς που δεν απορρίπτονται λόγω οποιουδήποτε από αυτά τα κριτήρια, κάθε οφθαλμός με πάχος κερατοειδούς που αποκλίνει κατά περισσότερο από 10 % από τη μέση τιμή του συνόλου των οφθαλμών πρέπει να απορρίπτεται. Οι χρήστες θα πρέπει να γνωρίζουν ότι η ένδειξη της σχισμοειδούς λυχνίας για το πάχος του κερατοειδούς μπορεί να διαφέρει ανάλογα με τη ρύθμιση του πλάτους της σχισμής. Το πλάτος της σχισμής πρέπει να ρυθμίζεται στα 0,095 mm.

Όταν όλοι οι οφθαλμοί έχουν εξεταστεί και εγκριθεί, επωάζονται επί 45 έως 60 λεπτά περίπου για την εξισορρόπησή τους με το σύστημα δοκιμής πριν από τη χορήγηση της δόσης. Μετά την παρέλευση του διαστήματος εξισορρόπησης, καταγράφεται η μηδενική μέτρηση αναφοράς ως γραμμή βάσης του πάχους και της αδιαφάνειας του κερατοειδούς (δηλ. χρόνος = 0). Η βαθμολογία κατακράτησης φλουορεσκεΐνης κατά την ανατομή χρησιμοποιείται ως γραμμή βάσης για το συγκεκριμένο τελικό σημείο.

Εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας

Αμέσως μετά τις μηδενικές μετρήσεις αναφοράς, ο οφθαλμός (με τη διάταξη που τον συγκρατεί) απομακρύνεται από τη συσκευή υπερδιαπότισης και τοποθετείται σε οριζόντια θέση και η υπό δοκιμή χημική ουσία εφαρμόζεται στον κερατοειδή.

Οι υγρές υπό δοκιμή χημικές ουσίες υποβάλλονται κατά κανόνα σε δοκιμή χωρίς αραίωση, αλλά μπορούν να αραιωθούν, εάν κριθεί απαραίτητο (π.χ. στο πλαίσιο του σχεδιασμού της μελέτης). Ο προτιμώμενος διαλύτης για την αραίωση των υπό δοκιμή χημικών ουσιών είναι ο φυσιολογικός ορός. Μπορούν πάντως να χρησιμοποιούνται και εναλλακτικοί διαλύτες υπό ελεγχόμενες συνθήκες, αλλά πρέπει να αποδεικνύεται η καταλληλότητά τους.

Οι υγρές υπό δοκιμή ουσίες εφαρμόζονται στον κερατοειδή κατά τρόπο ώστε να καλύπτουν ομοιογενώς ολόκληρη την επιφάνειά του. Ο τυπικός όγκος είναι 0,03 ml.

Εάν είναι εφικτό, οι στερεές ουσίες θα πρέπει να κονιοποιούνται σε όσο το δυνατόν λεπτότερη σκόνη σε ιγδίο με ύπερο ή με συγκρίσιμο εργαλείο άλεσης. Η σκόνη εφαρμόζεται στον κερατοειδή κατά τρόπο ώστε η υπό δοκιμή χημική ουσία να καλύπτει ομοιόμορφα την επιφάνειά του. Η τυπική ποσότητα είναι 0,03 g.

Η υπό δοκιμή χημική ουσία (υγρή ή στερεά) εφαρμόζεται επί 10 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια εκπλένεται από τον οφθαλμό με ισότονο αλατούχο διάλυμα (περίπου 20 ml) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολούθως, ο οφθαλμός (με τη διάταξη που τον συγκρατεί) επαναφέρεται στη συσκευή υπερδιαπότισης στην αρχική κατακόρυφη θέση. Σε περίπτωση ανάγκης, μπορεί να πραγματοποιηθεί συμπληρωματική έκπλυση μετά την εφαρμογή επί 10 δευτερόλεπτα, καθώς και σε μεταγενέστερες χρονικές στιγμές (π.χ. όταν εντοπίζονται υπολείμματα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στον κερατοειδή). Γενικά,, η επιπλέον ποσότητα αλατούχου διαλύματος που χρησιμοποιείται για έκπλυση δεν είναι κρίσιμης σημασίας, ενώ αντίθετα είναι σημαντική η παρατήρηση προσκόλλησης της χημικής ουσίας στον κερατοειδή.

Χημικές ουσίες που χρησιμεύουν ως μάρτυρες

Κάθε πείραμα πρέπει να περιλαμβάνει παράλληλους αρνητικούς μάρτυρες ή μάρτυρες με διαλύτη/φορέα και θετικούς μάρτυρες.

Κατά τη δοκιμή υγρών χωρίς αραίωση ή στερεών, ως παράλληλος αρνητικός μάρτυρας στη μέθοδο δοκιμών ICE χρησιμοποιείται φυσιολογικός ορός για την ανίχνευση μη ειδικών αλλαγών στο σύστημα δοκιμής και για να εξασφαλίζεται ότι οι συνθήκες προσδιορισμού δεν προκαλούν άτοπη απόκριση ερεθισμού.

Κατά τη δοκιμή αραιωμένων υγρών, στη μέθοδο δοκιμών περιλαμβάνεται ομάδα παράλληλων μαρτύρων με διαλύτη/φορέα για την ανίχνευση μη ειδικών αλλαγών στο σύστημα δοκιμής και για να εξασφαλίζεται ότι οι συνθήκες προσδιορισμού δεν προκαλούν άτοπη απόκριση ερεθισμού. Όπως αναφέρεται στην παράγραφο 31, μπορεί να χρησιμοποιείται μόνο διαλύτης/φορέας για τον οποίο έχει αποδειχθεί ότι δεν έχει δυσμενείς επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής.

Σε κάθε πείραμα περιλαμβάνεται γνωστό ερεθιστικό των οφθαλμών ως παράλληλος θετικός μάρτυρας ούτως ώστε να επιβεβαιώνεται η πρόκληση της κατάλληλης απόκρισης. Δεδομένου ότι ο προσδιορισμός ICE χρησιμοποιείται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών για τον προσδιορισμό διαβρωτικών ή ισχυρών ερεθιστικών, ο θετικός μάρτυρας θα πρέπει να είναι χημική ουσία αναφοράς που επάγει σοβαρή απόκριση με αυτή τη μέθοδο. Ωστόσο, για να διασφαλιστεί η δυνατότητα αξιολόγησης της μεταβλητότητας της απόκρισης στον θετικό μάρτυρα σε συνάρτηση με τον χρόνο, το μέγεθος της σοβαρής απόκρισης δεν θα πρέπει να είναι υπερβολικό. Θα πρέπει να συγκεντρώνονται επαρκή δεδομένα in vitro για τον θετικό μάρτυρα, ώστε να είναι εφικτός ο υπολογισμός στατιστικά καθορισμένου αποδεκτού εύρους αποκρίσεων σε αυτόν. Εάν για συγκεκριμένο θετικό μάρτυρα δεν διατίθενται επαρκή ιστορικά δεδομένα προερχόμενα από τη μέθοδο δοκιμών ICE, ενδέχεται να χρειάζεται η διεξαγωγή μελετών για την απόκτηση αυτών των στοιχείων.

Παραδείγματα θετικών μαρτύρων για υγρές υπό δοκιμή χημικές ουσίες είναι το οξικό οξύ 10 % και το χλωριούχο βενζαλκόνιο 5 %, ενώ παραδείγματα θετικών μαρτύρων για στερεές υπό δοκιμή χημικές ουσίες είναι το υδροξείδιο του νατρίου και το ιμιδαζόλιο.

Οι χημικές ουσίες συγκριτικής αξιολόγησης είναι χρήσιμες για την αξιολόγηση του δυναμικού οφθαλμικής ερεθιστικότητας άγνωστων χημικών ουσιών συγκεκριμένης χημικής τάξης ή κατηγορίας προϊόντων ή για την αξιολόγηση του σχετικού δυναμικού ερεθιστικότητας ενός ερεθιστικού των οφθαλμών εντός συγκεκριμένου εύρους αποκρίσεων ερεθισμού.

Μετρούμενα τελικά σημεία

Κερατοειδείς αξιολογούνται πριν από τη μεταχείριση και στα 30, 75, 120, 180 και 240 λεπτά (± 5 λεπτά) μετά την έκπλυση που ακολουθεί τη μεταχείριση. Τα χρονικά αυτά σημεία εξασφαλίζουν επαρκή αριθμό μετρήσεων κατά τη διάρκεια της τετράωρης μεταχείρισης, παρέχοντας παράλληλα επαρκή χρονικά περιθώρια μεταξύ των μετρήσεων ώστε να γίνουν οι απαραίτητες παρατηρήσεις σε όλους τους οφθαλμούς.

Τα αξιολογούμενα τελικά σημεία είναι η αδιαφάνεια και το οίδημα του κερατοειδούς, η κατακράτηση φλουορεσκεΐνης και οι μορφολογικές επιδράσεις (π.χ. εντύπωμα ή χαλάρωση του επιθηλίου). Όλα τα τελικά σημεία προσδιορίζονται σε καθένα από τα ανωτέρω χρονικά σημεία με εξαίρεση την κατακράτηση φλουορεσκεΐνης (η οποία προσδιορίζεται μόνο πριν από τη μεταχείριση και 30 λεπτά μετά την έκθεση στην υπό δοκιμή χημική ουσία).

Συνιστάται η λήψη φωτογραφιών για την τεκμηρίωση της αδιαφάνειας του κερατοειδούς, της κατακράτησης φλουορεσκεΐνης, των μορφολογικών επιδράσεων και, εάν διενεργείται, της παθολογοανατομικής εξέτασης.

Μετά την τελική εξέταση στις τέσσερις ώρες, συνιστάται στους χρήστες να διατηρούν τους οφθαλμούς σε κατάλληλο υλικό μονιμοποίησης [π.χ. ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλδεΰδης (φορμόλη)] για πιθανή ιστολογική εξέταση [βλ. παράγραφο 14 και βιβλιογραφική παραπομπή (8) για λεπτομέρειες].

Το οίδημα του κερατοειδούς προσδιορίζεται βάσει μετρήσεων του πάχους του κερατοειδούς με οπτικό παχύμετρο σε σχισμοειδή λυχνία, εκφράζεται ως ποσοστό επί τοις εκατό και υπολογίζεται βάσει του ακόλουθου τύπου:

Υπολογίζεται το μέσο ποσοστό οιδήματος του κερατοειδούς για όλους τους οφθαλμούς της δοκιμής και για όλα τα χρονικά σημεία παρατήρησης. Βάσει της υψηλότερης μέσης βαθμολογίας οιδήματος του κερατοειδούς, όπως παρατηρείται ανεξαρτήτως χρονικού σημείου, συνάγεται συνολική βαθμολογία κατηγορίας για κάθε υπό δοκιμή χημική ουσία (βλ. παράγραφο 51).

Η αδιαφάνεια του κερατοειδούς αξιολογείται στην κερατοειδική περιοχή με τη μέγιστη θολερότητα για να βαθμολογηθεί όπως εμφαίνεται στον πίνακα 1. Υπολογίζεται η μέση τιμή αδιαφάνειας κερατοειδούς για όλους τους οφθαλμούς της δοκιμής και για όλα τα χρονικά σημεία παρατήρησης. Βάσει της υψηλότερης μέσης βαθμολογίας της αδιαφάνειας του κερατοειδούς, όπως παρατηρείται ανεξαρτήτως χρονικού σημείου, εξάγεται συνολική βαθμολογία κατηγορίας για κάθε υπό δοκιμή χημική ουσία (βλ. παράγραφο 51).

Πίνακας 1

Βαθμολογία αδιαφάνειας κερατοειδούς

Η κατακράτηση φλουορεσκεΐνης αξιολογείται κατά τον χρόνο παρατήρησης των 30 λεπτών, όπως εμφαίνεται στον πίνακα 2. Η μέση τιμή κατακράτησης φλουορεσκεΐνης για όλους τους οφθαλμούς της δοκιμής υπολογίζεται στο χρονικό σημείο παρατήρησης των 30 λεπτών και χρησιμοποιείται για να εξαχθεί συνολική βαθμολογία κατηγορίας για κάθε υπό δοκιμή χημική ουσία (βλ. παράγραφο

Πίνακας 2

Βαθμολογία κατακράτησης φλουορεσκεΐνης

Στις μορφολογικές επιδράσεις περιλαμβάνεται το «εντύπωμα» των κερατοειδικών επιθηλιακών κυττάρων, η «χαλάρωση» του επιθηλίου, η «τράχυνση» της επιφάνειας του κερατοειδούς και η «προσκόλληση» της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στον κερατοειδή. Τα ευρήματα αυτά ποικίλλουν σε σοβαρότητα και ενδέχεται να παρατηρούνται ταυτόχρονα. Η ταξινόμησή τους είναι υποκειμενική ανάλογα με την ερμηνεία του ερευνητή.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

Αξιολόγηση των δεδομένων

Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της κερατοειδικής αδιαφάνειας, του οιδήματος του κερατοειδούς και της κατακράτησης φλουορεσκεΐνης θα πρέπει να αξιολογούνται χωριστά ώστε να προκύπτει κατηγορία ICE για κάθε τελικό σημείο. Ακολούθως, οι κατηγορίες ICE για κάθε τελικό σημείο συνδυάζονται για την ταξινόμηση της ερεθιστικότητας κάθε υπό έλεγχο χημικής ουσίας.

Κριτήρια απόφασης

Μετά την αξιολόγηση κάθε τελικού σημείου, είναι εφικτή η κατάταξη σε κατηγορίες ICE βάσει προκαθορισμένου εύρους. Η ερμηνεία του οιδήματος του κερατοειδούς (πίνακας 3), της αδιαφάνειάς του (πίνακας 4) και της κατακράτησης φλουορεσκεΐνης (πίνακας 5) βάσει τεσσάρων κατηγοριών ICE πραγματοποιείται σύμφωνα με τις κλίμακες που παρατίθενται παρακάτω. Επισημαίνεται ότι η βαθμολογία οιδήματος του κερατοειδούς που εμφαίνεται στον πίνακα 3 ισχύει μόνο εάν το πάχος μετράται με μικροσκόπιο σχισμοειδούς λυχνίας (π.χ. Haag-Streit BP 900), με παχύμετρο αριθ. 1 και ρύθμιση του πλάτους σχισμής στο 9, που ισούται με 0,095 mm. Οι χρήστες θα πρέπει να γνωρίζουν ότι η ένδειξη της σχισμοειδούς λυχνίας για το πάχος του κερατοειδούς μπορεί να διαφέρει ανάλογα με τη ρύθμιση του πλάτους της σχισμής.

Πίνακας 3

Κριτήρια ταξινόμησης ICE για το οίδημα του κερατοειδούς

Πίνακας 4

Κριτήρια ταξινόμησης ICE για την αδιαφάνεια

Πίνακας 5

Κριτήρια ταξινόμησης ICE για τη μέση κατακράτηση φλουορεσκεΐνης

Η ταξινόμηση in vitro της υπό δοκιμή χημικής ουσίας καθορίζεται από την κατηγορία του GHS που αντιστοιχεί στον συνδυασμό των κατηγοριών που προκύπτουν για το οίδημα του κερατοειδούς, την κερατοειδική αδιαφάνεια και την κατακράτηση φλουορεσκεΐνης, όπως περιγράφεται στον πίνακα 6.

Πίνακας 6

Συνολική in vitro ταξινόμηση

Κριτήρια αποδοχής της μελέτης

Μια δοκιμή θεωρείται αποδεκτή εάν οι παράλληλοι αρνητικοί μάρτυρες ή μάρτυρες με φορέα/διαλύτη και οι παράλληλοι θετικοί μάρτυρες ταξινομούνται ως «Καμίας κατηγορίας» του GHS και κατηγορίας 1 του GHS αντίστοιχα.

Έκθεση δοκιμής

Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία, εφόσον αυτά έχουν σημασία για τη διενέργεια της μελέτης: