Οδηγία 2000/45/ΕΚ της Επιτροπής

της 6ης Ιουλίου 2000

σχετικά με τον καθορισμό κοινοτικής μεθόδου αναλύσεως για τον προσδιορισμό της βιταμίνης Α, της βιταμίνης Ε και της θρυπτοφάνης σε ζωοτροφές

(Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,

την οδηγία αριθ. 70/373/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 20ής Ιουλίου 1970, περί εισαγωγής τρόπων λήψεως δειγμάτων και μεθόδων κοινοτικής αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών(1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την πράξη προσχώρησης της Αυστρίας, της Φινλανδίας και της Σουηδίας(2), και ιδίως το άρθρο 2,

Εκτιμώντας τα ακόλουθα:

(1) Η οδηγία 70/373/ΕΟΚ προβλέπει ότι ο επίσημος έλεγχος των ζωοτροφών προκειμένου να διαπιστώνεται κατά πόσον πληρούνται οι νομοθετικές κανονιστικές διατάξεις όσον αφορά την ποιότητα και τη σύνθεση αυτών, πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τις κοινοτικές μεθόδους δειγματοληψίας και ανάλυσης.

(2) Η οδηγία 70/524/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 23ης Νοεμβρίου 1970, περί των προσθέτων υλών στις ζωοτροφές(3), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό ΕΚ αριθ. 2439/1999 της Επιτροπής(4), ορίζει ότι η περιεκτικότητα σε βιταμίνη Α και βιταμίνη Ε πρέπει να αναφέρεται στη σήμανση εφόσον οι ουσίες αυτές προστίθενται σε προμείγματα και ζωοτροφές.

(3) Η οδηγία 79/373/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 2ας Απριλίου 1979, περί εμπορίας των σύνθετων ζωοτροφών(5), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 2000/16/ΕΚ(6), και την οδηγία 93/74/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 13ης Σεπτεμβρίου 1993, για τις ζωοτροφές με τις οποίες επιδιώκονται στόχοι ιδιαίτερης διατροφής(7), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 96/25/ΕΚ(8), προβλέπουν τη δήλωση των αμινοξέων στη σήμανση των ζωοτροφών.

(4) Πρέπει να καθοριστούν κοινοτικές μέθοδοι ανάλυσης για τον έλεγχο των ουσιών αυτών.

(5) Τα μέτρα που προβλέπονται στην παρούσα οδηγία είναι σύμφωνα με τη γνώμη της μόνιμης επιτροπής ζωοτροφών,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:

Άρθρο 1

Τα κράτη μέλη προβλέπουν ότι αναλύσεις που διεξάγονται με σκοπό επίσημους ελέγχους της περιεκτότητας των ζωοτροφών και προμειγμάτων σε βιταμίνη Α, βιταμίνη Ε και θρυπτοφάνη εκτελούνται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται στο παράρτημα.

Άρθρο 2

Τα κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ, το αργότερο μέχρι τις 31 Αυγούστου 2000, τις αναγκαίες νομοθετικές, κανονιστικές ή διοικητικές διατάξεις για να συμμορφωθούν με τις διατάξεις της παρούσας οδηγίας. Ενημερώνουν την Επιτροπή σχετικά.

Τα προβλεπόμενα μέτρα εφαρμόζονται από την 1η Σεπτεμβρίου 2000.

Τα μέτρα αυτά, όταν θεσπίζονται από τα κράτη μέλη, περιλαμβάνουν αναφορά στην παρούσα οδηγία ή συνοδεύονται από παρόμοια αναφορά κατά την επίσημη δημοσίευσή τους. Η διαδικασία για την αναφορά αυτή καθορίζεται από τα κράτη μέλη.

Άρθρο 3

Η παρούσα οδηγία τίθεται σε ισχύ την εικοστή ημέρα από τη δημοσίευσή της στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.

Άρθρο 4

Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα κράτη μέλη.

Βρυξέλλες, 6 Ιουλίου 2000.

Για την Επιτροπή

David Byrne

Μέλος της Επιτροπής

(1) ΕΕ L 170 της 3.8.1970, σ. 2.

(2) ΕΕ C 241 της 29.8.1994, σ. 1.

(3) ΕΕ L 270 της 14.12.1970, σ. 1.

(4) ΕΕ L 297 της 18.11.1999, σ. 8.

(5) ΕΕ L 86 της 6.4.1979, σ. 30.

(6) ΕΕ L 105 της 3.5.2000, σ. 36.

(7) ΕΕ L 237 της 22.9.1993, σ. 23.

(8) ΕΕ L 125 της 23.5.1996, σ. 35.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

Μέρος Α

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Α

1. Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η παρούσα μέθοδος αποσκοπεί στον προσδιορισμό της βιταμίνης Α (ρετινόλη) σε ζωοτροφές και προμείγματα. Στον όρο βιταμίνη Α περιλαμβάνονται η ολο-trans-ρετινόλη και τα cis-ισομερή της που προσδιορίζονται με την παρούσα μέθοδο. Η περιεκτικότητα σε βιταμίνη Α εκφράζεται σε διεθνείς μονάδες (IU) ανά kg. Μία IU αντιστοιχεί στη δράση 0,300 μg αλκοολικής ολο-trans-βιταμίνης Α ή 0,344 μg οξικής ολο-trans-βιταμίνης Α ή 0,550 μg παλμιτικής ολο-trans-βιταμίνης Α.

Το όριο προσδιορισμού είναι 2000 IU βιταμίνης A/kg.

2. Αρχή

Το δείγμα υδρολύεται με αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου και η βιταμίνη Α εκχυλίζεται με πετρελαϊκό αιθέρα. Ο διαλύτης απομακρύνεται με εξάτμιση και το υπόλειμμα διαλύεται σε μεθανόλη και, εφόσον είναι αναγκαίο, αραιώνεται μέχρι την απαιτούμενη συγκέντρωση. Η συγκέντρωση της βιταμίνης Α προσδιορίζεται με υγρή χρωματογραφία ανάστροφης φάσεως υψηλής αποδόσεως (RP-HPLC) χρησιμοποιώντας ανιχνευτή UV ή φθορισμού. Οι χρωματογραφικές παράμετροι επιλέγονται έτσι ώστε να μη γίνεται διαχωρισμός μεταξύ της αλκοολικής ολο-trans- βιταμίνης Α και των cis ισομερών της.

3. Αντιδραστήρια

3.1. Αιθανόλη, σ = 96 %

3.2. Πετρελαϊκός αιθέρας, περιοχή ζέσεως 40 °C - 60 °C

3.3. Μεθανόλη

3.4. Διάλυμα υδροξειδίου του καλίου, β = 50 g/100 ml

3.5. Διάλυμα ασκορβικού νατρίου, β = 10 g/100 ml (βλέπε παρατηρήσεις, σημείο 7.7)

3.6. Θειούχο νάτριο, Na2S. x H2O (x = 7 - 9)

3.6.1. Διάλυμα θειούχου νατρίου, c = 0.5 mol/l σε γλυκερόλη, β = 120 g/l (για x = 9) (βλέπε παρατηρήσεις, σημείο 7.8)

3.7. Διάλυμα φαινολοφθαλεΐνης, β = 2 g/100 ml σε αιθανόλη (3.1)

3.8. 2-προπανόλη

3.9. Κινητή φάση για HPLC: μείγμα μεθανόλης (3.3) και ύδατος, π.χ. 980 + 20 (v + v). Η ακριβής σχέση καθορίζεται από τα χαρακτηριστικά της χρησιμοποιούμενης στήλης.

3.10. Άζωτο, απηλλαγμένο οξυγόνου

3.11. Οξική ολο-trans-βιταμίνη Α, εξαιρετικά καθαρή, πιστοποιημένης δραστικότητας, π.χ. 2.80 x 106 IU/g

3.11.1. Αρχικό διάλυμα οξικής ολο-trans-βιταμίνης Α: Σε ογκομετρική φιάλη 100 ml ζυγίζονται με προσέγγιση 0,1 mg, 50 mg οξικής βιταμίνης Α (3.11). Διαλύονται σε 2-προπανόλη (3.8) και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με τον ίδιο διαλύτη. Η ονομαστική συγκέντρωση του εν λόγω διαλύματος είναι 1400 IU βιταμίνης Α ανά ml. Η ακριβής συγκέντρωση πρέπει να προσδιορίζεται σύμφωνα με το σημείο 5.6.3.1.

3.12. Παλμιτική ολο-trans-βιταμίνη Α, εξαιρετικά καθαρή, πιστοποιημένης δραστικότητας, π.χ. 1.80 x 106 IU/g

3.12.1. Αρχικό διάλυμα παλμιτικής ολο-trans-βιταμίνης Α: Σε ογκομετρική φιάλη 100 ml ζυγίζονται με προσέγγιση 0,1 mg, 80 mg παλμιτικής βιταμίνης Α (3.12). Διαλύονται σε 2-προπανόλη (3.8) και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με τον ίδιο διαλύτη. Η ονομαστική συγκέντρωση του εν λόγω διαλύματος είναι 1400 IU βιταμίνης Α ανά ml. Η ακριβής συγκέντρωση πρέπει να προσδιορίζεται σύμφωνα με το σημείο 5.6.3.2.

3.13. 2,6-δι-tert-βουτυλο-4-μεθυλοφαινόλη (BHT) (βλέπε παρατηρήσεις, σημείο 7.5)

4. Συσκευές

4.1. Περιστροφικός εξατμιστήρας κενού

4.2. Αδιαφανή γυάλινα σκεύη

4.2.1. Κωνικές ή σφαιρικές φιάλες με επίπεδο πυθμένα των 500 ml, με εσμυρισμένη υποδοχή

4.2.2. Ογκομετρικές στενόλαιμες φιάλες με εσμυρισμένα πώματα των 10, 25, 100 και 500 ml

4.2.3. Κωνικές διαχωριστικές χοάνες των 1000 ml, με εσμυρισμένα πώματα

4.2.4. Απιοειδείς φιάλες των 250 ml, με εσμυρισμένες υποδοχές

4.3. Συμπυκνωτής Allihn, με χιτώνιο μήκους 300 mm, με εσμυρισμένη ένωση, με προσαρμογέα για σωλήνα παροχής αερίου

4.4. Πτυχωτός ηθμός για διαχωρισμό φάσεων, διαμέτρου 185 mm (π.χ. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Εξοπλισμός HPLC με σύστημα εγχύσεως

4.5.1. Στήλη υγρής χρωματογραφίας, 250 mm x 4 mm, C18, με πλήρωση 5 ή 10 μm, ή ισοδύναμη (κριτήριο απόδοσης: μία μόνον κορυφή για όλα τα ισομερή ρετινόλης υπό τις συνθήκες HPLC)

4.5.2. Ανιχνευτής UV ή φθορισμού, με μεταβαλλόμενο μήκος κύματος

4.6. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες χαλαζία των 10 mm

4.7. Υδρόλουτρο με μαγνητικό αναδευτήρα

4.8. Συσκευή εκχυλίσεως (βλέπε σχήμα 1) αποτελούμενη από:

4.8.1. Γυάλινο κύλινδρο χωρητικότητας 1l με εσμυρισμένο λαιμό και πώμα

4.8.2. Εσμυρισμένο γυάλινο ένθεμα εφοδιασμένο με πλευρικό βραχίονα και προσαρμόσιμο σωλήνα διερχόμενο από το κέντρο. Το κάτω άκρο του προσαρμόσιμου σωλήνα θα πρέπει να έχει σχήμα U ενώ στο άλλο άκρο θα πρέπει να υπάρχει ακροφύσιο έτσι ώστε η πάνω υγρή στιβάδα στον κύλινδρο να μπορεί να μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη.

5. Διαδικασία

Σημείωση:

Η βιταμίνη Α είναι ευαίσθητη στο υπεριώδες φως και στην οξείδωση. Όλες οι εργασίες θα πρέπει να γίνονται απουσία φωτός (χρησιμοποιώντας αδιαφανή γυάλινα σκεύη ή σκεύη προστατευόμενα με φύλλο αλουμινίου) και οξυγόνου (πλήρωση με άζωτο). Κατά τη διάρκετα της εκχύλισης ο αέρας θα πρέπει να αντικαθίσταται από άζωτο (αποφεύγεται η υπερβολική πίεση χαλαρώνοντας από καιρού σε καιρό το πώμα).

5.1. Παρασκευή του δείγματος

Το δείγμα αλέθεται έτσι ώστε να διέρχεται από κόσκινο με διάμετρο οπών 1 mm, προσέχοντας να μην παράγεται θερμότητα. Η άλεση πρέπει να γίνεται αμέσως πριν από τη ζύγιση και τη σαπωνοποίηση, αλλιώς μπορεί να υπάρξουν απώλειες βιταμίνης Α.

5.2. Σαπωνοποίηση

Ανάλογα με την περιεκτικότητα σε βιταμίνη Α, ζυγίζονται σε κωνική ή σφαιρική φιάλη με επίπεδο πυθμένα των 500 ml (4.2.1), 2 g έως 25 g του δείγματος με προσέγγιση 0,01 g. Προστίθενται διαδοχικά υπό ανακίνηση 130 ml αιθανόλης (3.1), περίπου 100 mg BHT (3.13), 2 ml διαλύματος ασκορβικού νατρίου (3.5) και 2 ml διαλύματος θειούχου νατρίου (3.6). Στη φιάλη προσαρμόζεται συμπυκνωτήρας (4.3) και η φιάλη βυθίζεται σε υδρόλουτρο με μαγνητικό αναδευτήρα (4.7). Θερμαίνεται μέχρι βρασμού και το διάλυμα αφήνεται υπό αναρροή για 5 λεπτά. Κατόπιν προστίθενται 25 ml διαλύματος υδροξειδίου του καλίου (3.4) μέσω του συμπυκνωτήρα (4.3) και το διάλυμα αφήνεται υπό αναρροή για 25 λεπτά ακόμη, με ανάδευση υπό ελαφρύ ρεύμα αζώτου. Ο συμπυκνωτήρας στη συνέχεια εκπλένεται με 20 ml νερό περίπου και το περιεχόμενο της φιάλης ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου.

5.3. Εκχύλιση

Το σαπωνοποιημένο διάλυμα μεταγγίζεται ποσοτικά, εκπλένοντάς το με νερό συνολικού όγκου 250 ml, σε διαχωριστική χοάνη των 1000 ml (4.2.3) ή σε συσκευή εκχυλίσεως (4.8). Η φιάλη σαπωνοποιήσεως εκπλένεται διαδοχικά με 25 ml αιθανόλης (3.1 ) και 100 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2) και τα εκπλύματα μεταφέρονται στη διαχωριστική χοάνη ή στη συσκευή εκχυλίσεως. Η αναλογία νερού-αιθανόλης στα συνενωμένα διαλύματα θα πρέπει να είναι περίπου 2:1. Το σύνολο ανακινείται ισχυρά επί 2 λεπτά και αφήνεται να ηρεμήσει για άλλα 2 λεπτά.

5.3.1. Εκχύλιση με διαχωριστική χοάνη (4.2.3)

Μετά το διαχωρισμό των στιβάδων (βλέπε παρατήρηση, σημείο 7.3), η στιβάδα του πετρελαϊκού αιθέρα μεταφέρεται σε άλλη διαχωριστική χοάνη (4.2.3). Η εκχύλιση αυτή επαναλαμβάνεται δύο φορές, με 100 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2) και δύο φορές με 50 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2).

Τα συνενωμένα εκχυλίσματα πλένονται στη διαχωριστική χοάνη δύο φορές με ήπια περιδίνιση (για την αποφυγή σχηματισμού γαλακτωμάτων) με 100 ml νερό κάθε φορά και κατόπιν με επανειλημμένη ανακίνηση με περαιτέρω ποσότητες νερού των 100 ml μέχρις ότου το νερό να παραμένει άχρωμο σε προσθήκη διαλύματος φαινολοφθαλεΐνης (3.7) (τέσσερις φορές πλύσιμο συνήθως αρκεί). Το πλυμένο εκχύλισμα διηθείται μέσω ξηρού πτυχωτού ηθμού για διαχωρισμό φάσεων (4.4) για την απομάκρυνση τυχόν εναιωρούμενου νερού σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml (4.2.2). Η διαχωριστική χοάνη και ο ηθμός εκπλύνονται με 50 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2), το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με πετρελαϊκό αιθέρα (3.2) και αναμειγνύεται καλά.

5.3.2. Εκχύλιση με συσκευή εκχυλίσεως (4.8)

Μετά το διαχωρισμό των στιβάδων (βλέπε παρατήρηση, σημείο 7.3), το πώμα του γυάλινου κυλίνδρου (4.8.1) αντικαθίσταται με το εσμυρισμένο ένθεμα (4.8.2) και το σχήματος U κάτω άκρο του προσαρμοζόμενου σωλήνα φέρεται σε τέτοια θέση ώστε να είναι ίσα-ίσα πάνω από το επίπεδο της διαχωριστικής επιφάνειας. Με εφαρμογή πιέσεως από γραμμή αζώτου στον πλευρικό βραχίονα, η πάνω στιβάδα του πετρελαϊκού αιθέρα μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη των 1000 ml (4.2.3). Στο γυάλινο κύλινδρο προστίθενται 100 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2), ο κύλινδρος πωματίζεται και ανακινείται καλά. Οι στιβάδες αφήνονται να διαχωριστούν και η πάνω στιβάδα μεταφέρεται όπως πριν στη διαχωριστική χοάνη. Η διαδικασία εκχυλίσεως επαναλαμβάνεται με 100 ml ακόμη πετρελαϊκού αιθέρα (3.2), στη συνέχεια δύο φορές με 50 ml κάθε φορά πετρελαϊκού αιθέρα (3.2) και οι στιβάδες του πετρελαϊκού αιθέρα προστίθενται στη διαχωριστική χοάνη.

Τα συνενωμένα πετρελαϊκά εκχυλίσματα πλένονται όπως περιγράφεται στο σημείο 5.3.1 και ακολουθείται η περιγραφόμενη εκεί διαδικασία.

5.4. Παρασκευή του δείγματος για την HPLC

Σε απιοειδή φιάλη 250 ml (4.2.4) μεταφέρεται με πιπέτα (σιφώνιο) κατάλληλη ποσότητα του διαλύματος πετρελαϊκού αιθέρα (από τα σημεία 5.3.1 ή 5.3.2). Ο διαλύτης εξατμίζεται σχεδόν μέχρι ξηρού σε περιστροφικό εξατμιστήρα (4.1) με ελαττωμένη πίεση και θερμοκρασία λουτρού μη υπερβαίνουσα τους 40 °C. Αποκαθίσταται η ατμοσφαιρική πίεση με εισαγωγή αζώτου (3.10) και η φιάλη απομακρύνεται από τον περιστροφικό εξατμιστήρα. Ο παραμένων διαλύτης απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου (3.10) και το υπόλειμμα διαλύεται αμέσως σε γνωστό όγκο (10 - 100 ml) μεθανόλης (3.3) (η συγκέντρωση της βιταμίνης Α θα πρέπει να είναι της τάξεως των 5 IU/ml έως 30 IU/ml).

5.5. Προσδιορισμός με HPLC

Η βιταμίνη Α διαχωρίζεται σε στήλη ανάστροφης φάσεως C18 (4.5.1) και μετράται η συγκέντρωση με τη βοήθεια ανιχνευτή UV (325 nm) ή φθορισμού (διέγερση: 325 nm, εκπομπή: 475 nm) (4.5.2).

Εγχύεται κατάλληλη ποσότητα (π.χ. 20 μl) του μεθανολικού διαλύματος που λαμβάνεται στο σημείο 5.4 και εκλούζεται με την κινητή φάση (3.9). Υπολογίζεται το μέσο ύψος κορυφής (εμβαδόν) ορισμένων εγχύσεων του ίδιου δείγματος και τα μέσα ύψη κορυφών (εμβαδά) ορισμένων εγχύσεων των διαλυμάτων βαθμονόμησης (5.6.2).

Συνθήκες HPLC

Για την HPLC πρέπει να χρησιμοποιούνται οι κατωτέρω συνθήκες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν όμως και άλλες συνθήκες υπό την προϋπόθεση ότι παρέχουν ισοδύναμα αποτελέσματα.

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

5.6. Βαθμονόμηση

5.6.1. Παρασκευή των προτύπων διαλυμάτων εργασίας

Σε κωνική ή σφαιρική φιάλη με επίπεδο πυθμένα των 500 ml μεταφέρονται με σιφώνιο 20 ml του αρχικού διαλύματος οξικής βιταμίνης Α (3.11.1) ή 20 ml του αρχικού διαλύματος παλμιτικής βιταμίνης Α (3.12.1) και υδρολύονται όπως περιγράφεται στο σημείο 5.2, αλλά χωρίς προσθήκη BHT. Ακολουθεί εκχύλιση με πετρελαϊκό αιθέρα (3.2) σύμφωνα με το σημείο 5.3 και συμπληρώνουμε μέχρι τη χαραγή των 500 ml με πετρελαϊκό αιθέρα (3.2). 100 ml του εκχυλίσματος αυτού εξατμίζονται στον περιστροφικό εξατμιστήρα (βλέπε σημείο 5.4) σχεδόν μέχρι ξηρού, ο εναπομένων διαλύτης απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου (3.10) και το υπόλειμμα αναδιαλύεται σε 10,0 ml μεθανόλης (3.3). Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του διαλύματος είναι 560 IU βιτανίμης Α ανά ml. Η ακριβής συγκέντρωση πρέπει να προσδιοριστεί σύμφωνα με το σημείο 5.6.3.3. Το πρότυπο διάλυμα εργασίας πρέπει να παρασκευάζεται πρόσφατα πριν από τη χρήση.

2,0 ml του προτύπου αυτού διαλύματος εργασίας μεταφέρονται με σιφώνιο σε ογκομετρική φιάλη των 20 ml, συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με μεθανόλη (3.3) και το σύνολο αναμειγνύεται. Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του αραιωμένου προτύπου διαλύματος εργασίας είναι 56 IU βιταμίνης Α ανά ml.

5.6.2. Παρασκευή των διαλυμάτων και καμπύλη βαθμονόμησης

1,0, 2,0, 5,0 και 10,0 ml του αραιωμένου προτύπου διαλύματος εργασίας μεταφέρονται σε μια σειρά ογκομετρικών φιαλών των 20 ml, συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με μεθανόλη (3.3) και αναμειγνύονται. Οι ονομαστικές συγκεντρώσεις των διαλυμάτων αυτών είναι 2,8, 5,6, 14,0 και 28,0 IU βιταμίνης Α ανά ml.

20 μl κάθε διαλύματος βαθμονόμησης εγχύονται μερικές φορές και προσδιορίζονται τα μέσα ύψη (εμβαδά) των κορυφών. Χρησιμοποιώντας τα μέσα ύψη (εμβαδά) των κορυφών, χαράσσεται καμπύλη βαθμονόμησης λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα του ελέγχου με UV (5.6.3.3).

5.6.3. Τυποποίηση σε UV των προτύπων διαλυμάτων

5.6.3.1. Αρχικό διάλυμα οξικής βιταμίνης Α

Σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml (4.2.2) μεταφέρονται με σιφώνιο 2,0 ml του αρχικού διαλύματος οξικής βιταμίνης Α (3.11.1) και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με 2-προπανόλη (3.8). Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του διαλύματος είναι 56 IU βιταμίνης Α ανά ml. 3,0 ml του αραιωμένου αυτού διαλύματος οξικής βιταμίνης Α μεταφέρονται με σιφώνιο σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με 2-προπανόλη (3.8). Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του διαλύματος είναι 6,72 IU βιταμίνης Α ανά ml. Μετριέται το UV φάσμα αυτού του διαλύματος σε σχέση με την 2-προπανόλη (3.8) στο φασματοφωτόμετρο (4.6) μεταξύ 300 nm και 400 nm. Η μέγιστη απόσβεση πρέπει να είναι μεταξύ 325 nm και 327 nm.

Υπολογισμός της συγκέντρωσης βιταμίνης Α:

>PIC FILE= "L_2000174EL.003601.EPS">

5.6.3.2. Αρχικό διάλυμα παλμιτικής βιταμίνης Α

Σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml (4.2.2) μεταφέρονται με σιφώνιο 2,0 ml του αρχικού διαλύματος παλμιτικής βιταμίνης Α (3.12.1) και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με 2-προπανόλη (3.8). Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του διαλύματος είναι 56 IU βιταμίνης Α ανά ml. 3,0 ml του αραιωμένου αυτού διαλύματος παλμιτικής βιταμίνης Α μεταφέρονται με σιφώνιο σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με 2-προπανόλη (3.8). Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του διαλύματος είναι 6,72 IU βιταμίνης Α ανά ml. Μετριέται το UV φάσμα αυτού του διαλύματος έναντι 2-προπανόλης (3.8) στο φασματοφωτόμετρο (4.6) μεταξύ 300 nm και 400 nm. Το μέγιστο της απόσβεσης πρέπει να είναι μεταξύ 325 nm και 327 nm.

Υπολογισμός της συγκέντρωσης βιταμίνης Α:

>PIC FILE= "L_2000174EL.003602.EPS">

5.6.3.3. Πρότυπο διάλυμα εργασίας βιταμίνης Α

Σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml (4.2.2) μεταφέρονται με σιφώνιο 3,0 ml του παρασκευασμένου σύμφωνα με το σημείο 5.6.1 μη αραιωμένου προτύπου διαλύματος εργασίας βιταμίνης Α (3.12.1) και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με 2-προπανόλη (3.8). 5,0 ml του εν λόγω διαλύματος μεταφέρονται με σιφώνιο σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με 2-προπανόλη (3.8). Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του διαλύματος είναι 6,72 IU βιταμίνης Α ανά ml. Μετριέται το UV φάσμα αυτού του διαλύματος έναντι 2-προπανόλης (3.8) στο φασματοφωτόμετρο (4.6) μεταξύ 300 nm και 400 nm. Το μέγιστο της απόσβεσης πρέπει να είναι μεταξύ 325 nm και 327 nm.

Υπολογισμός της συγκέντρωσης βιταμίνης Α:

>PIC FILE= "L_2000174EL.003603.EPS">

6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Από το μέσο ύψος (εμβαδόν) των κορυφών της βιταμίνης Α του δείγματος προσδιορίζεται η συγκέντρωση του διαλύματος σε IU/ml με αναφορά στην καμπύλη βαθμονόμησης (5.6.2).

Η συγκέντρωση της βιταμίνης Α σε IU/kg του δείγματος δίνεται από τον ακόλουθο τύπο:

>PIC FILE= "L_2000174EL.003701.EPS">

στον οποίο:

β= συγκέντρωση βιταμίνης Α στο δείγμα (5.4) σε IU/ml

V1= όγκος του δείγματος (5.4) σε ml

V2= όγκος της ποσότητας που λαμβάνεται στο σημείο 5.4 σε ml

m= μάζα της προς δοκιμή ποσότητας σε g

7. Παρατηρήσεις

7.1. Σε δείγματα με χαμηλή συγκέντρωση βιταμίνης Α, για τον προσδιορισμό με HPLC ενδέχεται να προσφέρεται περισσότερο η συνένωση των πετρελαϊκών εκχυλισμάτων δύο σαπωνοποιήσεων (ζυγισθείσα ποσότητα: 25 g) σε ένα δείγμα.

7.2. Το βάρος του δείγματος που λαμβάνεται για την ανάλυση δεν θα πρέπει να περιέχει περισσότερο από 2 g λίπος.

7.3. Εάν δεν επέλθει διαχωρισμός φάσεων, προστίθενται 10 ml περίπου αιθανόλης (3.1) για διάσπαση του γαλακτώματος.

7.4. Με μουρουνέλαιο και άλλα καθαρά λίπη, ο χρόνος σαπωνοποιήσεως θα πρέπει να παρατείνεται στα 45-60 λεπτά.

7.5. Αντί ΒΗΤ, μπορεί να χρησιμοποιηθεί υδροκινόνη.

7.6. Χρησιμοποιώντας στήλη κανονικής φάσης είναι πιθανός ο διαχωρισμός των ισομερών ρετινόλης.

7.7. Αντί διαλύματος ασκορβικού νατρίου, μπορούν να χρησιμοποιηθούν περίπου 150 mg ασκορβικού οξέος.

7.8. Αντί διαλύματος θειούχου νατρίου, μπορούν να χρησιμοποιηθούν περίπου 50 mg EDTA.

8. Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλων προσδιορισμών πραγματοποιούμενων στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 15 % σε σχέση με το υψηλότερο αποτέλεσμα.

9. Αποτελέσματα διεργαστηριακής μελέτης(1)

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

Σχήμα 1: Συσκευή εκχυλίσεως (4.8)

>PIC FILE= "L_2000174EL.003801.EPS">

ΜΕΡΟΣ Β

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Ε

1. Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η παρούσα μέθοδος αποσκοπεί στον προσδιορισμό της βιταμίνης Ε σε ζωοτροφές και προμείγματα. Η περιεκτικότητα σε βιταμίνη Ε εκφράζεται σε mg οξικής DL-α-τοκοφερόλης ανά kg. 1 mg οξικής DL-α-τοκοφερόλης αντιστοιχεί σε 0,91 mg DL-α-τοκοφερόλης (βιταμίνη Ε).

Το όριο προσδιορισμού είναι 2 mg βιταμίνης Ε/kg.

2. Αρχή

Το δείγμα υδρολύεται με αιθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου και η βιταμίνη Ε εκχυλίζεται με πετρελαϊκό αιθέρα. Ο διαλύτης απομακρύνεται με εξάτμιση και το υπόλειμμα διαλύεται σε μεθανόλη και, εφόσον είναι αναγκαίο, αραιώνεται μέχρι την απαιτούμενη συγκέντρωση. Η συγκέντρωση της βιταμίνης Ε προσδιορίζεται με υγρή χρωματογραφία ανάστροφης φάσεως υψηλής αποδόσεως (RP-HPLC) χρησιμοποιώντας ανιχνευτή UV ή φθορισμού.

3. Αντιδραστήρια

3.1. Αιθανόλη, σ = 96 %

3.2. Πετρελαϊκός αιθέρας, περιοχή ζέσεως 40 °C - 60 °C

3.3. Μεθανόλη

3.4. Διάλυμα υδροξειδίου του καλίου, β = 50 g/100 ml

3.5. Διάλυμα ασκορβικού νατρίου, β = 10 g/100 ml (βλέπε παρατηρήσεις σημείο 7.7)

3.6. Θειούχο νάτριο, Na2S. x Η2Ο (x = 7 - 9)

3.6.1. Διάλυμα θειούχου νατρίου, c = 0,5 mol/1 σε γλυκερόλη, β = 120 g/1 (για x = 9) (βλέπε παρατηρήσεις, σημεία 7.8)

3.7. Διάλυμα φαινολοφθαλεϊνης, β = 2 g/100 ml σε αιθανόλη (3.1)

3.8. Κινητή φάση για HPLC: μείγμα μεθανόλης (3.3) και ύδατος, π.χ. 980 + 20 (v + v). Η ακριβής σχέση καθορίζεται από τα χαρακτηριστικά της χρησιμοποιούμενης στήλης.

3.9. Άζωτο, απηλλαγμένο οξυγόνου

3.10. Οξική DL-α-τοκοφερεόλη, εξαιρετικά καθαρή, πιστοποιημένης δραστικότητας

3.10.1. Αρχικό διάλυμα οξικής DL-α-τοκοφερύλης: Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται με προσέγγιση 0,1 mg, 100 mg οξικής DL-α-τοκοφερόλης (3.10). Διαλύονται σε αιθανόλη (3.1) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με τον ίδιο διαλύτη. 1 ml αυτού του διαλύματος περιέχει 1 mg οξικής DL-α-τοκοφερόλης έλεγχος UV βλέπε σημείο 5.6.1.3, σταθεροποίηση (βλέπε παρατηρήσεις, σημείο 7.4).

3.11. DL-α-τοκοφερόλη, εξαιρετικής καθαρότητας, πιστοποιημένης δραστικότητας.

3.11.1. Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται με προσέγγιση 0,1 mg, 100 mg DL-α-τοκοφερόλης (3.10). Διαλύονται σε αιθανόλη (3.1) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με τον ίδιο διαλύτη. 1 ml αυτού του διαλύματος περιέχει 1 mg DL-α-τοκοφερόλης έλεγχος UV βλέπε σημείο 5.6.2.3, σταθεροποίηση βλέπε παρατηρήσεις 7.4).

3.12. 2,6 δι-tert-βουτυλο-4-μεθυλοφαινόλη (βλέπε παρατηρήσεις, σημείο 7.5)

4. Συσκευές

4.1. Περιστροφικός εξατμιστήρας κενού

4.2. Αδιαφανή γυάλινα σκεύη

4.2.1. Κωνικές ή σφαιρικές φιάλες με επίπεδο πυθμένα των 500 ml, με εσμυρισμένη υποδοχή

4.2.2. Ογκομετρικές φιάλες με εσμυρισμένα πώματα των 10, 25, 100 και 500 ml

4.2.3. Κωνικές διαχωριστικές χοάνες των 1000 ml, με εσμυρισμένα πώματα

4.2.4. Απιοειδείς φιάλες των 250 ml, με εσμυρισμένες υποδοχές

4.3. Συμπυκνωτής Αllihn, με χιτώνιο μήκους 300 mm, με εσμυρισμένη ένωση, με προσαρμογέα για σωλήνα παροχής αερίου

4.4. Πτυχωτός ηθμός για διαχωρισμό φάσεων, διαμέτρου 185 mm (π.χ.. Schleicher & Schuell 597 ΗΥ 1/2)

4.5. Εξοπλισμός HPLC με σύστημα εγχύσεως

4.5.1. Στήλη υγρής χρωματογραφίας, 250 mm x 4 mm, C18, με πλήρωση 5 ή 10 μm, ή ισοδύναμη

4.5.2. Ανιχνευτής UV ή φθορισμού, με μεταβαλλόμενο μήκος κύματος

4.6. Φασματοφωτόμετρο με κυψελίδες χαλαζία των 10 mm

4.7. Υδρόλουτρο με μαγνητικό αναδευτήρα

4.8. Συσκευή εκχυλίσεως (βλέπε σχήμα 1) αποτελούμενη από:

4.8.1. Γυάλινος κύλινδρος χωρητικότητας 1 l με εσμυρισμένο λαιμό και πώμα

4.8.2. Εσμυρισμένο γυάλινο ένθεμα εφοδιασμένο με πλευρικό βραχίονα και προσαρμόσιμο σωλήνα διερχόμενο από το κέντρο. Το κάτω άκρο του προσαρμόσιμου σωλήνα θα πρέπει να έχει σχήμα U ενώ στο άλλο άκρο θα πρέπει να υπάρχει ακροφύσιο έτσι ώστε η πάνω υγρή στιβάδα στον κύλινδρο να μπορεί να μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη.

5. Διαδικασία

Σημείωση:

Η βιταμίνη Ε είναι ευαίσθητη στο υπερτώδες φως και στην οξείδωση. Όλες οι εργασίες θα πρέπει να γίνονται απουσία φωτός (χρησιμοποιώντας αδιαφανή γυάλινα σκεύη ή σκεύη προστατευόμενα με φύλλο αλουμινίου) και οξυγόνου (πλήρωση με άζωτο). Κατά τη διάρκεια της εκχύλισης ο αέρας θα πρέπει να αντικαθίσταται από άζωτο (αποφεύγεται η υπερβολική πίεση χαλαρώνοντας από καιρού σε καιρό το πώμα).

5.1. Παρασκευή του δείγματος

Το δείγμα αλέθεται έτσι ώστε να διέρχεται από κόσκινο με διάμετρο οπών 1 mm, προσέχοντας να μην παράγεται θερμότητα. Η άλεση πρέπει να γίνεται αμέσως πριν από τη ζύγιση και τη σαπωνοποίηση, αλλιώς μπορεί να υπάρξουν απώλειες βιταμίνης Ε.

5.2. Σαπωνοποίηση

Ανάλογα με την περιεκτικότητα σε βιταμίνη Ε, ζυγίζονται σε κωνική ή σφαιρική φιάλη με επίπεδο πυθμένα των 500 ml (4.2.1), 2 g έως 25 g του δείγματος με προσέγγιση 0,01 g. Προστίθενται διαδοχικά υπό ανακίνηση 130 ml αιθανόλης (3.1), περίπου 100 mg ΒΗΤ (3.12), 2 ml διαλύματος ασκορβικού νατρίου (3.5) και 2 ml διαλύματος θειούχου νατρίου (3.6). Στη φιάλη προσαρμόζεται συμπυκνωτήρας (4.3) και η φιάλη βυθίζεται σε υδρόλουτρο με μαγνητικό αναδευτήρα (4.7). Θερμαίνεται μέχρι βρασμού και το διάλυμα αφήνεται υπό αναρροή για 5 λεπτά. Κατόπιν προστίθενται 25 ml διαλύματος υδροξειδίου του καλίου (3.4) μέσω του συμπυκνωτήρα (4.3) και το διάλυμα αφήνεται υπό αναρροή για 25 λεπτά ακόμη, με ανάδευση υπό ελαφρύ ρεύμα αζώτου. Ο συμπυκνωτήρας στη συνέχεια εκπλένεται με 20 ml νερό περίπου και το περιεχόμενο της φιάλης ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου.

5.3. Εκχύλιση

Το σαπωνοποιημένο διάλυμα μεταγγίζεται ποσοτικά, εκπλένοντάς το με νερό συνολικού όγκου 250 ml, σε διαχωριστική χοάνη των 1000 ml (4.2.3) ή σε συσκευή εκχυλίσεως (4.8). Η φιάλη σαπωνοποιήσεως εκπλένεται διαδοχικά με 25 ml αιθανόλης (3.1) και 100 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2) και τα εκπλύματα μεταφέρονται στη διαχωριστική χοάνη ή στη συσκευή εκχυλίσεως. Η αναλογία νερού-αιθανόλης στα συνενωμένα διαλύματα θα πρέπει να είναι περίπου 2:1. Το σύνολο ανακινείται ισχυρά επί 2 λεπτά και αφήνεται να ηρεμήσει για άλλα 2 λεπτά.

5.3.1. Εκχύλιση με διαχωριστική χοάνη (4.2.3)

Μετά το διαχωρισμό των στιβάδων (βλέπε παρατήρηση, σημείο 7.3), η στιβάδα του πετρελαϊκού αιθέρα μεταφέρεται σε άλλη διαχωριστική χοάνη (4.2.3). Η εκχύλιση αυτή επαναλαμβάνεται δύο φορές, με 100 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2) και δύο φορές με 50 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2).

Τα συνενωμένα εκχυλίσματα πλένονται στη διαχωριστική χοάνη δύο φορές με ήπια περιδίνιση (για την αποφυγή σχηματισμού γαλακτωμάτων) με 100 ml νερό κάθε φορά και κατόπιν με επανειλημμένη ανακίνηση με περαιτέρω ποσότητες νερού των 100 ml μέχρις ότου το νερό να παραμένει άχρωμο σε προσθήκη διαλύματος φαινολοφθαλεΐνης (3.7) (τέσσερις φορές πλύσιμο συνήθως αρκεί). Το πλυμένο εκχύλισμα διηθείται μέσω ξηρού πτυχωτού ηθμού για διαχωρισμό φάσεων (4.4) για την απομάκρυνση τυχόν εναιωρούμενου νερού σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml (4.2.2). Η διαχωριστική χοάνη και ο ηθμός εκπλύνονται με 50 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2), το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με πετρελαϊκό αιθέρα (3.2) και αναμειγνύεται καλά.

5.3.2. Εκχύλιση με συσκευή εκχυλίσεως (4.8)

Μετά το διαχωρισμό των στιβάδων (βλέπε παρατήρηση, σημείο 7.3), το πώμα του γυάλινου κυλίνδρου (4.8.1) αντικαθίσταται με το εσμυρισμένο ένθεμα (4.8.2) και το σχήματος U κάτω άκρο του προσαρμοζόμενου σωλήνα φέρεται σε τέτοια θέση ώστε να είναι ίσα-ίσα πάνω από το επίπεδο της διαχωριστικής επιφάνειας. Με εφαρμογή πιέσεως από γραμμή αζώ στον πλευρικό βραχίονα, η πάνω στιβάδα του πετρελαϊκού αιθέρα μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη των 1000 ml (4.2.3). Στο γυάλινο κύλινδρο προστίθενται 100 ml πετρελαϊκού αιθέρα (3.2), ο κύλινδρος πωματίζεται και ανακινείται καλά. Οι στιβάδες αφήνονται να διαχωριστούν και η πάνω στιβάδα μεταφέρεται όπως πριν στη διαχωριστική χοάνη. Η διαδικασία εκχυλίσεως επαναλαμβάνεται με 100 ml ακόμη πετρελαϊκού αιθέρα (3.2), στη συνέχεια δύο φορές με 50 ml κάθε φορά πετρελαϊκού αιθέρα (3.2) και οι στιβάδες του πετρελαϊκού αιθέρα προστίθενται στη διαχωριστική χοάνη.

Τα συνενωμένα πετρελαϊκά εκχυλίσματα πλένονται όπως περιγράφεται στο σημείο 5.3.1 και ακολουθείται η περιγραφόμενη εκεί διαδικασία.

5.4. Παρασκευή του δείγματος για την HPLC

Σε απιοειδή φιάλη 250 ml (4.2.4) μεταφέρεται με πιπέτα (σιφώνιο) κατάλληλη ποσότητα του διαλύματος πετρελαϊκού αιθέρα (από τα σημεία 5.3.1 ή 5.3.2). Ο διαλύτης εξατμίζεται σχεδόν μέχρι ξηρού σε περιστροφικό εξατμιστήρα (4.1) με ελαττωμένη πίεση και θερμοκρασία λουτρού μη υπερβαίνουσα τους 40 °C. Αποκαθίσταται η ατμοσφαιρική πίεση με εισαγωγή αζώτου (3.9) και η φιάλη απομακρύνεται από τον περιστροφικό εξατμιστήρα. Ο παραμένων διαλύτης απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου (3.9) και το υπόλειμμα διαλύεται αμέσως σε γνωστό όγκο ( 10 - 100 ml) μεθανόλης (3.3) (η συγκέντρωση της DL-α-τοκοφερόλης θα πρέπει να είναι της τάξεως των 5 IU/ml έως 30 IU/ml).

5.5. Προσδιορισμός με HPLC

Η βιταμίνη Ε διαχωρίζεται σε στήλη ανάστροφης φάσεως C18 (4.5.1) και μετράται η συγκέντρωση με τη βοήθεια ανιχνευτή φθορισμού (διέγερση: 295 nm, εκπομπή: 330 nm) ή UV (292 nm) (4.5.2).

Εγχύεται κατάλληλη ποσότητα (π.χ. 20 μl) του μεθανολικού διαλύματος που λαμβάνεται στο σημείο 5.4 και εκλούζεται με την κινητή φάση (3.8). Υπολογίζεται το μέσο ύψος κορυφής (εμβαδόν) ορισμένων εγχύσεων του ίδιου δείγματος και τα μέσα ύψη κορυφών (εμβαδά) ορισμένων εγχύσεων των διαλυμάτων βαθμονόμησης (5.6.2).

Συνθήκες HPLC

Για την HPLC πρέπει να χρησιμοποιούνται οι κατωτέρω συνθήκες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν όμως και άλλες συνθήκες υπό την προϋπόθεση ότι παρέχουν ισοδύναμα αποτέλεσματα.

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

5.6. Βαθμονόμηση (οξική DL-α-τοκοφερόλη ή DL-α-τοκοφερόλη)

5.6.1. Πρότυπο οξικής DL-α-τοκοφερόλης

5.6.1.1. Παρασκευή των προτύπων διαλυμάτων εργασίας

Σε κωνική ή σφαιρική φιάλη με επίπεδο πυθμένα των 500 ml (4.2.1) μεταφέρονται με σιφώνιο 25 ml του αρχικού διαλύματος οξικής DL-ατοκοφερόλης (3.10.1) και υδρολύεται όπως περιγράφεται στο σημείο 5.2. Ακολουθεί εκχύλιση με πετρελαϊκό αιθέρα (3.2) σύμφωνα με το σημείο 5.3 και συμπληρώνουμε μέχρι τη χαραγή των 500 ml με πετρελαϊκό αιθέρα. 25 ml του εκχυλίσματος αυτού εξατμίζονται στον περιστροφικό εξατμιστήρα (βλέπε σημείο 5.4) σχεδόν μέχρι ξηρού, ο εναπομένων διαλύτης απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου (3.9) και το υπόλειμμα αναδιαλύεται σε 25,0 ml μεθανόλης (3.3). Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του διαλύματος είναι 45,5 μg οξικής DL-α-τοκοφερόλης ανά ml. Το πρότυπο διάλυμα εργασίας πρέπει να παρασκευάζεται πρόσφατα πριν από τη χρήση.

5.6.1.2. Παρασκευή των διαλυμάτων και καμπύλη βαθμονόμησης

1,0, 2,0, 4,0 και 10,0 ml του προτύπου διαλύματος εργασίας μεταφέρονται σε μια σειρά ογκομετρικών φιαλών των 20 ml, συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με μεθανόλη (3.3) και αναμειγνύονται. Οι ονομαστικές περιεκτικότητες των διαλυμάτων αυτών είναι 2,5, 5,0, 10,0 και 25,0 μg/ml σε οξική DL-α-τοκοφερόλη, δηλαδή 2,28, 4,55, 9,10 και 22,8 μg/ml DLα-τοκοφερόλη

20 μl κάθε διαλύματος βαθμονόμησης εγχύονται μερικές φορές και προσδιορίζονται τα μέσα ύψη (εμβαδά) των κορυφών. Χρησιμοποιώντας τα μέσα ύψη (εμβαδά) των κορυφών, χαράσσεται καμπύλη βαθμονόμησης.

5.6.1.3. Τυποποίηση σε UV του αρχικού διαλύματος οξικής DL-α-τοκοφερόλης;(3.10.1)

5,0 ml του αρχικού διαλύματος οξικής DL-α-τοκοφερόλης (3.10.1 ) αραιώνονται στα 25,0 ml με αιθανόλη και μετράται το υπεριώδες φάσμα του διαλύματος αυτού σε σχέση με την αιθανόλη (3.1) στο φασματοφωτόμετρο (4.6) μεταξύ 250 nm και 320 nm.

Το μέγιστο της απορρόφησης θα πρέπει να είναι στα 284 nm:

>PIC FILE= "L_2000174EL.004201.EPS">

Στην αραίωση αυτή θα πρέπει να ληφθεί τιμή απόσβεσης 0,84 έως 0,88.

5.6.2. Πρότυπο DL-α-τοκοφερόλης

5.6.2.1. Παρασκευή του προτύπου διαλύματος εργασίας

Σε ογκομετρική φιάλη 50 ml μεταφέρονται με σιφώνιο 2 ml του αρχικού διαλύματος DL-α-τοκοφερόλης (3.11.1), διαλύονται σε μεθανόλη (3.3) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με μεθανόλη. Η ονομαστική συγκέντρωση αυτού του διαλύματος είναι 40 μg DL-α-τοκοφερόλης ανά ml, ισοδύναμη με 44,0 μg οξικής DL-α-τοκοφερόλης ανά ml. Το πρότυπο διάλυμα εργασίας πρέπει να παρασκευάζεται λίγο πριν από τη χρήση του.

5.6.2.2. Παρασκευή των διαλυμάτων βαθμονόμησης και καμπύλη βαθμονόμησης

1,0, 2,0, 4,0 και 10,0 ml του προτύπου διαλύματος εργασίας μεταφέρονται σε μια σειρά ογκομετρικών φιαλών των 20 ml, συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με μεθανόλη (3.3) και αναμειγνύονται. Οι ονομαστικές περιεκτικότητες των διαλυμάτων αυτών είναι 2,0, 4,0, 8,0 και 20,0 μg/ml σε DL-α-τοκοφερόλη, δηλαδή 2,20, 4,40, 8,79 και 22,0 μg/ml σε οξική DL-α-τοκοφερόλη

20 μl κάθε διαλύματος βαθμονόμησης εγχύονται μερικές φορές και προσδιορίζονται τα μέσα ύψη (εμβαδά) των κορυφών. Χρησιμοποιώντας τα μέσα ύψη (εμβαδά) των κορυφών, χαράσσεται καμπύλη βαθμονόμησης.

5.6.2.3. Τυποποίηση σε UV του αρχικού διαλύματος DL-α-τοκοφερόλης (3.11.1)

2,0 ml του αρχικού διαλύματος DL-α-τοκοφερόλης (3.11.1) αραιώνονται στα 25,0 ml με αιθανόλη και μετράται το υπεριώδες φάσμα του διαλύματος αυτού σε σχέση με αιθανόλη (3.1) στο φασματοφωτόμετρο (4.6) μεταξύ 250 nm και 320 nm. Το μέγιστο της απορρόφησης θα πρέπει να είναι στα 292 nm:

>PIC FILE= "L_2000174EL.004202.EPS">

Στην αραίωση αυτή θα πρέπει να λαμβάνεται τιμή απόσβεσης 0,6.

6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Από το μέσο ύψος (εμβαδόν) των κορυφών της βιταμίνης Ε του δείγματος προσδιορίζεται η συγκέντρωση του δείγματος σε μg/ml (ως οξική DL-α-τοκοφερόλη) με αναφορά στην καμπύλη βαθμονόμησης (5.6.1.2 ή 5.6.2.2).

Η συγκέντρωση w της βιταμίνης Ε σε mg/kg του δείγματος δίνεται από τον ακόλουθο τύπο:

>PIC FILE= "L_2000174EL.004203.EPS">

στον οποίο:

β= συγκέντρωση βιταμίνης Ε στο δείγμα (5.4) σε μg/ml

V1= όγκος του δείγματος (5.4) σε ml

V2= όγκος της ποσότητας που λαμβάνεται στο σημείο 5.4 σε ml

m= μάζα της προς δοκιμή ποσότητας σε g

7. Παρατηρήσεις

7.1. Σε δείγματα με χαμηλή συγκέντρωση βιταμίνης Ε, για τον προσδιορισμό με HPLC ενδέχεται να προσφέρεται περισσότερο η συνένωση των πετρελαϊκών εκχυλισμάτων δύο σαπωνοποιήσεων (ζυγισθείσα ποσότητα: 25 g) σε ένα δείγμα.

7.2. Το βάρος του δείγματος που λαμβάνεται για την ανάλυση δεν θα πρέπει να περιέχει περισσότερο από 2 g λίπος.

7.3. Εάν δεν επέλθει διαχωρισμός φάσεων, προστίθενται 10 ml περίπου αιθανόλης (3.1) για διάσπαση του γαλακτώματος.

7.4. Μετά την φασματοφωτομετρική μέτρηση του διαλύματος της οξικής DL-α-τοκοφερόλης ή DL-α-τοκοφερόλης σύμφωνα με τα σημεία 5.6.1.3 ή 5.6.2.3 αντιστοίχως, προστίθενται περίπου 10 mg ΒΗΤ (3.12) στο διάλυμα (3.10.1 ή 3.10.2) και το διάλυμα διατηρείται σε ψυγείο (μέγιστος χρόνος αποθήκευσης τέσσερις εβδομάδες).

7.5. Αντί ΒΗΤ, μπορεί να χρησιμοποιηθεί υδροκινόνη.

7.6. Χρησιμοποιώντας στήλη κανονικής φάσης είναι πιθανός ο διαχωρισμός μεταξύ α-, β-, χ- και δ-τοκοφερόλης.

7.7. Αντί διαλύματος ασκορβικού νατρίου, μπορούν να χρησιμοποιηθούν περίπου 150 mg ασκορβικού οξέος.

7.8. Αντί διαλύματος θειούχου νατρίου, μπορούν να χρησιμοποιηθούν περίπου 50 mg EDTA.

8. Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλων προσδιορισμών πραγματοποιούμενων στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 15 % σε σχέση με το υψηλότερο αποτέλεσμα.

9. Αποτελέσματα διεργαστηριακής μελέτης(2)

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

Σχήμα 1: Συσκευή εκχυλίσεως (4.8)

>PIC FILE= "L_2000174EL.004401.EPS">

ΜΕΡΟΣ Γ

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΘΡΥΠΤΟΦΑΝΗΣ

1. Σκοπός και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος αποσκοπεί στον προσδιορισμό της συνολικής και της ελεύθερης θρυπτοφάνης σε ζωοτροφές. Δεν γίνεται διάκριση μεταξύ D- και L- μορφών.

2. Αρχή

Για τον προσδιορισμό της συνολικής θρυπτοφάνης, το δείγμα υδρολύεται υπό αλκαλικές συνθήκες με κορεσμένο διάλυμα υδροξειδίου του βαρίου και θερμαίνεται στους 110 °C για 20 ώρες. Μετά την υδρόλυση, προστίθεται εσωτερικό πρότυπο.

Για τον προσδιορισμό της ελεύθερης θρυπτοφάνης, το δείγμα εκχυλίζεται υπό ήπιες όξινες συνθήκες παρουσία εσωτερικού προτύπου.

Η θρυπτοφάνη και το εσωτερικό πρότυπο στο υδρόλυμα ή στο εκχύλισμα προσδιορίζονται μέσω HPLC με ανίχνευση φθορισμού.

3. Αντιδραστήρια

3.1. Πρέπει να χρησιμοποιείται δισαπεσταγμένο νερό ή νερό ισοδύναμης καθαρότητας (αγωγιμότητα < 10 μS/cm)

3.2. Πρότυπη ουσία: θρυπτοφάνη (καθαρότητα/περιεκτικότητα >= 99 %) ξηρανθείσα υπό κενό υπεράνω πεντοξειδίου του φωσφόρου

3.3. Ουσία εσωτερικού προτύπου: α-μεθυλο-θρυπτοφάνη (καθαρότητα/περιεκτικότητα >= 99 %), ξηρανθείσα υπό κενό υπεράνω πεντοξειδίου του φωσφόρου

3.4. Οκταένυδρο υδροξείδιο του βαρίου (θα πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια ώστε το Ba(OH)28 H2O να μην εκτίθεται υπερβολικά στον αέρα για την αποφυγή σχηματισμού BaCO3, πράγμα το οποίο μπορεί να προκαλέσει προβλήματα στον προσδιορισμό) (βλέπε παρατηρήσεις σημείο 9.3)

3.5. Υδροξείδιο του νατρίου

3.6. Ορθοφωσφορικό οξύ, w = 85 %.

3.7. Υδροχλωρικό οξύ, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8. Μεθανόλη, καθαρότητας HPLC

3.9. Πετρελαϊκός αιθέρας, περιοχή ζέσεως 40-60 °C.

3.10. Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου, c = 1 mol/l:

40,0 g NaOH (3.5) διαλύονται σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό (3.1).

3.11. Υδροχλωρικό οξύ, c = 6 mol/l:

Λαμβάνονται 492 ml HCl (3.7) και συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.12. Υδροχλωρικό οξύ, c = 1 mol/l:

Λαμβάνονται 8,2 ml HCl (3.7) και συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.13. Υδροχλωρικό οξύ, c= 0,1 mol/l:

Λαμβάνονται 8,2 ml HCl (3.7) και συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό.

3.14. Ορθοφωσφορικό οξύ, c = 0.5 mol/l:

Λαμβάνονται 34 ml ορθοφωσφορικού οξέος (3.6) και συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με νερό (3.1)

3.15. Πυκνό διάλυμα θρυπτοφάνης (3.2), c = 2,50 μmοl/ml:

Σε ογκομετρική φιάλη 500 ml διαλύονται 0,2553 g θρυπτοφάνης (3.2) σε υδροχλωρικό οξύ (3.13) και συμπληρώνονται μέχρι τη χαραγή με υδροχλωρικό οξύ (3.13). Το διάλυμα αποθηκεύεται στους - 18 °C για τέσσερις εβδομάδες το πολύ

3.16. Πυκνό διάλυμα εσωτερικού προτύπου, c = 2,50 μmοl/ml:

Σε ογκομετρική φιάλη 500 ml διαλύονται 0,2728 g α-μεθυλο-θρυπτοφάνης (3.3) σε υδροχλωρικό οξύ (3.13) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με υδροχλωρικό οξύ (3.13). Αποθηκεύεται στους - 18 °C για τέσσερις εβδομάδες το πολύ.

3.17. Πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης θρυπτοφάνης και εσωτερικού προτύπου:

Λαμβάνονται 2,00 ml πυκνού διαλύματος θρυπτοφάνης (3.15), και 2,00 ml πυκνού διαλύματος εσωτερικού προτύπου (α-μεθυλο-θρυπτοφάνη) (3.16). Αραιώνονται με νερό (3.1) και μεθανόλη (3.8) μέχρι περίπου τον ίδιο όγκο και την ίδια περίπου συγκέντρωση μεθανόλης (10-30 %) όπως και το τελικό υδρόλυμα.

Το διάλυμα αυτό πρέπει να παρασκευάζεται λίγο πριν από τη χρήση του.

Κατά τη διάρκεια της παρασκευής, προστατεύεται από το άμεσο ηλιακό φως.

3.18. Οξικό οξύ

3.19. 1,1,1-τριχλωρο-2-μεθυλο-2-προπανόλη

3.20. Αιθανολαμίνη > 98 %

3.21. Διάλυμα 1 g 1,1,1-τριχλωρο-2-μεθυλο-2-προπανόλης (3.19) σε 100 ml μεθανόλης (3.8)

3.22. Κινητή φάση για HPLC: 3,00 g οξικό οξύ (3.18) + 900 ml νερό (3.1) + 50,0 ml διάλυμα (3.21) 1,1,1-τριχλωρο-2-μεθυλο-2-προπανόλης (3.19) σε μεθανόλη (3.8) (1g/100ml). Το pH ρυθμίζεται στο 5,00 με αιθανολαμίνη (3.20). Συμπληρώνεται μέχρι τα 1000 ml με νερό (3.1)

4. Εξοπλισμός

4.1. Εξοπλισμός HPLC με φασματοφθορισμομετρικό ανιχνευτή

4.2. Υγρή χρωματογραφική στήλη, 125 mm x 4 mm, C18 3 μm πλήρωση, ή ισοδύναμη

4.3. pH-μετρο

4.4. Φιάλη πολυπροπυλενίου, χωρητικότητας 125 ml, ευρύλαιμη και με βιδωτό πώμα.

4.5. Φίλτρο μεμβράνης, 0,45 μm

4.6. Αυτόκλειστο, 110 (+- 2) °C, 1,4 (+- 0,1) bar

4.7. Μηχανικό τάρακτρο (σέικερ) ή μαγνητικός αναδευτήρας

4.8. Αναμείκτης vortex

5. Διαδικασία

5.1. Παρασκευή δειγμάτων

Το δείγμα αλέθεται ώστε να διέρχεται από κόσκινο με διάμετρο οπών 0,5 mm. Δείγματα με υψηλή υγρασία πρέπει είτε να ξηραίνονται με αέρα σε θερμοκρασία μη υπερβαίνουσα τους 50 °C ή να ξηραίνονται με ψύξη πριν από την άλεση. Δείγματα με υψηλή περιεκτικότητα σε λίπος θα πρέπει να εκχυλίζονται με πετρελαϊκό αιθέρα (3.9) πριν από την άλεση.

5.2. Προσδιορισμός ελεύθερης θρυπτοφάνης (εκχύλισμα)

Σε κωνική φιάλη, ζυγίζεται με προσέγγιση 1 mg κατάλληλη ποσότητα 1-5 g) του παρασκευασθέντος δείγματος (5.1). Προστίθενται 100,0 ml υδροχλωρικό οξύ, c = 0,1 mol/l (3.13) και 5,00 ml πυκνό διάλυμα εσωτερικού προτύπου (3.16). Το σύνολο ανακινείται ή αναμειγνύεται επί 60 min χρησιμοποιώντας μηχανικό τάρακτρο ή μαγνητικό αναδευτήρα (4.7). Το ίζημα αφήνεται να κατακαθίσει και 10,0 ml του υπερκείμενου διαλύματος μεταφέρονται με σιφώνιο σε ποτήριο ζέσεως. Προστίθενται 5 ml ορθο-φωσφορικού οξέος, c = 0,5 mol/l (3.14). Το pH ρυθμίζεται στο 3 χρησιμοποιώντας υδροξείδιο του νατρίου, c = 1,0 mol/l (3.10). Προστίθεται ικανή ποσότητα μεθανόλης (3.8) ώστε να ληφθεί συγκέντρωση μεταξύ 10 και 30 % μεθανόλης στον τελικό όγκο. Το διάλυμα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη καταλλήλου όγκου και αραιώνεται με νερό στον όγκο που απαιτείται για τη χρωματογραφία [περίπου ο ίδιος όγκος με το πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης (3.17)]

Μερικά ml του διαλύματος διηθούνται μέσω φίλτρου μεμβράνης 0,45 μm (4.5) πριν εγχυθούν στη στήλη HPLC. Ακολουθεί χρωματογράφηση σύμφωνα με το σημείο 5.4.

Το πρότυπο διάλυμα και τα εκχυλίσματα προστατεύονται από το άμεσο ηλιακό φως. Εάν δεν είναι δυνατή η ανάλυση των εκχυλισμάτων την ίδια ημέρα, τα εκχυλίσματα μπορούν να φυλαχθούν στους 5 °C για τρεις ημέρες το πολύ.

5.3. Προσδιορισμός της συνολικής θρυπτοφάνης (υδρόλυμα)

Στην πολυπροπυλενική φιάλη (4.4) ζυγίζονται με προσέγγιση 0,2 mg από 0,1 έως 1 g του παρασκευασθέντος δείγματος (5.1). Η ζυγισθείσα ποσότητα δείγματος θα πρέπει να έχει περιεκτικότητα σε άζωτο περίπου 10 mg. Προστίθενται 8,4 g οκταένυδρο υδροξείδιο του βαρίου (3.4) και 10 ml νερό. Το σύνολο αναμειγνύεται σε αναμείκτη vortex (4.8) ή μαγνητικό αναδευτήρα (4.7). Ο επικαλυμμένος με τεφλόν μαγνήτης αφήνεται στο μείγμα. Τα τοιχώματα του δοχείου εκπλύνονται προς, τα κάτω με 4 ml νερό. Τοποθετείται το βιδωτό πώμα και η φιάλη κλείνεται χαλαρά. Μεταφέρεται σε αυτόκλειστο (4.6) με ζέον ύδωρ και ατμό για 30-60 λεπτά. Το αυτόκλειστο κλείνεται και και ακολουθεί θέρμανση στους 110 (+- 2) °C για 20 ώρες.

Πριν ανοιχθεί το αυτόκλειστο, η θερμοκρασία μειώνεται λίγο κάτω από τους 100 °C. Για την αποφυγή κρυστάλλωσης του Ba(OH)2.8 H20, προστίθενται στο θερμό μείγμα 30 ml νερό με θερμοκρασία δωματίου. Το σύνολο ανακινείται ή αναδεύεται ήπια. Προστίθενται 2,00 ml πυκνό διάλυμα εσωτερικού προτύπου (α-μεθυλο-θρυπτοφάνης) (3.16). Τα δοχεία ψύχονται σε λουτρό ύδατος/πάγου για 15 λεπτά.

Στη συνέχεια προστίθενται 5 ml ορθοφωσφορικού οξέος, c = 0,5 mol/l (3.14). Το δοχείο διατηρείται στο λουτρό ψύξεως και εξουδετερώνεται με HCI, c = 6 mol/l (3.11) με ταυτόχρονη ανάδευση και το pH ρυθμίζεται στο 3,0 με HCI, c = 1 mol/l (3.12). Προστίθεται ικανή ποσότητα μεθανόλης ώστε να ληφθεί συγκέντρωση μεταξύ 10 και 30 % μεθανόλης στον τελικό όγκο. Κατάλληλη ποσότητα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη και αραιώνεται με νερό στον καθορισμένο όγκο που απαιτείται για την χρωματογραφία (π.χ. 100 ml). Η προσθήκη μεθανόλης δεν θα πρέπει να προκαλεί καθίζηση.

Μερικά ml του διαλύματος διηθούνται μέσω φίλτρου μεμβράνης 0,45 μm (4.5) πριν εγχυθούν στη στήλη HPLC. Ακολουθεί χρωματογράφηση σύμφωνα με το σημείο 5.4.

Το πρότυπο διάλυμα και τα υδρολύματα προστατεύονται από το άμεσο ηλιακό φως. Εάν δεν είναι δυνατή η ανάλυση των υδρολυμάτων την ίδια ημέρα, τότε αυτά μπορούν να φυλαχθούν στους 5 °C για τρεις ημέρες το πολύ.

5.4. Προσδιορισμός με HPLC

Για ισοκρατική έκλουση κατάλληλες είναι οι ακόλουθες συνθήκες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες συνθήκες, υπό την προϋπόθεση ότι παρέχουν ισοδύναμα αποτέλεσματα (βλέπε επίσης παρατηρήσεις σημεία 9.1 και 9.2):

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

6. Υπολογισμός αποτελεσμάτων

>PIC FILE= "L_2000174EL.004701.EPS">

A= εμβαδόν κορυφής εσωτερικού προτύπου, πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης (3.17)

B= εμβαδόν κορυφής θρυπτοφάνης, εκχύλισμα (5.2) ή υδρόλυμα (5.3)

C= όγκος σε ml (2 ml) πυκνού διαλύματος θρυπτοφάνης (3.15) που προστίθεται στο διάλυμα βαθμονόμησης (3.17)

D= συγκέντρωση σε μmol/ml ( =2,50) πυκνού διαλύματος θρυπτοφάνης (3.15) που προστίθεται στο διάλυμα βαθμονόμησης (3.17)

E= όγκος σε ml του πυκνού διαλύματος εσωτερικού προτύπου (3.16) που προστίθεται στην εκχύλιση (5.2) (= 5,00 ml) ή στο υδρόλυμα (5.3) (= 2,00 ml)

F= εμβαδόν κορυφής εσωτερικού προτύπου, εκχύλισμα (5.2) ή υδρόλυμα (5.3)

G= εμβαδόν θρυπτοφάνης, πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης (3.17)

H= όγκος σε ml (= 2,00 ml) πυκνού διαλύματος εσωτερικού προτύπου (3.16) που προστίθεται στο πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης (3.17)

W= βάρος δείγματος σε g (διορθωμένο στο αρχικό βάρος εφόσον έχει ξηρανθεί ή/και απολιπανθεί)

MW= μοριακό βάρος θρυπτοφάνης (= 204,23)

7. Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παράλληλων προσδιορισμών που γίνονται στο ίδιο δείγμα πρέπει να μην υπερβαίνει το 10 % σε σχέση με την υψηλότερη τιμή.

8. Αποτελέσματα διεργαστηριακής μελέτης

Πραγματοποιήθηκε διεργαστηριακή κοινοτική μελέτη (τέταρτη διασύγκριση) στην οποία τρία δείγματα αναλύθηκαν από μέχρι δώδεκα εργαστήρια για την πιστοποίηση της μεθόδου υδρολύσεως. Σε κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν πέντε επαναληπτικές αναλύσεις. Τα αποτελέσματα δίνονται στον ακόλουθο πίνακα:

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

Πραγματοποιήθηκε μια άλλη κοινοτική μελέτη (τρίτη διασύγκριση) στην οποία δύο δείγματα αναλύθηκαν από μέχρι δεκατρία εργαστήρια για την πιστοποίηση της μεθόδου υδρολύσεως. Σε κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν πέντε επαναληπτικές αναλύσεις. Τα αποτελέσματα δίνονται στον ακόλουθο πίνακα:

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

Πραγματοποιήθηκε μια άλλη κοινοτική μελέτη διασύγκρισης στην οποία αναλύθηκαν τέσσερα δείγματα από μέχρι επτά εργαστήρια με σκοπό την πιστοποίηση θρυπτοφάνης για υδρόλυση. Τα αποτελέσματα δίνονται κατωτέρω. Σε κάθε δείγμα έγιναν πέντε επαναληπτικές αναλύσεις.

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

9. Παρατηρήσεις

9.1. Με ειδικές χρωματογραφικές συνθήκες μπορεί να επιτευχθεί καλύτερος διαχωρισμός μεταξύ θρυπτοφάνης και α-μεθυλο-θρυπτοφάνης.

>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>

9.2. Η χρωματογραφία διαφοροποιείται ανάλογα με τον τύπο HPLC και το χρησιμοποιούμενο υλικό πλήρωσης στήλης. Το επιλεγόμενο σύστημα πρέπει να μπορεί να επιτυγχάνει διαχωρισμό βασικής γραμμής μεταξύ θρυπτοφάνης και εσωτερικού προτύπου. Περαιτέρω, παίζει σημαντικό ρόλο τα προϊόντα αποικοδόμησης να διαχωρίζονται σωστά από τη θρυπτοφάνη και το εσωτερικό πρότυπο. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται υδρολύματα χωρίς εσωτερικό πρότυπο για να ελέγχεται η βασική γραμμή υπό το εσωτερικό πρότυπο για προσμείξεις. Παίζει σημαντικό ρόλο ο χρόνος λειτουργίας να είναι αρκετά μεγάλος για την έκλουση όλων των προϊόντων αποικοδόμησης, διαφορετικά στις επόμενες χρωματογραφικές δοκιμές μπορεί να παρεισφρύσουν όψιμες κορυφές έκλουσης.

Στην περιοχή εργασίας, το χρωματογραφικό σύστημα θα πρέπει να παρέχει γραμμική απόκριση. Η γραμμική απόκριση θα πρέπει να μετριέται με σταθερή (την κανονική) συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου και ποικίλλες συγκεντρώσεις θρυπτοφάνης. Έχει σημασία το μέγεθος των κορυφών και της θρυπτοφάνης και του εσωτερικού προτύπου να είναι στα πλαίσια της γραμμικής περιοχής του συστήματος HPLC/φθορισμού. Εάν η (οι) κορυφή(-ές) ή της θρυπτοφάνης ή/και του εσωτερικού προτύπου είναι πολύ μικρή ή πολύ υψηλή, η ανάλυση θα πρέ πει να επαναλαμβάνεται με άλλο μέγεθος δείγματος ή/και τελικό όγκο.

9.3. Υδροξείδιο του βαρίου

Με το χρόνο, το υδροξείδιο του βαρίου είναι πολύ δύσκολο να διαλυθεί. Το γεγονός αυτό απολήγει σε μη διαυγές διάλυμα για τον προσδιορισμό HPLC, πράγμα το οποίο μπορεί να δώσει χαμηλές τιμές για τη θρυπτοφάνη.

(1) Πραγματοποιήθηκε από την ομάδα εργασίας για τις ζωοτροφές του Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2) Πραγματοποιήθηκε από την ομάδα εργασίας για τις ζωοτροφές του Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).