1.1.1.1.

ELISA-plader påføres rekombinant AHSV-4 VP7 fortyndet med carbonat/bicarbonatbuffer, pH-værdi 9,6. Pladerne inkuberes natten over ved 4 °C.

1.1.1.2.

Pladerne skylles fem gange med destilleret vand indeholdende 0,01 % (v/v) Tween 20 (skylleopløsning). Pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale, så eventuel resterende skylleopløsning fjernes.

1.1.1.3.

Pladerne blokeres med phosphatbufferet saltopløsning (PBS), pH-værdi 7,2, + 5 % (w/v) skummetmælk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/brønd, i 1 time ved 37 °C.

1.1.1.4.

Den blokerende opløsning fjernes, og pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale.

1.1.2.1.

De serumprøver, der skal testes, og positive og negative kontrolsera fortyndes 1:25 med PBS + 5 % (w/v) skummetmælk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl pr. brønd. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C.

Ved titrering tilberedes en tofolds fortyndingsrække fra 1:25 (100 μl/brønd), ét serum pr. pladekolonne, og det samme gøres med de positive og negative kontroller. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C.

1.1.2.2.

Pladerne skylles fem gange med destilleret vand indeholdende 0,01 % (v/v) Tween 20 (skylleopløsning). Pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale, så eventuel resterende skylleopløsning fjernes.

1.1.3.1.

Der overføres 100 μl/brønd horseradishperoxidasekonjugeret (HRP) antihestegammaglobulin fortyndet med PBS + 5 % mælk + 0,05 % Tween 20, pH-værdi 7,2. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C.

1.1.3.2.

Pladerne skylles fem gange med destilleret vand indeholdende 0,01 % (v/v) Tween 20 (skylleopløsning). Pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale, så eventuel resterende skylleopløsning fjernes.

1.1.4.1.

Der tilsættes 200 μl/brønd kromogen-/substratopløsning (10 ml 80,6 mM DMAB (dimethylaminobenzaldehyd) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinhydrazonhydrochlorid) + 5 μl H2O2).

Farveudviklingen standses ved tilsætning af 50 μl 3N H2SO4 efter ca. 5-10 minutter (inden den negative kontrol begynder at antage farve).

Andre kromogener såsom ABTS (2,2′-azino-bis-[3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre]), TMB (tetramethylbenzidin) eller OPD (orthophenyldiamin) kan også benyttes.

1.1.4.2.

Pladerne aflæses ved 600 nm (eller 620 nm).

1.2.1.

Cut-off-værdien beregnes, ved at der lægges 0,06 til værdien af den negative kontrol (0,06 er den afledte standardafvigelse for en gruppe på 30 negative sera).

1.2.2.

Testprøver, der giver absorbansværdier, som ligger under cut-off, betragtes som negative.

1.2.3.

Testprøver, der giver absorbansværdier, som ligger over cut-off + 0,15, betragtes som positive.

1.2.4.

Testprøver, der giver mellemliggende absorbansværdier, betragtes som inkonklusive, og resultatet skal bekræftes ved en anden metode.

2.1.1.1.

Pladerne påføres 50-100 ng rekombinant AHSV-4 VP7 fortyndet med carbonat/bicarbonatbuffer, pH-værdi 9,6. Der inkuberes natten over ved 4 °C.

2.1.1.2.

Pladerne skylles 3 gange med phosphatbufferet saltopløsning (PBS) 0,1x indeholdende 0,135 M NaCl og 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale, så eventuel resterende skylleopløsning fjernes.

2.1.2.1.

De serumprøver, der skal testes, og positive og negative kontrolsera fortyndes 1:5 med fortyndingsmiddel indeholdende 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 + 0,1 % Kathon, 100 μl pr. brønd. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C.

Ved titrering tilberedes en tofolds fortyndingsrække af testseraene fra 1:10 til 1:280 over 8 brønde (100 μl/brønd), ét serum pr. pladekolonne, og det samme gøres med de positive og negative kontroller. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C.

2.1.2.2.

Pladerne skylles 5 gange med phosphatbufferet saltopløsning (PBS) 0,1× indeholdende 0,135 M NaCl og 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale, så eventuel resterende skylleopløsning fjernes.

2.1.3.1.

Der overføres 100 μl/brønd horseradishperoxidasekonjugeret anti-VP7-Mab. Dette Mab er forinden fortyndet 1:5 000-1:15 000 i en 1:1 opløsning af StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Reference: SZ03) i destilleret vand. Der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.

2.1.3.2.

Pladerne skylles 5 gange med phosphatbufferet saltopløsning (PBS) 0,1× indeholdende 0,135 M NaCl og 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale, så eventuel resterende skylleopløsning fjernes.

2.2.1.

Blokeringsprocenten (BP) bestemmes for hver prøve ved anvendelse af følgende formel, hvor »Abs« står for antistoffer:

2.2.2.

Prøver, der giver en BP-værdi på over 50 %, betragtes som positive for AHSV-antistoffer.

2.2.3.

Prøver, der giver en BP-værdi på under 45 %, betragtes som negative for AHSV-antistoffer.

2.2.4.

Prøver, der giver en BP-værdi på mellem 45 % og 50 %, betragtes som inkonklusive og underkastes fornyet testning. Er resultatet igen inkonklusivt, underkastes dyrene fornyet testning på prøver udtaget tidligst to uger efter udtagelsen af den prøve, der blev betragtet som inkonklusiv.

—

phenol-chloroform-ekstraktion af nukleinsyrer

—

adsorption af nukleinsyrer til filter

—

adsorption af nukleinsyrer til magnetiske kugler.

1.1.

1 g vævsprøve homogeniseres i 1 ml denatureringsopløsning (4 M guanidiniumthiocyanat, 25 mM natriumcitrat, 0,1 M 2-mercaptoethanol og 0,5 % sarcosyl).

1.2.

Efter centrifugering tilsættes 1 μg gær-RNA, 0,1 ml 2 M natriumacetat, pH-værdi 4, 1 ml phenol og 0,2 ml chloroform/isoamylalkohol-blanding (49:1), til supernatanten.

1.3.

Opløsningen omrystes kraftigt og afkøles på is i 15 minutter.

1.4.

Efter centrifugering phenolekstraheres RNA'et, som er til stede i den vandige fase, hvorefter det udfældes med ethanol og resuspenderes i sterilt vand.

—

forward primer

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

revers primer

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

MGB-TaqMan-probe

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

Primer-stamopløsningen fortyndes til en arbejdskoncentration på 8 μM (»primer-arbejdsopløsning 8 μM«), mens proben fortyndes til en arbejdskoncentration på 50 μM (»probe-arbejdsopløsning 50 μM«). Der frembringes et testpladelayout, som indlæses i realtids-PCR-maskinens software. Med dette layout som rettesnor tilsættes 2,5 μl af hver primer-arbejdsopløsning 8 μM til hver brønd, der er bestemt til at indeholde RNA-prøver/positive og/eller negative kontroller (slutkoncentrationen af primeren vil være på 1 μM i de 20 μl RT-PCR-mix). Pladen holdes på is.

2.1.2.

2 μl af det isolerede RNA (testprøver og den positive kontrol), eller 2 μl RNAse-frit vand i negative reaktionskontroller, blandes med forward- og revers-primere. Denne blanding denatureres ved opvarmning ved 95 °C i 5 minutter, efterfulgt af hurtig afkøling på is i mindst 5 minutter.

2.1.3.

Der tilberedes en passende mængde realtids-one-step-RT-PCR-mastermix til det antal prøver, der skal testes, efter fabrikantens anvisninger. Der tilsættes 0,1 μl probe-arbejdsopløsning 50 μM til hver brønd indeholdende RNA-prøver (slutkoncentrationen af proben vil være på 0,25 μM i hver brønd indeholdende RNA-prøver). 13 μl realtids-one-step-RT-PCR-mastermix fordeles i hver brønd på PCR-pladen indeholdende de(t) denaturerede primere/RNA.

2.1.4.

Pladen anbringes i en realtidstermocykler, som er programmeret til revers transkriptase og cDNA-amplifikation/fluorescensdetektion. Amplifikationsbetingelserne består af et første revers transkriptase-trin ved 48 °C i 25 minutter, efterfulgt af 10 minutter ved 95 °C (»varmstart«) og 40 cykler a 15 sekunder ved 95 °C, 35 sekunder ved 55 °C og 30 sekunder ved 72 °C (eller 40 cykler ved 97 °C i 2 sekunder og 55 °C i 30 sekunder, såfremt der anvendes reagenser og thermocycler, der muliggør hurtige reaktioner). Fluorescensdata opnås ved afslutningen af 55 °C-trinnet.

2.1.5.

Assayet betragtes som værende ikke validt, hvis der fås atypiske amplifikationskurver, og skal da gentages.

Prøver betragtes som positive, hvis Ct-værdien (cyklusnummer, ved hvilken den fluorescens, der er genereret i en reaktion, krydser fluorescenstærskelværdien) er lavere end eller lig med den definerede Ct-tærskelværdi (35) inden for 40 PCR-cykler (Ct ≤ 35).

Prøver betragtes som inkonklusive, hvis Ct-værdien er højere end den definerede Ct-tærskelværdi (35) inden for 40 PCR-cykler (CT ≥ 35).

Prøver betragtes som negative, hvis der fås en horisontal amplifikationskurve, som ikke krydser tærskelværdien inden for 40 PCR-cykler.

—

forward primer

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

revers primer

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

MGB-TaqMan-probe

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

5 μΜ forward- og revers-primere og 3 μΜ probe blandes til primer- og probemixstamopløsninger i en koncentration på 25×. Der frembringes et testpladelayout, som indlæses i realtids-PCR-maskinens software. Med dette layout som rettesnor tilsættes 5 μl RNA-prøver, herunder testprøver og positive og negative kontroller, til de relevante brønde på pladen i overensstemmelse med layoutet.

2.2.2.

RNA'et denatureres ved opvarmning ved 95 °C i 5 minutter, efterfulgt af hurtig afkøling på is i mindst 3 minutter.

2.2.3.

Der tilberedes en passende mængde realtids-one-step-RT-PCR-mastermix til det antal prøver, der skal testes, efter fabrikantens anvisninger. 1 μl 25× primersondemixstamopløsning (se punkt 2.2.1 ovenfor) tilsættes til mastermixet, så der opnås en slutkoncentration i hver brønd på 200 nM for hver primer og 120 nM for proben. 20 μl mastermix fordeles i hver brønd på PCR-pladen, der indeholder det denaturerede RNA.

2.2.4.

Pladen anbringes i en realtidstermocykler, som er programmeret til revers transkriptase og cDNA-amplifikation/fluorescensdetektion, efter fabrikantens anvisninger. Amplifikationsbetingelserne er f.eks. et første revers transkriptase-trin ved 48 °C i 10 minutter, efterfulgt af 10 minutter ved 95 °C og 40 cykler a 15 sekunder ved 95 °C og 45 sekunder ved 60 °C.

2.2.5.

Prøver betragtes som positive, hvis den normaliserede fluorescens for AHSV-RT-PCR-assayet overstiger en tærskelværdi på 0,1 inden for 36 PCR-cykler i alle replikater af en prøve.

Prøver betragtes som inkonklusive, hvis den normaliserede fluorescens for AHSV-RT-PCR-assayet overstiger en tærskelværdi på 0,1 mellem 36 og 40 PCR-cykler i et eller flere replikater af en prøve.

Prøver betragtes som negative, hvis den normaliserede fluorescens for AHSV-RT-PCR-assayet ikke oversteg en tærskelværdi på 0,1 inden for 40 PCR-cykler i alle replikater af en prøve, og hvis den normaliserede fluorescens for det ejendomsretligt beskyttede syntetiske eksterne kontrolassay oversteg en tærskelværdi på 0,1 inden for 33 PCR-cykler.«