EUR-Lex Access to European Union law

1.

Denne metode svarer til OECD Test Guideline (TG) 105 (1995). Denne metode er en revideret version af den oprindelige TG 105, som blev vedtaget i 1981. Der er ingen indholdsmæssig forskel mellem den nuværende version og versionen fra 1981. Det er primært formatet, som er ændret. Revisionen var baseret på EU-testmetoden »Vandopløselighed« (1).

2.

Et stofs vandopløselighed kan i betragtelig grad afhænge af tilstedeværelsen af urenheder. Metoden omfatter bestemmelse af opløseligheden i vand af stoffer, som i det væsentlige er rene, og som er stabile i vand og ikke flygtige. Inden vandopløseligheden bestemmes, er det nyttigt at have forhåndsoplysninger om teststoffets strukturformel, damptryk, dissociationskonstant og hydrolyse som funktion af pH.

3.

To metoder, kolonne-eluerings-metoden og kolbe-metoden, som omfatter opløselighed henholdsvis under og over 10–2 g/l, er beskrevet i denne testmetode. En simpel foreløbig test er også beskrevet. Den gør det muligt at bestemme, hvor meget materiale der omtrentligt skal anvendes i den endelige test, og hvor lang tid der omtrentligt kræves til at opnå mætning.

4.

Et stofs opløselighed i vand er mætningskoncentrationen af stoffet i vand ved en given temperatur.

5.

Opløselighed i vand angives i masse pr. rumfang opløsning. SI-enheden er kg/m3 (g/l kan dog også anvendes).

6.

Anvendelse af referencekemikalier er ikke påkrævet, når et teststof skal undersøges.

7.

Testen udføres helst ved 20 °C ± 0,5 °C. Den valgte temperatur bør holdes konstant i alle relevante dele af udstyret.

8.

Stigende mængder vand tilsættes trinvist ved stuetemperatur til ca. 0,1 g af prøven (faste teststoffer skal være pulveriserede) i et 10 ml måleglas med glasprop. Efter hver tilsætning af vand omrystes blandingen kraftigt i 10 minutter, og det undersøges visuelt, om der er noget uopløst af prøven tilbage. Hvis prøven eller dele af prøven forbliver uopløst, efter at der er tilsat 10 ml vand, fortsættes testen i et 100 ml måleglas. Den anslåede opløselighed er angivet i tabel 1 nedenfor under den mængde tilsat vand, der netop forårsagede en fuldstændig opløsning af prøven. Hvis opløseligheden er lav, kan det tage lang tid at opløse et teststof, og henstandstiden øges til mindst 24 timer. Hvis teststoffet stadig ikke er opløst efter 24 timer, øges henstandstiden yderligere (op til 96 timer), eller der foretages yderligere fortynding, så det kan afgøres, om kolonne-eluerings- eller kolbe-metoden skal anvendes.

Tabel 1

9.

Denne metode er baseret på eluering af teststoffet med vand fra en mikrokolonne, der indeholder et inert bæremateriale, som er belagt med overskud af teststoffet (2). Opløseligheden i vand angives ved massekoncentrationen i eluatet, når den har nået et plateau som en funktion af tiden.

10.

Apparaturet består af en mikrokolonne (figur 1), som holdes ved konstant temperatur. Den er forbundet til en recirkulationspumpe (figur 2) eller en niveaubeholder (figur 3). Mikrokolonnen indeholder et inert bæremateriale, som holdes på plads af en lille prop af glasuld, der også fungerer som filter for partikler. Mulige materialer, der kan anvendes som bæremateriale, er glaskugler, diatoméjord eller andet inert materiale.

11.

Mikrokolonnen i figur 1 kan anvendes til konfigurationen med recirkulationspumpe. Den har et headspace, der sikrer plads til fem bed-rumfang (som kasseres ved begyndelsen af testen) og rumfanget af fem prøver (som udtages til analyse under testen). Alternativt kan størrelsen reduceres, hvis vand kan tilsættes systemet under testen som erstatning for de første fem bed-rumfang, der fjernes med urenheder. Kolonnen tilsluttes med slange fremstillet af et inert materiale til recirkulationspumpen, som kan levere ca. 25 ml/h. Recirkulationspumpen kan f.eks. være en slangepumpe eller en membranpumpe. Det skal omhyggeligt sikres, at der ikke sker kontaminering af og/eller adsorption på slangematerialet.

12.

Et system med niveaubeholder er vist skematisk i figur 3. I dette system er mikrokolonnen udstyret med en envejsstophane. Tilslutningen til niveaubeholderen består af en glasslibforbindelse og slange fremstillet af et inert materiale. Flowhastigheden fra niveaubeholderen bør være ca. 25 ml/h.

Figur 1

Mål i mm

Figur 2

Figur 3

13.

Ca. 600 mg bæremateriale overføres til en 50 ml rundbundet kolbe. En passende mængde af teststoffet opløses i et flygtigt opløsningsmiddel af analysekvalitet, og en passende mængde af denne opløsning tilsættes bærematerialet. Opløsningsmidlet afdampes fuldstændigt, f.eks. i en rotationsfordamper, da bærematerialet ellers ikke kan vandmættes i elueringstrinnet som følge af fordelingseffekter på overfladen. Det behandlede bæremateriale henstilles til kvældning i to timer i ca. 5 ml vand, hvorefter suspensionen overføres til mikrokolonnen. Alternativt kan det tørre behandlede bæremateriale hældes i mikrokolonnen, der er fyldt med vand, og derefter henstå i ca. to timer til opnåelse af ligevægt.

14.

Afsætningen på bærematerialet kan give problemer, der kan føre til fejlagtige resultater, f.eks. hvis teststoffet afsættes som en olie. Sådanne problemer bør undersøges, og detaljerne bør rapporteres.

15.

Væskestrømmen gennem kolonnen startes. Det anbefales at bruge en flowhastighed på ca. 25 ml/h, hvilket svarer til ca. 10 bed-rumfang pr. time for den beskrevne kolonne. Som minimum kasseres de første fem bed-rumfang, så vandopløselige urenheder fjernes. Derefter køres pumpen, indtil der er opnået ligevægt, defineret ved, at fem på hinanden følgende prøver giver koncentrationer, der ikke afviger mere end ± 30 % på tilfældig måde. Disse prøver bør være adskilt fra hinanden ved tidsintervaller, der svarer til et gennemløb af mindst 10 bed-rumfang. Afhængigt af den anvendte analysemetode kan det med fordel påvises ved hjælp af en kurve over koncentration/tid, at ligevægt er opnået.

16.

Successive fraktioner af eluatet opsamles og analyseres ved hjælp af den valgte metode. Fraktioner fra det midterste elueringsområde, hvor koncentrationerne er konstante inden for ± 30 % i mindst fem på hinanden følgende prøver, anvendes til at bestemme opløseligheden.

17.

Dobbeltdestilleret vand er den foretrukne eluent. Deioniseret vand med en modstand over 10 megohm/cm og et samlet indhold af organisk kulstof under 0,01 % kan også anvendes.

18.

Ved begge fremgangsmåder udføres endnu et forsøg med halvt så høj flowhastighed som det første. Hvis resultaterne fra de to forsøg stemmer overens, er testen tilfredsstillende. Hvis den målte opløselighed er højere ved den lavere flowhastighed, skal halveringen af flowhastigheden fortsættes, indtil to på hinanden følgende forsøg giver samme opløselighed.

19.

Ved begge fremgangsmetoder kontrolleres fraktionerne for tilstedeværelse af kolloidt materiale ved hjælp af Tyndall-effekten. Tilstedeværelse af partikler gør testen værdiløs, og den bør gentages efter forbedring af kolonnens filtreringsfunktion.

20.

pH i alle prøver måles, helst ved hjælp af særligt indikatorpapir.

21.

Teststoffet opløses (faste stoffer skal være pulveriserede) i vand ved en temperatur noget over testtemperaturen. Når mætning er opnået, afkøles blandingen og opbevares ved testtemperatur. Hvis det ved passende prøvetagning i øvrigt sikres, at mætningsligevægten er nået, kan målingen foretages direkte ved testtemperaturen. Derefter bestemmes massekoncentrationen af teststoffet i den vandige opløsning, der ikke må indeholde uopløste partikler, ved hjælp af en passende analysemetode (3).

22.

Der er behov for følgende materialer:

23.

Den mængde teststof, der er nødvendig for at mætte det ønskede rumfang vand, anslås ud fra den foreløbige test. Ca. fem gange denne mængde stof afvejes i hver af tre glasbeholdere med glasprop (f.eks. centrifugeglas eller kolber). En mængde vand, der er bestemt ved hjælp af analysemetoden og opløselighedsområdet, tilsættes hver beholder. Beholderne lukkes tæt til og omrystes ved 30 °C. Der anvendes ryste- eller omrørerudstyr, som kan operere ved konstant temperatur, f.eks. magnetomrøring i et termostatbad. Efter en dag henstilles én af beholderne til opnåelse af ligevægt i 24 timer ved testtemperaturen, og den rystes lejlighedsvis. Indholdet i beholderen centrifugeres derefter ved testtemperaturen, og koncentrationen af teststoffet i den klare vandige fase bestemmes med en passende analysemetode. De andre to kolber behandles på samme måde efter forudgående opnåelse af ligevægt ved 30 °C i henholdsvis to og tre dage. Hvis de koncentrationer, der måles i mindst to af beholderne, ikke adskiller sig med mere end 15 %, er testen tilfredsstillende. Hvis resultaterne fra beholder 1, 2 og 3 viser en stigende tendens, gentages hele testen med længere tider til opnåelse af ligevægt.

24.

Testen kan også udføres uden forudgående henstand ved 30 °C. Der opnås et skøn over, hvor hurtigt mætningsligevægten indstiller sig, ved udtagning af prøver, indtil omrøringstiden ikke længere indvirker på de målte koncentrationer.

25.

pH i alle prøver måles, helst ved hjælp af særligt indikatorpapir.

26.

Der foretrækkes en stofspecifik analysemetode, eftersom små mængder af opløselige urenheder kan forårsage store fejl i den målte opløselighed. Eksempler på sådanne metoder omfatter gas- eller væskekromatografi, titrering, fotometri og voltametri.

27.

For hvert forsøg udregnes middelværdien og standardafvigelsen for mindst fem på hinanden følgende prøver udtaget ved mætningsplateauet. Forskellen mellem middelværdierne fra to test med forskellige flowhastigheder må ikke være større end 30 %.

28.

Der beregnes et gennemsnit af de enkelte resultater fra hver af de tre kolber, og forskellen mellem dem må ikke være større end 15 %.

29.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

30.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

(1)

Bilag til Kommissionens direktiv 92/69/EØF af 31. juli 1992 om syttende tilpasning til den tekniske udvikling af Rådets direktiv 67/548/EØF om tilnærmelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer, EFT L 383 A af 29.12.1992, s. 54.

(2)

NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.

(3)

NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.«

1.

Denne metode svarer til OECD Test Guideline (TG) 123 (2006). 1-Octanol/vand-fordelingskoefficienten (POW) er for POW-værdier svarende til log POW på indtil 8,2 blevet bestemt nøjagtigt med slow-stirring-metoden (1). Metoden er derfor velegnet til direkte eksperimentel bestemmelse af POW for stærkt hydrofobe stoffer.

2.

Andre metoder, der beskriver fremgangsmåden til bestemmelse af 1-octanol/vand-fordelingskoefficienten (POW), er »shake-flask«-metoden (2) og bestemmelse af POW ud fra retentionsmønsteret ved omvendt-fase HPLC (3). »Shake-flask«-metoden er tilbøjelig til at give artefakter på grund af overførsel af mikrodråber af octanol til den vandige fase. For stigende POW vil tilstedeværelse af sådanne dråber i den vandige fase medføre stadig større overvurdering af teststoffets koncentration i vandet. Metoden kan derfor kun anvendes på stoffer med log POW < 4. I den anden metode anvendes pålidelige, direkte bestemte POW-værdier til kalibrering af sammenhængen mellem HPLC-retentionsmønsteret og de målte POW-værdier. Der er desuden udarbejdet et udkast til en OECD-guideline til bestemmelse af 1-octanol/vand-fordelingskoefficienterne for ioniserbare stoffer (4), men den bør ikke anvendes.

3.

Denne metode er udviklet i Nederlandene. Præcisionen af de beskrevne metoder er valideret og optimeret i en ringtest med deltagelse af 15 laboratorier (5).

4.

For inerte organiske stoffer er der konstateret en meget signifikant sammenhæng mellem stoffernes 1-octanol/vand-fordelingskoefficient (POW) og bioakkumuleringen i fisk. Desuden er POW påvist at være korreleret såvel med toksicitet over for fisk som med deres sorption af kemikalier til faste stoffer, som f.eks. jord og sedimenter. En omfattende gennemgang af disse sammenhænge er givet i reference (6).

5.

En lang række forskellige sammenhænge er fastlagt mellem 1-octanol/vand-fordelingskoefficienten og andre miljøtoksikologisk og miljøkemisk relevante stofegenskaber. I konsekvens heraf er 1-octanol/vand-fordelingskoefficienten blevet en nøgleparameter såvel ved vurdering af kemikaliers miljøfarlighed som ved forudsigelse af deres skæbne i miljøet.

6.

Slow-stirring-metoden antages at nedsætte dannelsen af mikrodråber af 1-octanol i vandfasen. Derved undgås den overvurdering af teststofkoncentrationen i den vandige fase, der skyldes teststofmolekyler knyttet til sådanne dråber. Slow-stirring-metoden er derfor særlig velegnet til bestemmelse af POW for stoffer med en forventet log POW-værdi på 5 eller derover, hvor shake-flask-metoden (2) er tilbøjelig til at give fejlagtige resultater.

7.

Et stofs fordelingskoefficient mellem vand og et lipofilt opløsningsmiddel (1-octanol) karakteriserer kemikaliets ligevægtsfordeling mellem de to faser. Fordelingskoefficienten mellem vand og 1-octanol (POW) defineres som forholdet mellem ligevægtskoncentrationerne af teststoffet i 1-octanol mættet med vand (CO) og i vand mættet med 1-octanol (CW).

Den er et koncentrationsforhold og er derfor dimensionsløs. Den angives oftest ved sin titalslogaritme (log POW). POW er temperaturafhængig, og rapporterede data skal derfor omfatte måletemperaturen.

8.

Til bestemmelse af fordelingskoefficienten bliver vand, 1-octanol og teststof bragt i ligevægt med hinanden ved konstant temperatur. Derefter bestemmes teststoffets koncentration i de to faser.

9.

Den her foreslåede slow-stirring-metode mindsker de eksperimentelle vanskeligheder, der er forbundet med dannelse af mikrodråber, når shake-flask-metoden benyttes. I slow-stirring-metoden bliver vand, 1-octanol og teststof bragt i ligevægt med hinanden i en termostatstyret reaktionsbeholder med omrører. Transporten af stoffer mellem faserne fremskyndes ved omrøring. Ved omrøringen opstår der en vis turbulens, der øger stoftransporten mellem 1-octanol og vand, uden at der dannes mikrodråber (1).

10.

Da tilstedeværelse af andre stoffer end teststoffet kan tænkes at have indflydelse på teststoffets aktivitetskoefficient, skal teststoffet afprøves i ren form. Den reneste gængse kvalitet af teststoffet til bestemmelsen af fordelingen 1-octanol/vand skal anvendes.

11.

Denne metode finder anvendelse på rene stoffer, der ikke dissocierer eller associerer, og som ikke udviser nævneværdig overfladeaktivitet. Den kan anvendes til bestemmelse af 1-octanol/vand-fordelingskoefficienten for sådanne stoffer og for blandinger. Når metoden anvendes på blandinger, afhænger de målte fordelingsforhold 1-octanol/vand dels af den testede blandings kemiske sammensætning, dels af sammensætningen af den elektrolytblanding, der anvendes som vandig fase. Forudsat der træffes supplerende foranstaltninger, kan metoden også anvendes på stoffer, der dissocierer eller associerer (afsnit 12).

12.

Som følge af de mange forskellige ligevægte, der optræder ved fordelingen mellem 1-octanol/vand af dissocierende forbindelser som organiske syrer og phenoler, organiske baser og metalorganiske forbindelser, er fordelingsforholdet i 1-octanol/vand en betinget konstant, der afhænger stærkt af elektrolytsammensætningen (7) (8). Bestemmelse af fordelingsforholdet i 1-octanol/vand kræver derfor styring og rapportering af pH og elektrolytsammensætning i testen. Vurdering af sådanne fordelingsforhold kræver ekspertviden. Ud fra størrelsen af dissociationskonstanterne må der vælges passende pH-værdier, således at der bestemmes et fordelingsforhold for hver ioniseringstilstand. Til testning af metalorganiske forbindelser skal de anvendte buffere være ikke-kompleksdannende (8). På grundlag af kendskabet til vandige opløsningers kemi (kompleksdannelseskonstanter, dissociationskonstanter) må testbetingelserne vælges, så at det er muligt at fastlægge, i hvilke former teststoffet optræder i den vandige fase. Ionstyrken skal holdes identisk i alle test ved anvendelse af en baggrundselektrolyt.

13.

Teststoffer med lav vandopløselighed eller høj POW kan volde vanskeligheder, fordi koncentrationen i vandfasen bliver meget lav og derfor vanskeligt kan bestemmes nøjagtigt. Det beskrives i metoden, hvordan dette problem gribes an.

14.

Kemiske reagenser skal være af analytisk kvalitet eller bedre. Det anbefales, at der enten anvendes umærket teststof med kendt kemisk sammensætning og helst mindst 99 % renhed eller radioaktivt mærket teststof med kendt kemisk sammensætning og radiokemisk renhed. Anvendes der radioaktive tracerstoffer med kort halveringstid, skal der korrigeres for henfald. Hvis der anvendes radioaktivt mærket teststof, skal analysemetoden være specifik for det pågældende kemiske stof for at sikre, at den målte radioaktivitet hænger direkte sammen med teststoffet.

15.

Log POW kan enten bestemmes ved hjælp af gængs software til bestemmelse af log POW eller ud fra forholdet mellem opløselighederne i de to opløsningsmidler.

16.

Før man udfører en test til bestemmelse af POW med slow-stirring-metoden, skal der foreligge følgende oplysninger om teststoffet:

17.

Der kræves sædvanligt laboratorieudstyr, herunder specielt følgende:

18.

Beholderen skal være udført i inert materiale, så der kan ses bort fra adsorption til beholderens overflade.

19.

Til bestemmelsen af POW skal der anvendes 1-octanol af reneste handelskvalitet (over 99 %). Rensning af den anvendte 1-octanol ved ekstraktion med syre, base og vand og efterfølgende tørring anbefales. Derudover kan 1-octanol renses ved destillation. Til fremstilling af standardopløsningerne af teststofferne skal der bruges renset 1-octanol. Vandet, der benyttes til bestemmelse af POW, skal enten være destilleret i glas eller kvarts, hidrøre fra et rensningssystem eller være af HPLC-kvalitet. Destilleret vand skal filtreres gennem et 0,22 μm filter, og der skal indgå blindprøver for at kontrollere, at der ikke er urenheder, der kan gribe forstyrrende ind i bestemmelsen af teststoffet i de koncentrerede ekstrakter. Hvis der anvendes et glasfiberfilter, skal det renses ved opvarmning til 400 °C i mindst tre timer.

20.

Inden testen mættes de to faser gensidigt ved ækvilibrering i en tilstrækkelig stor beholder. Dette opnås ved langsom omrøring (slow-stirring) af tofasesystemet i to døgn.

21.

Der udtages en passende mængde teststof, som opløses i 1-octanol (mættet med vand). Fordelingskoefficienten 1-octanol/vand bestemmes i fortyndede opløsninger i 1-octanol og vand. Koncentrationen af teststoffet bør derfor ikke være over 70 % af opløseligheden, og ikke over 0,1 M i nogen af faserne (1). De anvendte 1-octanol-opløsninger skal være fri for opslæmmede faste partikler af teststof.

22.

Der udtages en passende mængde teststof, som opløses i 1-octanol (mættet med vand). Hvis den anslåede værdi af POW er over fem, skal det sikres, at de i testen anvendte 1-octanol-opløsninger er fri for opslæmmede partikler af teststoffet. Til dette formål benyttes følgende fremgangsmåde til kemikalier med en anslået log POW-værdi > 5:

23.

Til assay af teststoffet skal der anvendes en valideret analysemetode. De for analysen ansvarlige skal dokumentere, at koncentrationerne både i den vandmættede 1-octanol-fase og i den 1-octanol-mættede vandfase er over kvantificeringsgrænsen for den anvendte analysemetode gennem hele testen. Når det er nødvendigt at bruge ekstraktion, skal genfindingen af teststoffet ved analysen af vandfasen og 1-octanol-fasen bestemmes inden testen. Analysesignalet skal korrigeres for blindværdi, og det skal sikres, at der ikke kan overføres analysand fra én prøve til en anden.

24.

På grund af de ret lave koncentrationer i vandfasen af et hydrofobt teststof vil det antagelig være nødvendigt at ekstrahere vandfasen med et organisk opløsningsmiddel og forkoncentrere ekstrakten inden analyse. Af samme grund er det nødvendigt at reducere et eventuelt indhold i blindprøverne. Det kræver, at der anvendes opløsningsmidler af høj renhed, fortrinsvis opløsningsmidler til reststofanalyse. Derudover vil omhyggelig rensning af det anvendte glasapparatur(f.eks. vask med opløsningsmiddel eller opvarmning til høj temperatur) medvirke til at undgå krydskontaminering.

25.

Et skøn over log POW kan fås af et beregningsprogram eller ved en ekspertvurdering. Hvis værdien er over seks, skal blindkorrektioner og overførsel af analysand nøje overvåges. Hvis den anslåede værdi af log POW er over seks, er det desuden obligatorisk at bruge en surrogatstandard til korrektion for genfinding, for at der kan opnås en høj forkoncentrationsfaktor. Til tilnærmet beregning af en log POW-værdi findes der på markedet forskellige softwareprogrammer (1), f.eks. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) og ACD log P (19). Metoderne til tilnærmet beregning er beskrevet i referencerne (20-22).

26.

Kvantificeringsgrænserne (LOQ) for bestemmelse af teststoffet i 1-octanol og vand fastlægges med anerkendte metoder. Som tommelfingerregel kan metodens kvantificeringsgrænse sættes til den koncentration i vand eller 1-octanol, der frembringer et signal/støjforhold på 10. Der skal vælges en passende metode til ekstraktion og forkoncentrering, og genfindingsværdierne ved analysen skal ligeledes angives. Forkoncentreringsfaktoren skal vælges, så der opnås et signal af den nødvendige størrelse ved den analytiske bestemmelse.

27.

På grundlag af analysemetodens parametre og de forventede koncentrationer bestemmes den omtrentlige prøvemængde, der er nødvendig for at få en nøjagtig bestemmelse af teststofkoncentrationen. Det bør undgås at tage vandprøver, der er for små til at give et tilstrækkeligt analysesignal. Ligeledes bør det undgås at tage vandprøver, der er alt for store, da der i så fald kan være for lidt vand tilbage til det nødvendige mindste antal analyser (n = 5). I tillæg 1 er angivet det minimale prøvevolumen som funktion af beholdervolumen, detektionsgrænse for teststoffet og opløselighed af teststoffet.

28.

Kvantificering af teststoffet foretages ved sammenholdelse med kalibreringskurverne for den pågældende forbindelse. Koncentrationerne i de analyserede prøver skal ligge i intervallet mellem den højeste og den laveste koncentration af standard.

29.

For teststoffer med en anslået log POW-værdi højere end seks skal der før ekstraktion tilsættes en surrogatstandard til vandet for at registrere tab under ekstraktion og forkoncentrering af vandprøverne. For at der kan korrigeres nøjagtigt for genfindingsgraden, skal surrogaternes egenskaber nøje svare til teststoffets eller være identiske dermed. Til det formål bør der fortrinsvis anvendes (stabile) isotopmærkede analoger af de undersøgte stoffer (f.eks. deuterium- eller 13C-mærkede). Hvis det ikke er muligt at anvende stabile, isotopmærkede analoger, f.eks. 13C eller 2H, skal det ud fra pålidelige litteraturdata godtgøres, at surrogaternes fysisk-kemiske egenskaber ligger meget tæt på teststoffets. Under væske-væske ekstraktion af vandfasen kan der dannes emulsioner. Emulsionsdannelsen kan begrænses ved tilsætning af salt og ved at lade emulsionen sætte sig natten over. De anvendte metoder til ekstraktion og forkoncentrering af prøverne skal beskrives.

30.

Prøverne af 1-octanolfasen kan om nødvendigt fortyndes med et passende opløsningsmiddel inden analyse. Desuden anbefales brug af surrogatstandarder til korrektion for genfindingsgraden for stoffer, som har udvist stor variation ved genfindingsforsøgene (relativ standardafvigelse > 10 %).

31.

Analysemetoden skal beskrives i detaljer. Herunder angives ekstraktionsmetode, forkoncentrerings- og fortyndingsfaktor, instrumentparametre, kalibreringsrutine, kalibreringsområde, analytisk genfinding af teststoffet i vand, tilsætning af surrogatstandarder til korrektion for genfindingsgrad, blindværdier, detektionsgrænser og kvantificeringsgrænser.

32.

Ved valg af volumenet af vand og volumenet af 1-octanol skal følgende forhold tages i betragtning: kvantificeringsgrænsen i 1-octanol og vand, de forkoncentreringsfaktorer, der anvendes på vandprøverne, de udtagne prøvevolumener af 1-octanol og vand samt de forventede koncentrationer. Af hensyn til forsøgets udførelse skal volumenet af 1-octanol i slow-stirring-systemet vælges, så 1-octanol-laget er tilstrækkelig tykt (> 0,5 cm) til, at der kan tages prøver af 1-octanol-fasen uden at forstyrre denne.

33.

Til bestemmelse af forbindelser med log POW på 4,5 og derover anvendes typisk et forhold mellem faserne på 20-50 ml 1-octanol og 950-980 ml vand i en beholder på én liter.

34.

Under testen skal reaktionsbeholderen være termostateret med en temperaturvariation på under 1 °C. Assayet skal udføres ved 25 °C.

35.

Testsystemet skal være beskyttet mod dagslys, enten ved brug af mørkekammer eller ved indpakning af reaktionsbeholderen i alufolie.

36.

Testen skal (så vidt muligt) udføres i støvfrit miljø.

37.

Systemet 1-octanol-vand omrøres, til det har nået ligevægt. Der foretages et indledende pilotforsøg, hvor ækvilibreringsperioden bestemmes ved slow-stirring metoden med regelmæssig prøveudtagning af vand og 1-octanol. Der skal gå mindst fem timer mellem prøveudtagningerne.

38.

Hver POW-bestemmelse skal ske ved hjælp af mindst tre uafhængige slow-stirring-test.

39.

Ligevægt antages at være nået, når afbildning af koncentrationsforholdet i 1-octanol/vand mod tiden i fire tidspunkter resulterer i en regressionslinje med en hældning, der ikke er signifikant forskellig fra nul ved et p-niveau på 0,05. Der skal ækvilibreres i mindst ét døgn, før prøvetagningen påbegyndes. For stoffer med en anslået log POW-værdi på mindre end fem kan prøveudtagning som tommelfingerregel finde sted på dag to og tre. For mere hydrofobe forbindelser kan det være nødvendigt med længere ækvilibreringstid. For en forbindelse med en log POW på 8,23 (decachlorbiphenyl) var 144 timer tilstrækkeligt til ækvilibrering. Opnåelse af ligevægt vurderes ved gentagne prøvetagninger fra samme forsøgsbeholder.

40.

Ved testens start fyldes reaktionsbeholderen med vand mættet med 1-octanol. Det afventes, at blandingen antager den termostaterede temperatur.

41.

Den ønskede mængde teststof (opløst i det nødvendige volumen 1-octanol mættet med vand) tilsættes forsigtigt til reaktionsbeholderen. Dette er et afgørende trin i testen, da det er nødvendigt at undgå turbulent opblanding af de to faser. Til dette formål kan 1-octanol-fasen langsomt afpipetteres op mod væggen af testbeholderen, tæt på vandoverfladen. Den vil derved flyde ned ad glasvæggen og danne en film på oversiden af vandfasen. Dekanter aldrig 1-octanol direkte i kolben; undgå, at der drypper 1-octanol direkte ned i vandet.

42.

Efter start af omrøringen skal omrøringshastigheden øges langsomt. Hvis omrørermotoren ikke kan indstilles passende, må brug af en transformator overvejes. Omrøringshastigheden skal indstilles, så der dannes en hvirvel med en dybde på 0,5 til højst 2,5 cm i grænsefladen mellem vand og 1-octanol. Hvis hvirvlens dybde er over 2,5 cm, skal omrøringshastigheden mindskes, da der ellers kan dannes mikrodråber af 1-octanol i vandfasen, hvilket vil medføre overvurdering af teststofkoncentrationen i vandet. Den anbefalede maksimale omrøringshastighed svarende til 2,5 cm er baseret på resultaterne af ring-testen (5). Den repræsenterer et kompromis mellem hurtigst mulig ækvilibrering og begrænsning af dannelsen af mikrodråber af 1-octanol.

43.

Ved prøvetagning skal omrøreren være afbrudt, og bevægelsen i væskerne skal være ophørt. Når prøverne er taget, startes omrøreren igen langsomt som ovenfor beskrevet, hvorefter hastigheden øges gradvis.

44.

Prøver af vandfasen tages fra en hane i bunden af reaktionsbeholderen. Dødvolumenet af vand i hanerne skal altid kasseres (i den i tillæg 2 viste beholder er det ca. 5 ml). Vandet i hanerne bliver ikke omrørt og er derfor ikke i ligevægt med hovedmængden. Notér volumenet af vandprøverne, og sørg for, at indholdet af teststof i det kasserede vand medregnes ved opstilling af massebalancen. Fordampningstabet skal minimeres ved at lade vandet løbe roligt ned i skilletragten, så laget af vand/1-octanol ikke forstyrres.

45.

Prøverne af 1-octanol fås ved at udtage en lille aliquot (ca. 100 μl) fra 1-octanol-laget med en 100 mikroliter sprøjte udført helt i glas-metal. Der skal udvises forsigtighed for at ikke at forstyrre grænsefladen. Volumenet af den udtagne væskeprøve noteres. En lille aliquot er tilstrækkeligt, da prøven af 1-octanol bliver fortyndet.

46.

Overflødige overførselstrin for prøverne bør undgås. Der benyttes derfor vejning til bestemmelse af prøvevolumenet. For vandprøvernes vedkommende kan dette ske ved opsamling af vandprøven i en skilletragt, der i forvejen indeholder det nødvendige volumen opløsningsmiddel.

47.

I denne metode bestemmes POW ved tre slow-stirring-test (tre forsøgsenheder) med det undersøgte stof under identiske betingelser. Den regressionslinje, der anvendes til påvisning af ligevægt, skal være baseret på resultaterne af mindst fire på hinanden følgende bestemmelser af CO/CW. Derved kan variansen beregnes som et mål for usikkerheden på det beregnede gennemsnit for hver forsøgsenhed.

48.

POW kan karakteriseres ved variansen af de data, der opnås for hver forsøgsenhed. På grundlag heraf beregnes POW som det vægtede gennemsnit af resultaterne fra de enkelte forsøgsenheder. Ved beregningen vægtes resultaterne for forsøgsenhederne med deres reciprokke varians. Derved opnås, at data med stor variation (udtrykt ved variansen) og dermed mindre pålidelighed får mindre indflydelse på resultatet end data med lille varians.

49.

Analogt hermed beregnes den vægtede standardafvigelse. Denne karakteriserer repeterbarheden af målingen af POW. Hvis den vægtede standardafvigelse er lav, har POW-bestemmelsen en høj grad af repeterbarhed inden for samme laboratorium. Den formelle statistiske behandling af data er beskrevet nedenfor.

50.

For hvert prøvetagningstidspunkt beregnes logaritmen til forholdet mellem teststoffets koncentration i 1-octanol og vand (log (CO/CW)). Opnåelse af kemisk ligevægt påvises ved afbildning af dette forhold mod tiden. Når denne kurve går over i et plateau bestående af mindst fire på hinanden følgende tidspunkter, er ligevægt nået, og stoffet er reelt opløst i 1-octanol. Hvis ikke, må testen fortsættes, indtil fire på hinanden følgende tidspunkter giver en hældning, der ikke er signifikant forskellig fra 0 ved et p-niveau på 0,05 som tegn på, at CO/CW er uafhængig af tiden.

51.

Log POW for den pågældende forsøgsenhed beregnes som det vægtede gennemsnit af log Co/Cw for den del af kurven over log Co/Cw som funktion af tiden, hvor ligevægt er påvist at være indtrådt. Det vægtede gennemsnit beregnes ved at vægte data med den reciprokke varians, så indflydelsen af data på slutresultatet bliver omvendt proportional med usikkerheden på data.

52.

Gennemsnitsværdien af log POW for forskellige forsøgsenheder beregnes som gennemsnittet af resultaterne for de enkelte forsøgsenheder, vægtet med den pågældende varians.

Beregningen foretages således:

hvor:

Den reciprokke varians af log POW,i anvendes som wi ()

53.

Fejlen på gennemsnittet af log POW beregnes som repeterbarheden af log CO/CW, bestemt i ligevægtsfasen i de enkelte forsøgsenheder. Den udtrykkes som den vægtede standardafvigelse på log POW,Av (σlog Pow,Av), der igen er et mål for fejlen på log POW,Av. Den vægtede standardafvigelse kan beregnes af den vægtede varians varlog Pow,Av på følgende måde:

Symbolet n er antal forsøgsenheder.

54.

Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger:

(1)

De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the »slow-stirring« method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.

(2)

Kapitel A.8 i dette bilag, Fordelingskoefficient.

(3)

Kapitel A.8 i dette bilag, Fordelingskoefficient.

(4)

OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.

(5)

Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.

(6)

Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

(7)

Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

(8)

Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.

(9)

OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.

(10)

Kapitel A.6 i dette bilag, Vandopløselighed.

(11)

Kapitel C.7 i dette bilag, Nedbrydning — Abiotisk nedbrydning: hydrolyse som funktion af pH.

(12)

Kapitel C.4 — del II til VII (Metode A til F) i dette bilag, Bestemmelse af let bionedbrydelighed.

(13)

Kapitel A.4 i dette bilag, Damptryk.

(14)

Pinsuwan S, Li A og Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.

(15)

Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 til 2-52.

(16)

Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.

(17)

Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.

(18)

Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.

(19)

ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.

(20)

Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.

(21)

Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.

(22)

Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.

1.

Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline 403 (2009) (1). Den oprindelige Test Guideline 403 (TG 403) for akut toksicitet ved inhalation blev vedtaget i 1981. Formålet med denne reviderede testmetode B.2 (som svarer til den reviderede TG 403) er at sikre mere fleksibilitet, reducere omfanget af dyreforsøg og opfylde myndighedsbestemmelser. Den reviderede testmetode omfatter to typer forsøg: en traditionel LC50-protokol og en koncentration × tid-protokol (C × t). Denne testmetode er primært kendetegnet ved dens evne til at tilvejebringe en koncentrationsresponsrelation varierede fra ikke-dødelige til dødelige resultater med henblik på at få en gennemsnitlig dødelig dosis (LC50), ikke-dødelig tærskelkoncentration (f.eks. LC01) og hældning og dens evne til at identificere mulig kønsspecifik modtagelighed. C × t-protokollen bør anvendes, når specifikke myndighedsbestemmelser eller videnskabelige behov nødvendiggør forsøg med dyr i forskellige tidsrum, f.eks. med henblik på planlægning af nødberedskab [f.eks. udledning af værdier for Acute Exposure Guideline Levels (AEGL), Emergency Response Planning Guidelines (ERPG) eller Acute Exposure Threshold Levels (AETL)] eller med henblik på fysisk planlægning.

2.

Vejledning i udførelse og fortolkning af forsøgene i forbindelse med denne testmetode findes i Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39) (2).

3.

De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i slutningen af dette kapitel og i GD 39 (2).

4.

Denne testmetode muliggør karakterisering og kvantitativ risikovurdering af testkemikaliet og gør det muligt at vurdere og klassificere testkemikalierne i overensstemmelse med forordning (EF) nr. 1272/2008 (3). GD 39 (2) beskriver, hvordan den mest hensigtsmæssige metode til akut testning vælges. Hvis der kun kræves oplysninger om klassificering og mærkning, anbefales generelt kapitel B.52 i dette bilag (4) [se GD 39 (2)]. Denne testmetode B.2 er ikke specifikt beregnet til test af særlige materialer, som f.eks. tungtopløselige isometriske eller fiberholdige materialer eller fremstillede nanomaterialer.

5.

Inden test i overensstemmelse med denne metode overvejes, bør alle tilgængelige oplysninger om testkemikaliet, herunder eksisterende forsøg (f.eks. kapitel B.52 i dette bilag (4)), hvis data understøtter, at der ikke udføres yderligere test, overvejes af testlaboratoriet med henblik på at minimere omfanget af dyreforsøg. Oplysninger, der kan hjælpe med at vælge de mest hensigtsmæssige arter, stammer, køn, eksponeringsformer og testkoncentrationer, omfatter testkemikaliets identitet, kemiske struktur og fysisk-kemiske egenskaber, resultater af in vitro- eller in vivo-toksicitetstest, forventede anvendelser og potentialet for human eksponering, tilgængelige (Q)SAR-data og toksikologiske data vedrørende strukturelt relaterede stoffer [se GD 39 (2)].

6.

Test af ætsende og/eller irriterende testkemikalier ved koncentrationer, der forventes at forvolde stærk smerte og lidelse, bør så vidt muligt undgås. Ætsnings-/irritationsstyrken skal evalueres af eksperter ved hjælp af dokumentation, som f.eks. erfaringer fra mennesker og dyr (f.eks. fra forsøg med gentagen dosering udført ved koncentrationer, der ikke er ætsende/irriterende), eksisterende in vitro-data [f.eks. fra kapitel B.40 (5) og kapitel B.40.A (6) i dette bilag eller OECD TG 435 (7)], pH-værdier, information fra lignende stoffer eller andre relevante data med henblik på at undersøge, om yderligere test kan undgås. Når konkrete myndighedsbestemmelser gør det nødvendigt (f.eks. i forbindelse med planlægning af nødberedskab), kan denne testmetode bruges til eksponering af dyr for sådanne materialer, fordi det giver forsøgslederen eller den primære investigator mulighed for at vælge målkoncentrationerne. Målkoncentrationerne bør dog ikke have svære irriterende/ætsende virkninger, men alligevel være tilstrækkelige til at hæve koncentrations-responskurven til et niveau, der opfylder testens lovgivningsmæssige eller videnskabelige formål. Disse koncentrationer bør vælges i hvert enkelt tilfælde, og den valgte koncentration bør begrundes [se GD 39 (2)].

7.

Denne reviderede testmetode B.2 har til formål at tilvejebringe tilstrækkelige oplysninger om den akutte toksicitet af et testkemikalie til, at det kan klassificeres, og til at tilvejebringe data om dødelighed (f.eks. LC50, LC01 og hældning) for et eller begge køn, hvis det er nødvendigt til de kvantitative risikovurderinger. Denne testmetode omfatter to metoder. Den første metode er en traditionel protokol, hvor grupper af dyr eksponeres for en grænsekoncentration (grænsetest) eller en serie af koncentrationer i en trinvis fremgangsmåde i en forudbestemt periode på normalt fire timer. Andre eksponeringsvarigheder kan anvendes for at opfylde konkrete myndighedsbestemmelser. Den anden metode er en C × t-protokol, hvor grupper af dyr eksponeres for en grænsekoncentration eller en serie af flere koncentrationer i flere perioder.

8.

Dyr, som er døende, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, bør aflives humant og betragtes ved fortolkningen af testresultatet på samme måde som dyr, der er døde under testen. Kriterierne for aflivning af døende eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller forestående død er genstand for en særskilt vejledning (OECD Guidance Document No. 19 on Humane Endpoints) (8).

9.

Der anvendes raske unge dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Den foretrukne art er rotter, og der bør gives begrundelse, hvis en anden art anvendes.

10.

Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. På eksponeringsdagen bør dyrene være unge voksne, der er mellem 8 og 12 uger gamle, og deres kropsvægt bør være inden for ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn af tidligere eksponerede dyr i samme alder. Dyrene udtages på tilfældig måde og mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres. Dyrene holdes i deres bure i mindst fem dage, inden testen påbegyndes, så de tilvænnes laboratorieforholdene. Dyrene tilvænnes også testudstyret i en kort perioden inden testen, da det vil mindske stress forårsaget af introduktionen til et nyt miljø.

11.

Temperaturen i forsøgsdyrrummet bør være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed bør være 30-70 %, selv om det muligvis ikke er muligt, hvis vand bruges som vehikel. Før og efter eksponering bør dyr generelt holdes i bur i grupper efter køn og koncentration, men antallet af dyr pr. bur må ikke bevirke, at det er vanskeligt at observere de enkelte dyr, og bør minimere tab som følge af kannibalisme og slagsmål. Hvis dyr alene eksponeres gennem næsen, skal de muligvis tilvænnes fastspændingsslanger. Disse slanger må ikke påføre dyrene unødig fysisk, termisk eller bevægelsesmæssig belastning. Fastspænding kan påvirke fysiologiske effektparametre, som f.eks. kropstemperatur (hypertermi) og/eller respiratorisk minutvolumen. Hvis der foreligger generiske data, som viser, at sådanne ændringer ikke forekommer i nævneværdigt omfang, er tilvænning til fastspændingsslangerne ikke nødvendig. Dyr, der med hele kroppen eksponeres for en aerosol, bør holdes i individuelle bure under eksponeringen for at undgå, at testaerosolen filtreres gennem pelsen på de andre dyr i buret. Der kan anvendes normalt og godkendt laboratoriefoder, dog ikke under eksponering, med ubegrænset forsyning af drikkevand. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke.

12.

Karakteren af testkemikaliet og formålet med testen bør overvejes ved valget af inhalationskammer. Den foretrukne eksponeringsform er gennem næsen (dette udtryk omfatter kun hoved, kun næse og kun snude). Eksponering gennem næsen foretrækkes generelt i forbindelse med test af flydende eller faste aerosoler og dampe, der kan kondensere og danne aerosoler. Særlige formål med forsøget kan bedre opfyldes ved eksponering af hele kroppen, men dette skal begrundes i forsøgsrapporten. For at sikre en stabil atmosfære, når der anvendes et kammer til hele kroppen, må forsøgsdyrenes totale volumen ikke overstige 5 % af kammerets volumen. Principperne for teknikkerne til eksponering gennem næsen eller eksponering af hele kroppen samt deres særlige fordele og ulemper er beskrevet i GD 39 (2).

13.

Eksponering gennem næsen kan være af enhver varighed på op til seks timer for rotter. Hvis mus eksponeres gennem næsen, må eksponeringstiden generelt ikke overstige fire timer. Der gives en begrundelse, hvis test af længere varighed er påkrævet [se GD 39 (2)]. Dyr, der eksponeres for aerosoler i kamre til hele kroppen, bør holdes i individuelle bure for at undgå, at de indtager testkemikaliet som følge af soignering af de andre dyr. Dyrene bør ikke fodres i eksponeringsperioden. Dyret skal have adgang til vand under helkropseksponering.

14.

Dyr eksponeres for testkemikaliet i form af en gas, dampe, aerosoler eller en blanding heraf. Den fysiske tilstand, der skal testes, afhænger af testkemikaliets fysisk-kemiske egenskaber, den valgte koncentration og/eller den fysiske form, der højst sandsynligt vil være til stede under håndteringen og anvendelsen af testkemikaliet. Hygroskopiske og kemisk reaktive testkemikalier bør testes under tørre luftforhold. Der må ikke skabes eksplosive koncentrationer.

15.

Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for alle aerosoler og dampe, der kan kondensere og danne aerosoler. For at sikre, at alle relevante områder af luftvejene eksponeres, anbefales aerosoler med en massemedian af den aerodynamiske diameter (MMAD) i området fra 1 til 4 μm med en geometrisk standardafvigelse (σg) i området fra 1,5 til 3,0 (2) (9) (10). Der bør ydes en rimelig indsats for at overholde denne standard, men en ekspertvurdering gives, hvis det ikke er muligt. Partikler fra tungmetalrøg kan f.eks. være mindre end denne standard, og ladede partikler, fibre og hygroskopiske materialer (som udvides i luftvejenes fugtige miljø) kan overstige standarden.

16.

Der kan anvendes et vehikel til at frembringe et testkemikalie med den rigtige koncentration og partikelstørrelse i atmosfæren. Generelt foretrækkes vand. Partikelformigt materiale kan underkastes mekaniske processer for at opnå den krævede partikelstørrelsesfordeling. Det skal dog omhyggeligt sikres, at testkemikaliet ikke dekomponerer eller ændres. Hvis mekaniske processer menes at have ændret teststoffets sammensætning (f.eks. ekstreme temperaturer som følge af friktion under formaling), bør testkemikaliets sammensætning kontrolleres analytisk. Kontaminering af testkemikaliet skal undgås. Det er ikke nødvendigt at teste granulat, der ikke er letsmuldrende, og som netop er formuleret, så det ikke kan inhaleres. Der bør anvendes en slidtest til at dokumentere, at der ikke frembringes respirable partikler under håndteringen af granulat. Hvis en slidtest frembringer respirable stoffer, bør der udføres en inhalationstoksicitetstest.

17.

En sideløbende negativ (luft)kontrolgruppe er ikke nødvendig. Hvis et andet vehikel end vand bruges til at frembringe testatmosfæren, skal en vehikelkontrolgruppe kun anvendes, hvis historiske inhalationstoksicitetsdata ikke foreligger. Hvis et toksicitetsforsøg vedrørende et testkemikalie, der er formuleret i et vehikel, ikke påviser toksicitet, følger det, at vehiklet er ikke-toksisk ved den testede koncentration. Der er derfor ikke brug for en vehikelkontrol.

18.

Luftgennemstrømningen gennem kammeret skal nøje kontrolleres, overvåges løbende og registreres mindst én gang i timen under eksponering. Overvågningen af koncentrationen (eller stabiliteten) i testatmosfæren indgår i målingen af alle dynamiske parametre og giver indirekte mulighed for at kontrollere alle relevante dynamiske parametre for generering af atmosfæren. Genindånding i kamre til eksponering gennem næsen skal undgås, hvis luftgennemstrømningen gennem eksponeringssystemet ikke er tilstrækkelig til at tilvejebringe en dynamisk gennemstrømning i den kemiske testatmosfære. Der er fastlagte metodologier, der kan bruges til at påvise, at genindånding ikke finder sted under de valgte driftsbetingelser (2) (11). Iltkoncentrationen skal være mindst 19 %, og kuldioxidkoncentrationen må ikke overstige 1 %. Hvis der er grund til at antage, at disse standarder ikke kan overholdes, skal ilt- og kuldioxidkoncentrationerne måles.

19.

Kammerets temperatur skal være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed i dyrenes vejrtrækningszone skal ved eksponering gennem næsen og helkropseksponering overvåges og registreres mindst tre gange ved varigheder af op til fire timer og hver time ved kortere varigheder. Den relative fugtighed bør være 30-70 %, men dette er ikke altid muligt (f.eks. ved test af vandbaserede blandinger) eller kan ikke måles på grund af testkemikaliets indvirkning på testmetoden.

20.

Når det er muligt, bør den nominelle eksponeringskoncentration i kammeret beregnes og registreres. Den nominelle koncentration er massen af det genererede testkemikalie divideret med den samlede mængde luft, der passerer gennem kammersystemet. Den nominelle koncentration bruges ikke til at karakterisere dyrenes eksponering, men en sammenligning af den nominelle koncentration og den faktiske koncentration giver en indikation af testsystemets genereringseffektivitet og kan derfor bruges til at opdage eventuelle genereringsproblemer.

21.

Den faktiske koncentration er koncentrationen af testkemikaliet ved dyrenes vejrtrækningszone i et inhalationskammer. Faktiske koncentrationer kan bestemmes med specifikke metoder (f.eks. direkte prøveudtagning, adsorptive eller kemisk reaktive metoder og efterfølgende analytisk karakterisering) eller med ikke-specifikke metoder, som f.eks. gravimetrisk filteranalyse. Brugen af gravimetrisk analyse er kun acceptabel for pulverbaserede enkeltkomponent-aerosoler eller aerosoler af væsker med lav flygtighed og bør støttes af hensigtsmæssige testkemikaliespecifikke karakteriseringer udført før forsøget. Koncentrationen af pulverbaserede flerkomponent-aerosoler kan også bestemmes ved hjælp af gravimetrisk analyse. Det kræver dog analysedata, der viser, at det luftbårne materiales sammensætning svarer til udgangsmaterialet. Hvis denne information ikke er tilgængelig, kan det være nødvendigt at gentage analysen af testkemikaliet (ideelt i dets luftbårne tilstand) med regelmæssige intervaller i løbet af forsøget. For aerosoliserede stoffer, der kan fordampe eller sublimere, bør det påvises, at alle faser er indsamlet ved hjælp af den valgte metode. Målkoncentrationer, nominelle koncentrationer og faktiske koncentationer angives i forsøgsrapporten, men kun de faktiske koncentrationer bruges i de statistiske analyser til at beregne letale koncentrationer.

22.

Der anvendes så vidt muligt én batch af testkemikaliet, og prøven opbevares under forhold, der bevarer dens renhed, homogenitet og stabilitet. Inden forsøget påbegyndes, bør testkemikaliet karakteriseres, herunder dets renhed og, hvis det er teknisk muligt, identitet og mængde af identificerede kontaminanter og urenheder. Dette kan påvises ved hjælp af bl.a. følgende data: retentionstid og relativt topareal, molekylvægt fra massespektroskopi- eller gaskromatografianalyser eller andre vurderinger. Selv om testlaboratoriet ikke er ansvarligt for prøvens identitet, bør testlaboratoriet af hensyn til sikkerheden bekræfte rekvirentens karakterisering i hvert fald på en begrænset måde (f.eks. farve, fysisk form osv.).

23.

Eksponeringsatmosfæren holdes så konstant som muligt og overvåges kontinuerligt og/eller i intervaller afhængigt af analysemetoden. Hvis intervalbaseret prøveudtagning anvendes, bør der udtages atmosfæreprøver i kammeret mindst to gange i løbet af et forsøg med en varighed på fire timer. Hvis det ikke er muligt på grund af begrænsede luftgennemstrømningshastigheder eller lave koncentrationer, kan en prøve udtages over hele eksponeringsperioden. Hvis der forekommer markante udsving fra prøve til prøve, bør der anvendes fire prøver pr. eksponering for de næste testede koncentrationer. De enkelte prøver for koncentrationen i kammeret bør ikke afvige fra middelkoncentrationen med mere end ± 10 % for gasser og dampe eller ± 20 % for flydende eller faste aerosoler. Tiden til ækvilibrering af kammer (t95) beregnes og registreres. Varigheden af en eksponering strækker sig over den tid, hvor testkemikaliet genereres, og det omfatter den tid, der kræves for at opnå t95. Vejledning i beregning af t95 findes i GD 39 (2).

24.

For meget komplekse blandinger, der består af gasser/dampe og aerosoler (f.eks. forbrændingsatmosfærer og testkemikalier genereret af formålsbestemte slutprodukter/apparater), kan hver fase opføre sig forskelligt i et inhalationskammer, og der udvælges derfor mindst ét indikatorstof (analysand), normalt det primære aktivstof i blandingen, fra hver fase (gas/damp og aerosol). Hvis testkemikaliet er en blanding, rapporteres analysekoncentrationen for blandingen og ikke kun for det aktive stof eller komponenten (analysand). Yderligere oplysninger om faktiske koncentrationer findes i GD 39 (2).

25.

Aerosolers partikelstørrelsesfordeling bestemmes mindst to gange i løbet af hver eksponering på fire timer ved hjælp af en kaskadeimpaktor eller et andet instrument, f.eks. et instrument til aerodynamisk partikelstørrelsesbestemmelse. Hvis der kan påvises ækvivalens mellem de resultater, der er opnået ved hjælp af kaskadeimpaktoren eller et alternativt instrument, kan det alternative instrument bruges i hele forsøget. Et andet apparat, f.eks. et gravimetrisk filter eller en impinger/gas bubbler, anvendes parallelt med det primære instrument til at bekræfte det primære instruments opsamlingseffektivitet. Den massekoncentration, der fås ved hjælp af partikelstørrelsesanalysen, skal være inden for rimelige grænser af den massekoncentration, der fås ved hjælp af filteranalyse [se GD 39 (2)]. Hvis ækvivalens kan påvises i forsøgets tidligere fase, kan yderligere bekræftelsesmålinger udelades. Af hensyn til dyrevelfærden træffes der foranstaltninger for at minimere inkonklusive data, der kan gøre det nødvendigt at gentage en eksponering. Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for dampe, hvis der er mulighed for, at kondensering af dampe kan føre til dannelsen af en aerosol, eller hvis der konstateres partikler i en dampatmosfære med potentiale for blandede faser (se afsnit 15).

26.

To forsøgstyper er beskrevet nedenfor: en traditionel protokol og en C × t-protokol. Begge protokoller kan omfatte et forforsøg, et hovedforsøg og/eller en grænsetest (traditionel protokol) eller testning ved en grænsekoncentration (C × t). Hvis et køn vides at være mere modtagelig, kan forsøgslederen vælge at udføre disse forsøg alene ved hjælp af det mest modtagelige køn. Hvis andre gnaverarter end rotter eksponeres gennem næsen, kan de maksimale eksponeringsvarigheder justeres for at minimere artsspecifikke lidelser. Inden forsøget påbegyndes, undersøges alle tilgængelige data med henblik på at minimere omfanget af dyreforsøg. Data, der er indhentet ved hjælp af kapitel B.52 i dette bilag 4, kan f.eks. overflødiggøre behovet for et forforsøg og kan også vise, om et køn er mere modtageligt [se GD 39 (2)].

27.

I et traditionelt forsøg eksponeres grupper af dyr for et testkemikalie i en bestemt tidsperiode (oftest 4 timer) i et kammer til eksponering gennem næsen eller helkropseksponering. Dyr eksponeres for en grænsekoncentration (grænsetest) eller mindst tre koncentrationer i en trinvis fremgangsmåde (hovedforsøg). Et forforsøg kan udføres inden hovedforsøget, medmindre der allerede foreligger visse informationer om testkemikaliet, f.eks. et tidligere udført B.52-forsøg [se GD 39 (2)].

28.

Et forforsøg bruges til at skønne testkemikaliets styrke, identificere kønsbetingede forskelle i modtagelighed og hjælpe med at vælge eksponeringskoncentrationer til hovedforsøget eller grænsetesten. Når koncentrationerne vælges til forforsøget, anvendes alle tilgængelige informationer, herunder tilgængelige (Q)SAR-data og data vedrørende lignende kemikalier. Højst tre hanner og tre hunner bør eksponeres ved hver koncentration (3 dyr/køn kan være nødvendigt for at fastslå en kønsbetinget forskel). Et forforsøg kan omfatte én koncentration, men flere koncentrationer kan om nødvendigt testes. Et forforsøg bør ikke teste så mange dyr og koncentrationer, at det ligner et hovedforsøg. Et tidligere udført B.52-forsøg (4) kan bruges i stedet for et forforsøg [se GD 39 (2)].

29.

En grænsetest bruges, når testkemikaliet vides eller forventes at være stort set ikke-toksisk, dvs. det fremkalder toksisk respons, der kun ligger over den fastsatte grænsekoncentration. I en grænsetest eksponeres en gruppe af tre hanner og tre hunner for testkemikaliet ved en grænsekoncentration. Oplysninger om testkemikaliets toksicitet kan fås ud fra viden om tilsvarende testede kemikalier, idet der tages hensyn til art og procentuelt indhold af de stoffer, der vides at være af toksikologisk betydning. Når der kun foreligger få eller slet ingen oplysninger om testkemikaliets toksicitet, eller når testkemikaliet forventes at være toksisk, bør hovedforsøget udføres.

30.

Valget af grænsekoncentrationer afhænger normalt af lovgivningskrav. Når forordning (EF) nr. 1272/2008 anvendes, er grænsekoncentrationerne for gasser, dampe og aerosoler henholdsvis 20 000 ppm, 20 mg/l og 5 mg/l (eller den højest opnåelige koncentration) (3). Det kan være en teknisk udfordring at generere testkoncentrationer af visse testkemikalier, især som dampe og aerosoler. Ved test af aerosoler bør det primære mål være at opnå en respirabel partikelstørrelse (MMAD på 1-4 μm). For de fleste testkemikalier er det muligt ved en koncentration på 2 mg/l. Test af aerosoler ved en koncentration på mere end 2 mg/l bør kun forsøges, hvis der kan opnås en respirabel partikelstørrelse [se GD 39 (2)]. I henhold til forordning (EF) nr. 1272/2008 bør test, der overstiger en grænsekoncentration, undgås af hensyn til dyrevelfærden (3). Grænsekoncentrationen bør kun overvejes, når resultaterne af en sådan test med overvejende sandsynlighed ventes at få direkte relevans for beskyttelsen af menneskers sundhed (3), og der skal gives en begrundelse i forsøgsrapporten. I tilfælde af potentielt eksplosive testkemikalier skal der udvises forsigtighed for at undgå forhold, der kan fremkalde eksplosion. For at undgå unødvendig brug af dyr bør et testforsøg gennemføres uden dyr inden grænsetesten, så det sikres, at betingelserne i kammeret for en grænsetest kan opnås.

31.

Hvis der observeres mortalitet eller døende tilstand ved grænsekoncentrationen, kan resultaterne af grænsetesten bruges som et forforsøg med henblik på yderligere test ved andre koncentrationer (se hovedforsøg). Hvis et testkemikalies fysiske eller kemiske egenskaber gør det umuligt at opnå en grænsekoncentration, testes den højest opnåelige koncentration. Hvis mindre end 50 % letalitet forekommer ved den højest opnåelige koncentration, er yderligere test ikke nødvendig. Hvis grænsekoncentrationen ikke kan opnås, gives en forklaring og understøttende data i forsøgsrapporten. Hvis den højest opnåelige koncentration af en damp ikke fremkalder toksicitet, skal testkemikaliet muligvis genereres som en flydende aerosol.

32.

Et hovedforsøg udføres typisk med fem hanner og fem hunner (eller 5 dyr af det mest modtagelige køn, hvis det kendes) pr. koncentrationsniveau med mindst tre koncentrationsniveauer. Der skal bruges tilstrækkelige koncentrationsniveauer til at opnå en robust statistisk analyse. Tidsintervallet mellem eksponeringsgrupperne bestemmes ud fra de toksiske symptomers indsætten, varighed og sværhed. Eksponering af dyrene ved det næste koncentrationsniveau udsættes, indtil der er rimelig sikkerhed for, at de tidligere testede dyr vil overleve. Det giver forsøgslederen mulighed for at justere målkoncentrationen for den næste eksponeringsgruppe. Som følge af afhængigheden af avancerede teknologier er dette ikke altid praktisk muligt i inhalationsforsøg, og derfor bør eksponeringen af dyr ved det næste koncentrationsniveau baseres på tidligere erfaring og videnskabelig vurdering. GD 39 (2) bør anvendes ved test af blandinger.

33.

Et trinvist C × t-forsøg kan overvejes som alternativ til en traditionel protokol ved vurdering af inhalationstoksicitet (12) (13) (14). Denne fremgangsmåde gør det muligt at eksponere dyr for et testkemikalie ved flere koncentrationsniveauer og i flere tidsrum. Alle test udføres i et kammer til eksponering gennem næsen (helkropskamre er ikke anvendelige i forbindelse med denne protokol). Et flowdiagram i tillæg 1 illustrerer denne protokol. En simuleringsanalyse har vist, at den traditionelle protokol og C × t-protokollen begge kan give robuste LC50-værdier, men C × t-protokollen er generelt bedre til at give robuste LC01- og LC10-værdier (15).

34.

En simuleringsanalyse har vist, at det generelt er tilstrækkeligt at anvende to dyr pr. C × t-interval (et pr. køn ved brug af begge køn eller to af det mest modtagelige køn), når der testes fire koncentrationer og fem eksponeringsvarigheder i et hovedforsøg. Under visse omstændigheder kan forsøgslederen vælge at bruge to rotter pr. køn pr. C × t-interval (15). Hvis der bruges to dyr pr. køn pr. koncentration og tidspunkt, kan det reducere bias og variabiliteten af estimaterne, øge succesraten for estimeringen og forbedre konfidensintervallet. I tilfælde af utilstrækkelig tilpasning til de data, der er brugt til estimeringen (ved brug af et dyr pr. køn eller to dyr af det mest modtagelige køn), kan en femte eksponeringskoncentration også være tilstrækkelig. Yderligere vejledning om det antal dyr og koncentrationer, der skal anvendes i et C × t-forsøg, findes i GD 39 (2).

35.

Et forforsøg bruges til at skønne testkemikaliets styrke og til at hjælpe med at vælge eksponeringskoncentrationer til hovedforsøget. Det kan være nødvendigt at udføre et forforsøg med op til tre dyr/køn/koncentration [se Appendix III i GD 39 (2)] for at vælge en hensigtsmæssig startkoncentration til hovedforsøget og minimere antallet af anvendte dyr. Der skal muligvis bruges tre dyr pr. køn for at fastslå en kønsbetinget forskel. Disse dyr bør eksponeres over én varighed, normalt 240 minutter. Muligheden for at skabe tilstrækkelige testatmosfærer bør vurderes i løbet af de tekniske forudgående test uden dyr. Det er generelt ikke nødvendigt at udføre et forforsøg, hvis mortalitetsdata er tilgængelige fra et B.52-forsøg (4). Når den indledende målkoncentration vælges i et B.2-forsøg, bør forsøgslederen overveje de mortalitetsmønstre, der er observeret i evt. tilgængelige B.52-forsøg (4) for begge køn og alle testede koncentrationer [se GD 39 (2)].

36.

Startkoncentrationen (eksponeringssession I) (tillæg 1) er enten en grænsekoncentration eller en koncentration, som forsøgslederen har valgt ud fra forforsøget. Grupper af ét dyr/køn eksponeres for denne koncentration i flere tidsrum (f.eks. 15, 30, 60, 120 eller 240 minutter), så i alt 10 dyr eksponeres (kaldes eksponeringssession I) (tillæg 1).

37.

Valget af grænsekoncentrationer afhænger normalt af lovgivningskrav. Når forordning (EF) nr. 1272/2008 anvendes, er grænsekoncentrationerne for gasser, dampe og aerosoler henholdsvis 20 000 ppm, 20 mg/l og 5 mg/l (eller den højest opnåelige koncentration) (3). Det kan være en teknisk udfordring at generere testkoncentrationer af visse testkemikalier, især som dampe og aerosoler. Ved test af aerosoler bør målet være at opnå en respirabel partikelstørrelse (dvs. en MMAD på 1-4 μm) ved en grænsekoncentration på 2 mg/l. Dette er muligt for de fleste testkemikalier. Test af aerosoler ved en koncentration på mere end 2 mg/l bør kun forsøges, hvis der kan opnås en respirabel partikelstørrelse [se GD 39 (2)]. I henhold til forordning (EF) nr. 1272/2008 bør test, der overstiger en grænsekoncentration, undgås af hensyn til dyrevelfærden (3). Test, der overstiger en grænsekoncentration, bør kun overvejes, når resultaterne af en sådan test med overvejende sandsynlighed ventes at få direkte relevans for beskyttelsen af menneskers sundhed (3), og der skal gives en begrundelse i forsøgsrapporten. I tilfælde af potentielt eksplosive testkemikalier skal der udvises forsigtighed for at undgå forhold, der kan fremkalde eksplosion. For at undgå unødvendig brug af dyr bør et testforsøg gennemføres uden dyr inden test ved startkoncentrationen, så det sikres, at betingelserne i kammeret for denne koncentration kan opnås.

38.

Hvis der observeres mortalitet eller døende tilstand ved startkoncentrationen, kan resultaterne ved denne koncentration bruges som udgangspunkt for yderligere test ved andre koncentrationer (se hovedforsøg). Hvis et testkemikalies fysiske eller kemiske egenskaber gør det umuligt at opnå en grænsekoncentration, testes den højest opnåelige koncentration. Hvis mindre end 50 % letalitet forekommer ved den højest opnåelige koncentration, er yderligere test ikke nødvendig. Hvis grænsekoncentrationen ikke kan opnås, gives en forklaring og understøttende data i forsøgsrapporten. Hvis den højest opnåelige koncentration af en damp ikke fremkalder toksicitet, skal testkemikaliet muligvis genereres som en flydende aerosol.

39.

Startkoncentrationen (eksponeringssession I) (tillæg 1), som testes i hovedforsøget, er enten en grænsekoncentration eller en koncentration, som forsøgslederen har valgt ud fra forforsøget. Hvis mortalitet er blevet observeret under eller efter eksponeringssession I, bruges den minimumseksponering (C × t), der resulterer i mortalitet, som rettesnor ved bestemmelsen af koncentrationen og eksponeringsperioderne til eksponeringssession II. Hver efterfølgende eksponeringssession afhænger af den forudgående session (se tillæg 1).

40.

For mange testkemikalier er de resultater, der fås ved startkoncentrationen kombineret med tre yderligere eksponeringssessioner med et mindre tidsinterval (dvs. den geometriske afstand mellem eksponeringsperioder som angivet af faktoren mellem successive perioder, generelt √2), tilstrækkelige til at bestemme C × t-mortalitetsforholdet (15), men det kan være en fordel af bruge en femte eksponeringskoncentration [se tillæg 1 og GD 39 (2)]. Oplysninger om den matematiske behandling af resultater til C × t-protokollen findes i tillæg 1.

41.

Dyrene bør hyppigt observeres klinisk i eksponeringsperioden. Efter eksponering bør kliniske observationer foretages mindst to gange på eksponeringsdagen eller hyppigere, hvis det begrundes af dyrenes respons på behandlingen, og derefter mindst én gang dagligt i sammenlagt 14 dage. Varigheden af observationsperioden er ikke fast, men bestemmes ud fra arten og tidspunktet for indtræden af kliniske tegn og varigheden af restitutionsperioden. Tidspunkterne for toksiske symptomers indsætten og forsvinden er vigtige, navnlig hvis der er tendens til forsinkede toksiske symptomer. Alle observationer registreres systematisk, og der føres individuel protokol for hvert dyr. Dyr, som findes at være døende, og dyr, som udviser svære smerter og/eller vedvarende tegn på svære lidelser, skal aflives humant af hensyn til dyrevelfærden. Stor omhu bør udvises ved undersøgelser for kliniske tegn på toksicitet for at sikre, at indledningsvist dårligt udseende og forbigående respirationsændringer, der er resultatet af selve eksponeringen, ikke forveksles med toksicitet relateret til testkemikaliet, som kræver tidlig aflivning af dyrene. De principper og kriterier, der er sammenfattet i Guidance Document on Humane Endpoints (GD 19), skal tages i betragtning (7). Når dyr aflives af humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet registreres så nøjagtigt som muligt.

42.

Observationer i burene skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slimhinder, respirationssystem, kredsløb, autonomt nervesystem og centralnervesystem samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Hvis det er muligt, registreres evt. sondring mellem lokale og systemiske virkninger. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, sløvhed, søvn og koma. Målingen af rektal temperatur kan dokumentere refleks-bradypnø eller hypo-/hypertermia relateret til behandling eller fangenskab.

43.

Det enkelte dyrs vægt registreres én gang i tilvænningsperioden, på eksponeringsdagen inden eksponeringen (dag 0) og mindst på dag 1, 3 og 7 (og derefter ugentligt), og den registreres på tidspunktet for død eller aflivning, hvis det indtræder efter dag 1. Kropsvægt anerkendes som en kritisk indikator for toksicitet, og dyr med et vedvarende vægttab på ≥ 20 % sammenlignet med vægten for forsøget, overvåges nøje. Overlevende dyr vejes og aflives humant ved afslutningen af perioden efter eksponering.

44.

Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller aflives og tages ud af forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes makroskopisk obduktion. Hvis makroskopisk obduktion ikke kan udføres umiddelbart efter opdagelsen af et dødt dyr, nedkøles (ikke fryses) dyret ved en temperatur, der er tilstrækkeligt lav til at minimere autolyse. Makroskopisk obduktion udføres så hurtigt som muligt, helst inden for en eller to dage. Alle makroskopiske patologiske forandringer registreres for hvert dyr med særligt fokus på forandringer i luftvejene.

45.

Yderligere undersøgelser, der på forhånd er medtaget som standard, kan overvejes for at udvide den fortolkningsmæssige værdi af undersøgelsen, f.eks. vejning af overlevende rotters lunger og tilvejebringelse af dokumentation for irritation ved hjælp af mikroskopisk undersøgelse af luftvejene. Undersøgte organer kan også omfatte organer, som udviser makroskopiske patologiske forandringer hos dyr, som overlever i 24 timer eller længere, og organer, som vides eller forventes at være påvirket. Mikroskopisk undersøgelse af hele luftvejene kan give nyttige informationer i forbindelse med testkemikalier, der reagerer med vand, f.eks. syrer og hygroskopiske testkemikalier.

46.

Der skal fremlægges data for de enkelte dyr om kropsvægt og obduktionsfund. For hver testgruppe opstilles i tabelform kliniske observationsdata om antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet samt obduktionsfund.

47.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er relevante:

(1)

OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(2)

OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39. Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(3)

Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006, EUT L 353 af 31.12.2008, s. 1.

(4)

Kapitel B.52 i dette bilag, Akut inhalationstoksicitet — Akut toksisitetsklassemetoden (ATC).

(5)

Kapitel B.40 i dette bilag, In vitro-hudætsning: måling af transkutan elektrisk modstand (TER).

(6)

Kapitel B.40.A i dette bilag, In vitro-hudætsning: test med human hudmodel.

(7)

OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(8)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition. Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(9)

SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.

(10)

Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.

(11)

Pauluhn J og Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.

(12)

Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.

(13)

Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.

(14)

Ten Berge WF og Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.

(15)

OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104. Paris. Findes på: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(16)

Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.

1.

Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline 407 (2008). Den oprindelige Test Guideline 407 blev vedtaget i 1981. I 1995 blev en revideret udgave vedtaget med henblik på at indhente flere informationer fra de anvendte forsøgsdyr, navnlig om neurotoksicitet og immunotoksicitet.

2.

I 1998 indledte OECD en højtprioriteret aktivitet, der havde til formål at revidere de eksisterende Test Guidelines og udvikle nye Test Guidelines for screening og test af potentielle hormonforstyrrende stoffer (8). Et element af denne aktivitet var at opdatere de eksisterende OECD-retningslinjer for »toksicitet ved gentagen dosering (28 dage, oral) hos gnavere« (TG 407) med parametre, der kunne bruges til at påvise testkemikaliers hormonforstyrrende aktiviteter. Denne fremgangsmåde blev underkastet et omfattende internationalt program, som omfattede test af relevansen og anvendeligheden af de yderligere parametre, disse parametres effektivitet for kemikalier med (anti)østrogen, (anti)androgen og (anti)thyreoid aktivitet samt reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier og de nye parametres interferens med de parametre, der krævedes i henhold til den tidligere TG 407. Den store datamængde, der blev indhentet herved, er samlet og evalueret i detaljer i en omfattende OECD-rapport (9). Denne opdaterede testmetode B.7 (svarende til TG 407) er resultatet af de erfaringer og resultater, der er opnået i løbet af det internationale testprogram. Denne testmetode gør det muligt at placere visse virkninger fremkaldt af hormonforstyrrende stoffer i sammenhæng med andre toksiske virkninger.

3.

Efter at en akut toksicitetstest er udført med henblik på primær vurdering af et kemisk stofs toksicitet, kan man udføre en oral toksicitetstest, hvor man anvender gentagne doser til bestemmelse og evaluering af stoffets toksiske egenskaber. Denne testmetode har til formål at undersøge virkningerne på en meget bred vifte af potentielle mål for toksicitet. Den skaffer viden om mulige trusler mod sundheden, som kan opstå ved gentagen eksponering i en relativt begrænset periode, herunder virkninger på nervesystemet, immunsystemet og det endokrine system. Med hensyn til disse effektparametre tager metoden sigte på at identificere kemikalier med neurotoksisk potentiale, som i givet fald bør undersøges nøjere, og kemikalier, der påvirker skjoldbruskkirtlens fysiologi. Den kan også tilvejebringe data om kemikalier, der påvirker mandlige og/eller kvindelige kønsorganer hos unge voksne dyr, og kan give en indikation af de immunologiske effekter.

4.

Resultaterne af denne testmetode B.7 bør anvendes til fareidentifikation og risikovurdering. De resultater, der fås ved hjælp af de endokrinrelaterede parametre, bør ses i sammenhæng med »OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals« (11). Metoden omfatter det grundlæggende forsøg vedrørende toksicitet ved gentagen dosering, der kan bruges til kemikalier, for hvilke et 90-dages forsøg ikke er berettiget (f.eks. når produktionsmængden ikke overstiger visse grænser), eller som et forforsøg forud for et langtidsforsøg. Eksponeringsvarigheden bør være 28 dage.

5.

Det internationale program, der blev gennemført med henblik på at validere parametre, der kan bruges til at påvise et testkemikalies potentielle hormonforstyrrende aktivitet, viste, at kvaliteten af de data, der indhentes ved hjælp af denne testmetode B.7, i høj grad afhænger af testlaboratoriets erfaring. Dette gælder specifikt for den histopatologiske bestemmelse af cykliske forandringer i de kvindelige kønsorganer og for bestemmelsen af vægten af de små hormonafhængige organer, der er vanskelige at dissekere. Der er udarbejdet vejledning om histopatologi (19). Den findes på OECD's offentlige websted for »Test Guidelines«. Den har til formål at hjælpe patologer i deres undersøgelser og øge testens sensitivitet. En lang række parametre blev vurderet at være indikative for endokrinrelateret toksicitet og er medtaget i testmetoden. Parametre, for hvilke der ikke forelå tilstrækkelige data til at påvise anvendelighed, eller som kun gav svage beviser i valideringsprogrammet på deres evne til at hjælpe med at påvise hormonforstyrrende stoffer, foreslås som valgfrie effektparametre (se tillæg 2).

6.

På grundlag af data genereret i valideringsprocessen skal det understreges, at testens sensitivitet ikke er tilstrækkelig til at identificere alle stoffer med (anti)androgene eller (anti)østrogene virkemåder (9). Testen anvendes ikke i en livsfase, der er mest sensitiv over for hormonforstyrrelser. Ved hjælp af testmetoden blev der dog i løbet af valideringsprocesserne identificeret stoffer, som svagt og stærkt påvirker skjoldbruskkirtlens funktion, og stærkt og moderat hormonforstyrrende stoffer, der virker gennem østrogene eller androgene receptorer, men i de fleste tilfælde blev der ikke identificeret hormonforstyrrende stoffer, som svagt påvirker østrogene eller androgene receptorer. Den kan derfor ikke beskrives som en test til screening af hormonforstyrrende aktivitet.

7.

Manglen på virkninger med tilknytning til disse virkemåder kan derfor ikke antages at være bevis for manglende virkning på det endokrine system. Hvad angår virkninger fremkaldt af hormonforstyrrende stoffer, bør stofkarakterisering derfor ikke alene baseres på resultaterne af denne testmetode, men bør anvendes i en »weight of evidence«-tilgang, der bruger alle eksisterende data om et kemikalie til at karakterisere potentiel hormonforstyrrende aktivitet. Myndigheders afgørelser vedrørende hormonforstyrrende aktivitet (stofkarakterisering) bør derfor baseres på en bred tilgang og ikke alene resultaterne af anvendelsen af denne testmetode.

8.

Det anerkendes, at alle dyreforsøg skal overholde lokale standarder for dyrepleje. De anførte beskrivelser af pleje og behandling er minimumsstandarder og tilsidesættes af evt. strengere lokale bestemmelser. Nærmere anvisninger i human behandling af dyr findes i OECD (14).

9.

De anvendte definitioner er anført i tillæg 1.

10.

Testkemikaliet administreres oralt dagligt i forskellige doser til forskellige grupper af forsøgsdyr, idet hver gruppe får en bestemt dosis i en periode på 28 dage. I eksponeringsperioden observeres dyrene hver dag omhyggeligt for tegn på toksicitet. Dyr, der dør eller aflives under forsøget, obduceres, og de overlevende dyr aflives og obduceres ved forsøgets afslutning. Et 28-dages forsøg tilvejebringer informationer om virkningerne af gentagen oral eksponering og kan angive behovet for yderligere forsøg med længere varighed. Det kan også give informationer om, hvilke koncentrationer der skal vælges til forsøg med længere varighed. Data, der udledes ved hjælp af testmetoden, bør kunne anvendes til at karakterisere testkemikaliets toksicitet, indikere dosis-responsforholdet og bestemme det laveste dosisniveau (NOAEL).

11.

Rotten er den foretrukne gnaverart, selv om andre gnaverarter kan anvendes. Hvis de parametre, der er anført i denne testmetode B.7, undersøges hos andre gnaverarter, gives en detaljeret begrundelse. Selv om det er biologisk plausibelt, at andre arter reagerer på giftstoffer på næsten samme måde som rotter, kan brugen af mindre arter resultere i øget variabilitet som følge af de tekniske udfordringer, der er forbundet med dissekering af små organer. I det internationale valideringsprogram til påvisning af hormonforstyrrende stoffer var rotter den eneste anvendte art. Der anvendes unge raske dyr af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. Doseringen bør begynde snarest muligt efter fravænning, og i hvert fald før dyrene er ni uger gamle. Ved forsøgets begyndelse bør den indbyrdes vægtforskel være minimal og ikke overstige ± 20 % af gennemsnittet for hvert køn. Hvis et forsøg med gentagen oral dosis gennemføres som et forforsøg forud for et langtidsforsøg, bør der så vidt muligt anvendes dyr fra samme stamme og herkomst i begge forsøg.

12.

Alle fremgangsmåder skal overholde lokale standarder for pleje af forsøgsdyr. Temperaturen i forsøgslokalet skal være 22 oC (± 3 oC). Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke være over 70 %, hvilket dog ikke gælder under rengøring af lokalet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. Ved valg af foder kan der tages hensyn til nødvendigheden af at sikre passende iblanding af testkemikaliet, når denne administrationsmåde anvendes. Dyrene bør anbringes i bure med små grupper af samme køn. Dyrene kan anbringes enkeltvis, hvis det er videnskabeligt begrundet. Hvis flere dyr anbringes i samme bur, bør der højst være fem dyr pr. bur.

13.

Foderet analyseres regelmæssigt for forurenende stoffer. En prøve af foderet opbevares, indtil rapporten er udarbejdet.

14.

Der udvælges tilfældigt sunde unge voksne dyr til kontrol- og behandlingsgruppen. Burene bør anbringes på en sådan måde, at deres placering får mindst mulig indvirkning. Dyrene identificeres entydigt og holdes i deres bure i mindst fem dage, inden behandlingsforsøget påbegyndes, så de tilvænnes laboratorieforholdene.

15.

Testkemikaliet indgives gennem sonde eller i føden eller drikkevandet. Den orale administrationsmetode afhænger af forsøgets formål og testkemikaliets fysiske/kemiske/toksikokinetiske egenskaber.

16.

Om nødvendigt opløses eller opslæmmes testkemikaliet i et egnet vehikel. Det anbefales, at man som første valg vurderer muligheden af at benytte en vandig opløsning/suspension, derefter en opløsning/suspension i olie (f.eks. majsolie), og først derefter eventuel opløsning i andre vehikler. For andre midler end vand bør de toksiske egenskaber kendes. Testkemikaliets stabilitet i vehiklet skal bestemmes.

17.

Der anvendes mindst 10 dyr (5 hunner og 5 hanner) ved hvert dosisniveau. Hvis der påregnes aflivning af dyr under forsøget, bør det oprindelige antal forøges med det antal dyr, man påregner at aflive i løbet af forsøget. Det kan overvejes at udsætte en yderligere satellitgruppe på 10 dyr (5 af hvert køn) i kontrolgruppen og i gruppen med den højeste dosis, således at man kan observere evt. reversibilitet, persistens eller forsinket indtræden af toksicitet i mindst 14 dage efter behandlingen.

18.

Generelt skal der anvendes mindst tre testgrupper og en kontrolgruppe, men hvis andre data ikke giver anledning til at forvente virkning af en dosis på 1 000 mg/kg kropsvægt/dag, kan en grænsetest udføres. Foreligger der ikke passende data, kan der udføres et dosisbestemmende forsøg (»range finding«) (dyr af samme stamme og herkomst) til bestemmelse af de doser, der skal anvendes. Bortset fra behandling med testkemikaliet skal dyrene i kontrolgruppen håndteres på samme måde som dyrene i testgrupperne. Hvis der anvendes et vehikel, doseres kontrolgruppen med samme mængde vehikel som den gruppe, der modtager den højeste dosis.

19.

Dosisniveauerne udvælges under hensyntagen til eventuelle foreliggende data om testkemikaliet eller beslægtede kemikaliers toksicitet og (toksiko)kinetik. Den højeste dosis vælges med henblik på fremkaldelse af toksiske effekter, men ikke død eller alvorlig lidelse. Normalt vælges en faldende række dosisniveauer til påvisning af eventuelt dosisafhængigt respons og niveau, hvor skadelige effekter ikke kan observeres ved det laveste dosisniveau (NOAEL). Det optimale interval mellem to doser er ofte en faktor på 2-4, og tilføjelse af en fjerde forsøgsgruppe er ofte at foretrække frem for anvendelse af meget store intervaller (f.eks. mere end en faktor på 10) mellem dosisniveauerne.

20.

Hvis der observeres generel toksicitet (f.eks. reduceret kropsvægt, virkninger på lever, hjerte, lunger eller nyrer osv.) eller andre forandringer, der eventuelt ikke er toksiske virkninger (f.eks. reduceret indtagelse af føde eller forstørret lever), bør de observerede virkninger på de immonologiske, neurologiske eller endokrine effektparametre fortolkes med forsigtighed.

21.

Hvis en test med et dosisniveau på mindst 1 000 mg/kg kropsvægt/dag eller, ved administration gennem foder eller drikkevand, en tilsvarende procentdel i foderet eller drikkevandet (baseret på bestemmelse af kropsvægten), udført efter nedenstående fremgangsmåde, ikke fremkalder erkendbare toksiske virkninger, og hvis der ikke på grundlag af data fra strukturelt beslægtede stoffer kan ventes toksiske virkninger, kan et fuldstændigt forsøg med anvendelse af tre dosisniveauer betragtes som unødvendigt. Grænsetesten er kun relevant, hvis human eksponering indicerer, at der er behov for anvendelse af et højere dosisniveau.

22.

Dyrene får testkemikaliet syv gange ugentlig hver uge i 28 dage. Hvis testkemikaliet indgives med sonde, skal det gøres i en enkelt dosis, med anvendelse af en mavesonde eller et passende intubationsrør. Den maksimale væskemængde, som kan administreres ad gangen, afhænger af forsøgsdyrets størrelse. Dette volumen må højst være 1 ml/100 g kropsvægt, bortset fra vandige opløsninger, af hvilke der kan anvendes 2 ml/100 g kropsvægt. Bortset fra lokalirriterende eller ætsende stoffer, hvis effekt sædvanligvis forstærkes ved højere koncentration, skal variation af testvolumenet minimeres ved at justere koncentrationen, så volumenet er konstant ved alle dosisniveauer.

23.

For testkemikalier, som administreres i foderet eller drikkevandet, er det vigtigt at sikre, at det pågældende testkemikalie i den anvendte mængde ikke griber ind i den normale ernærings- eller vandbalance. Ved administration af testkemikaliet i foderet kan det enten gives ved konstant koncentration i foderet (ppm) eller ved et konstant dosisniveau i forhold til dyrets kropsvægt; den anvendte mulighed skal specificeres. Ved administration med sonde skal dosis gives på tilsvarende tidspunkt hver dag og efter behov justeres, så dosisniveauet holdes konstant i forhold til kropsvægten. Hvis et forsøg med gentagen dosis anvendes som et forforsøg forud for et langtidsforsøg, bør foderet være det samme i begge forsøg.

24.

Observationsperioden varer 28 dage. En eventuel satellitgruppe beregnet til opfølgningsobservationer holdes i mindst 14 dage uden indgift af testkemikalie, således at det kan registreres, om der er forsinkede, vedvarende eller reversible toksiske virkninger.

25.

Der foretages generelle kliniske observationer mindst én gang om dagen, om muligt på det eller de samme tidspunkter hver dag og under hensyntagen til, hvornår de forventede virkninger efter dosering er stærkest. Dyrenes sundhedstilstand registreres. Dyrene observeres for morbiditet og mortalitet mindst to gange om dagen.

26.

Én gang før den første eksponering (med henblik på individbaserede sammenligninger) og mindst én gang om ugen derefter foretages der indgående kliniske observationer af alle dyrene. Med henblik på disse observationer tages dyrene ud af deres egne bure og anbringes i et standardindelukke. Observationerne udføres om muligt på samme tidspunkt hver gang. De skal noteres omhyggeligt, fortrinsvis ved anvendelse af et scoringssystem, eksplicit defineret af testlaboratoriet. Det er vigtigt at sikre, at testbetingelserne varierer minimalt, og at observationerne om muligt foretages af observatører, der ikke har kendskab til behandlingen. Observationerne bør bl.a. omfatte ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion, ekskretion og autonom aktivitet (f.eks. tåreflod, strittende hårlag, pupilstørrelse, usædvanligt respirationsmønster). Forandringer i gang, stilling og respons på håndtering såvel som tilstedeværelse af toniske og kloniske bevægelser, stereotypi (f.eks. overdreven pudsning, repetitive cirkelbevægelser) eller bizar opførsel (f.eks. selvmutilation, baglæns gang) skal også noteres (2).

27.

I den fjerde eksponeringsuge vurderes reaktiviteten over for sensoriske stimuli af forskellig art (2) (f.eks. auditive, visuelle og proprioceptive stimuli) (3) (4) (5), gribestyrke og motorisk aktivitet (7). Nærmere oplysninger om de fremgangsmåder, der kan benyttes, findes i de respektive referencer. Andre alternative fremgangsmåder end de refererede kan imidlertid anvendes.

28.

Funktionelle observationer i den fjerde eksponeringsuge kan udelades, hvis forsøget gennemføres som et forforsøg til et efterfølgende forsøg vedrørende subkronisk toksicitet (90 dage). I så fald medtages de funktionelle observationer i det opfølgende forsøg. På den anden side kan data vedrørende funktionelle observationer fra forsøget med gentagen dosis lette valget af dosisniveauer for et efterfølgende forsøg vedrørende subkronisk toksicitet.

29.

Undtagelsesvis kan funktionsundersøgelser udelades på grupper, der på anden vis viser tegn på toksicitet i en grad, der vil have afgørende indflydelse på funktionsundersøgelserne.

30.

Ved obduktion kan brunstcyklus for alle hundyr bestemmes (frivilligt) ved at tage vaginalt smear. Disse observationer skaffer viden om brunstcyklusfasen på aflivningstidspunktet og bidrager til den histologiske evaluering af østrogenfølsomt væv [se vejledning om histopatologi (19)].

31.

Alle dyr skal vejes mindst én gang ugentlig. Mængden af foderindtagelse skal beregnes mindst én gang ugentlig. Hvis testkemikaliet administreres via drikkevandet, skal vandindtagelsen beregnes mindst én gang ugentlig.

32.

Følgende hæmatologiske undersøgelser foretages ved forsøgsperiodens afslutning: hæmatokrit, hæmoglobinkoncentration, erythrocyttælling, retikulocyttælling, total og differential leucocyttælling, blodpladetælling og en måling af koaguleringsevne/tid. Andre analyser, som bør udføres, hvis testkemikaliet eller dets putative metabolitter har eller mistænkes at have oxiderende egenskaber, omfatter methæmoglobinkoncentration og Heinz-legemer.

33.

Der tages blodprøver fra et bestemt, angivet sted, lige inden eller i forbindelse med aflivning af dyrene; prøverne opbevares under passende betingelser. Dyrene skal være fastende inden aflivning (7).

34.

Klinisk-biokemiske bestemmelser med henblik på undersøgelse af vigtige toksiske virkninger i væv, og navnlig i nyrer og lever, foretages med blodprøver, der udtages fra alle dyr lige inden eller i forbindelse med dyrenes aflivning (bortset fra dem, der er fundet døende, og/eller som er aflivet under forsøget). Undersøgelser af plasma eller serum skal omfatte natrium, kalium, glukose, total kolesterol, urinstof, kreatinin, total protein og albumin, mindst to enzymer, hvis forekomst kan være tegn på hepatocellulære effekter (f.eks. alanin-aminotransferase, aspartat-aminotransferase, alkalisk fosfatase, γ-glutamyltranspeptidase og glutamat-dehydrogenase), og galdesyrer. Målinger af yderligere enzymer (fra lever eller andre organer) og bilirubin kan under visse omstændigheder give nyttige oplysninger.

35.

Følgende urinanalyser kan eventuelt udføres i forsøgets sidste uge til bestemmelse af: udseende, volumen, osmolalitet eller specifik vægtfylde, pH, protein, glukose og blod/blodceller.

36.

Yderligere bør man overveje at måle plasma- eller serummarkører for generel vævsskade. Andre bestemmelser, der bør foretages, hvis testkemikaliets kendte egenskaber kan eller forventes at kunne indvirke på tilsvarende metaboliske funktioner, omfatter kalcium, fosfat, triglycerider, visse hormoner og cholinesterase. Disse bør måles i forbindelse med kemikalier af særlige typer eller fra tilfælde til tilfælde.

37.

Selv om der i den internationale evaluering af de endokrinrelaterede effektparametre ikke blev påvist en klar fordel med henblik på bestemmelse af thyreoideahormoner (T3 og T4) og TSH, kan det være nyttigt at opbevare plasma- eller serumprøver for at måle T3, T4 og TSH (frivillig), hvis der er tegn på en virkning på hypofyse-thyroidea-aksen. Disse prøver kan opbevares nedfrosne ved – 20 °C. Følgende faktorer kan påvirke variabiliteten og de absolutte koncentrationer af hormonanalyserne:

Definitiv identifikation af thyroidea-aktive kemikalier baseret på histopatologisk analyse er mere pålidelig end analyse baseret på hormonniveauer.

38.

Plasmaprøver, der specifikt er beregnet til hormonanalyse, tages på et tilsvarende tidspunkt på dagen. Det anbefales, at T3-, T4- og TSH-analyser overvejes i tilfælde af ændringer af histologi for thyroidea. De numeriske værdier, der fås ved analyse af hormonkoncentrationer, varierer ved anvendelse af forskellige analysesæt på markedet. Det betyder, at der muligvis ikke kan opstilles effektivitetskriterier baseret på ensartede historiske data. Alternativet bør laboratorierne tilstræbe at holde variationskoefficienterne til kontrol under 25 for T3 og T4 og under 35 for TSH. Alle koncentrationer registreres i ng/ml.

39.

Hvis der ikke foreligger passende data fra tidligere forsøg, bør det overvejes at bestemme hæmatologiske og klinisk-biokemiske variable, inden eksponering påbegyndes, eller så vidt muligt hos en gruppe dyr, der ikke er med i forsøgsgrupperne.

40.

Alle dyr, som indgår i forsøget, skal have udført en fuldstændig, detaljeret makroskopisk obduktion, hvilket inkluderer omhyggelig undersøgelse af alle overflader, alle åbninger, og kraniets, brystkassens og abdomens kaviteter og deres indhold. Lever, nyrer, binyrer, testikler, bitestikler, prostata og vesiculae seminales med prostata anterior (coagulating glands) (som én samlet enhed), thymus, milt, hjerne og hjerte skal på alle dyr renses for andet vedhængende væv som behørigt (undtaget er de dyr, der findes døende og/eller aflives undervejs i forsøget) og vejes snarest muligt efter dissektionen for at undgå udtørring. Forsigtighed skal udvises ved trimming af prostata for at undgå punktering af de væskefyldte vesiculae seminales. Alternativt kan vesiculae seminales og prostata trimmes og vejes efter fiksering.

41.

To andre væv kan også vejes snarest muligt efter dissektionen for at undgå udtørring: ovarier (vådvægt) og uterus med cervix (vejledning om udtagning og forberedelse af uterusvæv med henblik på vejning findes i OECD TG 440 (18)).

42.

Skjoldbruskkirtlens vægt (frivillig) bestemmes efter fiksering. Trimming bør også foretages omhyggeligt og først efter fiksering for at undgå beskadigelse af vævet. Beskadiget væv kan kompromittere den histopatologiske analyse.

43.

Følgende væv skal præserveres ved hjælp af det mest passende fikseringsmiddel både med henblik på vævstypen og den følgende histopatologiske undersøgelse (se afsnit 47): alle makroskopiske læsioner, hjerne (repræsentative regioner, herunder cerebrum, cerebellum og pons), rygmarv, øjne, mavesæk, tyktarm og tyndtarm (herunder Peyerpletter), lever, nyrer, binyrer, milt, hjerte, thymus, skjoldbruskkirtel, spiserør og lunger (præserveret ved oppumpning med fikseringsmiddel og efterfølgende immersion), gonader (testikler og æggestokke), sekundære kønsorganer (uterus med cervix, bitestikler, prostata og vesiculae seminales med prostata anterior (coagulating glands), vagina, urinblære, lymfeknuder [ud over den nærmeste drænende lymfeknude bør en anden lymfeknude udtages på baggrund af laboratoriets erfaring (15)], perifer nerve (ischias- eller tibianerven), om muligt tæt på musklen, skeletmuskel og knogle med knoglemarv (afsnit eller som alternativt et nyligt præpareret knoglemarvsaspirat). Det anbefales, at testikler fikseres ved immersion i Bouins eller modificeret Davidsons fikseringsmiddel (16) (17). Tunica albuginea punkteres forsigtigt og overfladisk i begge ender af organet med en kanyle, der muliggør hurtig penetration af fikseringsmidlet. Kliniske og andre fund kan foranledige undersøgelse af andet væv. Også særlige organer, der sandsynligvis kan være mål for testkemikaliets kendte virkninger, bør præserveres.

44.

Følgende væv kan give værdifulde indikationer på endokrinrelaterede virkninger: gonader (testikler og æggestokke), sekundære kønsorganer (uterus med cervix, bitestikler, vesiculae seminales med prostata anterior (coagulating glands), dorsolateral og ventral prostata), vagina, hypofyse, brystkirtler fra handyr, skjoldbruskkirtel og binyrer. Forandringer i brystkirtler fra handyr er ikke tilstrækkeligt dokumenteret, men denne parameter kan være meget sensitiv over for stoffer med østrogen virkemåde. Observation af organer/væv, der ikke er anført i afsnit 43, er frivillig (se tillæg 2).

45.

I vejledningen om histopatologi (19) findes der flere oplysninger om dissekering, fiksering, udtagning af snit og histopatologisk undersøgelse af endokrine væv.

46.

I det internationale testprogram blev der fremskaffet dokumentation for, at små hormonforstyrrende virkninger af kemikalier med ringe evne til at påvirke homeostase for kønshormoner kan identificeres ud fra forstyrrelse af synkroniseringen af brunstcyklussen i forskellige væv og ikke i så høj grad ud fra direkte histopatologiske forandringer i hundyrenes kønsorganer. Selv om der ikke blev fremskaffet definitivt bevis for sådanne virkninger, anbefales det, at bevis for mulig asynkronicitet i brunstcyklussen tages i betragtning ved fortolkningen af histopatologiske undersøgelser af æggestokke (follikulære celler og theca-granulosaceller), uterus, cervix og vagina. Cyklusfasen bestemt ved vaginalt smear kan, hvis den vurderes, også medtages i denne sammenligning.

47.

En komplet histopatologisk undersøgelse skal udføres af de præserverede organer og væv på alle dyrene i kontrol- og højdosisgrupperne. Undersøgelserne skal omfatte alle dyrene i de andre grupper, også hvis der observeres ændringer i højdosisgruppen, der kan tilskrives belastningen.

48.

Alle makroskopiske læsioner undersøges.

49.

Hvis der anvendes en satellitgruppe, skal der på dyrene i denne gruppe udføres histopatologisk undersøgelse af væv og organer, på hvilke der var vist ændringer i behandlingsgruppen.

50.

Der skal fremlægges data for de enkelte dyr. Yderligere skal alle data opsummeres i tabeller, der for hver testgruppe viser antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr fundne døde i løbet af testen eller aflivede af humane grunde og tidspunktet for deres død, det antal dyr, der udviser tegn på toksicitet, en beskrivelse af disse tegn inklusive tidspunktet for deres begyndelse, deres varighed og toksicitetsgraden; det antal dyr, der har læsioner, typen af læsioner og den procentdel af dyrene, der udviser de forskellige typer af læsion.

51.

Når det er muligt, bedømmes resultaterne ved en egnet og almindeligt anerkendt statistisk metode. Sammenligninger af virkningen i et dosisinterval bruges til at undgå brugen af flere t-test. Valg af statistisk metode skal finde sted i forbindelse med fastlæggelsen af forsøgets design.

52.

Med henblik på kvalitetskontrol foreslås det, at historiske kontroldata indsamles, og at variationskoefficienter beregnes for numeriske data, især for parametre med relation til bestemmelse af hormonforstyrrende effekter. Disse data kan bruges i forbindelse med sammenligninger, når de faktiske forsøg evalueres.

53.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

(1)

OECD (Paris, 1992). Chairman's Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.

(2)

IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.

(3)

Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.

(4)

Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.

(5)

Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.

(6)

Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.

(7)

Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.

(8)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(9)

OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No. 59, ENV/JM/MONO(2006)26.

(10)

OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No. 21, ENV/JM/MONO(2002)8.

(11)

OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html

(12)

OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.

(13)

OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.

(14)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7.

(15)

Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.

(16)

Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. I: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE og Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, s. 52-85.

(17)

Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.

(18)

OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No.440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.

(19)

OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.

1.

Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline 412 (2009). Den oprindelige Test Guideline 412 (TG 412) for subakut toksicitet ved inhalation blev vedtaget i 1981 (1). Denne testmetode B.8 (som svarer til den reviderede TG 412) er blevet opdateret, så den afspejler det videnskabelige niveau og for at opfylde nuværende og fremtidige lovgivningskrav.

2.

Denne metode gør det muligt at karakterisere negative virkninger efter gentagen daglig inhalationseksponering for et testkemikalie i 28 dage. Data, der udledes af 28-dages forsøg med subakut toksicitet ved inhalation, kan bruges til kvantitative risikovurderinger [hvis de ikke efterfølges af et 90-dages forsøg med subkronisk toksicitet ved inhalation (kapitel B.29 i dette bilag)]. Dataene kan også give informationer om, hvilke koncentrationer der skal vælges til forsøg med længere varighed, f.eks. 90-dages forsøg med subakut toksicitet ved inhalation. Denne testmetode er ikke specifikt beregnet til test af nanomaterialer. De definitioner, der anvendes i forbindelse med denne testmetode, er anført i slutningen af dette kapitel og i Guidance Document 39 (2).

3.

Alle tilgængelige informationer om testkemikaliet bør overvejes af testlaboratoriet inden gennemførelsen af forsøget med henblik på at forbedre kvaliteten af forsøget og minimere omfanget af dyreforsøg. Informationer, der kan hjælpe med at vælge de mest hensigtsmæssige testkoncentrationer, omfatter testkemikaliets identitet, kemiske struktur og fysisk-kemiske egenskaber, resultater af in vitro- eller in vivo-toksicitetstest, forventede anvendelser og potentialet for human eksponering, tilgængelige (Q)SAR-data og toksikologiske data vedrørende strukturelt relaterede kemikalier samt data udledt af forsøg med akut toksicitet ved inhalation. Hvis neurotoksicitet forventes eller observeres i løbet af forsøget, kan forsøgslederen vælge at inkludere relevante evalueringer, som f.eks. FOB (Functional Observational Battery) og måling af motorisk aktivitet. Selv om tidspunkterne for eksponering kan være afgørende i forhold til de specifikke undersøgelser, må gennemførelsen af disse ekstra aktiviteter ikke påvirke det grundlæggende forsøgsdesign.

4.

Fortyndinger af ætsende eller irriterende testkemikalier kan testes ved koncentrationer, der giver den ønskede toksicitetsgrad [se GD 39 (2)]. Når dyr eksponeres for sådanne materialer, bør målkoncentrationerne være så lave, at de ikke medfører udtalt smerte og lidelse, men de bør alligevel være tilstrækkelige til at hæve koncentrations-responskurven til et niveau, der opfylder testens lovgivningsmæssige eller videnskabelige formål. Disse koncentrationer bør vælges i det enkelte tilfælde, fortrinsvis på grundlag af målrettede dosisbestemmende forsøg (»range finding«), der giver information om den kritiske effektparameter, irritationstærskel og tidspunkt for indtræden (se afsnit 11-13). Der gives en begrundelse for valget af koncentration.

5.

Dyr, som er døende, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant. Dyr, som er døende, betragtes på samme måde som dyr, der dør i løbet i forsøget. Kriterierne for aflivning af døende eller stærkt lidende dyr samt vejledning i at fastslå forudsigelig eller forestående død er genstand for en særskilt vejledning (OECD Guidance Document No. 19 on Humane Endpoints) (3).

6.

Der anvendes raske unge gnavere af sædvanligt benyttede laboratoriestammer. Rotten er det foretrukne forsøgsdyr. Begrundelse skal anføres, hvis der anvendes andre dyrearter.

7.

Hundyrene må ikke have født og må ikke være drægtige. På randomiseringsdagen bør dyrene være unge voksne, der er mellem syv og ni uger gamle. Deres kropsvægt bør være inden for ± 20 % af gennemsnitsvægten for hvert køn. Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres, og holdes i burene i mindst fem døgn forud for forsøgets start, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne.

8.

Dyrene identificeres individuelt med subkutane transpondere, hvis det er muligt, for at lette observationer og undgå forvirring. Temperaturen i forsøgsdyrrummet bør være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed bør være 30-70 %, selv om det muligvis ikke er muligt, hvis vand bruges som vehikel. Før og efter eksponering bør dyr generelt holdes i bur i grupper efter køn og koncentration, men antallet af dyr pr. bur må ikke bevirke, at det er vanskeligt at observere de enkelte dyr, og bør minimere tab som følge af kannibalisme og slagsmål. Hvis dyr alene eksponeres gennem næsen, skal de muligvis tilvænnes fastspændingsslanger. Disse slanger må ikke påføre dyrene unødig fysisk, termisk eller bevægelsesmæssig belastning. Fastspænding kan påvirke fysiologiske effektparametre, som f.eks. kropstemperatur (hypertermi) og/eller respiratorisk minutvolumen. Hvis der foreligger generiske data, som viser, at sådanne ændringer ikke forekommer i nævneværdigt omfang, er tilvænning til fastspændingsslangerne ikke nødvendig. Dyr, der med hele kroppen eksponeres for en aerosol, bør holdes i individuelle bure under eksponeringen for at undgå, at testaerosolen filtreres gennem pelsen på de andre dyr i buret. Der kan anvendes normalt og godkendt laboratoriefoder, dog ikke under eksponering, med ubegrænset forsyning af drikkevand. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke.

9.

Karakteren af testkemikaliet og formålet med testen bør overvejes ved valget af inhalationskammer. Den foretrukne eksponeringsform er gennem næsen (dette udtryk omfatter kun hoved, kun næse og kun snude). Eksponering gennem næsen foretrækkes generelt i forbindelse med test af flydende eller faste aerosoler og dampe, der kan kondensere og danne aerosoler. Særlige formål med testen kan bedre opfyldes ved eksponering af hele kroppen, men dette skal begrundes i testrapporten. For at sikre en stabil atmosfære, når der anvendes et kammer til hele kroppen, må forsøgsdyrenes totale volumen ikke overstige 5 % af kammerets volumen. Principperne for teknikkerne til eksponering gennem næsen eller eksponering af hele kroppen samt deres særlige fordele og ulemper er beskrevet i GD 39 (2).

10.

I modsætning til forsøg med akut toksicitet er der ingen definerede grænsekoncentrationer i 28-dages forsøg med subakut toksicitet ved inhalation. Den testede maksimumskoncentration baseres på: 1) den højest opnåelige koncentration, 2) »worst case« eksponeringsniveau for mennesker, 3) behovet for at sikre tilstrækkelig iltforsyning og/eller 4) hensyn til dyrevelfærd. Hvis der ikke foreligger databaserede grænser, kan de akutte grænser i forordning (EF) nr. 1272/2008 (13) anvendes (dvs. op til en maksimumskoncentration på 5 mg/l for aerosoler, 20 mg/l for dampe og 20 000 ppm for gasser); se GD 39 (2). Der gives en begrundelse, hvis det er nødvendigt at overskride disse grænser ved test af gasser eller meget flygtige testkemikalier (f.eks. kølemidler). Grænsekoncentrationen bør fremkalde klar toksicitet uden at forårsage unødig stress for dyrene eller påvirke deres levetid (3).

11.

Inden hovedforsøget påbegyndes, kan det være nødvendigt at udføre et dosisbestemmende forsøg (»range finding«). Et dosisbestemmende forsøg er mere omfattende end et forforsøg, fordi det ikke er begrænset til valg af koncentration. Viden, der opnås fra et dosisbestemmende forsøg, kan resultere i et vellykket hovedforsøg. Et dosisbestemmende forsøg kan f.eks. fremskaffe teknisk information om analysemetoder, partikelstørrelsesfordeling, opdagelse af toksiske mekanismer, klinisk patologi og histopatologiske data samt estimeringer af de mulige NOAEL- og MTC-koncentrationer i et hovedforsøg. Forsøgslederen kan vælge at bruge det dosisbestemmende forsøg til at identificere tærsklen for irritation af luftvejene (f.eks. ved hjælp af histopatologisk undersøgelse af luftvejene, lungefunktionstest eller bronchieskylning), den øvre koncentration, der tåles uden unødig belastning af dyrene, og de parametre, der bedst karakteriserer et testkemikalies toksicitet.

12.

Et dosisbestemmende forsøg kan omfatte et eller flere koncentrationsniveauer. Højst tre hanner og tre hunner bør eksponeres ved hvert koncentrationsniveau. Et dosisbestemmende forsøg bør vare mindst fem dage og generelt højst 14 dage. En begrundelse for valget af koncentrationer til hovedforsøget gives i forsøgsrapporten. Formålet med hovedforsøget er at påvise et forhold mellem koncentration-respons med udgangspunkt i det, der forventes at være den mest sensitive effektparameter. Den laveste koncentration bør ideelt være en NOAEL-koncentration, mens den højeste koncentration bør fremkalde klar toksicitet uden at forårsage unødig stress for dyrene eller påvirke deres levetid (3).

13.

Når koncentrationerne vælges til det dosisbestemmende forsøg, anvendes alle tilgængelige informationer, herunder data om forholdet mellem struktur og aktivitet og data vedrørende lignende kemikalier (se afsnit 3). Et dosisbestemmende forsøg kan bekræfte/afvise, hvad der betragtes som de mest sensitive mekanistisk baserede effektparametre, f.eks. organofosfaters hæmning af kolinesterasen, erythrocytotoksiske stoffers dannelse af methæmoglobin, thyreoideahormoner (T3, T4) for thyreotoksikanter, protein, eller neutrofiler i bronchieskylning for uskadelige svært opløselige partikler eller lungeirriterende aerosoler.

14.

Hovedforsøget vedrørende subakut toksicitet omfatter generelt tre koncentrationsniveauer og også en samtidig negativ kontrolgruppe (luft) og/eller vehikelgruppe, hvis det er nødvendigt (se afsnit 17). Alle tilgængelige data bør anvendes som hjælp til at vælge hensigtsmæssige eksponeringsniveauer, herunder resultaterne af systemiske toksicitetsforsøg, metabolisme og kinetik (der bør lægges særlig vægt på at undgå høje koncentrationsniveauer, der mætter kinetiske processer). Hver testgruppe består af mindst 10 gnavere (5 hanner og 5 hunner), der eksponeres for testkemikaliet i seks timer om dagen i fem dage om ugen i en periode på fire uger (samlet forsøgsvarighed på 28 dage). Dyr kan også eksponeres i syv dage om ugen (f.eks. ved test af inhalerede lægemidler). Hvis det vides, at det ene køn er mere modtageligt for et bestemt testkemikalie, kan kønnene eksponeres ved forskellige koncentrationsniveauer for at observere forholdet mellem koncentration-respons som beskrevet i afsnit 15. Hvis andre gnaverarter end rotter eksponeres gennem næsen, kan de maksimale eksponeringsvarigheder justeres for at minimere artsspecifikke lidelser. Der bør gives en begrundelse, når der anvendes en eksponeringsvarighed på mindre end 6 timer/dag, eller når det er nødvendigt at gennemføre et forsøg med langvarig helkropseksponering (f.eks. 22 timer/dag) [se GD 39 (2)]. Dyrene bør ikke fodres i eksponeringsperioden, medmindre eksponeringen varer længere end seks timer. Dyret skal have adgang til vand under helkropseksponering.

15.

De valgte målkoncentrationer bør identificere målorganet (-organerne) og påvise et klart forhold mellem koncentration og respons:

16.

Et satellitforsøg (reversibilitetsforsøg) kan bruges til at observere reversibilitet, persistens eller forsinket indtræden af toksicitet i mindst 14 dage efter behandlingen. Satellitgrupper består af fem hanner og fem hunner, der eksponeres samtidig med forsøgsdyrene i hovedforsøget. Satellitforsøgsgrupper bør eksponeres for testkemikaliet ved det højeste koncentrationsniveau, og der bør efter behov være samtidige luft- og/eller vehikelkontrolgrupper (se afsnit 17).

17.

Dyr i den samtidige negative (luft)kontrolgruppe bør behandles på samme måde som forsøgsdyrene, bortset fra at de eksponeres for filtreret luft i stedet for testkemikaliet. Hvis vand eller et andet stof bruges til at frembringe testatmosfæren, skal en vehikelkontrolgruppe inkluderes i forsøget i stedet for en negativ (luft)kontrolgruppe. Vand bør så vidt muligt anvendes som vehikel. Når vand bruges som vehikel, eksponeres kontroldyrene for luft med samme fugtighed som de eksponerede grupper. Valget af et hensigtsmæssigt vehikel baseres på et korrekt gennemført forforsøg eller historiske data. Hvis et vehikels toksicitet ikke er velkendt, kan forsøgslederen vælge at bruge en negativ (luft)kontrol og en vehikelkontrol, men det frarådes på det kraftigste. Hvis historiske data viser, at vehiklet er ikke-toksisk, er der ikke behov for en negativ (luft)kontrolgruppe, og der anvendes kun en vehikelkontrol. Hvis et forforsøg vedrørende et testkemikalie, der er formuleret i et vehikel, ikke påviser toksicitet, følger det, at vehiklet er ikke-toksisk ved den testede koncentration, og at denne vehikelkontrol bør anvendes.

18.

Dyr eksponeres for testkemikaliet i form af en gas, dampe, aerosoler eller en blanding heraf. Den fysiske tilstand, der skal testes, afhænger af testkemikaliets fysisk-kemiske egenskaber, den valgte koncentration og/eller den fysiske form, der højst sandsynligt vil være til stede under håndteringen og anvendelsen af testkemikaliet. Hygroskopiske og kemisk reaktive testkemikalier bør testes under tørre luftforhold. Der må ikke skabes eksplosive koncentrationer. Partikelformigt materiale kan underkastes mekaniske processer for at reducere partikelstørrelsen. Nærmere detaljer findes i GD 39 (2).

19.

Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for alle aerosoler og dampe, der kan kondensere og danne aerosoler. For at sikre, at alle relevante områder af luftvejene eksponeres, anbefales aerosoler med en massemedian af den aerodynamiske diameter (MMAD) i området fra 1 til 3 μm med en geometrisk standardafvigelse (σg) i området fra 1,5 til 3,0 (4). Der bør ydes en rimelig indsats for at overholde denne standard, men en ekspertvurdering gives, hvis det ikke er muligt. Partikler fra tungmetalrøg kan f.eks. være mindre end denne standard, og ladede partikler og fibre kan overstige den.

20.

Ideelt testes testkemikaliet uden et vehikel. Hvis det er nødvendigt at bruge et vehikel til at frembringe en passende koncentration og partikelstørrelse af testkemikaliet, bør der fortrinsvis anvendes vand. Når et testkemikalie er opløst i et vehikel, skal dets stabilitet påvises.

21.

Luftgennemstrømningen gennem eksponeringskammeret skal nøje kontrolleres, overvåges løbende og registreres mindst én gang i timen under eksponering. Realtidsovervågning af koncentrationen (eller den tidsmæssige stabilitet) i testatmosfæren indgår i målingen af alle dynamiske parametre og giver indirekte mulighed for at kontrollere alle relevante dynamiske parametre for inhalation. Hvis koncentrationen overvåges i realtid, kan frekvensen for måling af luftgennemstrømning reduceres til én måling pr. eksponering pr. dag. Genindånding i kamre til eksponering gennem næsen skal undgås. Iltkoncentrationen skal være mindst 19 %, og kuldioxidkoncentrationen må ikke overstige 1 %. Hvis der er grund til at antage, at denne standard ikke kan overholdes, skal ilt- og kuldioxidkoncentrationerne måles. Hvis målinger på den første eksponeringsdag viser, at disse gasser er på passende niveauer, kræves der ikke yderligere målinger.

22.

Kammerets temperatur skal være 22 ± 3 °C. Den relative fugtighed i dyrenes vejrtrækningszone skal ved eksponering gennem næsen og helkropseksponering overvåges og registreres hver time under eksponering, hvis det er muligt. Den relative fugtighed bør være 30-70 %, men dette er ikke altid muligt (f.eks. ved test af vandbaserede blandinger) eller kan ikke måles på grund af testkemikaliets indvirkning på testmetoden.

23.

Når det er muligt, bør den nominelle eksponeringskoncentration i kammeret beregnes og registreres. Den nominelle koncentration er massen af det genererede testkemikalie divideret med den samlede mængde luft, der passerer gennem inhalationskammersystemet. Den nominelle koncentration bruges ikke til at karakterisere dyrenes eksponering, men en sammenligning af den nominelle koncentration og den faktiske koncentration giver en indikation af testsystemets genereringseffektivitet og kan derfor bruges til at opdage eventuelle genereringsproblemer.

24.

Den faktiske koncentration er koncentrationen af testkemikaliet målt ved dyrenes vejrtrækningszone i et inhalationskammer. Faktiske koncentrationer kan bestemmes med specifikke metoder (f.eks. direkte prøveudtagning, adsorptive eller kemisk reaktive metoder og efterfølgende analytisk karakterisering) eller med ikke-specifikke metoder, som f.eks. gravimetrisk filteranalyse. Brugen af gravimetrisk analyse er kun acceptabel for pulverbaserede enkeltkomponent-aerosoler eller aerosoler af væsker med lav flygtighed og bør støttes af hensigtsmæssige testkemikaliespecifikke karakteriseringer udført før testen. Koncentrationen af pulverbaserede flerkomponent-aerosoler kan også bestemmes ved hjælp af gravimetrisk analyse. Det kræver dog analysedata, der viser, at det luftbårne materiales sammensætning svarer til udgangsmaterialet. Hvis denne information ikke er tilgængelig, kan det være nødvendigt at gentage analysen af testkemikaliet (ideelt i dets luftbårne tilstand) med regelmæssige intervaller i løbet af forsøget. For aerosoliserede stoffer, der kan fordampe eller sublimere, bør det påvises, at alle faser er indsamlet ved hjælp af den valgte metode.

25.

Der anvendes så vidt muligt én batch af testkemikaliet i hele forsøgets varighed, og prøven opbevares under forhold, der bevarer dens renhed, homogenitet og stabilitet. Inden forsøget påbegyndes, bør testkemikaliet karakteriseres, herunder dets renhed og, hvis det er teknisk muligt, identitet og mængde af identificerede kontaminanter og urenheder. Dette kan påvises ved hjælp af bl.a. følgende data: retentionstid og relativt topareal, molekylvægt fra massespektroskopi- eller gaskromatografianalyser eller andre vurderinger. Selv om testlaboratoriet ikke er ansvarligt for prøvens identitet, bør testlaboratoriet af hensyn til sikkerheden bekræfte rekvirentens karakterisering i hvert fald på en begrænset måde (f.eks. farve, fysisk form osv.).

26.

Eksponeringsatmosfæren skal være så konstant som praktisk muligt. Apparatur til realtidsovervågning, f.eks. et aerosolfotometer til måling af aerosoler eller en kulbrinteanalysator til dampe, kan bruges til at påvise eksponeringsbetingelsernes stabilitet. Den faktiske koncentration i kammeret måles mindst tre gange i løbet af hver eksponeringsdag for hvert eksponeringsniveau. Hvis det ikke er muligt på grund af begrænsede luftgennemstrømningshastigheder eller lave koncentrationer, kan én prøve pr. eksponeringsperiode accepteres. Ideelt udtages denne prøve over hele eksponeringsperioden. De enkelte prøver for koncentrationen i kammeret bør ikke afvige fra middelkoncentrationen i kammeret med mere end ± 10 % for gasser og dampe eller ± 20 % for flydende eller faste aerosoler. Tiden til ækvilibrering af kammer (t95) beregnes og registreres. Varigheden af en eksponering strækker sig over den tid, hvor testkemikaliet genereres. Det omfatter den tid, der kræves for at opnå ækvilibrering af kammeret (t95) og henfald. Vejledning i beregning af t95 findes i GD 39 (2).

27.

For meget komplekse blandinger, der består af gasser/dampe, og aerosoler (f.eks. forbrændingsatmosfærer og testkemikalier genereret af specialdrevne slutprodukter/-apparater), kan hver fase opføre sig forskelligt i et inhalationskammer. Der udvælges derfor mindst ét indikatorstof (analysand), normalt det primære aktivstof i blandingen, fra hver fase (gas/damp og aerosol). Hvis testkemikaliet er en blanding, rapporteres analysekoncentrationen for blandingen som helhed og ikke kun for det aktive stof eller indikatorstoffet (analysand). Yderligere oplysninger om faktiske koncentrationer findes i GD 39 (2).

28.

Aerosolers partikelstørrelsesfordeling bestemmes mindst ugentligt for hvert koncentrationsniveau ved hjælp af en kaskadeimpaktor eller et andet instrument, f.eks. et instrument til aerodynamisk partikelstørrelsesbestemmelse (APS). Hvis der kan påvises ækvivalens mellem de resultater, der er opnået ved hjælp af kaskadeimpaktoren eller et alternativt instrument, kan det alternative instrument bruges i hele forsøget.

29.

Et andet apparat, f.eks. et gravimetrisk filter eller en impinger/gas bubbler, anvendes parallelt med det primære instrument til at bekræfte det primære instruments opsamlingseffektivitet. Den massekoncentration, der fås ved hjælp af partikelstørrelsesanalysen, skal være inden for rimelige grænser af den massekoncentration, der fås ved hjælp af filteranalyse [se GD 39 (2)]. Hvis ækvivalens kan påvises ved alle de koncentrationer, der testes i forsøgets tidligere fase, kan yderligere bekræftelsesmålinger udelades. Af hensyn til dyrevelfærden træffes der foranstaltninger for at minimere inkonklusive data, der kan gøre det nødvendigt at gentage et forsøg.

30.

Bestemmelse af partikelstørrelse udføres for dampe, hvis der er mulighed for, at kondensering af dampe kan føre til dannelsen af en aerosol, eller hvis der konstateres partikler i en dampatmosfære med potentiale for blandede faser.

31.

Dyrene bør hyppigt observeres klinisk før, under og efter eksponeringsperioden. Hyppigere observationer kan være påkrævet afhængigt af dyrenes respons på eksponeringen. Hvis observation af dyrene hindres af fastspændingsslanger på dyrene, dårligt belyste helkropskamre eller uigennemsigtige atmosfærer, observeres dyrene omhyggeligt efter eksponering. Observationer inden næste dags eksponering kan omfatte vurdering af reversibilitet eller forværring af toksiske virkninger.

32.

Alle observationer registreres, og der føres individuel protokol for hvert dyr. Når dyr aflives af humane grunde eller findes døde, skal dødstidspunktet registreres så nøjagtigt som muligt.

33.

Observationer i burene skal omfatte forandringer i hud, pels, øjne og slimhinder, respirationssystem, kredsløb, autonomt nervesystem og centralnervesystem samt somatomotorisk aktivitet og adfærdsmønster. Man skal være opmærksom på, om der kan iagttages tremor, kramper, spytflåd, diarré, sløvhed, søvn og koma. Målingen af rektal temperatur kan dokumentere refleks-bradypnø eller hypo-/hypertermia relateret til behandling eller fangenskab. Forsøgsprotokollen kan omfatte yderligere vurderinger, f.eks. kinetik, bioovervågning, lungefunktion, retention af tungtopløselige stoffer, der akkumuleres i lungevæv, og adfærdsændringer.

34.

Det enkelte dyrs vægt registreres kort før den første eksponering (dag 0) og derefter to gange om ugen (f.eks. hver fredag og mandag for at påvise restitution i løbet af en eksponeringsfri weekend eller med et tidsinterval, der gør det muligt at vurdere systemisk toksicitet), og på døds- eller aflivningstidspunktet. Hvis der ikke er nogen virkninger i de første to uger, måles kropsvægten ugentligt i resten af forsøgsperioden. Hvis der anvendes satellitdyr (reversibilitet), vejes de ugentligt i hele restitutionsperioden. Ved forsøgets afslutning vejes alle dyr umiddelbart inden aflivning med henblik på at beregne forholdet mellem organ- og kropsvægt uden bias.

35.

Foderindtagelse måles ugentligt. Vandindtagelse kan også måles.

36.

Klinisk patologisk vurdering foretages for alle dyr, herunder kontrol- og satellitdyr (reversibilitet), når de aflives. Tidsintervallet med den sidste eksponering og blodtapning registreres, navnlig når den undersøgte effektparameter hurtigt rekonstitueres. Prøvetagning efter eksponering er indiceret for parametre med en kort plasmahalveringstid (f.eks. COHb, CHE og MetHb).

37.

I tabel 1 vises de kliniske patologiske parametre, der generelt kræves i forbindelse med alle toksikologiforsøg. Rutinemæssig urinanalyse er ikke påkrævet, medmindre den indiceres af forventede eller observerede toksiske virkninger. Forsøgslederen kan vælge at undersøge yderligere parametre med henblik på at opnå en bedre karakterisering af testkemikaliets toksicitet (f.eks. cholinesterase, lipider, hormoner, syre/basebalance, methæmoglobin eller Heinz-legemer, kreatinkinase, myeloid/erythroid-forhold, troponiner, arterielle blodgasser, lactat-dehydrogenase, sorbitol-dehydrogenase, glutamat-dehydrogenase og γ-glutamyltranspeptidase).

Tabel 1

Standardparametre for klinisk patologi

38.

Når der er bevis for, at de nedre luftveje (dvs. alveolerne) er det primære afsætnings- og retentionssted, kan bronchieskylning (BAL) anvendes til kvantitativt at analysere hypotesebaserede parametre for dosis/virkning med fokus på alveolitis, lungebetændelse og fosfolipidose. Det gør det muligt at undersøge forandringer i dosis/respons og tidsforløb i forbindelse med alveoleskader. BAL-væsken kan analyseres for total og differentieret leukocyttal, total protein og lactat-dehydrogenase. Andre parametre, der kan overvejes, er parametre, der indicerer lysosomale skader, fosfolipidose, fibrose og irritationsinflammation eller allergisk inflammation, som kan omfatte bestemmelse af pro-inflammatoriske cytokiner/kemokiner. BAL-målinger supplerer generelt resultaterne af histopatologiske undersøgelser, men kan ikke erstatte dem. Vejledning i udførelse af lungeskylning findes i GD 39 (2).

39.

Alle forsøgsdyr (herunder dem, der dør under forsøget eller tages ud af forsøget af dyrevelfærdsmæssige grunde) underkastes komplet exsanguination (hvis muligt) og makroskopisk obduktion. Tidsrummet mellem afslutningen på hvert dyrs sidste eksponering og dets aflivning registreres. Hvis obduktion ikke kan udføres umiddelbart efter opdagelsen af et dødt dyr, nedkøles (ikke fryses) dyret ved en temperatur, der er tilstrækkeligt lav til at minimere autolyse. Makroskopisk obduktion udføres så hurtigt som muligt, helst inden for en eller to dage. Alle makroskopiske patologiske forandringer registreres for hvert dyr med særligt fokus på forandringer i luftvejene.

40.

I tabel 2 vises de organer og væv, der skal præserveres i et passende medium under makroskopisk obduktion med henblik på mulig histopatologisk undersøgelse. Forsøgslederen afgør, om organer og væv i [kantet parentes] og andre organer og væv skal præserveres. Organer i fed trimmes og vejes i våd tilstand så hurtigt som muligt efter dissektionen for at undgå udtørring. Skjoldbruskkirtel og bitestikler bør kun vejes, hvis artefakter fra trimming kan hindre histopatologisk evaluering. Væv og organer fikseres i 10 % bufret formalin eller et andet egnet fikseringsmiddel, straks obduktion er udført, men højst 24-48 timer inden trimming afhængigt af det anvendte fikseringsmiddel.

Tabel 2

Organer og væv, der præserveres under makroskopisk obduktion

Binyrer

Knoglemarv (og/eller nyligt aspirat)

Hjerne (herunder udsnit af cerebrum, cerebellum og medulla/pons)

[Øjne (retina, synsnerve) og øjenlåg]

Hjerte

Nyrer

Larynx (3 niveauer, 1 niveau, som omfatter basis af strubelåget)

Lever

Lunge (alle lungelapper på et niveau, herunder hovedbronchier)

Lymfeknuder fra lungens hilum, navnlig ved tungtopløselige testkemikalier. Ved mere detaljerede undersøgelser og/eller forsøg med immunologisk fokus kan yderligere lymfeknuder overvejes, f.eks. lymfeknuder fra de mediastinale, cervikale/submandibulære og/eller aurikulære områder.

Nasopharyngeale væv (mindst niveauer; 1 niveau for at medtage nasopharyngeal kanalen og NALT (Nasal Associated Lymphoid Tissue)

Øsofagus

[Bulbus olfactorius]

Æggestokke

Vesiculae seminales

Rygmarv (cervikal, midt-torakal og lumbal)

Milt

Mavesæk

Testikler

Brisler

Skjoldbruskkirtlen

Spiserør (mindst 2 niveauer, herunder 1 længdesnit gennem carina og 1 tværsnit)

[Urinblære]

Uterus

Alle større læsioner

41.

Lunger udtages hele og intakte, vejes og behandles med et passende fikseringsmiddel ved et tryk på 20-30 cm vand for at sikre, at lungestrukturen bevares (5). Snit udtages for alle lapper på et niveau, herunder hovedbronchier, men hvis der udføres lungeskylning, udtages en ikkeskyllet lap på tre niveauer (ikke serielle snit).

42.

Mindst fire niveauer af nasopharyngealt væv undersøges, hvoraf det ene omfatter nasopharyngeal-kanalen (5, 6, 7, 8, 9), så der kan udføres en tilstrækkelig undersøgelse af pladeepitel, transitionelt epitel (respiratorisk uden cilier), respiratorisk epitel (respiratorisk med cilier) og lugteepitel samt drænende lymfevæv (NALT; 10, 11). Tre niveauer af larynx undersøges, og et af disse niveauer skal omfatte basis af strubelåget (12). Mindst to niveauer af luftrøret undersøges, herunder et længdesnit gennem carina i bifurkationen af de ekstrapulmonal bronchier og et tværsnit.

43.

Der foretages en histopatologisk evaluering af alle organer og væv, der er anført i tabel 2, for kontrolgruppen og gruppen med den højeste koncentration og for alle dyr, der dør eller aflives under forsøget. Særligt luftvejene, målorganerne og større læsioner skal undersøges. Organer og væv med læsioner i gruppen med den højeste koncentration undersøges i alle grupper. Forsøgslederen kan vælge at udføre histopatologiske evalueringer for yderligere grupper for at påvise et klart forhold mellem koncentration og respons. Hvis der anvendes en satellitgruppe (reversibilitet), skal der på dyrene i denne gruppe udføres histopatologisk evaluering af væv og organer, hvor der var vist ændringer i behandlingsgruppen. Hvis der er usædvanligt mange dyr, der dør tidligt, eller andre problemer i højeksponeringsgruppen, som kompromitterer signifikansen af data, foretages en histopatologisk undersøgelse af den næste lavere koncentration. Makroskopiske observationer korreleres så vidt muligt med mikroskopiske fund.

44.

Der skal fremlægges data for de enkelte dyr om kropsvægt, foderindtagelse, klinisk patologi, makroskopisk patologi, organvægt og histopatologi. For hver testgruppe opstilles i tabelform kliniske observationsdata om antal dyr ved forsøgets begyndelse, antal dyr, som viser tegn på toksisk virkning, antal dyr, som er fundet døde under forsøget eller aflivet af humanitære grunde, dødstidspunkt for de enkelte dyr, beskrivelse af toksiske virkninger og disses tidsmæssige forløb og reversibilitet samt obduktionsfund. Alle kvantitative og uventede resultater evalueres ved hjælp af en passende statistisk metode. Enhver generelt accepteret statistisk metode kan anvendes, og de statistiske metoder skal vælges under planlægningen af forsøget.

45.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger, når de er relevante: