BILAG I

(Artikel 1)

LISTE OVER REFERENCEMETODER

Indeks min. = minimum, maks. = maksimum, bilag = bilag til den nævnte forordning, FT = fedtfri tørstof, PI = peroxidindeks, U = udseende, S = smag, K = konsistens, SK = samlet kimindhold, ITB = indhold af termofile bakterier, MS = medlemsstat, IDF = Det Internationale Mejeriforbund, ISO = Den Internationale Standardiseringsorganisation, IUPAC = International Union of Pure and Applied Chemistry, ADPI = American Dairy Products Institute, SKM = sødet koncentreret mælk, IMF = inddampet mælk eller fløde.

DEL A

Kommissionens forordning	Produkt	Parameter	Grænse (1)	Referencemetode	Bemærkning
Forordning (EF) nr. 2771/1999 — Offentlig oplagring	Usaltet smør	Fedtstof	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vand	Maks. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FT	Maks. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Fedtsyrer	1,2 mmol/100 g fedtstof	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PI (maks.)	0,3 mækv. ilt/1 000 g fedtstof	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Bemærkning 1
		Coliforme bakterier	Ikke påviselige i 1 g	Bilag X	Bemærkning 3
		Andre fedtstoffer end mælkefedt	Ikke påviselige ved triglyceridanalyse	Bilag XX
		Sterolrøbestoffer	Ikke påviselige, β-sitosterol ≤ 40 mg/kg	Bilag VIII
		Andre røbestoffer
		— vanillin	Ikke påviseligt	Bilag VI
		— ethylester af karotinsyre	≤ 6 mg/kg	Bilag VII
		— triglycerider af enantiksyre	Ikke påviselige	Bilag V
		Organoleptiske egenskaber	Mindst 4 point af 5 for U, S og K	Bilag IV
		Vandfordeling	Mindst 4 point	ISO 7586:1985 — IDF 112A:1989
Forordning (EF) nr. 2771/1999 Privat oplagring	Usaltet smør	Fedtstof	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vand	Maks. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FT	Maks. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Forordning (EF) nr. 2771/1999 Privat oplagring	Saltet smør	Fedtstof	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vand	Maks. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FT (ekskl. salt)	Maks. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Salt	Maks. 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Forordning (EF) nr. 1898/2005 kapitel II	Usaltet smør	Fedtstof	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Andre fedtstoffer end mælkefedt		Bilag XX
		Vand	Maks. 16 % m/m	ISO 3727-1 2001|IDF 80-1:2001
		FT	Maks. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Røbestoffer:
		— steroler	Se bilag VIII	Bilag VIII
		— vanillin	Se bilag VI	Bilag VI
		— ethylester af karotinsyre	Se bilag VII	Bilag VII
		— triglycerider af enantiksyre	Se bilag V	Bilag V
Forordning (EF) nr. 1898/2005 kapitel II	Saltet smør	Fedtstof	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Andre fedtstoffer end mælkefedt		Bilag XX
		Vand	Maks. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FT (ekskl. salt)	Maks. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Salt	Maks. 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Røbestoffer:
		— steroler	Se bilag VIII	Bilag VIII
		— vanillin	Se bilag VI	Bilag VI
		— ethylester af karotinsyre	Se bilag VII	Bilag VII
		— triglycerider af enantiksyre	Se bilag V	Bilag V
Forordning (EF) nr. 1898/2005 kapitel II	Koncentreret smør	Fedtstof	Min. 99,8 % m/m	IDF 24:1964
		Vand og FT	Maks. 0,2 % m/m	ISO 5536:2002|IDF 23:2002 (vandindhold) IDF 24:1964 (SNF)
		Fedtsyrer	1,2 mmol/100 g fedtstof	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PI (maks.)	0,5 mækv. ilt/1 000 g fedtstof	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Bemærkning 1
		Andre fedtstoffer end mælkefedt	Ingen	Bilag XX
		Smag	Ren
		Lugt	Ingen fremmed lugt
		Andet	Ingen neutraliseringsmidler, antioxidanter og konserveringsmidler
		Røbestoffer:
		— steroler	Se bilag VIII	Bilag VIII
		— vanillin	Se bilag VI	Bilag VI
		— ethylester af karotinsyre	Se bilag VII	Bilag VII
		— triglycerider af enantiksyre	Se bilag V	Bilag V
Forordning (EF) nr. 1898/2005 kapitel II	Fløde	Fedtstof	Min. 35 % m/m	ISO 2450:1999 — IDF 16 C:1987
		Andre fedtstoffer end mælkefedt		Bilag XX
		Røbestoffer:
		— steroler	Se bilag VIII		Bemærkning 2
		— vanillin	Se bilag VI	Bilag VI
		— ethylester af karotinsyre	Se bilag VII		Bemærkning 2
		— triglycerider af enantiksyre	Se bilag V	Bilag V
Forordning (EF) nr. 1898/2005 kapitel III	Koncentreret smør	Fedtstof	Min. 96 % m/m		Bemærkning 2
		Andre fedtstoffer end mælkefedt		Bilag XX
		FT	Maks. 2 % m/m		Bemærkning 2
		Røbestoffer:
		— stigmasterol (95 % m/m)	15 g/100 kg koncentreret smør:	Bilag VIII
		— stigmasterol (85 % m/m)	17 g/100 kg koncentreret smør:	Bilag VIII
		— triglycerider af enantiksyre	10,34 kg/100 t koncentreret smør:	Bilag V
		— ethylester af smørsyre og stigmasterol		— ethylester af smørsyre — stigmasterol: Bilag VIII	Bemærkning 2
		— ethylester af smørsyre og triglycerider af enantiksyre		— ethylester af smørsyre — triglycerider af enantiksyre Bilag V	Bemærkning 2
		Lecithin (E 322)	Maks. 0,5 % m/m		Bemærkning 2
		NaC1	Maks. 0,75 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Fedtsyrer	1,2 mmol/100 g fedtstof	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PI (maks.)	Maks. 0,5 mækv. ilt/1 000 g fedtstof	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Bemærkning 1
		Smag	Ren
		Lugt	Ingen fremmed lugt
		Andet	Ingen neutraliseringsmidler, antioxidanter og konserveringsmidler
Forordning (EF) nr. 1898/2005 kapitel IV	Usaltet smør	Fedtstof	Min. 82 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vand	Maks. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FT	Maks. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
Forordning (EF) nr. 1898/2005 kapitel IV	Saltet smør	Fedtstof	Min. 80 % m/m	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Vand	Maks. 16 % m/m	ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
		FT (ekskl. salt)	Maks. 2 % m/m	ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
		Salt	Maks. 2 % m/m	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Artikel 9 og afsnit II i forordning (EF) nr. 1255/1999	Ost af fåre- og/eller gedemælk	Komælk	< 1 % m/m	Bilag IX
Forordning (EØF) nr. 2921/90	Bilag I — Syrekasein	Vand	Maks. 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Fedtstof	Maks. 1,75 % m/m	ISO 5543:2004|IDF127:2004
		Frie syrer	Maks. 0,30 ml 0,1N NaOH-opløsning/g	ISO 5547:1978 — IDF 91:1979
Forordning (EØF) nr. 2921/90	Bilag I — Løbekasein	Vand	Maks. 12,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Fedtstof	Maks. 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Aske	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978 — IDF 90:1979
Forordning (EØF) nr. 2921/90	Bilag I — Kaseinat	Vand	Maks. 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mælkeprotein	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978 — IDF 92:1979
		Fedtstoffer og aske	Maks. 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Aske (fixed ash)		ISO 5544:1978 — IDF 89:1979
		Aske		ISO 5545:1978 — IDF 90:1979
Forordning (EØF) nr. 2921/90	Bilag II — Syrekasein	Vand	Maks. 10,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Fedtstof	Maks. 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Frie syrer	Maks. 0,20 ml 0,1 N NaOH-opløsning/g	ISO 5547:1978 — IDF 91:1979
		SK (maks.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3
		Coliforme bakterier	Ingen i 0,1 g	Bilag X	Bemærkning 3
		ITB (maks.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3 og 4
Forordning (EØF) nr. 2921/90	Bilag II — Løbekasein	Vand	Maks. 8,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Fedtstof	Maks. 1,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Aske	Min. 7,50 % m/m	ISO 5545:1978 — IDF 90:1979
		SK (maks.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3
		Coliforme bakterier	Ingen i 0,1 g	Bilag X	Bemærkning 3
		ITB (maks.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3 og 4
Forordning (EØF) nr. 2921/90	Bilag II — Kaseinat	Vand	Maks. 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mælkeprotein	Min. 88,00 % m/m	ISO 5549:1978 — IDF 92:1979
		Fedtstoffer og aske	Maks. 6,00 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004 ISO 5544:1978 — IDF 89:1979 eller ISO 5545:1978 — IDF 90:1979
		SK (maks.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3
		Coliforme bakterier	Ingen i 0,1 g	Bilag X	Bemærkning 3
		ITB (maks.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3 og 4
Forordning (EØF) nr. 2921/90	Bilag III — Kaseinat	Vand	Maks. 6,00 % m/m	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mælkeprotein	Min. 85,00 % m/m	ISO 5549:1978 — IDF 92:1979
		Fedtstof	Maks. 1,50 % m/m	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Lactose	Maks. 1,00 % m/m	ISO 5548:2004|IDF 106:2004
		Aske	Maks. 6,50 % m/m	ISO 5544:1978 — IDF 89:1979 eller ISO 5545:1978 — IDF 90:1979
		SK (maks.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3
		Coliforme bakterier	Ingen i 0,1 g	Bilag X	Bemærkning 3
		ITB (maks.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3 og 4
Forordning (EF) nr. 2799/1999	Foderblandinger og skummetmælkspulver (til dyrefoder)	Vand (syrnet kærnemælkspulver)	Maks. 5 % m/m	Bilag XIX
		Protein	31,4 % (min.) i det fedtfrie tørstof	ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
		Vand (skummetmælkspulver)	Maks. 5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Fedtstof (skummetmælkspulver)	Maks. 11 % m/m	ISO 1736:2000 — IDF 9C:1987
		Løbevalle (skummetmælkspulver)	Ingen	Bilag XIII	Bemærkning 6
		Stivelse (skummetmælkspulver)	Ingen	Bilag XVII
		Vand (blanding)	Maks. 5 % m/m i det fedtfrie tørstof	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Fedtstof (blanding)		Kommissionens direktiv 84/4/EØF (EFT L 15 af 18.1.1984, s. 29)
		Løbevalle (blanding)	Ingen	Bilag XIII
		Indhold af skummetmælkspulver (i det endelige produkt)	Min. 50 % m/m	Bilag XVI
		Fedtstof (i det endelige produkt)	Min. 2,5 % m/m eller 5 % m/m	Kommissionens direktiv 84/4/EØF (EFT L 15 af 18.1.1984, s. 29)	Bemærkning 7
		Stivelse (i det endelige produkt)	Min. 2 % m/m	Bilag XVII	Bemærkning 8
		Kobber (i det endelige produkt)	25 ppm	Kommissionens direktiv 78/633/EØF (EFT L 206 af 26.7.1987, s. 43)
Forordning (EF) nr. 214/2001	Skummetmælkspulver (spraymetoden)	Fedtstof	Maks. 1,0 % m/m	ISO 1736:2000 — IDF 9C:1987
		Protein	31,4 % (2)(min.) i det fedtfrie tørstof	ISO 8968-1/2:2001|IDF 20-1/2:2001
		Vand	Maks. 3,5 % m/m	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Syreindhold	Maks., 19,5 ml, 0,1N NaOH, 10 g fedtfrit tørstof	ISO 6091:1980 — IDF 86:1981
		Lactater	Maks. 150 mg/100 g fedtfrit tørstof	ISO 8069:2005|IDF 69:2005
		Fosfatase	Negativ	ISO 11816-1:2006|IDF 155-1:2006
		Uopløselighed	Maks. 0,5 ml ved 24 °C	ISO 8156:2005|IDF 129:2005
		Brændte partikler	Filter A eller B (15,0 mg)	ADPI (1990)
		SK	40 000/g	ISO 4833:2003	Bemærkning 3
		Coliforme bakterier	Negativ/0,1 g	Bilag X	Bemærkning 3
		Kærnemælk	Negativ	Bilag XIV
		Løbevalle	Negativ	Bilag XII
		Sur valle	Negativ		Bemærkning 2
		Antimikrobielle stoffer		Bilag XV

DEL B

Referencemetoderne i del B anvendes ved analyse af produkter, der er omfattet af en af forordningerne i første kolonne.

Kommissionens forordning	Produkt	KN-kode	Parameter	Grænse	Referencemetode	Bemærkning
Forordning (EF) nr. 2658/87 Forordning (EF) nr. 2535/2001 Forordning (EF) nr. 1282/2006	Mælk og fløde, ikke koncentreret og ikke tilsat sukker eller andre sødemidler	0401	Fedtstof (≤ 6 % m/m)	Grænserne svarer til de grænser, der er specificeret i beskrivelsen af KN-koden for det særlige produkt, og som eventuelt er præciseret i Kommissionens forordning (EØF) nr. 3846/87 (EFT L 366 af 24.12.1987, s. 1), del 9 i nomenklaturen over eksportrestitutioner, eller i forordning (EF) nr. 2535/2001 (EFT L 341 af 22.12.2001, s. 29)	ISO 1211:2001 — IDF 1D:1996
			Fedtstof (> 6 % m/m)		ISO 2450:1999 — IDF 16C:1987
	Mælk og fløde, koncentreret eller tilsat sukker eller andre sødemidler	0402	Fedtstof (flydende form)		ISO 1737:1999 — IDF 13C:1987
			Fedtstof (fast form)		ISO 1736:2000 — IDF 9C:1987
			Protein		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF20-1|2|3:2001
			Saccharose (normalt indhold)		ISO 2911:2004| IDF 35:2004
			Saccharose (ringe indhold)			Bemærkning 2
			Tørstof (SKM)		ISO 6734:1989 — IDF 15B:1991
			Tørstof (IMF)		ISO 6731:1989 — IDF 21B:1987
			Vand (mælkepulver)		ISO 5537:2004/IDF 26:2004
			Vand (flødepulver)		Bilag XVIII
	Kærnemælk, fermenteret eller syrnet mælk og fløde, også koncentreret, tilsat sukker eller andre sødemidler	0403	Fedtstof		ISO 1211:2001 — IDF 1D:1996 ISO 1736:2000 — IDF 9C:1987 ISO 2450:1999 — IDF 16 C:1987 ISO 7208:1999 — IDF 22B:1987 ISO 8262-3:2005 — IDF 124-3:2005
			Protein		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Saccharose (normalt indhold)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Saccharose (ringe indhold)			Bemærkning 2
			Vand (syrnet kærnemælkspulver)		Bilag XIX
			Vand (usyrnet kærnemælkspulver)		ISO 5537:2004|IDF26:2004
			Tørstof (andre produkter)		Metoder, der er godkendt af den kompetente myndighed
	Valle, også koncentreret eller tilsat sukker eller andre sødemidler; varer bestående af naturlige mælkebestanddele	0404	Fedtstof		ISO 1736:2000 — IDF 9C:1987 ISO 2450:1999 — IDF 16C:1987 ISO 7208:1999 — IDF 22B:1987
			Protein		ISO 8968-1|2|3:2001|IDF 20-1|2|3:2001
			Saccharose (normalt indhold)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Saccharose (ringe indhold)			Bemærkning 2
		0404 90	Protein		ISO 8968 1/2 2001|IDF 20-1/2:2001
			Vand		IDF 21B:1987
			Tørstof		ISO 6734:1989 — IDF 15B:1991
			(Koncentrerede produkter)		ISO 6731:1989 — IDF 21B:1987
	Smør og andre mælkefedtstoffer; smørbare mælkefedtprodukter	0405	Fedtstof (hvis ≤ 85 % m/m)		ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Smør	Vand		ISO 3727-1:2001|IDF 80-1:2001
			FT		ISO 3727-2:2001|IDF 80-2:2001
			NaCl		ISO 15648:2004|IDF 179:2004
			Fedtstof (hvis > 99 % m/m)		IDF 24:1964
	Smørolie		Vand (hvis fedtstof < 99 % m/m)		ISO 5536:2002|IDF 23:2002
	Ost og ostemasse	0406	Fedtstof		ISO 1735:2004|IDF 5:2004
			Tørstof		ISO 5534:2004|IDF 4:2004
			Tørstof (ricotta)		ISO 2920:2004|IDF 58:2004
			NaCl		ISO 5943:2006|IDF 88:2006
			Lactose		ISO 5765-1/2:2002|IDF 79-1/2:2002
Forordning (EF) nr. 2658/87	Foderblandinger	2309	Lactose		Bilag XI

Bemærkninger til listen over EU-referencemetoder.

Bemærkning 1: Isolering af mælkefedt som beskrevet i ISO 1740:1991 (beskyttelse mod lys).

Bemærkning 2: Der er ikke fastsat nogen referencemetode. Metoder, der er godkendt af den kompetente myndighed.

Bemærkning 3: Prøven skal forberedes ifølge ISO 8261:2001|IDF 122:2001.

Bemærkning 4: Inkubering i 48 timer ved 55 °C. Der skal træffes forholdsregler mod udtørring af dyrkningsmediet.

Bemærkning 5: % m/m FT = % m/m tørstof — % m/m fedtstof.

Bemærkning 6: Kommissionens direktiv 84/4/EØF.

Bemærkning 7: Kommissionens forordning (EF) nr. 2799/1999 (EFT L 340 af 31.12.1999, s. 3-27).

Bemærkning 8: Kommissionens direktiv 78/633/EØF.

---

(1)  Jf. dog kravene i særforordningen.

(2)  Mindsteindhold af protein bliver 34 % pr. 1. september 2009.

BILAG II

(Artikel 3)

VURDERING AF, OM EN SENDING OVERHOLDER DEN FORSKRIFTSMÆSSIGE GRÆNSE

1.   PRINCIP

Når der i de relevante bestemmelser er fastsat detaljerede prøveudtagningsprocedurer, følges sådanne procedurer. I alle andre tilfælde anvendes der en prøve bestående af mindst 3 prøveenheder udtaget tilfældigt af den sending, der forevises til kontrol. En blandingsprøve kan forberedes. Resultatet sammenlignes med de forskriftsmæssige grænser ved beregning af et konfidensinterval på 95 % som to gange standardafvigelsen, hvor den relevante standardafvigelse afhænger af, 1) om metoden er valideret ved internationalt samarbejde med værdier for σr og σR, eller 2) om der ved intern validering er beregnet en intern reproducerbarhed. Konfidensintervallet er da det samme som resultatets måleusikkerhed.

2.   METODE VALIDERET VED INTERNATIONALT SAMARBEJDE

I dette tilfælde er standardafvigelsen for repeterbarhed σr og standardafvigelsen for reproducerbarhed σR blevet fastlagt, og laboratoriet kan dokumentere overholdelse af karakteristika for den validerede metodes ydeevne.

Det aritmetiske gennemsnit af de n gentagne målinger beregnes.

Den ekspanderede måleusikkerhed (k = 2) af som

Hvis det endelige måleresultat x beregnes med en formel af typen x = y1 + y2, x = y1 – y2, x = y1. y2 oder x = y1 / y2, følges de sædvanlige procedurer til kombinering af standardafvigelser i sådanne tilfælde.

Sendingen anses for ikke at overholde den øvre forskriftsmæssige grænse UL, hvis

ellers anses den for at overholde UL.

Sendingen anses for ikke at overholde den nedre forskriftsmæssige grænse LL, hvis

ellers anses den for at overholde LL.

3.   INTERN VALIDERING MED BEREGNING AF DEN INTERNE STANDARDAFVIGELSE FOR REPRODUCERBARHED

Hvis der anvendes metoder, der ikke er angivet i denne forordning, og der ikke er fastlagt præcisionsmålinger, skal der foretages en intern validering. Den interne standardafvigelse for repeterbarhed sir og den interne standardafvigelse for reproducerbarhed siR skal anvendes i stedet for henholdsvis σr og σ R i formlen til beregning af den ekspanderede usikkerhed U.

Afgørelser træffes i henhold til punkt 1. Hvis sendingen imidlertid bedømmes til ikke at overholde den forskriftsmæssige grænse, gentages målingerne ved anvendelse af den metode, der er angivet i denne forordning, og der træffes afgørelse i henhold til punkt 1.

BILAG III

(Artikel 4)

EVALUERING AF DOMMERE OG PÅLIDELIGHEDEN AF RESULTATER AF ORGANOLEPTISKE BEDØMMELSER

Følgende procedurer benyttes, hvis der gøres brug af karaktergivningsmetoder (IDF — standard 99C:1997).

A)   BESTEMMELSE AF »REPETERBARHEDSINDEKS«

Der analyseres mindst ti prøver som blinde dobbeltanalyser af en dommer inden for en periode på 12 måneder. Dette vil sædvanligvis finde sted i flere omgange. Resultaterne af de forskellige produkters karakteristika evalueres ved anvendelse af følgende formel:

hvor:

w1	:	repeterbarhedsindeks
xi1	:	point for første evaluering af prøve xi
xi2	:	point for anden evaluering af prøve xi
n	:	antal prøver

De prøver, der skal evalueres, skal afspejle et bredt kvalitetsudsnit. wI må ikke overstige 1,5 (fempunktsskalaer).

B)   BESTEMMELSER AF »AFVIGELSESINDEKSET«

Dette indeks skal anvendes til at tjekke, om en dommer anvender samme skala for kvalitetsvurdering som en gruppe erfarne dommere. De point, som dommeren har givet, sammenlignes med gennemsnittet af de point, som dommerpanelet har givet.

Følgende formel anvendes for evalueringen af resultaterne:

hvor:

xi1; xi2	:	se litra A)
;	:	dommerpanelets gennemsnitspoint for henholdsvis første og anden evaluering af prøven xi
n	:	antal prøver (mindst 10 pr. tolvmånedersperiode).

De prøver, der skal evalueres, skal afspejle et bredt kvalitetsudsnit. DI må ikke overstige 1,5 (fempunktsskalaer).

Medlemsstaterne giver meddelelse om alle vanskeligheder, der er opstået under anvendelsen af denne metode.

Hvis det konstateres, at en dommer overskrider grænsen på 1,5 point for afvigelsesindekset eller repeterbarhedsindekset, gennemfører den officielle myndigheds særligt sagkyndige atter et eller flere randomiserede præstationstjek på prøver, som vedkommende har klassificeret i de seneste uger, eller den/de særligt sagkyndige gennemfører et eller flere check, hvor de ledsager den pågældende dommer. Det er nødvendigt med nøje tilsyn for at afgøre, om dommerne fortsat skal varetage deres hverv. De konstaterede forhold bør dokumenteres, og dokumentationen bør opbevares til brug ved opfølgende indsats.

C)   SAMMENLIGNING AF DE OPNÅEDE RESULTATER I FORSKELLIGE REGIONER AF EN MEDLEMSSTAT OG I FORSKELLIGE MEDLEMSSTATER

Hvis det er relevant, foretages der mindst én gang om året en test, som giver mulighed for at sammenligne resultaterne af de vurderinger, som dommere fra forskellige regioner har foretaget. Konstateres der væsentlige forskelle, træffes de nødvendige foranstaltninger for at finde årsagerne hertil og nå frem til sammenlignelige resultater.

Medlemsstaterne kan tilrettelægge test, som giver mulighed for at sammenligne de resultater, der er opnået af deres egne dommere og af dommere fra nabomedlemsstater. I tilfælde af væsentlige forskelle skal der foretages en tilbundsgående undersøgelse for at nå frem til sammenlignelige resultater.

Medlemsstaterne underretter Kommissionen om resultaterne af disse sammenligninger.

BILAG IV

(Artikel 4)

ORGANOLEPTISK BEDØMMELSE AF SMØR

1.   FORMÅL

Formålet med denne metode til organoleptisk bedømmelse af smør er at give en ensartet metode, der kan benyttes i samtlige medlemsstater.

Nærmere detaljer findes i den aktuelle udgave af IDF International Standard for Milk and Milk Products, IDF 99 — Parts 1,2,3 on Sensory Evaluation.

2.   DEFINITIONER

Ved »organoleptisk bedømmelse« (vurdering) forstås undersøgelse af et produkts egenskaber ved hjælp af sanseorganerne.

Ved »panel« forstås en gruppe udvalgte dommere, der under vurderingen arbejder uden indbyrdes kontakt og uden at påvirke hinanden.

Ved »dommer« forstås en person, der er udvalgt på grund af vedkommendes evne til at foretage en organoleptisk test. Denne type dommer har ikke nødvendigvis stor erfaring.

Ved »særligt sagkyndig dommer« forstås en person, der har stor sensorisk følsomhed og erfaring med sensorisk metodologi, og som er i stand til at foretage konsistente og pålidelige organoleptiske bedømmelser af diverse produkter. Denne type dommer skal have en god langtidshukommelse hvad angår sanseindtryk.

Ved »karaktergivning« forstås et panels organoleptiske bedømmelse efter en talskala. Der skal benyttes en nomenklatur for fejl.

Ved »klassificering« forstås en kvalitetssortering, der sker på grundlag af karaktergivningen.

Ved »kontroldokumenter« forstås dokumenter, hvori noteres de enkelte point for hver egenskab samt produktets endelige klasse (samme dokument kan også anvendes til angivelse af kemisk sammensætning).

3.   PRØVELOKALE

Nærmere detaljer findes i ISO 8589 og ISO/DIS 22935-2 | IDF 99-2 afsnit 7.

Der skal træffes forholdsregler, så dommerne i prøvelokalet ikke bliver påvirket af udefra kommende faktorer.

Prøvelokalet skal være frit for fremmede lugte og let at rengøre. Væggene skal have en lys farve og må ikke være reflekterende.

Prøvelokalet og dets belysning skal være således, at de produktegenskaber, der skal bedømmes, ikke påvirkes.

Lokalet skal være udstyret med passende termostatisk styring, så smørret kan holde en konstant temperatur. Smørret bør ved klassificeringen have en temperatur på 12 °C (±2 °C).

4.   UDVÆLGELSE AF DOMMERE

En dommer skal være velkendt med smørprodukter og kunne foretage organoleptisk klassificering. Vedkommendes egnethed bør overvåges regelmæssigt (mindst en gang om året) af den kompetente myndighed.

4.1.   Nærmere detaljer findes i ISO/DIS 22935-1 | IDF 99-1 afsnit 4 (hvervning) og afsnit 5.1 vedrørende generelle krav og screeningtest, der kan benyttes, inden en ny dommer anvendes officielt.

Løbende efteruddannelse er af afgørende betydning, og der bør regelmæssigt afholdes fælles kurser. Nærmere oplysninger om uddannelse af paneler findes i ISO 8586-1.

4.2.   Grunduddannelsen bør omfatte følgende:

—	generel teori om og praktisk betydning af organoleptisk bedømmelse

—	metoder, skalaer og beskrivelse af sanseindtryk

—	påvisning og genkendelse af organoleptiske egenskaber og specifikke sensoriske termer

—	grundlæggende viden om smørfremstilling

—	validerede referencer og prøver, der kan hjælpe dommeren til at identificere specifikke smagsindtryk og smagsintensitet i produktet.

5.   KRAV TIL PANELET

Antallet af dommere i panelet bør være ulige og mindst tre personer. Flertallet af dem skal være medarbejdere ved den kompetente myndighed eller autoriserede personer, der ikke er ansat i mejeribruget.

Panellederen har ansvaret for hele proceduren og kan deltage i panelet.

Flere faktorer skal tages i betragtning inden vurderingen, for at dommerne kan opnå en optimal dømmekraft:

—	Dommerne må ikke lide af sygdomme, der kan påvirke deres dømmekraft. Hvis sådanne sygdomme opstår, skal en anden person indlemmes i panelet.

—	Dommerne skal overholde tiden for deltagelse i bedømmelsen og afsætte tilstrækkelig tid til bedømmelsen.

—	Dommerne skal undgå at bruge stærkt duftende produkter såsom parfume, aftershave og deodorant og bør undlade at spise stærkt aromatiserede (krydrede) fødevarer osv.

—	Dommerne må hverken ryge, spise eller drikke andet end vand i den sidste halve time inden bedømmelsen.

6.   PRÆSTATIONER

Alle dommere bør regelmæssigt deltage i paneler for organoleptisk bedømmelse for at bevare deres kompetence. Hyppigheden afhænger af, hvor meget smør der produceres, men vedkommende bør om muligt deltage i mindst et panel pr. måned.

Erfarne dommere bør ligeledes deltage i flere paneler om året, om muligt mindst en gang pr. kvartal.

7.   UDTAGNING OG FORBEREDELSE AF PRØVER

Det er afgørende, at prøvernes identitet er skjult under bedømmelsen, så enhver form for eventuel partiskhed undgås. Prøverne bør forsynes med en kode.

Dette skal ske inden bedømmelsen. Der bør fastsættes krav til smørrets temperatur under transporten til prøvelokalet (6 °C ± 2 °C).

Når den organoleptiske bedømmelse foretages på et kølehus, udtages prøven med en smørstikker. Hvis den organoleptiske bedømmelse finder sted på et andet sted end i kølehuset, skal der udtages en prøve på mindst 500g. Under vurderingen bør smørret have en temperatur på 12 °C (±2 °C) (NB: i ISO/DIS 22935-2 | IDF 99-2 er smørrets temperatur ved bedømmelsen fastsat til 14 °C ±2 °C). Store afvigelser bør for enhver pris undgås.

8.   VURDERING AF VÆRDIEN AF DE ENKELTE EGENSKABER

8.1.   Den organoleptiske bedømmelse skal omfatte følgende egenskaber: udseende, konsistens, lugt og smag.

Udseende omfatter farve, synlig renhed, fravær af fysisk kontaminering, fravær af mugvækst og ensartet vandfordeling. Vandfordelingen afprøves efter IDF-standard 112A/1989.

Konsistens omfatter formstabilitet, tekstur og hårdhed. Smørbarhed kan kontrolleres med fysiske metoder, hvis en enkeltmedlemsstat ønsker det for at imødekomme forbrugerkrav. Kommissionen kan på et senere tidspunkt beslutte at harmonisere metoderne.

Formstabilitet drejer sig om produktets sammenhængsevne ved forbrug. Formstabilitet forbindes normalt med hårdhed og smørbarhed, og den bør være ensartet i hele produktet. Den hænger nøje sammen med teksturen og udtrykker produktets evne til at bære sin egen vægt. Den konstateres ved modstanden under gennemskæring og kan måles mekanisk og ved fornemmelsen i munden og mellem fingrene.

Smag er de egenskaber, der opfattes i munden, primært via tungens smagsløg.

Lugt er de egenskaber, der opfattes af næsen og lugtesansen.

En signifikant afvigelse fra den anbefalede temperatur forhindrer pålidelig vurdering af konsistens, lugt og smag. Temperaturen er af altafgørende betydning.

Klassificeringen af smør skal udskydes, hvis temperaturen ligger uden for det anbefalede interval.

8.2.   Egenskaberne skal bedømmes organoleptisk hver for sig. Der gives karakterer efter tabel 1.

8.3.   Det kan være ønskværdigt, at dommerne, inden de begynder bedømmelsen, sammen giver karakterer for en eller flere referenceprøver med hensyn til udseende, konsistens samt lugt og smag, så der bliver vurderet ensartet.

8.4.   Karaktererne for, at produktet kan godkendes, er som følger:

Ved karaktergivningen følges afsnit 7 — Nomenclature, and description of criteria applicable to points.

	Maksimum	Krævet
Udseende	5	4
Konsistens	5	4
Smag/lugt	5	4

—	Hvis den krævede karakter ikke opnås, skal fejlen beskrives.

—	De karakterer, den enkelte dommer giver for hver egenskab, skal optegnes i kontroldokumentet.

—	Produktet godkendes eller afvises på grundlag af en flertalsbeslutning.

—	Der bør ikke ofte forekomme tilfælde (ikke mere end ét pr. 20 prøver), hvor de enkelte dommeres karakter for hver egenskab giver en forskel på over et point. Hvis det sker, må panellederen kontrollere, om panelet er kompetent.

9.   TILSYN

Lederen af et panel, som skal være en medarbejder ved den kompetente myndighed og kan være medlem af panelet, skal være generelt ansvarlig for hele proceduren. Vedkommende skal optegne de enkelte dommeres karakter for hver egenskab i kontroldokumentet og attestere, om produktet er godkendt eller afvist.

10.   NOMENKLATUR

Jf. vedlagte tabel 2.

11.   HENVISNINGER

FIL-IDF 99C:1997 Sensory evaluation of dairy products by scoring — Reference method

ISO/DIS 22935 | IDF 99 International Standard for Milk and Milk Products — Sensory analysis — Parts 1-3

ISO 8586-1 Sensorisk analyse — Generel vejledning i udvælgelse, træning og overvågning af assessorer — del 1

ISO 8589 Sensory analysis — General guidance for the design of test rooms

FIL-IDF 112A:1989 Butter — Determination of water dispersion value.

Tabel 1

Bedømmelsesskema for smør

Udseende			Konsistens			Smag og lugt
Point	Nr. (1)	Bemærkninger	Point (kvalitetsklasse)	Nr. (1)	Bemærkninger	Point (kvalitetsklasse)	Nr. (1)	Bemærkninger
5		Meget tilfredsstillende idealtype højeste kvalitet (ensartet tør)	5		Meget tilfredsstillende idealtype højeste kvalitet (godt smørbar)	5		Meget tilfredsstillende idealtype højeste kvalitet (absolut ren, fineste lugt)
4		Tilfredsstillende  (2) ingen åbenlyse fejl	4	17 18	Tilfredsstillende  (2) hård blød	4		Tilfredsstillende  (2) ingen åbenlyse fejl
3	1 2 3 4 5 6 7 8	Temmelig tilfredsstillende (mindre fejl) synlige vanddråber ikke ensartet farve, tofarvet stribet skjoldet, marmoreret plettet olieudskillelse for stærk farve poret (åben tekstur)	3	14 15 16 17 18	Temmelig tilfredsstillende (mindre fejl) skør, smuldrende dejagtig, fedtet klæbrig hård blød	3	21 22 25 27 33 34 35	Temmelig tilfredsstillende (mindre fejl) uren fremmed smag syrlig kogt smag, sveden smag fodersmag grov, bitter oversaltet
2	1 3 4 5 6 10 11 12	Utilfredsstillende (åbenlyse fejl) synlige vanddråber stribet skjoldet, marmoreret plettet olieudskillelse fremmede bestanddele muggen uopløst salt	2	14 15 16 17 18	Utilfredsstillende (åbenlyse fejl) skør, smuldrende dejagtig, fedtet klæbrig hård blød	2	21 22 23 25 32 33 34 35 36 38	Utilfredsstillende (åbenlyse fejl) uren fremmed smag gammel smag syrlig oxideret smag, metallisk smag fodersmag grov, bitter oversaltet muggen, fad, rådden kemikaliesmag
1	1 3 4 5 6 7 9 10 11 12	Særdeles utilfredsstillende (udtalte fejl) synlige vanddråber stribet skjoldet, marmoreret plettet olieudskillelse for stærk farve kornet fremmede bestanddele muggen uopløst salt	1	14 15 16 17 18	Særdeles utilfredsstillende (udtalte fejl) skør, smuldrende dejagtig, fedtet klæbrig hård blød	1	22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38	Særdeles utilfredsstillende (udtalte fejl) fremmed smag osteagtig, syrlig ostesmag syrlig gærsmag muggen smag harsk olieagtig, trannet talgagtig oxideret smag, metallisk smag grov, bitter oversaltet muggen, fad, rådden maltagtig kemikaliesmag

Tabel 2

Nomenklatur over fejl ved smør

I. Udseende

1. synlige vanddråber

2. ikke ensartet farve, tofarvet

3. stribet

4. skjoldet, marmoreret

5. plettet

6. olieudskillelse

7. for stærk farve

8. poret (åben tekstur)

9. kornet

10. fremmede bestanddele

11. muggen

12. uopløst salt

II. Konsistens

14. skør, smuldrende

15. dejagtig, fedtet

16. klæbrig

17. hård

18. blød

III. Smag og lugt

20. uden smag

21. uren (3)

22. fremmed smag

23. gammel smag

24. osteagtig, syrlig ostesmag

25. syrlig

26. gærsmag

27. a) kogt smag

b) sveden smag

28. muggen smag

29. harsk

30. olieagtig, trannet

31. talgagtig

32. a) oxideret smag

b) metallisk smag

33. fodersmag

34. grov, bitter

35. oversaltet

36. muggen, fad, rådden

37. maltagtig

38. kemikaliesmag

---

(1)  Tabel 2.

(2)  De fejl, der er nævnt under »tilfredsstillende«, må kun bestå i meget små afvigelser fra idealtypen.

(3)  Denne benævnelse bør bruges så sjældent som muligt og kun, når fejlen ikke kan beskrives mere præcist.

BILAG V

(Artikel 5)

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF TRIGLYCERID AF ENANTIKSYRE I SMØR, SMØROLIE OG FLØDE VED GASKROMATOGRAFISK ANALYSE AF TRIGLYCERIDER

1.   FORMÅL

Denne metode anvendes til bestemmelse af indholdet af triglycerid af enantiksyre i smør, smørolie og fløde.

2.   TERMER OG DEFINITIONER

Indhold af enantiksyre: indholdet af triglycerid af enantiksyre bestemt ved den i denne metode angivne procedure.

Bemærkning: Indholdet af enantiksyre udtrykkes i kg pr. ton produkt for smørolie og smør, og det udtrykkes i kg pr. ton mælkefedt for fløde.

3.   PRINCIP

Mælkefedt ekstraheres fra de forskellige produkter ifølge ISO 14156 | IDF 172:2001. Den kvantitative bestemmelse af indholdet af triglycerid af enantiksyre i det ekstraherede fedt foretages ved hjælp af gaskromatografi med kapillarkolonne (GC). Resultatet for prøven vurderes ved reference til triglycerid af capronsyre som intern standard.

Bemærkning: Tributyrin er også en tilfredsstillende intern standard.

4.   REAGENSER

Der må kun anvendes reagenser af anerkendt analysekvalitet.

4.1.   n-Hexan

4.2.   Standardtriglycerid af capronsyre, mindst 99 % rent.

4.3.   Standardtriglycerid af enantiksyre, mindst 99 % rent.

4.4.   Vandfri natriumsulfat (Na2SO4).

5.   APPARATUR

Sædvanligt laboratorieudstyr, især følgende:

5.1.   Analysevægt, nøjagtighed 1 mg

5.2.   Målekolber, 10 ml og 20 ml

5.3.   Centrifugeglas, 30 ml

5.4.   Rotationsinddamper

5.5.   Ovn, som kan holde en temperatur på 50 °C ±5 °C

5.6.   Filtrerpapir, medium porøsitet, diameter ca. 15 cm

Gaskromatografiudstyr

5.7.1.   Gaskromatograf udstyret med split/splitless-injektor eller direkte injektion på kolonnen og en flammeionisationsdetektor (FID)

GC-kolonne med en stationær fase, der med godt resultat er blevet anvendt til triglyceridseparation (100 % dimethylpolysiloxan eller 5 % phenyl-95 % methylpolysiloxan). Den stationære fase, kolonnehøjden (4-15 m), den indre diameter (0,22-0,50 mm) og filmtykkelse (0,12 μm eller derover) vælges under hensyntagen til laboratoriets erfaring og det anvendte injektionssystem. Under alle omstændigheder skal den valgte kolonne frembringe såvel en komplet separation mellem opløsningsmidlets top og triglycerid af capronsyre som en resolution til basislinjen mellem toppene for triglycerid af capronsyre og enantiksyre. Nedenfor er anført eksempler på betingelserne.

5.7.2.1.   Eksempel på betingelser ved anvendelse af en split-injektor

—	Bæregas: helium

—	Tryk ved kolonnetop: 100 kPa

—	Kolonne: 12 m lang kolonne i kvartsglas, 0,5 mm indre diameter, 0,1 μm filmtykkelse

—	Stationær fase: 100 % dimethylpolysiloxan eller 5 % phenyl-95 % dimethylpolysiloxan (f.eks. HT5)

—	Kolonnetemperatur: initialtemperatur på 130 °C, opretholdt i 1 min., øget med 20 °C/min. til 260 °C og dernæst øget med 30 °C/min. til 360 °C; opretholdes i 10 min. ved 360 °C

—	Detektortemperatur: 370 °C

—	Injektortemperatur: 350 °C

—	Splitforhold: 1:30

—	Indsprøjtet mængde af prøven: 1 μl.

5.7.2.2.   Eksempel på betingelser ved anvendelse af injektor på kolonnen

—	Bæregas: hydrogen (konstant flow-system)

—	Tryk ved kolonnetop: 89 kPa

—	Kolonne: 4 m lang kolonne i kvartsglas, 0,32 mm indre diameter, 0,25 μm filmtykkelse

—	Stationær fase: 5 % phenyl, 95 % dimethylpolysiloxan

—	Kolonnetemperatur: initialtemperatur på 60 °C, opretholdt i 2 min., øget med 35 °C/min. til 340 °C, opretholdt ved denne temperatur i 5 min.

—	Detektortemperatur: 350 °C

—	Indsprøjtet mængde af prøven: 1 μl.

5.8.   Injektionssprøjte, 5 μl.

6.   PRØVEUDTAGNING

Det er vigtigt, at laboratoriet modtager en prøve, der reelt er repræsentativ, og som ikke er skadet eller forandret under transport eller oplagring.

Prøveudtagning indgår ikke i den metode, der er angivet i dette bilag. En anbefalet metode til prøveudtagning findes i IDF: standard 50C: 1995 eller ISO 707-1997- Mælk og mælkeprodukter. Vejledning om prøveudtagning.

7.   FREMGANGSMÅDE

7.1.   Forberedelse af klargjort prøve og analyseprøve

Fremgangsmåden følger ISO 14156 | IDF 172:2001.

7.1.1.   Smørolie og smør

7.1.1.1.   Der smeltes 50-100 g af den klargjorte prøve i ovnen (5.5).

7.1.1.2.   0,5-1,0 g vandfri natriumsulfat (5.4) placeres i et foldet filtrerpapir.

7.1.1.3.   Fedtet filtreres gennem filtrerpapiret, der indeholder vandfri natriumsulfat, og filtratet opsamles i et bægerglas, der hele tiden findes i ovnen (5.5). Når det smeltede smør dekanteres over på filtrerpapiret, skal der udvises omhu, for at der ikke følger valle med.

7.1.2.   Fløde

7.1.2.1.   Den klargjorte prøve opvarmes til en temperatur på 20 °C ±2 °C.

7.1.2.2.   Prøven blandes eller røres grundigt.

7.1.2.3.   En passende mængde af den klargjorte prøve fortyndes, så der fås 100 ml analyseprøve med en massefraktion af fedt på ca. 4 %.

7.1.2.4.   For at ekstrahere fedtet fra fløden følges samme fremgangsmåde som for rå mælk og homogeniseret mælk (se ISO 14156 | IDF 172:2001, § 8.3).

7.1.2.5.   1 g af det ekstraherede fedt afvejes med 1 mg nøjagtighed i en 10 ml målekolbe (5.2). Derefter tilsættes 1 ml opløsning 7.2.2. Der fyldes n-hexan (4.1) i op til 10 ml, hvorefter der homogeniseres.

7.1.2.6.   1 ml af opløsning 7.1.1.2 fyldes i en 10 ml målekolbe (5.2), og der fortyndes op til 10 ml med n-hexan (4.1).

7.2.   Forberedelse af kalibreringsstandarder

7.2.1.   100 mg triglycerid af enantiksyre (4.3) opløses i 10 ml n-hexan (4.1).

7.2.2.   100 mg triglycerid af capronsyre (4.2) opløses i 10 ml n-hexan (4.1).

7.2.3.   1 ml af opløsning 7.2.2 fyldes i en 10 ml målekolbe (5.2). Der fyldes n-hexan (4.1) i op til 10 ml.

7.2.4.   1 ml af opløsning 7.2.1 og 1 ml af opløsning 7.2.2 fyldes i en 10 ml målekolbe (5.2). Der fyldes n-hexan (4.1) i op til 10 ml.

7.2.5.   1 ml af opløsning 7.2.4 fyldes i en 10 ml målekolbe (5.2), og der fyldes n-hexan (4.1) i op til 10 ml.

7.3.   Kromatografisk bestemmelse

7.3.1.   Der indsprøjtes 1 μl standardopløsning 7.2.5 to gange.

7.3.2.   Der indsprøjtes 1 μl af hver prøveopløsning.

Bemærkning: Hvis der benyttes direkte injektion på kolonnen, bør både standardopløsningen og prøveopløsningerne fortyndes mere.

7.3.3.   Fremgangsmåden 7.3.1 gentages for hver tredje prøve, for at prøverne ligger tæt på dobbeltanalyser af standardopløsningen. Resultaterne baseres på gennemsnittet af responsfaktorerne fra standardkromatogrammerne.

8.   BEREGNING AF RESULTATER

For hvert kromatogram integreres toparealet for triglyceriderne af enantiksyre og capronsyre.

Instrukserne følges for hver sekvens, dvs. for et sæt af prøver med standardopløsninger før og efter (bracketing), idet den standardopløsning, der indsprøjtes to gange umiddelbart før, kaldes STD1, og den standardopløsning, der indsprøjtes to gange umiddelbart efter, kaldes STD2.

8.1.   Kalibrering

8.1.1.   Der foretages en beregning af responsfaktoren for hver dobbeltanalyse af STD1, Rf1(a) og Rf1(b).

Rf1 (a) eller (b) = (topareal for triglycerid af capronsyre/topareal for triglycerid af enantiksyre) × 100

Den gennemsnitlige responsfaktor Rf1 beregnes således:

Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(b)) / 2

8.1.2.   Den gennemsnitlige responsfaktor STD2, Rf2 beregnes på lignende måde.

8.1.3.   Den gennemsnitlige responsfaktor Rf beregnes således:

Rf = (Rf1 + Rf2) /2

8.2.   Klargjorte prøver

For hvert prøvekromatogram, der ligger mellem STD1 og STD2, beregnes enantiksyreindholdet, C (kg/ton):

C = (topareal for triglycerid af enantiksyre × Rf × 100)/(topareal for triglycerid af capronsyre × Wt × 1 000)

hvor:

—	Wt = fedtstofvægt (g)

—	100 = prøvens fortyndingsvolumen

—	1 000 = omregningsfaktor (for μg/g til kg/ton).

For smørprøver tages smørrets fedtindhold i betragtning, og der beregnes et korrigeret indhold, Csmør (kg/ton smør)

Csmør = Cfedt × F

hvor F er smørrets fedtindhold.

9.   PRÆCISION

Nærmere oplysninger om en sammenlignende laboratorieprøvning vedrørende smør i overensstemmelse med ISO 5725-1 og ISO 5725-2 om præcisionsmetode findes i punkt 12.

Værdierne for repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænser udtrykkes for en 95 % sandsynlighedsgrænse og må ikke anvendes til andre koncentrationsintervaller eller matrixer end de angivne.

9.1.   Repeterbarhed

De absolutte forskelle mellem to enkeltresultater, der er opnået med den samme metode på identisk prøvemateriale, på det samme laboratorium, udført af den samme person med det samme udstyr og med et kort tidsinterval, bliver i højst 5 % af tilfældene større end 0,35 kg/t.

9.2.   Reproducerbarhed

De absolutte forskelle mellem to enkeltresultater, der er opnået med den samme metode på identisk prøvemateriale på forskellige laboratorier udført af forskellige personer med forskelligt udstyr, bliver i højst 5 % af tilfældene større end 0,66 kg/t.

10.   TOLERANCERGRÆNSER: NEDRE GRÆNSER (VED UTILSTRÆKKELIGE MÆNGDER)

10.1.   Der udtages tre prøver af produktet med røbestof for at kontrollere, om produktet er tilsat røbestof på korrekt måde.

10.2.   Smør og koncentreret smør

10.2.1.   Der iblandes 11 kg mindst 95 % ren triglycerid af enantiksyre pr. t smør, dvs. 10,45 kg/t.

10.2.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	9,51 kg/t (95 % af den mindste iblanding for 95 % ren triglycerid af enantiksyre, enkeltbestemmelse)

—	6,89 kg/t (70 % af den mindste iblanding for 95 % ren triglycerid af enantiksyre, enkeltbestemmelse)

—	Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 9,51 kg/t og 6,89 kg/t.

10.3.   Fløde

10.3.1.   Der iblandes 10 kg mindst 95 % ren triglycerid af enantiksyre pr. t mælkefedt, dvs. 9,50 kg/t mælkefedt med røbestof.

10.3.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	8,60 kg/t (95 % af den mindste iblanding for 95 % ren triglycerid af enantiksyre, enkeltbestemmelse)

—	6,23 kg/t (70 % af den mindste iblanding for 95 % ren triglycerid af enantiksyre, enkeltbestemmelse)

—	Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 8,60 kg/t og 6,23 kg/t.

11.   TOLERANCEGRÆNSER: ØVRE GRÆNSER (VED EN MÆNGDE, DER ER MERE END 20 % FOR STOR)

11.1.   Der udtages tre prøver af produktet med røbestof for at kontrollere, om produktet er tilsat røbestof på korrekt måde.

11.2.   Smør og koncentreret smør

11.2.1.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og gennemsnittet af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	Den øvre grænse er 12,96 kg/t.

11.3.   Fløde

11.3.1.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og gennemsnittet af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	Den øvre grænse er 11,82 kg/t.

12.   SUPPLERENDE OPLYSNINGER: STATISTISK ANALYSE AF RESULTATER AF BESTEMMELSEN AF TRIENANTOAT I SMØRFEDT VED TRIGLYCERIDANALYSE

Der er gennemført fire fællesafprøvninger for at bestemme trienantoatindholdet i smør med røbestof.

Ni laboratorier deltog i den første ringtest, og der forelå ingen specifikationer om, hvilke analysemetoder der skulle anvendes.

Ti laboratorier deltog i den anden ringtest, og der blev anvendt fire forskellige metoder:

—	kvantitativ bestemmelse af methylheptanoat ved anvendelse af n-nonan eller methylnonanoat som intern standard

—	kvantitativ bestemmelse af trienantoat ved anvendelse af tricaproat som intern standard

—	kvantitativ bestemmelse af methylheptanoat ved anvendelse af en kalibreringsprøve/-blanding

—	kvantitativ bestemmelse af methylheptanoat ved anvendelse af en kalibreringsblanding.

Hvis methylestere af fedtsyrer (FAME) blev analyseret, blev der desuden anvendt to forskellige methyleringsprocedurer (De Francesco og Christopherson & Glass).

På grundlag af resultaterne blev der udvalgt to metoder til den tredje ringtest:

—	kvantitativ bestemmelse af methylheptanoat ved anvendelse af n-nonan eller methylnonanoat som intern standard

—	kvantitativ bestemmelse af trienantoat ved anvendelse af tricaproat som intern standard.

Resultaterne fra 7 laboratorier viste, at FAME-metoden havde en større variabilitet, og det blev derfor besluttet kun at bestemme trienantoat som triglycerid ved anvendelse af proceduren med kvantitativ bestemmelse af trienantoat ved anvendelse af tricaproat som intern standard. Endvidere skal triglyceridanalysen gennemføres med kapillarkolonne.

I den fjerde ringtest blev der rundsendt fire prøver (A, B, C, D), og der blev fremlagt resultater fra ni laboratorier (tabel 1-2).

To laboratorier (DE og EU) analyserede prøverne ved anvendelse af FAME-metoden.

På grund af det begrænsede antal laboratorier er der foretaget en statistisk beregning både af det komplette datasæt (tabel 1-2), inkl. FAME-resultaterne, og af dataene fra triglyceridanalysen.

Outliertest:

—	Prøve A: Dixon, Cochran og Grubbs-test på niveau 1 og 5 % viste én afvigende værdi (outlier) for et laboratorium.

—	Prøve B: Grubbs-test på niveau 5 % viste én afvigende værdi (outlier) for et laboratorium.

—	Prøve C: Dixon og Grubbs-test på niveau 1 og 5 % viste én afvigende værdi (outlier) for et laboratorium.

—	Prøve D: Dixon og Grubbs-test på niveau 1 og 5 % viste én afvigende værdi (outlier) for et laboratorium.

Den afvigende værdi er blevet udelukket fra beregningen.

Det bør bemærkes, at resultaterne fremkommet ved FAME-metoden aldrig blev betragtet som afvigende ved de anvendte test.

Præcisionsparametre

Tabel 1 og 2 viser resultaterne fra alle laboratorierne og præcisionsparametrene, der er beregnet ud fra et acceptabelt antal (8) laboratorier, men som desværre ikke hidrører fra den samme analysemetode.

Tabel 3 og 4 viser kun de resultater, der hidrører fra triglyceridmetoden og de tilsvarende præcisionsparametre. En accept af disse parametre forudsætter, at det lave antal laboratorier (6) accepteres.

Figur 3 og 4 viser tendensen for Sr og SR beregnet for de 4 prøver ud fra de to nævnte datasæt.

Tabel 5 viser værdierne for Sr og SR sammen med de tilsvarende puljede værdier og de samlede parametre for r og R.

Endelig er den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse blevet beregnet.

Tabel 1

Statistiske resultater af triglycerid- + FAME*-metoderne

Prøve A		R1	R2	GNSN	Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater	8
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Antal afvigende resultater	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Afvigende resultater	DК
ZPLA	DE*	11,6	11,8	11,7	Gennemsnitsværdi	11,3
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Korrekt værdi	11,0
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Standardafvigelse for repeterbarhed (Sr)	0,09
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Relativ standardafvigelse for repeterbarhed (RSDr%)	0,80
ËÈLA	FI	11,3	11,2	11,3	Repeterbarhed r (95 %)	0,26
ISPRA	UE*	11,0	11,0	11,0	Relativ repeterbarhed r %	2,24
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Standardafvigelse for reproducerbarhed (SR)	0,23
					Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed (RSDR%)	2,04
					Reproducerbarhed R (95 %)	0,84
					Relativ reproducerbarhed R %	5,71
Prøve B		R1	R2	GNSN	Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater	8
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Antal afvigende resultater	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Afvigende resultater	DK
ZPLA	DE*	14,0	13,8	13,9	Gennemsnitsværdi	13,4
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Korrekt værdi	13,5
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Standardafvigelse for repeterbarhed (Sr)	0,14
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Relativ standardafvigelse for repeterbarhed (RSDr%)	1,04
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Repeterbarhed r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	13,2	13,3	13,3	Relativ repeterbarhed r %	2,91
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Standardafvigelse for reproducerbarhed (SR)	0,35
					Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed (RSDR%)	2,61
					Reproducerbarhed R (95 %)	0,99
					Relativ reproducerbarhed R %	7,31

Tabel 2

Statistiske resultater af triglycerid- + FAME*-metoderne

Prøve C		R1	R2	GNSN	Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater	8
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Antal afvigende resultater	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Afvigende resultater	DK
ZPLA	DE*	9,2	9,4	9,3	Gennemsnitsværdi	9,3
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Korrekt værdi	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Standardafvigelse for repeterbarhed (Sr)	0,14
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Relativ standardafvigelse for repeterbarhed (RSDr%)	1,50
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Repeterbarhed r (95 %)	0,40
ISPRA	UE*	9,4	9,3	9,4	Relativ repeterbarhed r %	4,20
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Standardafvigelse for reproducerbarhed (SR)	0,17
					Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed (RSDR%)	1,82
					Reproducerbarhed R (95 %)	0,47
					Relativ reproducerbarhed R %	5,10
Prøve D		R1	R2	GNSN	Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater	8
RENNES	R1	1,6	1,6	1,6	Antal afvigende resultater	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Afvigende resultater	DK
ZPLA	DE*	2,3	2,3	2,3	Gennemsnitsværdi	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Korrekt værdi	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Standardafvigelse for repeterbarhed (Sr)	0,08
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relativ standardafvigelse for repeterbarhed (RSDr%)	3,81
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Repeterbarhed r (95 %)	0,22
ISPRA	UE*	2,3	2,3	2,3	Relativ repeterbarhed r %	10,67
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Standardafvigelse for reproducerbarhed (SR)	0,24
					Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed (RSDR%)	11,43
					Reproducerbarhed R (95 %)	0,67
					Relativ reproducerbarhed R %	32,00

Tabel 3

Statistiske resultater af triglycerid- + FAME*-metoderne

Prøve A		R1	R2	GNSN	Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater	6
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Antal afvigende resultater	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Afvigende resultater	DК
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Gennemsnitsværdi	11,2
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Korrekt værdi	11,0
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Standardafvigelse for repeterbarhed (Sr)	0,09
ËÈLA	FI	11,3	11,2	11,3	Relativ standardafvigelse for repeterbarhed (RSDr%)	0,80
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Repeterbarhed r (95 %)	0,25
					Relativ repeterbarhed r %	2,24
					Standardafvigelse for reproducerbarhed (SR)	0,13
					Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed (RSDR%)	1,16
					Reproducerbarhed R (95 %)	0,36
					Relativ reproducerbarhed R %	3,25
Prøve B		R1	R2	GNSN	Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater	6
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Antal afvigende resultater	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Afvigende resultater	DК
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Gennemsnitsværdi	13,3
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Korrekt værdi	13,5
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Standardafvigelse for repeterbarhed (Sr)	0,15
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Relativ standardafvigelse for repeterbarhed (RSDr%)	1,13
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Repeterbarhed r (95 %)	0,42
					Relativ repeterbarhed r %	3,16
					Standardafvigelse for reproducerbarhed (SR)	0,33
					Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed (RSDR%)	2,48
					Reproducerbarhed R (95 %)	0,93
					Relativ reproducerbarhed R %	6,94

Tabel 4

Statistiske resultater af triglyceridmetoden

Prøve C		R1	R2	GNSN	Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater	6
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Antal afvigende resultater	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Afvigende resultater	DК
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Gennemsnitsværdi	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Korrekt værdi	9,3
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Standardafvigelse for repeterbarhed (Sr)	0,15
ËÈLA	FI	9,4	9,6	9,5	Relativ standardafvigelse for repeterbarhed (RSDr%)	1,61
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Repeterbarhed r (95 %)	0,42
					Relativ repeterbarhed r %	4,51
					Standardafvigelse for reproducerbarhed (SR)	0,19
					Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed (RSDR%)	2,04
					Reproducerbarhed R (95 %)	0,53
					Relativ reproducerbarhed R %	5,71
Prøve D		R1	R2	GNSN	Antal laboratorier efter eliminering af laboratorier med afvigende resultater	6
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Antal afvigende resultater	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Afvigende resultater	DK
					Gennemsnitsværdi	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Korrekt værdi	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Standardafvigelse for repeterbarhed (Sr)	0,09
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relativ standardafvigelse for repeterbarhed (RSDr%)	4,29
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Repeterbarhed r (95 %)	0,26
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Relativ repeterbarhed r %	12,01
					Standardafvigelse for reproducerbarhed (SR)	0,25
					Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed (RSDR%)	11,90
					Reproducerbarhed R (95 %)	0,69
					Relativ reproducerbarhed R %	33,32

Tabel 5

Repeterbarhed og reproducerbarhed (med FAME)

	Antal laboratorier	Afvigende resultat	Repeterbarhed Sr (95 %)	Reproducerbarhed SR (95 %)
Prøve A	8	1	0,09	0,23
Prøve B	8	1	0,14	0,35
Prøve C	8	1	0,14	0,17
Prøve D	8	1	0,08	0,24
Puljet værdi			0,116	0,256
			R	R
Puljet værdi * 2,8			0,324	0,716
CrD95 =0,40 Minimumsrenhed angivet for trienantoat = 95 % Minimumsgrænse angivet for trienantoat i smørfedt = 11 kg/t Med et konventionelt konfidensinterval på 95 % må gennemsnittet af de to resultater ikke være lavere end:   10,05 kg/t ved iblanding af 95 % ren trienantoat.

Repeterbarhed og reproducerbarhed (uden FAME)

	Antal laboratorier	Afvigende resultat	Repeterbarhed Sr (95 %)	Reproducerbarhed SR (95 %)
Prøve A	6	1	0,09	0,13
Prøve B	6	1	0,15	0,33
Prøve C	6	1	0,15	0,19
Prøve D	6	1	0,09	0,25
Puljet værdi			0,124	0,237
			r	R
Puljet værdi * 2,8			0,347	0,663
CrD95 = 0,36 Minimumsrenhed angivet for trienantoat = 95 % Minimumsgrænse angivet for trienantoat i smørfedt = 11 kg/t Med et konventionelt konfidensinterval på 95 % må gennemsnittet af de to resultater ikke være lavere end:   10,09 kg/t ved iblanding af 95 % ren trienantoat.

Figur 1 (1)

Forsøgsresultater: Prøve A

Forsøgsresultater: Prøve B

Forsøgsresultater: Prøve C

Forsøgsresultater: Prøve D

Figur 2

Standardafvigelse for repeterbarhed og reproducerbarhed på forskellige niveauer (TG+FAME)

Figur 3

Standardafvigelse for repeterbarhed og reproducerbarhed på forskellige niveauer (TG)

Figur 4

Eksempel ved direkte injektion på kolonnen

---

(1)  = FAME-metode

BILAG VI

(Artikel 5)

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF VANILLIN I KONCENTRERET SMØR, SMØR OG FLØDE VED HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI

1.   FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE

Kvantitativ bestemmelse af vanillin i koncentreret smør, smør og fløde.

2.   PRINCIP

Ekstraktion af en kendt prøvemængde ved hjælp af en blanding af isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2). Udskillelse af størsteparten af fedtstoffet ved afkøling (temperatur mellem –15 og –20 °C) efterfulgt af centrifugering.

Efter fortynding med vand bestemmes vanillinindholdet ved højtryksvæskekromatografi (HPLC).

3.   APPARATUR

Sædvanligt laboratorieapparatur, herunder især følgende:

3.1.   Fryser med en arbejdstemperatur mellem –15 °C og –20 °C

3.2.   Injektionssprøjter (engangssprøjter) 2 ml

3.3.   Membranfiltre (porestørrelse: 0,45 μm), modstandsdygtige over for en opløsning med 5 % ekstraktionsmiddel (4.4)

3.4.   Væskekromatografisk system bestående af pumpe (flow 1,0 ml/min.), injektionsenhed (20 μl injektion, automatisk eller manuel), UV-detektor (306 nm, fuldt udslag 0,01 absorptionsenhed), skriver eller integrator samt kolonnetermostat indstillet til 25 °C

3.5.   Analysekolonne (250 mm x 4,6 mm indvendig diameter) pakket med LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) eller tilsvarende

3.6.   Forkolonne (ca. 20 mm x 3 mm indvendig diameter) pakket tørt med LiChrospher RP 18 (5-10 μm) eller tilsvarende

3.7.   Centrifuge, som arbejder ved 2 000 omdrejninger pr. minut.

4.   REAGENSER

Alle reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet.

4.1.   Isopropanol

4.2.   Ethanol, 96 % (v/v)

4.3.   Acetonitril

4.4.   Ekstraktionsopløsning

Isopropanol (4.1), ethanol (4.2) og acetonitril (4.3) blandes i forholdet 1:1:2 (v/v)

Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd) ≥ 98 %

4.5.1.   Vanillinstamopløsning (= 500 μg/ml)

Ca. 50 mg (»CM« mg) vanillin (4.5) afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg i en 100 ml målekolbe; der tilsættes 25 ml ekstraktionsmiddel (4.4) og fyldes op med vand.

4.5.2.   Vanillinstandardopløsning (= 10 μg/ml)

Der afpipetteres 5 ml vanillinstamopløsning (4.5.1) i en 250 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op med vand.

4.5.3.   Methanol, HPLC-kvalitet

4.5.4.   Iseddike

4.5.5.   Vand, HPLC-kvalitet

4.5.6.   Mobil fase til HPLC

300 ml methanol (4.5.3), ca. 500 ml vand (4.5.5) og 20,0 ml iseddike (4.5.4) blandes i en 1 000 ml målekolbe, og der fyldes op med vand (4.5.5). Blandingen filtreres gennem et filter (0,45 μm) (3.3).

5.   FREMGANGSMÅDE

5.1.   Forberedelse af prøven

5.1.1.   Smør

Prøven opvarmes, indtil den begynder at smelte. Lokal opvarmning til ca. 30 °C skal undgås. Smørret må under ingen omstændigheder skille i to faser. Når prøven er blevet tilstrækkeligt blød, homogeniseres den ved rystning. Der omrøres i 15 sek., inden der udtages en prøve. Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg ca. 5 g (»SM« g) smør i en 100 ml målekolbe.

5.1.2.   Koncentreret smør

Umiddelbart inden prøveudtagningen anbringes beholderen med koncentreret smør i en ovn ved 40-50 °C, indtil smørret er fuldstændig smeltet. Prøven blandes ved forsigtig omdrejning eller omrøring. For voldsom bevægelse med dannelse af luftbobler skal undgås. Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg ca. 4g (»SM« g) koncentreret smør i en 100 ml målekolbe.

5.1.3.   Fløde

Prøven opvarmes i vandbad eller i inkubator ved en temperatur på 35-40 °C. Fedtstoffet fordeles ensartet ved forsigtig omdrejning og om nødvendigt ved omrøring. Prøven afkøles hurtigt til 20 ± 2 °C. Prøven skal fremtræde ensartet, ellers gentages proceduren. Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg ca. 10g (»SM« g) fløde i en 100 ml målekolbe.

5.2.   Fremstilling af prøveopløsning

Der tilsættes ca. 75 ml ekstraktionsopløsning (4.4) til analyseprøven (5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3), og der omrøres eller omrystes kraftigt i ca. 15 min. og fyldes op med ekstraktionsopløsning (4.4). Ca. 10 ml af dette ekstrakt overføres til et reagensglas med prop. Glasset stilles i fryseren (3.1) i ca. 30 min. Det afkølede ekstrakt centrifugeres i 5 minutter ved ca. 2 000 omdrejninger pr. minut, og der dekanteres straks. Den dekanterede opløsning henstår, til den har nået stuetemperatur. Der afpipetteres 5 ml heraf i en 100 ml målekolbe, og der fyldes op med vand. En delprøve heraf filtreres på membranfilter (3.3) ved anvendelse af en injektionssprøjte (3.2). Filtratet er klart til HPLC-analyse.

5.3.   Kalibrering

Der afpipetteres 5 ml vanillinstandardopløsning (4.5.2) i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes 5 ml ekstraktionsopløsning (4.4) og fyldes op med vand til mærket. Denne opløsning indeholder 0,5 μg vanillin pr. ml.

5.4.   Bestemmelse ved HPLC

Kromatografisystemet stabiliseres i ca. 30 min. Standardopløsningen (5.3) indsprøjtes. Dette gentages, indtil forskellen i topareal eller tophøjde mellem to på hinanden følgende indsprøjtninger er mindre end 2 %. Under de beskrevne forhold har vanillin en retentionstid på ca. 9 min. Der foretages en dobbeltanalyse af standardopløsningen (5.3) med indsprøjtning af 20 μl. Der indsprøjtes 20 μl prøveopløsning (5.2). Arealet eller højden af den fremkomne vanillintop bestemmes. Efter 10 indsprøjtninger af prøveopløsninger (5.2) gentages dobbeltanalysen af standardopløsningen (5.3).

6.   BEREGNING AF RESULTATER

Det gennemsnitlige topareal (eller tophøjde) (»AC«) for de vanillintoppe, der er fremkommet ved de to dobbeltanalyser før og efter hver batch af prøveopløsninger (4 toparealer eller tophøjder), beregnes.

Responsfaktoren (R) beregnes således:

hvor CM er massen af vanillin i mg (4.5.1).

Indholdet (i mg/kg) af vanillin (C) i analyseprøven beregnes ved følgende formel:

hvor:

AS	=	toparealet eller tophøjden af vanillintoppen fra analyseprøven
SM	=	massen af analyseprøven i g (5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3).

Bemærkning: Når fløden analyseres for vanillin, skal koncentrationen af røbestoffet udtrykkes som mg røbestof/kg mælkefedt. Dette gøres ved, at man multiplicerer C med 100/f, hvor f er flødens fedtindhold i procent (m/m).

20	=	en faktor, hvor der tages hensyn til fortyndingerne af standard- og analyseprøven
0,96	=	korrektionsfaktoren for fedtindholdet ved første fortynding af analyseprøven

Bemærkning: I stedet for toparealer kan der benyttes tophøjder (se punkt 8.3).

7.   METODENS NØJAGTIGHED

7.1.   Repeterbarhed (r)

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 16 mg/kg.

7.2.   Reproducerbarhed (R)

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke overstige 27 mg/kg.

8.   TOLERANCEGRÆNSER

8.1.   Der skal tages tre prøver fra produktet med røbestof for at kontrollere homogeniteten.

Røbestof fra vanille eller syntetisk vanillin

8.2.1.   Iblandingen af 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd er 250g pr. t koncentreret smør eller smør. For fløde med røbestof er iblandingen 250g pr. t mælkefedt.

8.2.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	220,8 mg/kg (95 % af den mindste iblanding)

—	158,3 mg/kg (70 % af den mindste iblanding).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 220,8 mg/kg og 158,3 mg/kg.

Røbestof kun fra vanilleplantens frugt eller komplette ekstrakter heraf

8.3.1.   Iblandingen af 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd er 100g pr. t koncentreret smør eller smør. For fløde med røbestof er iblandingen 100g pr. t mælkefedt.

8.3.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	78,3 mg/kg (95 % af den mindste iblanding)

—	53,3 mg/kg (70 % af den mindste iblanding).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 78,3 mg/kg og 53,3 mg/kg.

9.   BEMÆRKNINGER

9.1.   Genfindingen af vanillin, der er tilsat i en mængde på 250 mg pr. kg smørolie, varierer fra 97,0 % til 103,8 %. I gennemsnit er der fundet 99,9 % med en standardafvigelse på 2,7 %.

9.2.   Standardopløsningen indeholder 5 % ekstraktionsopløsning for at kompensere for topforbredning, som følge af at prøveopløsningerne indeholder 5 % ekstraktionsopløsning. Derved kan der ved den kvantitative bestemmelse benyttes tophøjder.

9.3.   Analysen bygger på en lineær kalibreringskurve, der går gennem nulpunktet.

9.4.   Med passende fortyndinger af standardopløsningen (4.5.2) bør lineariteten kontrolleres, første gang analysen udføres, og derefter regelmæssigt og efter udskiftninger eller reparationer på HPLC-udstyret. Vanillin kan nedbrydes til vanillinsyre, divanillin eller andre bestanddele som følge af naturligt forekommende enzymer i upasteuriseret fløde eller produkter heraf.

BILAG VII

(Artikel 5)

BESTEMMELSE AF ETHYLESTER AF β-APO-8'-CAROTENSYRE I KONCENTRERET SMØR OG SMØR VED SPEKTROMETRI

1.   FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE

Det er en metode til kvantitativ bestemmelse af ethylester af β-apo-8'-carotensyre (apocarotenester) i koncentreret smør og smør. Apocarotenester er summen af alle stoffer, der er til stede i et ekstrakt af prøver fremstillet på de i metoden beskrevne betingelser, og som absorberer lys ved 440 nm.

2.   PRINCIP

Smørfedt opløses i petroleumsether (light petroleum), og absorbansen måles ved 440 nm. Indholdet af apocarotenester bestemmes ved reference til en ekstern standard.

3.   APPARATUR

3.1.   Målepipetter på 0,25, 0,50, 0,75 og 1,0 ml

3.2.   Spektrofotometer, der er egnet til brug ved 440 nm (og 447-449 nm), og som er udstyret med kuvetter med en lysvej på 1 cm

3.3.   Målekolber, 20 ml og 100 ml

3.4.   Analysevægt med en følsomhed på 0,1 mg, der kan veje med en nøjagtighed på 1 mg, og som kan aflæses med en nøjagtighed på 0,1 mg

3.5.   Ovn, 45 °C ± 1 °C

3.6.   Hurtigfiltrerende askefri filtre.

4.   REAGENSER

Alle reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet.

Opslæmning af apokarotenester (ca. 20 %)

4.1.1.   Opslæmningens indhold bestemmes som følger:

Opslæmningen opvarmes til mellem 45 °C og 50 °C og homogeniseres i den uåbnede originalbeholder. Ca. 400 mg afvejes nøjagtigt ned i en 100 ml målekolbe, opløses i 20 ml chloroform (4.4) og målekolben fyldes op til mærket med cyclohexan (4.5). 5 ml af denne opløsning fortyndes til 100 ml med cyclohexan (opløsning A). 5 ml af opløsning A fortyndes til 100 ml med cyclohexan. Absorbansen måles ved 447-449 nm (maksimum måles med cyclohexan som reference i kuvetter med 1 cm lysvej).

Indhold af apocarotenester P (%) = (Abs max × 40 000) / (Msusp × 2 550) eller efter formlen: (Absmax / 2 550) × (100 / 5) × (100 / 5) × (100 / Msusp)

Absmax	=	måleopløsningens absorbans ved maksimum
Msusp	=	opslæmningens masse (g)
2 550	=	referenceværdi Abs (1 %, 1 cm)
P	=	opslæmningens renhed (indhold) (%)

Bemærkning: En opslæmning af apocarotenester er følsom for luft, varme og lys. Den kan opbevares i ca. 12 måneder i uåbnet originalbeholder (forseglet under kvælstof) på et køligt sted. Efter åbning skal indholdet anvendes inden for kort tid.

4.1.2.   Standardopløsning af apocarotenester, ca. 0,2 mg/ml

0,100 g ± 1 mg opslæmning af apocarotenester (4.1.1) afvejes (Wg), opløses i petroleumsether (4.2) og overføres kvantitativt til en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med petroleumsether.

Denne opløsning indeholder (W × P) / 10 mg/ml apocarotenester.

Bemærkning: Opløsningen skal opbevares på et køligt sted i mørke. Ubrugt opløsning kasseres efter en måneds forløb.

4.2.   Petroleumsether (kogepunktsinterval 40-60 °C)

4.3.   Natriumsulfat, vandfrit, granuleret og forinden tørret ved 102 °C i to timer

4.4.   Chloroform

4.5.   Cyclohexan.

5.   FREMGANGSMÅDE

5.1.   Forberedelse af prøven

5.1.1.   Koncentreret smør

Prøven smeltes i ovn ved ca. 45 °C.

5.1.2.   Smør

Prøven smeltes i ovn ved ca. 45 °C. En repræsentativ portion filtreres gennem et filter, der indeholder ca. 10 g vandfrit natriumsulfat (4.3), afskærmet fra stærk naturlig eller kunstig belysning, bibeholdt ved en temperatur på 45 °C. En passende mængde smørfedt opsamles.

5.2.   Bestemmelse

Ca. 1 g koncentreret smør (eller ekstraheret smørfedt (5.1.2)) (M) afvejes med 1 mg nøjagtighed. Det overføres kvantitativt til en 20 ml målekolbe (V), der fyldes op til mærket med petroleumsether (4.2), og blandes grundigt.

En delmængde overføres til en 1 cm kuvette, og absorbansen måles ved 440 nm med petroleumsether som reference. Koncentrationen af apocarotenester i opløsningen fås ud fra den fremkomne standardkurve (C μ/ml).

5.3.   Kalibrering

0, 0,25, 0,5, 0,75 og 1,0 ml standardopløsning af apocarotenester (4.1.2) pipetteres i fem 100 ml målekolber. Der fyldes op til mærket med petroleumsether (4.2) og blandes.

Opløsningernes koncentrationer går fra 0 til 2 μg/ml og angives nøjagtigt ved reference til koncentrationen af standardopløsningen (4.1.2) (W. × P) / 10 mg/ml. Absorbansen måles ved 440 nm med petroleumsether (4.2) som reference.

Absorbanserne afbildes på y-aksen mod koncentrationen af apocarotenester ad x-aksen. Standardkurvens ligning beregnes.

6.   BEREGNING AF RESULTATER

6.1.   Indholdet af apocarotenester udtrykt i mg/kg produkt angives ved:

koncentreret smør: (C × V)/M

smør: 0,82 (C × V)M

hvor:

C	=	indhold af apocarotenester i μg/ml aflæst på kalibreringskurven (5.3)
V	=	volumen (ml) af prøveopløsningen (5.2)
M	=	massen (g) af analyseprøven (5.2)
0,82	=	en korrektionsfaktor for smørfedtindholdet i smør.

7.   METODENS NØJAGTIGHED

7.1.   Repeterbarhed

7.1.1.   Analyse af smør

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 1,4 mg/kg.

7.1.2.   Analyse af koncentreret smør

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 1,6 mg/kg.

7.2.   Reproducerbarhed

7.2.1.   Analyse af smør

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke overstige 4,7 mg/kg.

7.3.   Analyse af koncentreret smør

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke overstige 5,3 mg/kg.

7.4.   Kilde for præcisionsdata

Præcisionsdataene blev fastlagt på grundlag af et forsøg i 1995, der omfattede elleve laboratorier og tolv prøver af smør med røbestof (seks blinde dobbeltprøver) og tolv prøver af koncentreret smør med røbestof (seks blinde dobbeltprøver).

8.   TOLERANCEGRÆNSER

8.1.   Der udtages tre prøver af produktet med røbestof for at kontrollere, om produktet er tilsat røbestof på korrekt måde.

8.2.   Smør

8.2.1.   Under hensyntagen til baggrundsabsorbansen er iblandingen for smør 22 mg/kg.

8.2.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	17,7 mg/kg (95 % af den mindste iblanding)

—	12,2 mg/kg (70 % af den mindste iblanding).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 17,7 mg/kg og 12,2 mg/kg.

8.3.   Koncentreret smør

8.3.1.   Under hensyntagen til baggrundsabsorbansen er iblandingen for koncentreret smør 24 mg/kg.

Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	19,2 mg/kg (95 % af den mindste iblanding)

—	13,2 mg/kg (70 % af den mindste iblanding).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 19,2 mg/kg og 13,2 mg/kg.

BILAG VIII

(Artikel 5)

BESTEMMELSE AF SITOSTEROL OG STIGMASTEROL I KONCENTRERET SMØR OG SMØR VED GASKROMATOGRAFI I KAPILLARKOLONNE

1.   FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE

Metoden består i en procedure til kvantitativ bestemmelse af sitosterol og stigmasterol i koncentreret smør og smør. Ved sitosterol forstås summen af β-sitosterol og 22-dihydro-β-sitosterol, da de andre sitosteroler anses for at være uden større betydning.

2.   PRINCIP

Det koncentrerede smør og smørret forsæbes med kaliumhydroxid i en ethanolopløsning og uforsæbelige bestanddele ekstraheres med diethylether.

Sterolerne omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved gaskromatografi i en kapillarkolonne med betulin som intern standard.

3.   APPARATUR

3.1.   En 150 ml kolbe til forsæbning med tilbagesvaler med glasslib

3.2.   500 ml skilletragte

3.3.   250 ml kolber

3.4.   Trykudligningstragte, 250 ml eller tilsvarende, til opsamling af fordampet diethylether

3.5.   Glaskolonne, 350 mm × 20 mm, med sintret glasskive

3.6.   Vandbad eller varmekappe

3.7.   Prøveglas, 2 ml

Gaskromatograf (med splitningssystem), som egner sig til brug med kapillarkolonne, og som består af:

3.8.1.   en termostatstyret kolonneovn, som kan opretholde den ønskede temperatur inden for ±1 °C

3.8.2.   injektionsblok med temperaturindstilling

3.8.3.   flammeioniseringsdetektor og konverter/forstærker

3.8.4.   skriver med integrator, som kan anvendes sammen med konverteren/forstærkeren (3.8.3)

3.9.   Kapillarkolonne i kvartsglas, coated med BP1 eller tilsvarende (eller anden kolonne med mindst tilsvarende resolution) i en ensartet lagtykkelse på 0,25 μm. Kolonnen skal kunne adskille trimethylsilylderivater af lanosterol og sitosterol. En BP1-kolonne på 12 m med 0,2 mm indre diameter er velegnet

3.10.   Mikrosprøjte på 1 μl med hærdet nål til gaskromatografi.

4.   REAGENSER

Alle reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet. Der anvendes destilleret vand eller vand af mindst tilsvarende renhed.

4.1.   Ethanol, mindst 95 %.

4.2.   Kaliumhydroxid, 60 %; 600 g kaliumhydroxid (minimum 85 %) opløses i vand og fortyndes til 1 liter med vand.

Betulin, mindst 99 % renhed

Betulinopløsninger i diethylether (4.4)

4.3.1.1.   Betulinopløsningen til bestemmelse af sitosterol skal være af en koncentration på 1,0 mg/ml.

4.3.1.2.   Betulinopløsningen til bestemmelse af stigmasterol skal være af en koncentration på 0,4 mg/ml.

4.4.   Analytisk ren diethylether (fri for peroxider og rester)

4.5.   Natriumsulfat, vandfrit, granuleret og forinden tørret ved 102 °C i to timer.

4.6.   Silyleringsreagens, f.eks. TRI-SIL (kan fås fra Pierce Chemical Co., katalognummer 49001) eller tilsvarende (NB: TRI-SIL er brandfarligt og giftigt, ætsende og kan være kræftfremkaldende. Laboratoriepersonalet skal have kendskab til sikkerhedsbestemmelserne for TRI-SIL og handle derefter)

4.7.   Lanosterol

Sitosterol af en kendt renhedsgrad på ikke under 90 % (P)

Bemærkning 1: Renhedsgraden af standardmaterialer, som anvendes til kalibrering, fastsættes efter standardiseringsmetoden. Det forudsættes, at samtlige steroler, som findes i prøven, kommer til udtryk på kromatogrammet, at toppenes samlede areal repræsenterer 100 % af sterolindholdet og at sterolerne fremkalder samme detektorrespons. Systemets linearitet skal kontrolleres for de aktuelle koncentrationsområder.

4.8.1.   Sitosterolstandardopløsning: Der fremstilles en opløsning af sitosterol (4.8) i diethylether (4.4), der indeholder ca. 0,5 mg/ml, (med en nøjagtighed på 0,001 mg/ml) (W1)

Stigmasterol af en kendt renhedsgrad på ikke under 90 % (P)

4.9.1.   Stigmasterolstandardopløsning: Der fremstilles en opløsning af stigmasterol (4.9) i diethylether (4.4), der indeholder ca. 0,2 mg/ml, (med en nøjagtighed på 0,001 mg/ml (W1).

4.10.   Blanding til kontrol af resolution. Der fremstilles en opløsning af 0,05 mg lanosterol (4,7) og 0,5 mg sitosterol (4.8) pr. ml diethylether (4.4).

5.   METODE

5.1.   Fremstilling af standardopløsninger til kromatografi

Den interne standardopløsning (4.3.1) tilsættes til den pågældende sterolstandardopløsning samtidig med tilsætning til den forsæbede prøve (se 5.2.2).

5.1.1.   Standardkromatografiopløsning for sitosterol: Der overføres 1 ml sitosterolstandardopløsning (4.8.1) til hvert af to prøveglas (3.7), og diethyletheren afdampes med kvælstof. Der tilsættes 1 ml intern standardopløsning (4.3.1.1), og diethyletheren afdampes med kvælstof.

5.1.2.   Standardkromatografiopløsning for sitosterol: Der overføres 1 ml sitosterolstandardopløsning (4.9.1) til hvert af to prøveglas (3.7), og diethyletheren afdampes med kvælstof. Der tilsættes 1 ml intern standardopløsning (4.3.1.2), og diethyletheren afdampes med kvælstof.

5.2.   Tilberedning af uforsæbelige bestanddele

5.2.1.   Smørprøven smeltes ved opvarmning til højst 35 °C. Den blandes omhyggeligt ved omrøring.

Der afvejes 1 g smør (W2) eller koncentreret smør (W2), med 1 mg nøjagtighed, i en 150 ml kolbe (3.1). Der tilsættes 50 ml ethanol (4.1) og 10 ml kaliumhydroxidopløsning (4.2). Tilbagesvaleren påsættes, og kolben opvarmes til ca. 75 °C i 30 minutter. Svaleren tages af, og kolben afkøles til rumtemperatur.

5.2.2.   Der tilsættes 1,0 ml intern standardopløsning (4.3.1.1) til kolben, hvis indholdet af sitosterol skal bestemmes, eller 4.3.1.2, hvis indholdet af stigmasterol skal bestemmes. Opløsningen blandes omhyggeligt. Kolbens indhold overføres kvantitativt til en 500 ml skilletragt (3.2). Kolben skylles med 50 ml vand og dernæst med 250 ml diethylether (4.4). Skilletragten rystes kraftigt i to minutter, hvorefter man lader faserne adskilles. Det nedre vandige lag tappes af, og etherlaget vaskes ved at ryste kolben med fire hold vand a 100 ml.

Bemærkning 2:: For at undgå emulsionsdannelse skal de første to skylninger med vand foretages forsigtigt (kolben vendes ti gange). Ved tredje skylning kan der rystes kraftigt i 30 sekunder. En eventuel emulsion kan brydes ved at tilsætte 5 til 10 ml ethanol. Hvis der tilsættes ethanol, skal der foretages yderligere to grundige skylninger med vand.

5.2.3.   Det klare, sæbefrie etherlag ledes igennem en glaskolonne (3.5), som indeholder 30 g vandfri natriumsulfat (4,5). Etheren opsamles i en 250 ml kolbe (3.3). Der tilsættes en kogesten, og etheren afdampes til næsten tørhed i vandbad eller varmekappe, mens overskydende opløsningsmiddel omhyggeligt opsamles.

Bemærkning 3: Hvis prøveekstrakter inddampes til fuldstændig tørhed ved for høj temperatur, kan der ske tab af sterol.

5.3.   Fremstilling af trimethylsilylethere

5.3.1.   Den resterende etheropløsning i kolben hældes i et 2 ml prøveglas (3.7) med 2 ml diethylether, og etheren afdampes med kvælstof. Kolben skylles med yderligere to hold diethylether a 2 ml, og indholdet hældes hver gang over i prøveglasset, og etheren afdampes med kvælstof hver gang.

5.3.2.   Prøven silyleres ved tilsætning af 1 ml TRI-SIL (4.6). Prøveglasset lukkes og rystes kraftigt for at opløse prøven. Hvis prøven stadig ikke er fuldstændigt opløst, opvarmes den til 65-70 °C. Prøven henstår i mindst fem minutter, inden den indsprøjtes i gaskromatografen. Standardopløsningerne silyleres på samme måde som prøverne. Opløsningen til kontrol af resolution (4.10) silyleres på samme måde.

Bemærkning 4: Silylering skal foretages i vandfrit miljø. Ved ufuldstændig silylering ses en top tæt ved betulintoppen.

Ethanol kan give interferens ved silylering. Dette kan skyldes utilstrækkelig skylning ved ekstraktionen. Hvis dette problem forekommer, kan der foretages en femte skylning med kraftig rystning i 30 sekunder ved ekstraktionen.

5.4.   Gaskromatografisk analyse

5.4.1.   Valg af kromatografibetingelser

Gaskromatografen indstilles som angivet i betjeningsvejledningen.

De vejledende kromatografibetingelser er som følger:

—	kolonnetemperatur: 265 °C

—	injektorblokkens temperatur: 265 °C

—	detektorens temperatur: 300 °C

—	bæregassens gennemstrømningshastighed: 0,6 ml/min.

—	hydrogentryk: 84 kPa

—	lufttryk: 155 kPa

—	splitningssystemet indstilles til mellem 10:1 og 50:1 og optimeres i henhold til betjeningsvejledningen, hvorefter detektorresponsens linearitet kontrolleres inden for det aktuelle koncentrationsområde. Bemærkning 5: Det er særlig vigtigt, at injektionsblokkens belægning rengøres regelmæssigt.

—	indsprøjtet mængde: 1 μl trimethylsilyletheropløsning.

Systemet skal være i ligevægt og basislinjen stabil, inden analysen påbegyndes.

Disse betingelser kan fraviges, hvis særlige forhold ved kolonnen og gaskromatografen gør det nødvendigt for at opnå kromatogrammer, som opfylder følgende krav:

—	Sitosteroltoppen skal være tydeligt adskilt fra lanosteroltoppen. I figur 1 ses, hvordan et kromatogram af en silyleret blanding til kontrol af resolutionen (4.10) typisk skal se ud.

—	Den relative retentionstid for følgende steroler skal være ca.: — cholesterol: 1,0 — stigmasterol: 1,3 — sitosterol: 1,5 — betulin: 2,5

—	Retentionstiden for betulin skal være ca. 24 minutter.

5.4.2.   Analyseprocedure

Der indsprøjtes 1 μl silyleret standardopløsning (stigmasterol eller sitosterol), og integratorens kalibreringsparametre indstilles.

Herefter indsprøjtes yderligere 1 μl silyleret standardopløsning for at bestemme responsfaktorerne for betulin.

Der indsprøjtes 1 μl silyleret prøveopløsning, og toppene aflæses. Hver kromatografisk serie skal begyndes med og efterfølges af indsprøjtning af standardopløsninger.

Som hovedregel kan der indsprøjtes seks prøver i hver serie.

Bemærkning 6: Integration af stigmasteroltoppen skal også omfatte en evt. hale som afgrænset af punkt 1, 2 og 3 i figur 2b.

Integration af sitosteroltoppen skal også omfatte toppen for 22-dihydro-β-sitosterol (stigmastanol), som eluerer umiddelbart efter sitosterol (figur 3b), når den samlede mængde sitosterol bestemmes.

6.   BEREGNING AF RESULTATER

6.1.   Arealet af steroltoppe og betulintoppe i begge referencekromatogrammer omkring en serie bestemmes, og R1 beregnes således:

R1 = (gennemsnitsarealet af steroltoppen i standardopløsningen)/(gennemsnitsarealet af betulintoppen i standardopløsningen)

Arealet af steroltoppen (stigmasterol og sitosterol) og betulintoppen i prøven bestemmes, og R2 beregnes således:

R2 = (arealet af steroltoppen i prøven)/(arealet af betulintoppen i prøven)

W1	=	sterolindhold (i mg) i 1 ml standardopløsning (4.8.1 eller 4.9.1)
W2	=	prøvens vægt i g (5.2.1)
P	=	renhedsgrad af sterolstandarden (4.8 eller 4.9)

Sterolindhold i prøven (mg/kg) = ((R 2) / (R 1)) × ((W 1) / (W 2)) × P × 10

7.   METODENS PRÆCISION

7.1.   Smør

7.1.1.   Repeterbarhed

7.1.1.1.   Stigmasterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 19,3 mg/kg.

7.1.1.2.   Sitosterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 23,0 mg/kg.

7.1.2.   Reproducerbarhed

7.1.2.1.   Stigmasterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke overstige 31,9 mg/kg.

7.1.2.2.   Sitosterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke være større end 8,7 % af gennemsnittet af resultaterne.

7.1.3.   Kilde for præcisionsdata

Præcisionsdataene er fastlagt på grundlag af et eksperiment, som i 1992 blev foretaget med otte laboratorier og seks prøver (blindbestemmelse med tre dobbeltprøver) for stigmasterol samt seks prøver (blindbestemmelse med tre dobbeltprøver) for sitosterol.

7.2.   Koncentreret smør

7.2.1.   Repeterbarhed

7.2.1.1.   Stigmasterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 10,2 mg/kg.

7.2.1.2.   Sitosterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke være større end 3,6 % af gennemsnittet af resultaterne.

7.2.2.   Reproducerbarhed

7.2.2.1.   Stigmasterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke overstige 25,3 mg/kg.

7.2.2.2.   Sitosterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke være større end 8,9 % af gennemsnittet af resultaterne.

7.2.3.   Kilde for præcisionsdata

Præcisionsdataene er fastlagt på grundlag af et eksperiment, som i 1991 blev foretaget med ni laboratorier og seks prøver (blindbestemmelse med tre dobbeltprøver) for stigmasterol samt seks prøver (blindbestemmelse med tre dobbeltprøver) for sitosterol.

8.   TOLERANCEGRÆNSER

8.1.   Der udtages tre prøver af produktet med røbestof for at kontrollere, om produktet er tilsat røbestof på korrekt måde.

8.2.   Smør

8.2.1.   Stigmasterol

8.2.1.1.   Der iblandes 150 g mindst 95 % ren stigmasterol pr. t smør, dvs. 142,5 mg/kg, eller 170 g mindst 85 % ren stigmasterol pr. t smør, dvs. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	115,8 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigmasterol)

—	117,7 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigmasterol)

—	80,1 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigmasterol)

—	81,5 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigmasterol).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 115,8 mg/kg og 80,1 mg/kg eller mellem 117,7 mg/kg og 81,5 mg/kg.

8.2.2.   Sitosterol

8.2.2.1.   Der iblandes 600 g mindst 90 % ren sitosterol pr. t smør, dvs. 540 mg/kg.

8.2.2.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	482,6 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol)

—	347,6 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 482,6 mg/kg og 347,6 mg/kg.

8.3.   Koncentreret smør

8.3.1.   Stigmasterol

8.3.1.1.   Der iblandes 150 g mindst 95 % ren stigmasterol pr. t koncentreret smør, dvs. 142,5 mg/kg eller 170 g mindst 85 % ren stigmasterol pr. t koncentreret smør, dvs. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	118,5 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigmasterol)

—	120,4 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigmasterol)

—	82,9 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigmasterol)

—	84,3 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigmasterol).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 118,5 mg/kg og 82,9 mg/kg eller mellem 120,4 mg/kg og 84,3 mg/kg.

8.3.2.   Sitosterol

8.3.2.1.   Der iblandes 600 g mindst 90 % ren sitosterol pr. t koncentreret smør, dvs. 540 mg/kg.

8.3.2.2.   Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier:

—	480,9 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol)

—	345,9 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 480,9 mg/kg og 345,9 mg/kg.

Figur 1

Kromatogram af opløsning til kontrol af adskillelsesevne

Det er bedst, hvis toppene er fuldstændig adskilt, dvs. At toppen for lanosterol går helt ned til basislinjen, før sitosteroltoppen begynder. En vis overlapning kan dog accepteres.

Figur 2a	Figur 2b
Stigmasterolstandardopløsning	Smørprøve denatureret med stigmasterol
Bemœrk: Integration af stigmasteroltoppen skal også omfatte en eventuel hale som afgrænset af punkt 1, 2 og 3.

Figur 3a	Figur 3b
β-sitosterolstandardopløsning	Smørprøve denatureret med β-sitosterol
Bemœrk: β-sitosterol indeholder ofte et fremmedstof (stigmastanol), som eluerer umiddelbart efter β-sitosterol. Det samlede indhold af β-sitosterol findes ved at lægge disse to toppes arealer sammen.