1)

V části A se doplňuje tato kapitola:

„A.25   DISOCIAČNÍ KONSTANTY VE VODĚ (TITRAČNÍ METODA – SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA – KONDUKTOMETRICKÁ METODA)

ÚVOD

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 112 (1981).

Předpoklady

Pomocné informace

Použití metody

Podklady pro metodu

Tato zkušební metoda je založena na metodách uvedených v odkazech v oddíle „Literatura“ a na předběžném návrhu dokumentu Návod pro oznamování před výrobou, EPA, 18. srpna 1978.

METODA – ÚVOD, ÚČEL, ROZSAH, RELEVANTNOST, POUŽITÍ A OMEZENÍ ZKOUŠKY

Disociace látky ve vodě má význam pro posuzování jejího dopadu na životní prostředí. Závisí na ní forma látky, což určuje její chování a přepravu. Může ovlivňovat absorpci chemické látky do půdy a sedimentů a adsorpci do biologických buněk.

Definice a jednotky

Disociace je reverzibilní rozdělení molekuly na dvě nebo více chemických látek, které mohou mít charakter iontů. Tento proces obecně vyjadřuje rovnice

RX ⇌ R ++ X –

a koncentrační rovnovážná konstanta určující reakci je

Například v konkrétním případě, kde R je vodík (látkou je kyselina), je tato konstanta

nebo

Referenční látky

Následující referenční látky není nutné používat vždy při zkoušení nové chemické látky. Jsou uvedeny především proto, aby bylo možné čas od času provést kalibraci metody a aby bylo možné porovnat výsledky v případě, že se použije jiná metoda.

Bylo by užitečné mít látku s několika hodnotami pK, jak je uvedeno níže v oddíle „Princip zkušební metody“. Takovou látkou by mohla být:

Princip zkušební metody

Popisovaný chemický proces je celkově jen mírně závislý na teplotě v teplotním rozpětí, které je běžné v životním prostředí. Ke stanovení disociační konstanty je nutné změřit koncentrace disociované a nedisociované formy chemické látky. Příslušnou konstantu lze stanovit na základě znalosti stechiometrie disociační reakce uvedené výše v oddíle „Definice a jednotky“. V konkrétním případě popsaném v této zkušební metodě se látka chová jako kyselina nebo jako zásada a stanovení se nejpohodlněji provede určením relativních koncentrací iontové a neiontové formy látky a pH roztoku. Vztah mezi těmito pojmy popisuje rovnice pro výpočet pKa v oddíle „Definice a jednotky“ výše. Některé látky vykazují více než jednu disociační konstantu a lze odvodit obdobné rovnice. Některé z metod zde popsaných jsou vhodné také pro nekyselé/bazické disociace.

Kritéria kvality

Opakovatelnost

Stanovení disociační konstanty by se mělo provést opakovaně (minimálně tři stanovení) s tolerancí ± 0,1 log.

POPIS ZKUŠEBNÍCH POSTUPŮ

Existují dvě základní metody pro stanovení pKa. Jedna zahrnuje titraci známého množství látky se standardní kyselinou nebo případně zásadou; druhá zahrnuje stanovení relativní koncentrace ionizované a neionizované formy a její závislosti na pH.

Příprava

Metody založené na těchto zásadách lze rozdělit na titrační, spektrofotometrické a konduktometrické.

Zkušební roztoky

Při titrační metodě a konduktometrické metodě by chemická látka měla být rozpuštěna v destilované vodě. Při spektrofotometrické a jiných metodách se používají pufrované roztoky. Koncentrace zkoušené chemické látky by neměla přesahovat 0,01 M nebo polovinu saturační koncentrace, podle toho, která z hodnot je nižší, a pro přípravu roztoku by měla být použita nejčistší dostupná forma látky. Je-li látka jen mírně rozpustná, může být před přípravou výše uvedených koncentrací rozpuštěna v malém množství rozpouštědla mísitelného s vodou.

Roztoky by měly být za využití Tyndallova jevu zkontrolovány na přítomnost emulzí, zejména pokud byl použit kosolvent pro zvýšení rozpustnosti. Použijí-li se pufrované roztoky, neměla by koncentrace pufru přesáhnout 0,05 M.

Podmínky zkoušky

Teplota

Teplota by měla být regulována s přesností nejméně ± 1°C. Stanovení by se mělo provádět při 20 °C.

Existuje-li podezření na významnou závislost na teplotě, mělo by být stanovení prováděno alespoň při dvou jiných teplotách. Teplotní intervaly by v tomto případě měly být 10 °C a regulace teploty ± 0,1 °C.

Analýzy

Metoda bude určována povahou látky, která se testuje. Musí být dostatečně citlivá, aby umožňovala stanovení různých druhů chemických látek při každé koncentraci zkušebního roztoku.

Provedení zkoušky

Titrační metoda

Zkušební roztok se testuje titrací se standardním roztokem zásady nebo případně kyseliny, přičemž po každém přidání titračního roztoku se změří pH. Před dosažením bodu ekvivalence by měl být roztok přidán v rostoucích objemech alespoň desetkrát. Je-li rovnováhy dosaženo dostatečně rychle, může se použít záznamový potenciometr. Pro tuto metodu musí být přesně známo celkové množství látky a její koncentrace. Je nutné vyloučit oxid uhličitý. Podrobnosti postupu, preventivní opatření a výpočet jsou uvedeny ve standardních zkouškách, např. v položkách (1), (2), (3) a (4) seznamu literatury.

Spektrofotometrická metoda

Vlnová délka se zjistí, pokud ionizovaná a neionizovaná forma látky má znatelně rozdílné absorpční koeficienty. Absorpční spektrum UV/VIS se zjistí z roztoků o konstantní koncentraci za takové hodnoty pH, kde je látka v podstatě neionizovaná, kde je plně ionizovaná a při několika mezilehlých hodnotách pH. Toho lze dosáhnout buď přidáním podílů koncentrované kyseliny (zásady) do poměrně velkého objemu roztoku látky v mnohosložkovém pufru, nejprve při vysoké (nízké) hodnotě pH (viz položka 5 seznamu literatury), anebo přidáním stejných objemů zásobního roztoku látky např. ve vodě nebo v methanolu ke konstantním objemům různých pufrovaných roztoků, jež pokrývají žádoucí rozpětí hodnot pH. Z hodnot pH a hodnot absorbance při zvolené vlnové délce se vypočítá dostatečný počet hodnot pKa za použití alespoň 5 hodnot pH, kdy je látka ionizována z nejméně 10 % a z méně než 90 %. Další podrobnosti o zkoušce a metoda výpočtu jsou uvedeny v odborné literatuře (1).

Konduktometrická metoda

Pomocí elektrického článku o nízké, známé článkové konstantě se změří vodivost přibližně 0,1 M roztoku látky ve vodivostní vodě. Změří se rovněž vodivost několika přesně připravených zředění tohoto roztoku. Koncentrace se pokaždé sníží na polovinu a celá série by měla pokrývat koncentrace nejméně v rozsahu jednoho řádu. Mezní vodivost při nekonečném zředění se zjistí provedením obdobného pokusu se sodnou solí a extrapolací. Míru disociace pak lze vypočítat z vodivosti každého roztoku pomocí Onsagerovy rovnice, a disociační konstantu je tedy možné vypočítat pomocí Ostwaldova zřeďovacího zákona jako K = α2C/(1 – α), kde C je koncentrace v molech na litr a α je disociovaná frakce. Je nutné vyloučit CO2. Další podrobnosti o zkoušce a metoda výpočtu jsou uvedeny v normách a odborné literatuře (1), (6) a (7).

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Zpracování výsledků

Titrační metoda

Vypočítá se pKa pro 10 měřených bodů na titrační křivce. Vypočítá se střední hodnota těchto hodnot pKa a směrodatná odchylka. Měl by být přiložen graf závislosti hodnot pH na objemu standardní zásady nebo kyseliny spolu s vyjádřením v tabulce.

Spektrofotometrická metoda

Hodnoty absorbance a pH v každém spektru se uvedou v tabulce. Z mezilehlých údajů ve spektrech se vypočítá alespoň pět hodnot pKa a vypočte se rovněž střední hodnota těchto výsledků a směrodatná odchylka.

Konduktometrická metoda

Vypočítá se ekvivalentní vodivost Λ pro každou koncentraci kyseliny a pro každou koncentraci směsi jednoho ekvivalentu kyseliny plus 0,98 ekvivalentu hydroxidu sodného bez uhličitanů. Přebytek kyseliny má zabránit přebytku OH– v důsledku hydrolýzy. Hodnota 1/Λ se vynese do grafu v závislosti na √C a hodnotu Λo soli lze stanovit extrapolací na nulovou koncentraci.

Hodnotu Λo kyseliny lze vypočítat pomocí hodnot H+ a Na+ uvedených v odborné literatuře. Hodnotu pKa je možné vypočítat z α = Λi /Λo a Ka = α2C/(1 – α) pro každou koncentraci. Přesnější hodnoty Ka lze získat provedením úprav na mobilitu a aktivitu. Měla by se vypočítat střední hodnota a směrodatné odchylky z hodnot pKa.

Závěrečná zpráva

Předložit by se měly všechny naměřené údaje a vypočítané hodnoty pKa spolu s metodou výpočtu (nejlépe ve formě tabulky, jak se doporučuje v položce seznamu literatury (1)) a stejně tak i výše popsané statistické parametry. U titračních metod by měly být uvedeny podrobnosti o standardizaci titračních roztoků.

U spektrofotometrické metody by měla být předložena všechna spektra. U konduktometrické metody by měly být uvedeny podrobnosti týkající se stanovení článkové konstanty. Měly by se uvést informace o použitém postupu, analytických metodách a povaze všech použitých pufrů.

Měla by se uvést zkušební teplota (teploty).

LITERATURA

2)

V části B se kapitola B.5 nahrazuje tímto:

„B.5   AKUTNÍ DRÁŽDIVÉ/LEPTAVÉ ÚČINKY NA OČI

ÚVOD

Tato metoda je rovnocenná metodě Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 405 (2012). Pokyny OECD pro zkoušení chemických látek jsou pravidelně přezkoumávány s cílem zajistit, aby odrážely nejlepší dostupné vědecké poznatky. Při předchozích přezkumech těchto pokynů pro zkoušení byla zvýšená pozornost věnována možným zlepšením, jichž lze dosáhnout vyhodnocováním veškerých existujících informací o zkoušené chemické látce s cílem vyhnout se nadbytečným zkouškám na laboratorních zvířatech a zohlednit tak zásadu dobrého zacházení se zvířaty. Pokyn pro zkoušení (TG) 405 (přijatý v roce 1981 a aktualizovaný v letech 1987, 2002 a 2012) obsahuje doporučení, aby byla před provedením popsané zkoušky akutních dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo provedena analýza závažnosti důkazů (1) u existujících relevantních údajů. Pokud nejsou dostatečné údaje k dispozici, doporučuje se získat je pomocí metody postupného zkoušení (2) (3). Strategie zkoušení zahrnuje provedení validovaných a uznaných zkoušek in vitro a je popsána v doplňku této zkušební metody. Pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (REACH) (2) je v příslušném pokynu agentury ECHA uvedena rovněž integrovaná strategie zkoušení (21). Zkoušky na zvířatech by se měly provádět pouze v případě, kdy bylo po posouzení dostupných alternativních metod zjištěno, že tyto zkoušky jsou nezbytné a že použití takových zkoušek je přiměřené. V době přípravy této aktualizované zkušební metody existují případy, kdy použití této zkušební metody je stále nezbytné nebo je podle některých legislativních přístupů vyžadováno.

Poslední aktualizace se zaměřila hlavně na použití analgetik a anestetik, aniž by to ovlivnilo základní koncept a strukturu TG 405. Výbor ICCVAM (3) a nezávislá mezinárodní vědecká komise pro odbornou revizi posoudily užitečnost a omezení běžného používání topických anestetik, systémových analgetik a humánních opatření při zkouškách bezpečnosti chemických látek z hlediska jejich dráždivých účinků na oči in vivo (12). Přezkum dospěl k závěru, že použití topických anestetik a systémových analgetik by mohlo z větší části nebo zcela zamezit bolestem a utrpení, aniž by ovlivnilo výsledek zkoušky, a bylo doporučeno, aby tyto látky byly vždy používány. Tato zkušební metoda bere tento posudek v úvahu. Při testování akutních dráždivých a leptavých účinků na oči by se topická anestetika, systémová analgetika a humánní opatření měly používat rutinně. Výjimky z jejich použití by měly být zdůvodněny. Vylepšení popsaná v této metodě podstatně sníží bolest a utrpení zvířat nebo jim zamezí ve většině zkušebních situací, kdy je testování bezpečnosti pro oči in vivo stále nezbytné.

Vyvážené preventivní zmírňování bolesti by mělo zahrnovat i) běžné podávání topických anestetik (např. proparacain nebo tetracain) a systémových analgetik (např. buprenorfin) před expozicí, ii) rutinní plán systémové analgezie (např. buprenorfin a meloxicam) v postexpoziční době, iii) plánované prohlídky, sledování a zaznamenávání klinických příznaků bolesti a/nebo utrpení u zvířat a iv) plánované prohlídky, sledování a zaznamenávání povahy, závažnosti a progrese veškerých poškození očí. Další podrobnosti jsou uvedeny v níže popsaných aktualizovaných postupech. Po podání zkoušené chemické látky by další topická anestetika ani analgetika neměla být podávána, aby nedošlo k ovlivnění studie. Analgetika s protizánětlivým působením (např. meloxicam) by neměla být aplikována lokálně a použité dávky by neměly systémově ovlivňovat účinky na oči.

Definice jsou uvedeny v dodatku této zkušební metody.

VÝCHOZÍ ÚVAHY

V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení se zvířaty by se ke zkouškám in vivo nemělo přistupovat, dokud nebyly všechny dostupné údaje významné pro možné leptavé/dráždivé účinky chemické látky na oči vyhodnoceny na základě analýzy závažnosti důkazů. Takové údaje zahrnují důkazy získané z existujících studií na lidech a/nebo laboratorních zvířatech, důkazy leptavých/dráždivých účinků na oči jedné nebo více strukturně příbuzných látek nebo směsí těchto látek, údaje dokládající vysokou kyselost nebo zásaditost chemické látky (4) (5) a výsledky validovaných a uznaných zkoušek leptavých účinků na kůži a leptavých a dráždivých účinků na oči in vitro nebo ex vivo (6) (13) (14) (15) (16) (17). Tyto studie mohly být vypracovány před analýzou závažnosti důkazů nebo na základě zjištění této analýzy.

U některých chemických látek může taková analýza naznačovat nutnost provedení studií možných leptavých/dráždivých účinků chemické látky na oči in vivo. Ve všech takových případech by před zvážením použití oční zkoušky in vivo měla být přednostně nejprve provedena studie leptavých účinků chemické látky na kůži in vitro a/nebo in vivo a vyhodnocena v souladu se strategií postupného zkoušení uvedenou v rámci zkušební metody B.4 (7), nebo v souladu se strategií integrovaného zkoušení, která je popsána v pokynech agentury ECHA (21).

Strategie postupného zkoušení, která zahrnuje provedení validovaných zkoušek leptavých/dráždivých účinků na oči in vitro a ex vivo, je popsána v doplňku této zkušební metody a pro účely nařízení REACH v pokynech agentury ECHA (21). Doporučuje se, aby se podle této strategie zkoušení postupovalo před prováděním zkoušek in vivo. U nových chemických látek se doporučuje metoda zkoušení po krocích, díky které lze získat vědecky spolehlivé údaje o leptavých/dráždivých účincích chemické látky. U existujících chemických látek, o jejichž leptavých/dráždivých účincích na kůži a oči není k dispozici dostatek údajů, lze tuto strategii využít pro doplnění chybějících informací. Použití jiné strategie nebo postupu zkoušení nebo rozhodnutí nepoužít metodu zkoušení po krocích musí být odůvodněno.

PRINCIP ZKOUŠKY IN VIVO

Po předchozím ošetření systémovým analgetikem a zavedení vhodného topického anestetika se chemická látka, která má být zkoušena, nanese v jedné dávce na jedno oko pokusného zvířete, přičemž neexponované oko slouží jako kontrola. V předem určených intervalech se na základě lézí spojivky, rohovky a duhovky vyhodnotí stupeň dráždivých/leptavých účinků na oči. Popíší se také jiné účinky na oko a nežádoucí systémové účinky, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba studie by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo nevratnost účinků.

Zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují příznaky značného utrpení a/nebo bolesti nebo léze odpovídající humánním ukazatelům popsaným v této zkušební metodě (viz odstavec 26), se humánně utratí a chemická látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Kritéria rozhodování o humánním usmrcení umírajících a značně trpících zvířat lze nalézt v pokynech OECD (8).

PŘÍPRAVA NA ZKOUŠKU IN VIVO

Výběr druhů

Upřednostňovaným laboratorním zvířetem je albinotický králík; používají se zdravá mladá dospělá zvířata. Použití jiných kmenů nebo druhů je třeba zdůvodnit.

Příprava zvířat

24 hodin před zkouškou se u každého z předběžně vybraných pokusných zvířat provede vyšetření obou očí. Zvířata, u kterých se zjistí podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky, se nepoužijí.

Podmínky chovu a krmení

Zvířata by měla být chována samostatně. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být u králíků 20 °C (± 3 °C). Ačkoli by relativní vlhkost vzduchu měla být minimálně 30 % a pokud možno by kromě doby úklidu místnosti neměla přesáhnout 70 %, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Je třeba se vyvarovat nadměrné intenzity světla. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezeným přísunem pitné vody.

POSTUP ZKOUŠKY

Použití topických anestetik a systémových analgetik

K zamezení nebo minimalizaci bolesti a utrpení při postupech zkoušení bezpečnosti pro oči se doporučují následující postupy. Lze je nahradit alternativními postupy, u nichž bylo zjištěno, že stejně dobře nebo lépe zamezují nebo zbavují bolesti a utrpení.

Aplikace zkoušené chemické látky

Zkoušená chemická látka se aplikuje každému zvířeti do spojivkového vaku jednoho oka tak, že se spodní víčko lehce odchlípne od oční bulvy. Víčka se pak asi na jednu sekundu lehce přidrží u sebe, aby nedošlo ke ztrátě látky. Druhé oko, na které se látka neaplikuje, slouží jako kontrola.

Výplach

Oči pokusných zvířat se do 24 hodin po instilaci zkoušené chemické látky nevyplachují, s výjimkou pevných látek (viz odstavec 18) a okamžitých leptavých nebo dráždivých účinků. Po 24 hodinách je možné v případě potřeby oči vypláchnout.

Použití satelitní skupiny zvířat k vyšetření vlivu výplachu očí se nedoporučuje, pokud to není vědecky odůvodněno. Je-li satelitní skupina nezbytná, použijí se dva králíci. Podmínky výplachu se podrobně zdokumentují, např. doba výplachu, složení a teplota promývacího roztoku, trvání, objem a rychlost aplikace.

Úroveň dávek

1)   Zkoušení kapalin

Při zkoušení kapalin se použije dávka 0,1 ml. K instilaci chemické látky přímo do oka by se neměly používat aerosolové rozstřikovače s čerpadlem. Před instilací 0,1 ml do oka by se měla tekutina z rozstřikovače vypudit a shromáždit do nádobky.

2)   Zkoušení pevných látek

Při zkoušení pevných látek, past a chemických látek obsahujících částice se použije objem 0,1 ml nebo hmotnost nejvýše 100 mg. Zkoušená chemická látka se rozdrtí na jemný prášek. Objem pevného materiálu se stanoví až po opatrném zhutnění, např. poklepáním odměrnou nádobkou. Pokud nebyla zkoušená pevná chemická látka odstraněna z oka pokusného zvířete pomocí fyziologických mechanismů do doby prvního pozorování po 1 hodině po aplikaci, lze oko vypláchnout fyziologickým roztokem nebo destilovanou vodou.

3)   Zkoušení aerosolů

Před instilací látek do oka se doporučuje zachytit látky obsažené v rozstřikovačích nebo aerosolech do nádobky. Jedinou výjimkou jsou chemické látky obsažené v aerosolové nádobce pod tlakem, které z důvodu odpařování zachytit nelze. V takových případech se oko podrží otevřené a chemická látka se do oka aplikuje přímým vstříknutím trvajícím jednu sekundu ze vzdálenosti 10 cm. Vzdálenost se může lišit podle tlaku v rozprašovači a jeho obsahu. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození oka tlakem z rozprašovače. Případně bude nutné vyhodnotit možnost „mechanického“ poškození oka v důsledku rozprašovacího tlaku.

Odhad dávky z aerosolu lze provést simulací zkoušky takto: látka se nastříká na odvažovací papír otvorem o velikosti králičího oka, který se nachází bezprostředně před papírem. Na základě zvýšení hmotnosti papíru se odhadne množství látky, která se vstříkne do oka. U těkavých chemických látek lze dávku odhadnout pomocí zvážení odběrové nádobky před odstraněním zkoušené chemické látky a po jejím odstranění.

Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo na jednom zvířeti)

Důrazně se doporučuje, aby se zkouška in vivo provedla zpočátku na jednom zvířeti (viz doplněk této zkušební metody: „Strategie postupného zkoušení dráždivých a leptavých účinků na oči“). Na základě pozorování by mělo být možné určit závažnost a vratnost předtím, než se přejde k potvrzující zkoušce na druhém zvířeti.

Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že chemická látka má leptavé nebo vysoce dráždivé účinky na oči při použití popsaného postupu, další zkoušení dráždivých účinků na oči se neprovádí.

Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých účinků na oči in vivo na dalších zvířatech)

Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý nebo silně dráždivý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na maximálně dalších dvou zvířatech. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován dráždivý účinek, doporučuje se, doporučuje se provést potvrzující zkoušku metodou postupného zkoušení vždy na jednom zvířeti spíše než exponováním dalších dvou zvířat současně. Pokud se u druhého zvířete projeví leptavé nebo silně dráždivé účinky, ve zkoušce se nepokračuje. Pokud výsledky u druhého zvířete jsou dostačující a umožňují stanovit kategorii nebezpečnosti, žádné další zkoušení se neprovádí.

Doba pozorování

Doba pozorování by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit míru a vratnost pozorovaných účinků. Zkouška by však měla být ukončena vždy, pokud zvíře vykazuje příznaky značné bolesti nebo utrpení (8). Za účelem určení vratnosti účinků by se zvířata měla obvykle pozorovat 21 dnů po podání zkoušené chemické látky. Pokud je vratnost pozorována před uplynutím 21 dnů, zkouška se v tomto okamžiku ukončí.

Klinická pozorování a hodnocení očních reakcí

Oči by měly být komplexně zhodnoceny na přítomnost či nepřítomnost očních lézí hodinu po aplikaci zkoušené chemické látky a poté alespoň jednou denně. Zvířata by měla být pozorována v prvních třech dnech několikrát denně, aby se zajistilo, že rozhodnutí o utracení budou přijata včas. U zkušebních zvířat by se měly alespoň dvakrát denně po celou dobu studie pravidelně hodnotit na klinické příznaky bolesti a/nebo utrpení (např. opakované škrábání nebo tření oka, nadměrné mrkání, nadměrné slzení) (9) (10) (11) v minimálně šestihodinových nebo v případě potřeby i delších intervalech mezi jednotlivými pozorováními. Je nezbytné i) náležitě posoudit, zda jsou u zvířat patrné známky bolesti a utrpení, aby bylo možno přijmout podložená rozhodnutí, zda je nutné zvýšit dávkování analgetik, a ii) posoudit, zda jsou u zvířat patrné stanovené humánní ukazatele, aby bylo možné přijmout informované rozhodnutí, zda je nutné je humánně utratit, či nikoli, a zajistit, že tato rozhodnutí budou přijata včas. Běžně by se mělo používat zbarvení fluoresceinem a v případě potřeby (např. při posuzování hloubky poškození v případě zvředovatění rohovky) se jako pomůcka při detekci a měření poškození oka a při hodnocení, zda bylo dosaženo stanovených konečných ukazatelů pro humánní utracení, použije ruční štěrbinová lampa. Pro ilustraci lze pořídit digitální fotografie pozorovaných lézí a vést trvalý záznam o rozsahu poškození očí. Jakmile se získají konečné informace, nemělo by zkoušení na zvířatech probíhat déle, než je nezbytné. Zvířata se známkami značných bolesti nebo utrpení se neprodleně humánně utratí a chemická látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí.

Humánně se utratí ta zvířata, u nichž došlo po instilaci k těmto očním lézím (popis stupňů lézí viz tabulka 1): perforace rohovky nebo výrazné zvředovatění rohovky včetně stafylomu; krev v přední komoře oční; zákal rohovky stupně 4; absence reakce na osvit (reakce duhovky stupně 2) přetrvávající 72 hodin; zvředovatění spojivkové membrány; nekróza spojivek nebo slzné žlázy; nebo odlupování nekrotické hmoty. Tento postup je dán nevratností takových lézí. Dále se doporučuje použít následující oční léze jako humánní koncové ukazatele pro ukončení studií před uplynutím plánované 21denní doby pozorování. Tyto léze jsou považovány za předpověď závažných dráždivých nebo leptavých poškození a poškození, u nichž se neočekává plná vratnost před ukončením 21denní doby pozorování: značná hloubka poškození (např. zvředovatění rohovky zasahující dále než do povrchových vrstev stromatu), poškození limbu > 50 % (doložené vyblednutím spojivkové tkáně) a silná infekce očí (výtok hnisu). Za užitečné kritérium, jež může ovlivnit klinické rozhodnutí o předčasném ukončení studie, lze také považovat kombinaci vaskularizace povrchu rohovky (tj. pannus, povrchový zánět rohovky), oblastí zbarvených fluoresceinem, které se na základě každodenního posuzování v čase nezmenšují, a/nebo nedostatečné reepitelizace 5 dní po aplikaci zkoušené chemické látky. Jednotlivě však tyto nálezy nejsou dostatečným důvodem k ukončení studie. Jakmile jsou zjištěny závažné účinky na oči, je třeba se obrátit na praktického nebo kvalifikovaného laboratorního veterinárního lékaře nebo osobu odborně způsobilou k identifikaci klinických lézí, aby se provedlo klinické vyšetření, jež stanoví, zda je nutné v důsledku kombinace těchto účinků studii předčasně ukončit. Stupně očních reakcí (spojivek, rohovky a duhovky) by měly být zjišťovány a zaznamenávány po 1, 24, 48 a 72 hodinách od aplikace zkoušené chemické látky (tabulka 1). Zvířata, u nichž oční léze nevzniknou, nelze utratit dříve než 3 dny po instilaci. Zvířata s očními lézemi, které nejsou závažné, se pozorují, dokud léze nevymizí, nebo po 21 dnů, po jejichž uplynutí se studie ukončí. Pozorování, jejichž cílem je stanovit stav lézí a jejich vratnost či nevratnost, by měla být prováděna a zaznamenávána minimálně po 1 hodině, 24 hodinách, 48 hodinách, 72 hodinách, 7 dnech, 14 dnech a 21 dnech. V nezbytných případech by se pozorování mělo provádět častěji s cílem určit, zda by pokusná zvířata měla být z humánních důvodů utracena nebo kvůli negativním výsledkům ze studie vyjmuta.

Při každém vyšetření by měly být zaznamenány stupně očních lézí (tabulka 1). Zaznamenány by měly být také jakékoli další oční léze (např. zánět, zbarvení, změny v přední komoře oční) nebo nepříznivé systémové účinky.

Vyšetřování reakcí lze usnadnit použitím binokulární lupy, ruční štěrbinové lampy, očního mikroskopu nebo jiných vhodných zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 hodin mohou být oči zvířat dále vyšetřeny fluoresceinem.

Hodnocení reakcí očí je nevyhnutelně subjektivní. S cílem podporovat harmonizaci hodnocení reakcí očí a napomoci zkušebním laboratořím a těm, kdo provádějí a interpretují pozorování, musí být zaměstnanci provádějící pozorování odpovídajícím způsobem kvalifikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Vyhodnocení výsledků

Stupně dráždivých účinků na oči se zhodnotí ve spojení s povahou a stupněm závažnosti lézí a jejich vratností nebo nevratností. Jednotlivé stupně nepředstavují absolutní měřítko dráždivých vlastností chemické látky, neboť se hodnotí také jiné účinky zkoušené chemické látky. Jednotlivé stupně by spíše měly být považovány za referenční hodnoty, které jsou smysluplné, pouze pokud se opírají o úplný popis a hodnocení veškerých pozorování.

Závěrečná zpráva

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

Interpretace výsledků

Extrapolace výsledků studií dráždivých účinků na oči laboratorních zvířat na člověka je platná jen v omezené míře. Albinotický králík je ve většině případů na dráždivé a leptavé látky citlivější než člověk.

Je třeba dbát na to, aby byla při interpretaci údajů vyloučena dráždivost pramenící ze sekundární infekce.

LITERATURA

Tabulka 1

Stupnice očních lézí

DOPLNĚK ZKUŠEBNÍ METODY B.5  (4)

STRATEGIE POSTUPNÉHO ZKOUŠENÍ DRÁŽDIVÝCH A LEPTAVÝCH ÚČINKŮ NA OČI

Obecné informace

V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení se zvířaty je důležité vyhýbat se zbytečnému používání zvířat a minimalizovat jakékoli zkoušky, které u zvířat pravděpodobně vyvolají závažné reakce. Veškeré informace týkající se potenciálních dráždivých/leptavých účinků chemické látky na oči by se měly zhodnotit před zvažováním zkoušení in vivo. Může již existovat dostatek důkazů pro klasifikaci zkoušené chemické látky podle jejích potenciálních dráždivých nebo leptavých účinků na oči, aniž by bylo nutné provádět zkoušky na laboratorních zvířatech. Proto využití analýzy závažnosti důkazů a strategie postupného zkoušení sníží potřebu provádět zkoušení in vivo, zejména pokud chemická látka pravděpodobně vyvolá závažné reakce.

Doporučuje se, aby se stávající informace týkající se dráždivých a leptavých účinků chemické látky na oči zhodnotily pomocí analýzy závažnosti důkazů, na jejímž základě se rozhodne o tom, zda by se k lepší charakteristice tohoto potenciálu měly provést další studie, jiné než oční studie in vivo. Jsou-li nutné další studie, doporučuje se využít strategie postupného zkoušení a jejím prostřednictvím získat relevantní experimentální údaje. U látek, které doposud nebyly zkoušeny, by se měla strategie postupného zkoušení využít k získání údajů, které jsou nezbytné k vyhodnocení jejich leptavých nebo dráždivých účinků na oči. Původní strategie zkoušení popsaná v tomto doplňku byla vypracována na semináři OECD (1). Následně byla tato strategie potvrzena a rozpracována v Harmonizovaném integrovaném systému klasifikace nebezpečnosti chemických látek pro lidské zdraví a jejich vlivu na životní prostředí, který schválilo 28. společné zasedání Výboru pro chemické látky a Pracovní skupiny pro chemické látky v listopadu 1998 (2) a aktualizovala skupina odborníků OECD v roce 2011.

Ačkoliv tato strategie zkoušení není nedílnou součástí zkušební metody B.5, vyjadřuje doporučovaný postup stanovení dráždivých/leptavých účinků na oči. Tento postup představuje nejlepší praktický i etický standard pro zkoušení dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo. Zkušební metoda obsahuje pokyny pro provádění zkoušky in vivo a shrnuje faktory, kterým je nutno před zvažováním takové zkoušky věnovat pozornost. Strategie postupného zkoušení představuje přístup posuzování stávajících údajů o dráždivých a leptavých účincích chemických látek na oči a odstupňovaný přístup k získávání relevantních údajů o chemických látkách, u kterých je nutné provést další studie, nebo u nichž žádné studie nebyly doposud provedeny. Zkušební strategie zahrnuje provedení validovaných a uznaných zkoušek in vitro a ex vivo a poté, za specifických okolností, provedení studie zkušební metodou B.4 (3) (4).

Popis strategie zkoušení po krocích

Před zahájením zkoušek v rámci strategie postupného zkoušení (viz obrázek) se vyhodnotí veškeré dostupné informace, aby se mohlo rozhodnout o nutnosti provést zkoušku na očích in vivo. Ačkoliv lze podstatné informace získat z vyhodnocení jednotlivých parametrů (např. extrémní hodnota pH), stávající informace by se měly hodnotit jako celek. Všechny relevantní údaje o účincích zkoušené chemické látky a jejích strukturních obdob se vyhodnotí na základě rozhodnutí založeného na posouzení závažnosti důkazů a toto rozhodnutí se zdůvodní. Zvláštní důraz by měl být kladen na již existující údaje o účincích chemické látky na člověka a na zvířata a dále na výsledky zkoušení in vitro nebo ex vivo. Studie žíravých chemických látek in vivo by se měly provádět co nejméně. Mezi faktory uvedené ve strategii zkoušení patří:

STRATEGIE ZKOUŠENÍ A HODNOCENÍ DRÁŽDIVÝCH/LEPTAVÝCH ÚČINKŮ NA OČI

LITERATURA

3)

V části B se kapitola B.10 nahrazuje tímto:

„B.10   ZKOUŠKA NA CHROMOZÓMOVÉ ABERACE U SAVCŮ IN VITRO

ÚVOD

Tato zkušební metoda je rovnocenná pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 473 (2016). Je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument OECD, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které byly v těchto pokynech ke zkoušení provedeny (1).

Zkouška na chromozómové aberace u savců in vitro má identifikovat chemické látky, které způsobují strukturní chromozómové aberace v kultivovaných buňkách savců (2) (3) (4). Rozlišují se dva typy strukturních aberací: chromozómové a chromatidové. Při zkouškách na chromozómové aberace in vitro by mohla vzniknout polyploidie (včetně endoreduplikace). Aneugenní látky mohou vyvolat polyploidii, avšak z polyploidie samotné nevyplývá aneugenický potenciál a může prostě ukazovat na narušení buněčného cyklu nebo na cytotoxicitu (5). Tato zkouška není určena k měření aneuploidie. K detekci aneuploidie by bylo možné doporučit zkoušku na přítomnost mikrojader in vitro (6).

Ke zkoušce na chromozómové aberace in vitro mohou být použity stabilizované buněčné linie nebo primární buněčné kultury lidského původu nebo pocházející z hlodavců. Použité buňky by měly být vybrány na základě schopnosti růstu v kultuře, stálosti karyotypu (včetně počtu chromozómů) a spontánní četnosti výskytu chromozómových aberací (7). Údaje, které jsou v současné době k dispozici, neumožňují předkládat jednoznačná doporučení, avšak naznačují, že při hodnocení chemické nebezpečnosti je důležité zvážit stav p53, genetickou stálost (stálost karyotypu), reparační schopnost DNA a původ buněk (lidské versus pocházející z hlodavců) vybraných ke zkoušení. Uživatelům této zkušební metody se proto doporučuje, aby při detekování indukce chromozómových aberací zvážili vliv těchto i jiných buněčných charakteristik na vlastnosti buněčné linie.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ

Zkoušky prováděné in vitro zpravidla vyžadují použití exogenního zdroje metabolické aktivace, pokud nejsou buňky metabolicky kompetentní s ohledem na zkoušené chemické látky. Systém exogenní metabolické aktivace zcela nenapodobuje podmínky in vivo. Je třeba se zcela vyvarovat podmínek, které by vedly k falešným pozitivním výsledkům, tj. k poškození chromozómů, jež není způsobeno přímou interakcí mezi zkoušenou chemickou látkou a chromozómy; takové podmínky zahrnují změny pH nebo osmolality (8) (9) (10), interakce se složkami média (11) (12) nebo nadměrné úrovně cytotoxicity (13) (14) (15) (16).

Tato zkouška se používá k odhalování chromozómových aberací, jež mohou být výsledkem klastogenního působení. Analýza indukce chromozómových aberací by se měla provádět pomocí buněk v metafázi. Je proto důležité, že buňky by měly dosáhnout mitózy jak v exponovaných, tak v neovlivněných kulturách. Při zkoušení vyráběných nanomateriálů mohou být potřebné určité úpravy metody, které však v této zkušební metodě nejsou popsány.

Před použitím této zkušební metody na směs za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by se mělo zvážit, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.

PRINCIP ZKOUŠKY

Buněčné kultury lidského a savčího původu jsou vystaveny zkoušené chemické látce za přítomnosti exogenního zdroje metabolické aktivace i bez něho, pokud ovšem nejsou použity buňky s dostatečnou schopností metabolismu (viz odstavec 13). Ve vhodných předem stanovených intervalech po začátku expozice buněčných kultur zkoušené chemické látce se přidá látka zastavující metafázi (např. colcemid nebo kolchicin), buňky se shromáždí, obarví a u buněk v metafázi je mikroskopicky analyzována přítomnost chromozómových a chromatidových aberací.

POPIS METODY

Příprava

Buňky

Mohou být použity různé buněčné linie (např. vaječník křečka čínského (CHO), plíce křečka čínského V79, plíce křečka čínského (CHL/IU, TK6) nebo primární buněčné kultury včetně lymfocytů periferní krve člověka nebo jiných savců (7). Volba buněčných linií by měla být odborně zdůvodněna. Použijí-li se primární buňky, mělo by se vzhledem k ochraně pokusných zvířat, tam, kde je to možné, zvážit použití primárních buněk lidského původu. V takovém případě se odběr vzorků provede v souladu s etickými zásadami a předpisy platnými pro člověka. Lymfocyty periferní krve člověka by měly být získány od mladých (přibližně ve věku 18–35 let) nekuřáků, o nichž není známo, že by trpěli nemocemi nebo že by byli nedávno vystaveni genotoxickým činitelům (např. chemickým látkám, ionizujícímu záření) na úrovních, které by mohly zvýšit spontánní výskyt chromozómových aberací. Tím by se mělo zajistit, že spontánní výskyt chromozómových aberací bude nízký a stálý. Spontánní výskyt chromozómových aberací se s věkem zvyšuje a tento trend je více patrný u žen než u mužů (17) (18). Pokud se společně používají buňky pocházející od více než jednoho dárce, měl by být počet dárců uveden. Je nezbytné prokázat, že buňky se dělily od počátku ošetření zkoušenou chemickou látkou až do odběru buněk k analýze. Buněčné kultury jsou udržovány ve fázi exponenciálního růstu buněk (buněčné linie) nebo jsou stimulovány k dělení (primární kultury lymfocytů), aby bylo možné exponovat buňky v různých stadiích buněčného cyklu, protože citlivost stadií na zkoušené chemické látky nemusí být známa. Primární buňky, které k dělení potřebují stimulaci mitogenními látkami, během expozice zkoušené chemické látce již zpravidla nejsou dále synchronizovány (např. lidské lymfocyty po 48hodinové mitogenní stimulaci). Použití synchronizovaných buněk v průběhu expozice se nedoporučuje, avšak lze je akceptovat v odůvodněných případech.

Média a kultivační podmínky

Pro udržování kultur by mělo být použito vhodné kultivační médium a inkubační podmínky (kultivační nádoby, případně zvlhčená atmosféra s 5 % CO2, inkubační teplota 37 °C). U buněčných linií by se měla pravidelně kontrolovat stabilita modální hodnoty počtu chromozómů a mělo by se zjišťovat, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty (7) (19). Pokud jsou kultury kontaminované nebo se modální hodnota počtu chromozómů změnila, neměly by se dotyčné kultury používat. Pro buněčné linie nebo primární kultury použité ve zkušební laboratoři by měla být stanovena normální délka buněčného cyklu, která by měla být v souladu s buněčnými charakteristikami uvedenými v literatuře (20).

Příprava kultur

Buněčné linie: buňky se pomnoží z kmenových kultur, nasadí se do kultivačního média v takové hustotě, aby u buněk v suspenzích nebo v monovrstvách pokračoval exponenciální růst až do sběru buněk (např. mělo by se zamezit konfluenci u buněk rostoucích v monovrstvách).

Lymfocyty: krev ošetřená antikoagulantem (např. heparinem) nebo oddělené lymfocyty se kultivují (např. po dobu 48 hodin u lidských lymfocytů) za přítomnosti mitogenu [např. fytohemaglutinin (PHA) u lidských lymfocytů], aby se indukovalo dělení buněk před expozicí zkoušené chemické látce.

Metabolická aktivace

Při použití buněk, které mají nedostatečnou endogenní metabolickou schopnost, by se měly použít exogenní metabolizující systémy. Nejčastěji používaným systémem, který je standardně doporučován, pokud není zdůvodněno použití jiného systému, je postmitochondriální frakce (S9) doplněná kofaktory. Tato frakce se připravuje z jater hlodavců (zpravidla potkanů) exponovaných látkami indukujícími enzymy, jako je Aroclor 1254 (21) (22) (23) nebo kombinace fenobarbitalu a β-naftoflavonu (24) (25) (26) (27) (28) (29). Posledně jmenovaná kombinace není v rozporu se Stockholmskou úmluvou o perzistentních organických znečišťujících látkách (30) a bylo prokázáno, že je stejně účinná jako Aroclor 1254 pro indukování oxidáz se smíšenou funkcí (24) (25) (26) (28). Frakce S9 je v konečném testovacím médiu obvykle používána v koncentracích od 1 % do 2 % obj., ale koncentraci je možné zvýšit až na 10 %. V průběhu aplikace by se neměly používat látky, jež snižují mitotický index, zejména látky, které tvoří komplexy s vápníkem (31). Volbu typu a koncentrace systému exogenní metabolické aktivace nebo metabolického induktoru, který se použije, je třeba provádět s ohledem na typ zkoušených chemických látek

Příprava zkoušené chemické látky

Pevné zkoušené chemické látky by měly být před aplikací na buňky rozpuštěny ve vhodných rozpouštědlech a popřípadě zředěny (viz odstavec 23). Kapalné zkoušené látky mohou být přidány přímo k testovacímu systému a/nebo mohou být před aplikací zředěny. Plynné a těkavé zkoušené chemické látky by se měly zkoušet za použití vhodně upravených standardních protokolů, například prostřednictvím ošetření buněk v neprodyšně uzavřených kultivačních nádobách (32) (33) (34). Zkoušená chemická látka by měla být připravena bezprostředně před aplikací, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

Zkušební podmínky

Rozpouštědla

Rozpouštědlo by mělo být zvoleno tak, aby optimalizovalo rozpustnost zkoušené chemické látky, aniž by nepříznivě ovlivnilo provádění zkoušky, např. měnilo růst buněk, ovlivňovalo integritu zkoušené chemické látky, reagovalo s kultivačními nádobami, narušovalo systém metabolické aktivace. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodného rozpouštědla (nebo kultivačního média). Dobře zavedenými rozpouštědly jsou například voda nebo dimethylsulfoxid. Podíl organických rozpouštědel by zpravidla neměl být větší než 1 % obj. a podíl vodných rozpouštědel (fyziologického roztoku nebo vody) v konečném expozičním médiu by neměl být větší než 10 % obj. Použijí-li se jiná než dobře zavedená rozpouštědla (např. ethanol nebo aceton), mělo by být jejich použití podloženo údaji o jejich kompatibilitě se zkoušenou chemickou látkou a zkušebním systémem a o tom, že nejsou v použité koncentraci genotoxické. Pokud takové podpůrné údaje neexistují, je důležité zařadit neexponované kontroly (viz dodatek 1) prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné škodlivé nebo klastogenní účinky.

Měření buněčné proliferace a cytotoxicity a volba expozičních koncentrací

Při stanovení nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky by neměly být použity koncentrace, které jsou schopny vyvolat falešnou pozitivní odpověď, jako např. koncentrace, jež vyvolávají nadměrnou cytotoxicitu (viz odstavec 22), srážení kultivačního média (viz odstavec 23) nebo zřetelné změny pH nebo osmolality (viz odstavec 5). Pokud zkoušená chemická látka v době jejího přidání způsobuje zřetelnou změnu hodnoty pH média, pH může být upraveno pufrováním konečného expozičního média tak, aby nedošlo k falešným pozitivním výsledkům a aby byly zachovány vhodné kultivační podmínky.

Provádí se měření buněčné proliferace, aby bylo zajištěno, že dostatečný počet ošetřených buněk prodělal během zkoušky mitózu a že expozice je prováděna při vhodných úrovních cytotoxicity (viz odstavce 18 a 22). Cytotoxicita by měla být stanovena v hlavním experimentu s metabolickou aktivací a bez ní za použití vhodných indikátorů buněčné smrti a růstu. Hodnocení cytotoxicity při předběžné zkoušce může být užitečné a může napomoci k lepšímu určení koncentrací, jež mají být použity při hlavní zkoušce, avšak předběžná zkouška není povinná. Pokud se provede, nemůže nahradit měření cytotoxicity při hlavním experimentu.

Vhodnými metodami pro posouzení cytotoxicity v cytogenetických zkouškách jsou relativní zdvojnásobení populace (RPD) nebo relativní nárůst počtu buněk (RICC) (13) (15) (35) (36) (55) (příslušné vzorce viz dodatek 2). V případě dlouhodobé expozice a dobách odběru delších než 1,5násobek normální délky buněčného cyklu po zahájení zkoušky (tj. celkově delších než trojnásobek délky buněčného cyklu) by použití RPD mohlo vést k podhodnocení cytotoxicity (37). Za těchto okolností měření RICC může být lepším ukazatelem nebo v případě použití RPD by hodnocení cytotoxicity po 1,5násobku normální délky buněčného cyklu mohlo být užitečné.

U lymfocytů v primárních kulturách je mírou cytotoxických/cytostatických účinků mitotický index (MI), avšak ten je ovlivněn tím, po jaké době od expozice se měří, použitým mitogenem a možným narušením buněčného cyklu. MI je však přijatelný, protože jiné metody stanovení cytotoxicity mohou být obtížné a nepraktické a nemusí platit pro cílovou populaci lymfocytů rostoucích v reakci na stimulaci pomocí PHA.

Ačkoli doporučenými parametry cytotoxicity jsou pro buněčné linie RICC a RPD a pro primární kulturu lymfocytů MI, mohly by další užitečné informace poskytnout i jiné ukazatele (např. integrita buněk, apoptóza, nekróza, buněčný cyklus).

Měly by se vyhodnotit nejméně tři zkušební koncentrace (nepočítaje v to kontroly s rozpouštědlem a pozitivní kontroly), které splňují kritéria přijatelnosti (vhodná cytotoxicita, počet buněk atd.). Bez ohledu na typy buněk (buněčné linie nebo primární kultury lymfocytů) mohou být pro každou zkušební koncentraci použity buď jednotlivé exponované kultury nebo replikáty.I když je doporučováno použití duplicitních kultur, jednu kulturu lze rovněž akceptovat za předpokladu, že v této jediné kultuře je hodnocen stejný celkový počet buněk jako v duplicitních kulturách. Použití jedné kultury je opodstatněné zejména v případě, že jsou posuzovány více než 3 koncentrace (viz odstavec 31). Výsledky získané z duplicitních nezávislých kultur při dané koncentraci lze pro účely analýzy údajů sloučit (38). U zkoušených látek, jež vykazují malou cytotoxicitu nebo nevykazují žádnou cytotoxicitu, budou obvykle vhodné přibližně dvojnásobné až trojnásobné intervaly koncentrací. V případě cytotoxicity by měly zvolené zkušební koncentrace pokrývat rozpětí od koncentrace vyvolávající cytotoxicitu, jak je popsáno v odstavci 22, po koncentrace, při nichž dochází ke střední a nízké cytotoxicitě nebo nedochází k žádné cytotoxicitě. Mnohé zkoušené chemické látky vykazují strmé křivky závislosti odezvy na koncentraci, a aby bylo možné získat údaje při nízké a střední cytotoxicitě nebo podrobně studovat závislost účinku na dávce, může být nezbytné zvolit menší rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a/nebo více než tři koncentrace (ať už pro jednu kulturu, nebo replikáty), zejména v případě kdy je požadován opakovaný experiment (viz odstavec 47).

Je-li maximální koncentrace odvozena od cytotoxicity, měla by být nejvyšší koncentrace zvolena tak, aby se dosáhlo 55 ± 5 % cytotoxicity za použití doporučených parametrů cytotoxicity (tj. snížení RICC a RPD u buněčných linií a snížení MI u primárních kultur lymfocytů na 45 ± 5 % u souběžné negativní kontroly). Je třeba dbát na to, aby byly interpretovány pouze ty pozitivní výsledky, které jsou vykazovány při vyšší hranici tohoto rozmezí cytotoxicity 55 ± 5 % (13).

V případě špatně rozpustných zkoušených chemických látek, které nejsou cytotoxické při koncentracích nižších, než je jejich rozpustnost, by nejvyšší analyzovaná koncentrace měla na konci expozice zkoušené chemické látce vyvolat zákal nebo sraženinu viditelnou pouhým okem nebo pomocí inverzního mikroskopu. Dokonce i v případech, kdy k výskytu cytotoxicity dochází při koncentracích vyšších, než je rozpustnost, se doporučuje testovat pouze při jedné koncentraci vyvolávající zákal nebo viditelné sraženiny, neboť sraženina může vést k falešným účinkům. Při koncentraci, kdy vzniká sraženina, je třeba dbát na to, aby sraženina nemohla ovlivňovat provádění zkoušky (např. barvení nebo hodnocení). Užitečné může být stanovit rozpustnost v kultivačním médiu před pokusem.

Není-li pozorována sraženina nebo omezení cytotoxicity, měla by nejvyšší zkušební koncentrace odpovídat 10 mM, 2 mg/ml nebo 2 μl/ml, podle toho, která z uvedených hodnot je nejnižší (39) (40) (41). Pokud u zkoušené chemické látky není stanoveno její složení, např. u látek s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexních reakčních produktů nebo biologického materiálu (UVCB) (42), přírodního extraktu atd., může v případě nízké cytotoxicity být horní koncentrace vyšší (např. 5 mg/ml), aby se zvýšila koncentrace každé ze složek. Je však třeba poznamenat, že u humánních léčivých přípravků se tyto požadavky mohou lišit (43).

Kontroly

Pro každý časový interval sběru buněk by měly být použity souběžné negativní kontroly (viz odstavec 15) skládající se ze samotného rozpouštědla v kultivačním médiu a zpracované stejným způsobem jako exponované kultury.

Souběžné pozitivní kontroly jsou nutné pro prokázání schopnosti laboratoře identifikovat klastogeny za daných experimentálních podmínek a pro prokázání účinnosti exogenního systému metabolické aktivace, všude kde je to možné. Příklady pozitivních kontrol jsou uvedeny v tabulce 1 níže. V odůvodněných případech mohou být použity jiné pozitivní kontrolní chemické látky. Jelikož zkoušky na buňkách savců in vitro za účelem stanovení genetické toxicity jsou dostatečně standardizované, může se použití pozitivních kontrol omezit na experimenty s kontrolními klastogeny vyžadujícími metabolickou aktivaci. Pokud je provedena souběžně se zkouškou bez aktivace se stejnou dobou trvání expozice, tato jediná odpověď v pozitivní kontrole prokáže činnost metabolického aktivačního systému a citlivost testovacího systému. Dlouhodobá expozice (bez S9) by však měla mít svou vlastní pozitivní kontrolu, protože doba trvání expozice bude odlišná než při zkoušce za použití metabolické aktivace. Každá pozitivní kontrola by měla být použita při jedné nebo více koncentracích, u nichž se očekává, že poskytnou reprodukovatelný a detekovatelný nárůst oproti pozadí, čímž se prokáže citlivost testovacího systému (tj. aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo identita kódovaného preparátu), a reakce by neměla být narušena cytotoxicitou přesahující limitní hodnoty stanovené ve zkušební metodě.

Tabulka 1.

Referenční chemické látky doporučené pro posouzení způsobilosti laboratoře a pro výběr pozitivních kontrol.

POSTUP

Expozice zkoušené chemické látce

Proliferující buňky se vystaví zkoušené chemické látce jak za přítomnosti metabolického aktivačního systému, tak bez něho.

Doba sběru buněk

Pro důkladné hodnocení, které by bylo zapotřebí pro vyvození závěru o negativním výsledku, by měly být splněny všechny tři následující zkušební podmínky za použití krátkodobé expozice s metabolickou aktivací a bez ní a dlouhodobé expozice bez metabolické aktivace (viz odstavce 43, 44 a 45):

V případě, že kterékoli z výše uvedených experimentálních uspořádání vedlo k pozitivní odpovědi, nebude nutné zkoumat kterýkoli z ostatních režimů aplikace.

Příprava preparátů pro analýzu chromozómů

Do buněčné kultury se obvykle 1–3 hodiny před ukončení kultivace přidá colcemid nebo kolchicin. Pro přípravu preparátů pro analýzu chromozómů se každá buněčná kultura zpracovává zvlášť. Příprava preparátů pro analýzu chromozómů zahrnuje hypotonizaci buněk, fixaci a obarvení buněk. Na konci doby expozice v trvání 3–6 hodin se v monovrstvách mohou vyskytovat mitotické buňky (které se vyznačují okrouhlým tvarem a odchlipováním od povrchu). Jelikož lze tyto mitotické buňky snadno oddělit, mohou být při odstranění média obsahujícího zkoušenou chemickou látku ztraceny. Pokud v době sběru buněk existují důkazy podstatného nárůstu počtu mitotických buněk v porovnání s kontrolami, což pravděpodobně ukazuje na zastavení mitózy, pak by buňky měly být odebrány odstředěním a přidány zpět do kultur, aby se zabránilo ztrátě buněk, u nichž probíhá mitóza a mohou zde vznikat chromozómové aberace.

Analýza

Všechny preparáty, včetně pozitivních a negativních kontrol, by měly být před mikroskopickou analýzou chromozómových aberací nezávisle kódovány. Poněvadž při fixaci u částu buněk v metafázi často dochází ke ztrátě chromozómů, měly by tudíž vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu rovném modální hodnotě +/- 2.

Aby bylo možno vyhodnotit zkoušenou chemickou látku jako jasně negativní, u každé koncentrace a kontroly by mělo být hodnoceno alespoň 300 dobře rozprostřených metafází. Jsou-li využívány k replikám, mělo by být těchto 300 buněk rovnoměrně rozděleno mezi tyto kultury. Pokud je pro každou koncentraci použita jediná kultura (viz odstavec 21), mělo by být hodnoceno alespoň 300 dobře rozprostřených metafází v této jedné kultuře. Hodnocení 300 buněk má tu výhodu, že se zvyšuje statistická síla zkoušky a navíc budou zřídka pozorovány nulové hodnoty (předpokládá se, že pouze u 5 % buněk) (44). Počet hodnocených metafází lze snížit, je-li pozorován velký počet chromozómových aberací a zkoušená chemická látka je považována za jasně pozitivní.

Měly by být hodnoceny buňky se strukturními chromozómovými aberacemi včetně gapů a s vyloučením gapů. Zlomy a gapy jsou definovány v Dodatku 1 podle (45) (46). Chromatidové a chromozómové aberace by měly být zaznamenávány odděleně a klasifikovány podle podtypů (zlomy, výměny). Postupy používané v laboratoři by měly zajistit, aby analýzu chromozómových aberací prováděli dobře odborně připravení hodnotitelé a aby tato analýza byla případně podrobena odborné revizi.

Ačkoli je účelem zkoušky detekovat strukturní chromozómové aberace, je důležité zaznamenat četnost výskytu polyploidií a endoreduplikací, jsou-li tyto jevy pozorovány (viz odstavec 2).

Způsobilost laboratoře

Aby laboratoř prokázala dostatečnou zkušenost s testem před rutinním použitím, měla by provést sérii experimentů s referenčními pozitivními chemickými látkami, jež působí prostřednictvím různých mechanismů, a s různými negativními kontrolami (s použitím různých rozpouštědel/vehikul). Odpovědi těchto pozitivních a negativních kontrol by měly být v souladu s odbornou literaturou. Toto se nepoužije na laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají k dispozici databázi historických údajů, jak je definována v odstavci 37.

U vybraných pozitivních chemických látek (viz tabulka 1 v odstavci 26) by měla být testována krátká a dlouhá expozice za nepřítomnosti metabolické aktivace a rovněž krátká expozice za přítomnosti metabolické aktivace, aby byla prokázána způsobilost pro detekci klastogenních chemických látek a stanovení účinnosti systému metabolické aktivace. Rozsah koncentrací by u vybraných chemických látek měl být zvolen tak, aby poskytl opakovatelná zvýšení účinku v jednotlivých koncentracích ve srovnání s úrovní pozadí, aby se tak prokázala citlivost a dynamické rozpětí testovacího systému.

Historické kontrolní údaje

Laboratoř by měla stanovit:

Při prvním získávání údajů o historické distribuci negativních kontrol by měly být výsledky provedených negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji, pokud existují. S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by aktuální negativní kontroly v ideálním případě spadat do 95 % rozmezí této distribuce (44) (47). Historická databáze negativních kontrol dané laboratoře by měla být vytvořena na základě nejméně 10 experimentů, nejlépe však by měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek. V laboratořích by měly být uplatňovány metody řízení jakosti, jako např. kontrolní diagramy (např.C-charts nebo X-bar charts (48)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje o pozitivních a negativních kontrolách a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“ (44). Další doporučení, jak získat a používat historické údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (47).

Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich souladu se stávajícími historickými kontrolními databázemi laboratoře. Jakýkoli větší změna by měla vést k zavedení nové historické kontrolní databáze.

Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat výskyt buněk s chromozómovými aberacemi z jedné kultury nebo ze souhrnu replikovaných kultur, jak je popsáno v odstavci 21. Výsledky aktuálních negativních kontrol by v ideálním případě měly spadat do 95 % rozmezí distribuce v historické databázi negativních kontrol laboratoře (44) (47). Pokud jsou údaje z aktuálních negativních kontrol mimo 95 % rozmezí, může být přijatelné je zahrnout do dosavadní distribuce kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existuje důkaz o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz odstavec 37), a důkaz o tom, že nedošlo k technické nebo lidské chybě.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Vyjádření výsledků

Měl by se vyhodnotit procentuální podíl buněk se strukturními chromozómovými aberacemi. Chromatidové a chromozómové aberace klasifikované podle podtypů (zlomy, výměny) by měly být uvedeny odděleně spolu s jejich počty a četností v experimentálních a kontrolních kulturách. Gapy se zaznamenávají a uvádějí odděleně, ale nezahrnují se do celkové četnosti výskytu aberací. Zaznamená se procentuální podíl polyploidie a/nebo endoreduplikovaných buněk, pokud jsou pozorovány.

Měly by být zaznamenány výsledky souběžného stanovení cytotoxicity u všech exponovaných kultur a negativních a pozitivních kontrolních kultur v hlavních experimentech pro hodnocení aberací.

Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé kultury. Všechny údaje by měly být shrnuty ve formě tabulek.

Kritéria přijatelnosti

Přijetí zkoušky je založeno na následujících kritériích:

Hodnocení a interpretace výsledků

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud v některé ze zkoumaných experimentálních uspořádání (viz odstavec 28):

Jsou-li splněna všechna tato kritéria, má se za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat chromozómové aberace v kultivovaných savčích buňkách v tomto testovacím systému. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (49) (50) (51).

Za předpokladu, že byla splněna všechna kritéria přijatelnosti, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně negativní, pokud za všech zkoumaných experimentálních uspořádání (viz odstavec 28):

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka není schopna vyvolávat chromozómové aberace v kultivovaných savčích buňkách v tomto testovacím systému.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odpovědi se nepožaduje.

V případě, že odpověď není ani jasně negativní, ani jasně pozitivní, jak je popsáno výše, nebo s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku, by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším šetřením. Užitečné by mohlo být hodnocení většího počtu buněk (je-li vhodné) nebo provedení opakovaného experimentu, případně s použitím upravených zkušebních podmínek (např. rozsah koncentrací, jiné podmínky metabolické aktivace (např. koncentrace S9 nebo původu S9)).

V ojedinělých případech dokonce ani po dalším šetření nebude možné na základě daného souboru údajů učinit závěr, zda jsou výsledky pozitivní či negativní, a proto bude učiněn závěr, že odpověď na zkoumanou chemickou látku je neurčitá.

Nárůst počtu polyploidních buněk může znamenat, že zkoušená chemická látka má schopnost potlačit mitotické procesy a indukovat numerické chromozómové aberace (52). Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozómy může znamenat, že zkoušené chemické látky mají schopnost potlačit progresi buněčného cyklu (53) (54) (viz odstavec 2). Výskyt polyploidních buněk a buněk s endoreduplikovanými chromozómy by se proto měl zaznamenat odděleně.

Závěrečná zpráva

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

LITERATURA

4)

V části B se kapitola B.11 nahrazuje tímto:

„B.11   Zkouška na chromozómové aberace v buňkách kostní dřeně savců

ÚVOD

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 475 (2016). Je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument OECD, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které byly v těchto pokynech ke zkoušení provedeny (1).

Zkouška na chromozómové aberace v buňkách kostní dřeně savců in vivo je zvláště významná k posouzení genotoxicity, neboť zde probíhá aktivní metabolismus in vivo, farmakokinetika a procesy reparace DNA, které přispívají k účinku testované látky, jakkoli mohou být různé u různých druhů. Zkouška in vivo je rovněž užitečná pro další výzkum genotoxicity zjištěné v systémech in vitro.

Zkouška na chromozómové aberace u savců in vivo je používána pro detekci strukturních chromozómových aberací indukovaných zkoušenou chemickou látkou v buňkách kostní dřeně savců, obvykle hlodavců (2) (3) (4) (5). Rozlišují se dva typy strukturních aberací – chromozómové a chromatidové. U většiny genotoxických chemických látek jsou indukované aberace chromatidového typu, avšak chromozómové aberace se rovněž vyskytují. Poškození chromozómů a související jevy jsou příčinou mnoha geneticky podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho důkazů o tom, že pokud tyto léze a související jevy způsobují změny v onkogenech a v tumor-supresorových genech, mají podíl na indukci rakoviny u člověka a v experimentálních systémech. Při zkouškách na chromozómové aberace in vivo mohou vznikat polyploidie (včetně endoreduplikací). Z nárůstu polyploidie samotné však nevyplývá aneugenický potenciál a může prostě ukazovat na narušení buněčného cyklu nebo na cytotoxicitu. Tato zkouška není určena k detekci aneuploidie. Pro detekci aneuploidie in vivo a in vitro lze doporučit mikronukleus test v savčích erytrocytech in vivo (kapitola B.12 této přílohy) nebo zkoušku in vitro na přítomnost mikrojader v buňkách savců (kapitola B.49 této přílohy).

Definice použitých termínů jsou uvedeny v dodatku 1.

VÝCHOZÍ ÚVAHY

Při této zkoušce jsou běžně používáni hlodavci, avšak v některých případech, je-li to vědecky zdůvodněno, mohou být vhodné i jiné druhy. Cílovou tkání je v této zkoušce kostní dřeň, poněvadž je vysoce vaskularizovanou tkání a obsahuje populaci buněk s rychlým cyklem, které se snadno izolují a zpracovávají. Vědecké zdůvodnění použití jiných druhů než potkanů a myší by mělo být uvedeno ve zprávě. Jsou-li použity jiné druhy než hlodavci, doporučuje se detekci chromozómových aberací v buňkách kostní dřeně začlenit do jiné vhodné zkoušky toxicity.

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená chemická látka (chemické látky) nebo reaktivní metabolit (metabolity) nedostanou do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.

Před použitím této zkušební metody na směs za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by se mělo zvážit, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.

PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

Zvířata se vhodným způsobem vystaví zkoušené chemické látce a ve vhodném okamžiku po expozici se humánně utratí. Před utracením se zvířatům podá látka zastavující metafázi (např. kolchicin nebo colcemid). Z buněk kostní dřeně se poté připraví preparáty chromozómů, obarví se a analyzují se chromozómové aberace buněk v metafázi.

OVĚŘENÍ ZPŮSOBILOSTI LABORATOŘE

Experimenty pro ověření způsobilosti

Aby bylo možné před zahájením rutinního zkoušení zjistit, zda laboratoř má s danou zkouškou dostatečné zkušenosti, měla by prokázat schopnost reprodukovat očekávané výsledky z publikovaných údajů (např. (6)), pokud jde o četnost chromozómových aberací, nejméně se dvěma pozitivními kontrolními chemickými látkami (včetně slabých reakcí indukovaných nízkými dávkami u pozitivních kontrol), např. látkami uvedenými v tabulce 1, a s kontrolami s kompatibilním vehikulem/rozpouštědlem (viz odstavec 22). Při těchto experimentech by se měly používat dávky, jež poskytují reprodukovatelné nárůsty v závislosti na dávce, a měly by prokázat citlivost a dynamické rozpětí zkušebního systému ve sledované tkáni (kostní dřeň) za použití hodnotící metody, jež má být v laboratoři uplatňována. Tento požadavek neplatí pro laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají dostupnou databázi historických údajů, jak je definována v odstavcích 10–14.

Historické kontrolní údaje

V průběhu šetření způsobilosti by laboratoř měla stanovit:

Při prvním získávání údajů o dosavadní distribuci negativních kontrol by měly být výsledky provedených negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji, pokud existují. S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by souběžné negativní kontroly v ideálním případě spadat do 95 % rozmezí této distribuce. Historická databáze negativních kontrol laboratoře by měla být statisticky robustní, aby byla zajištěna schopnost laboratoře posuzovat distribuci svých údajů o negativních kontrolách. V literatuře se doporučuje, že nezbytným minimem může být 10 experimentů, nejlépe však by databáze měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek. V laboratořích by měly být uplatňovány metody řízení jakosti, jako např. kontrolní diagramy (např.C-charts nebo X-bar charts (7)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“. Další doporučení, jak získat a používat dosavadní údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (8).

Pokud laboratoř neprovedla dostatečný počet experimentů, aby mohla během ověření šetření způsobilosti (popsaného v odstavci 9) stanovit statisticky robustní distribuci negativních kontrol (viz odstavec 11), je přijatelné, aby distribuce byla stanovena během prvních rutinních zkoušek. Uplatňování tohoto přístupu by mělo vycházet z doporučení uvedených v literatuře (8) a výsledky negativních kontrol získané při těchto experimentech by měly zůstat v souladu s publikovanými údaji o negativních kontrolách.

Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich dopadu na výsledné údaje tak, aby zůstaly v souladu se stávající historickou kontrolní databází laboratoře. Pouze případy větších rozdílů ve zkušebním protokolu by měly vést k zavedení nové historické kontrolní databáze, přičemž její odlišnost od dřívější distribuce se stanoví na základě odborného posouzení (viz odstavec 11). V průběhu opětovného stanovení nemusí být k provedení aktuální zkoušky nutná úplná databáze negativních kontrol, pokud laboratoř prokáže, že hodnoty jejích souběžných negativních kontrol zůstávají v souladu s její předchozí databází nebo s odpovídajícími publikovanými údaji.

Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat výskyt strukturních chromozómových aberací (s vyloučením gapů) u každého zvířete. Výsledky souběžných negativních kontrol by v ideálním případě měly být v 95 % rozmezí distribuce negativních kontrol v historické databázi laboratoře. Pokud jsou údaje ze souběžných negativních kontrol mimo 95 % rozmezí, může být přijatelné je zařadit mezi dosavadní distribuci kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existuje důkaz o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz odstavec 11), a neexistuje důkaz o tom, že by došlo k technické nebo lidské chybě.

POPIS METODY

Příprava

Výběr druhu zvířat

Měly by být použity běžně používané laboratorní kmeny zdravých mladých pohlavně dospělých zvířat. Běžně je používán potkan, ale vhodná může být také myš. Použit může být i jakýkoli jiný vhodný druh savce, je-li ve zprávě poskytnuto vědecké zdůvodnění.

Podmínky chovu a krmení zvířat

Teplota v místnosti pro zvířata by u hlodavců měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by v ideálním případě měla být 50–60 %, ale minimálně 40 % a neměla by pokud možno přesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody. Výběr potravy může být ovlivněn nutností zajistit dostatečné mísení se zkoušenou látkou, je-li látka podávána touto cestou. Hlodavci by měli být chováni v malých skupinách (nejvýše po pěti v každé kleci) téhož pohlaví a se stejnou aplikací, pokud se nepředpokládá agresivní chování, přednostně v klecích s pevnou podlahou s vhodným obohacením životního prostředí. Zvířata mohou být umístěna v klecích individuálně, pouze je-li to vědecky odůvodněné.

Příprava zvířat

Obvykle se používají zdravá mladá dospělá zvířata (u hlodavců ideálně ve věku 6–10 týdnů na počátku expozice, ale přijatelná jsou i zvířata poněkud starší), která se náhodně přiřadí do kontrolních a experimentálních skupin. Jednotlivá zvířata se jednoznačně identifikují humánní, co nejméně invazivní metodou (např. kroužkováním, označením štítkem, pomocí mikročipu nebo biometrické identifikace, avšak nikoli nastřihnutím ucha nebo prstu dolní končetiny) a nechají se v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Mělo by se zabránit vzájemné kontaminaci pozitivní kontroly a zkoušené chemické látky. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti zvířat daného pohlaví.

Příprava dávek

Pevné zkoušené chemické látky by se měly rozpustit nebo suspendovat ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech nebo by měly být přimíchány do potravy nebo pitné vody před podáním dávky zvířatům. Kapalné zkoušené chemické látky mohou být podávány přímo nebo mohou být před podáním zředěny. Pro účely expozice inhalací lze zkoušené chemické látky v závislosti na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech podávat jako plyn, páru nebo pevný/kapalný aerosol. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování a nestanoví vhodné podmínky pro skladování.

Rozpouštědlo/vehikulum

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých hladinách dávek toxické účinky a mělo by být vyloučeno podezření, že reaguje se zkoušenou chemickou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo referenčními údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejprve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul. Jako příklad běžně používaných kompatibilních rozpouštědel/vehikul lze uvést vodu, fyziologický roztok, roztok methylcelulosy, roztok sodné soli karboxymethylcelulosy, olivový olej a kukuřičný olej. Neexistují-li historické nebo publikované kontrolní údaje prokazující, že zvolené atypické rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné strukturní aberace nebo jiné zhoubné účinky, měla by být provedena počáteční studie za účelem stanovení přijatelnosti kontroly s tímto rozpouštědlem/vehikulem.

Kontroly

Pozitivní kontroly

V každé zkoušce by měla být obvykle zařazena jedna skupina zvířat vystavených pozitivní kontrolní chemické látce. Od toho lze upustit, jestliže zkušební laboratoř prokázala způsobilost k provádění zkoušky a stanovila historické rozmezí pozitivních kontrol. Není-li zařazena souběžná pozitivní kontrolní skupina, měly by být v každém experimentu zařazeny hodnotící kontroly (fixované a neobarvené preparáty). Tyto hodnotící kontroly lze získat tak, že se do hodnocení studie zařadí vhodné referenční vzorky, které byly získány a uchovány ze samostatného experimentu s pozitivními kontrolami prováděného pravidelně (např. každých 6–18 měsíců) v laboratoři, kde se provádí daná zkouška, například během testování způsobilosti a poté pravidelně podle potřeby.

Chemické látky pro pozitivní kontrolu by měly spolehlivě vyvolat pozorovatelné zvýšení výskytu buněk se strukturními chromozómovými aberacemi nad spontánní úroveň. Dávky pozitivní kontroly by měly být zvoleny tak, aby byly účinky zřetelné, ale aby hodnotitel okamžitě nezjistil identitu kódovaného preparátu. Je přijatelné, aby látka v pozitivní kontrole byla podávána jiným způsobem než zkoušená chemická látka, podle odlišného harmonogramu expozice, a aby se odběr vzorků prováděl pouze v jediném okamžiku. Pro pozitivní kontrolu navíc může být vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické třídy, je-li to vhodné. Příklady pozitivních kontrolních chemických látek jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1.

Příklady pozitivních kontrolních chemických látek

Negativní kontroly

V každém expozičním intervalu by měla být zařazena souběžná negativní kontrolní skupina zvířat, které jinak podstupují stejný proces jako exponované skupiny až na to, že nejsou vystavena zkoušené chemické látce. Používá-li se při podávání zkoušené chemické látky rozpouštědlo/vehikulum, měla by toto rozpouštědlo/vehikulum dostávat i kontrolní skupina. Pokud však dosavadní údaje o negativních kontrolách v různých intervalech expozice v dané zkušební laboratoři prokazují konzistentní údaje o variabilitě zvířat a četnosti buněk se strukturními aberacemi, může být pro negativní kontrolu nezbytný pouze jeden interval expozice. Je-li u negativních kontrol použit jediný odběr buněk, měl by se provést v prvním (nejkratším) intervalu expozice použitém ve studii.

POSTUP

Počet a pohlaví zvířat

Obecně je známo, že účinky zjištěné v mikronukleus testu jsou podobné u samců a samic (9) a předpokládá se, že tomu tak bude i u strukturních chromozómových aberací; většinu studií proto je možné provést s kterýmkoli z obou pohlaví. Existence údajů prokazujících významné rozdíly mezi samci a samicemi (např. rozdíly v systémové toxicitě, metabolismu, biologické dostupnosti, toxicita pro kostní dřeň atd. získané např. ve studii ke stanovení rozsahu) by byla důvodem pro použití zvířat obojího pohlaví. V tomto případě může být vhodné provést studii s oběma pohlavími, např. jako součást studie toxicity po opakovaných dávkách. V případě použití obou pohlaví by mohlo být vhodné použít faktoriálního uspořádání experimentu. Podrobnosti ohledně toho, jak analyzovat údaje získané při tomto uspořádání experimentu, jsou uvedeny v dodatku 2.

Velikost skupin při zahájení studie by měla být stanovena tak, aby poskytla minimálně pět analyzovatelných zvířat jednoho pohlaví, nebo každého pohlaví, jsou-li použita obě, z každé skupiny. Je-li expozice člověka chemickým látkám specifická pro určité pohlaví, jako je tomu například u některých léčivých přípravků, měla by být zkouška provedena se zvířaty odpovídajícího pohlaví. Určitým vodítkem pro maximální typické požadavky na počet zvířat může být, že studie s buňkami kostní dřeně při dvou odběrech se třemi skupinami exponovanými dávce jednou souběžnou negativní kontrolní skupinou plus jednou pozitivní kontrolní skupinou (každá skupina složena z pěti zvířat jednoho pohlaví) by vyžadovala 45 zvířat.

Dávkování

Jestliže se provádí předběžná studie pro stanovení rozsahu dávek, poněvadž nejsou k dispozici vhodné údaje, jež by mohly pomoci při stanovení dávek, pak by měla být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, které se použijí v hlavní studii (10). Cílem studie by mělo být zjistit maximální tolerovanou dávku, která je definována jako nejvyšší dávka, která bude po dobu trvání zkoušky tolerována bez příznaků toxicity omezující studii (např. vyvolání poklesu tělesné hmotnosti nebo cytotoxicity hematopoetického systému, avšak nikoli smrti nebo příznaků bolesti, utrpení nebo strádání, kdy je nezbytné zvířata humánně utratit (11)).

Nejvyšší dávku lze rovněž definovat jako dávku, která vyvolává určité známky toxicity pro kostní dřeň.

Výjimku z kritérií pro stanovení dávek mohou představovat chemické látky, jež vykazují saturaci toxikokinetických vlastností nebo indukují detoxifikační procesy, které mohou vést ke snížení expozice po dlouhodobé aplikaci a jež by měly být hodnoceny v každém jednotlivém případě.

Aby bylo možné získat informace o dávce a účinku, měla by úplná studie zahrnovat negativní kontrolní skupinu a minimálně tři úrovně dávek, které jsou zpravidla odstupňovány faktorem 2, avšak nepřevyšujícím 4. Pokud ve studii ke stanovení rozsahu dávek nebo na základě stávajících údajů zkoušená chemická látka nevyvolává toxicitu, měla by nejvyšší dávka při jednorázovém podávání odpovídat 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti. Pokud však zkoušená chemická látka způsobuje toxicitu, měla by být největší podávanou dávkou maximální tolerovaná dávka a úrovně dávek by měly přednostně pokrývat rozmezí od maximální dávky až po dávku vyvolávající malou toxicitu nebo nevyvolávající žádnou toxicitu. Je-li toxicita pro cílovou tkáň (kostní dřeň) pozorována na všech testovaných úrovních dávek, doporučuje se další studie s netoxickými dávkami. Studie, jejichž cílem je úplnější charakteristika kvantitativních informací o dávce a účinku, mohou vyžadovat zařazení doplňkových skupin zvířat exponovaných dalším dávkám. Pro některé typy zkoušených chemických látek (např. humánních léčivých přípravků), na něž se vztahují specifické požadavky, se tyto limity mohou lišit.

Limitní zkouška

Pokud experimenty pro určení rozsahu dávek nebo stávající údaje získané u příbuzných kmenů zvířat naznačují, že aplikace limitní dávky (viz níže) nevyvolá pozorovatelné toxické účinky (ani pokles proliferace kostní dřeně nebo jiné příznaky cytotoxicity cílové tkáně), a není-li na základě studií genotoxicity in vitro nebo na základě údajů o látkách, které mají příbuznou strukturu, očekávána genotoxicita, nepovažuje se úplná studie se třemi úrovněmi dávek za nutnou, za předpokladu, že bylo prokázáno, že zkoušená chemická látka (látky) dosahuje (dosahují) cílové tkáně (kostní dřeně). V takových případech může být postačující jediná úroveň expozice v limitní dávce. Při delší než 14denní aplikaci je limitní dávka 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den. Při 14denní a kratší aplikaci je limitní dávka 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den.

Podávání dávek

Při plánování zkoušky by měl být zvážen předpokládaný způsob expozice člověka. Proto lze zvolit odůvodněné způsoby expozice např. stravou, v pitné vodě, lokálně, subkutánně, nitrožilně, orálně (pomocí žaludeční sondy), inhalací, intratracheálně nebo implantací. Způsob podávání by měl být v každém případě zvolen tak, aby zajistil odpovídající expozici cílové tkáně (tkání). Intraperitoneální injekce se obecně nedoporučují, protože se nejedná o předpokládaný způsob expozice člověka, a mohla by být použita pouze s konkrétním vědeckým zdůvodněním. Je-li zkoušená chemická látka přimíchána do potravy nebo pitné vody, zejména v případě jednorázové dávky, mělo by se dbát na to, aby prodleva mezi příjmem krmiva a vody a odběrem vzorku byla dostatečná, aby umožnila detekci účinků (viz odstavce 33–34). Maximální objem kapaliny, který může být najednou podán žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti pokusného zvířete. Toto množství by obvykle nemělo překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít maximálně 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití objemů větších než tento by mělo být odůvodněno. Až na dráždivé a žíravé zkoušené chemické látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující podávání konstantního objemu v závislosti na tělesné hmotnosti při všech úrovních dávky.

Plán expozice

Zkoušené chemické látky jsou obvykle podávány jednorázově, ale mohou být podávány také ve dvou dávkách (tzn. dvě nebo více dávek v týž den v rozmezí ne více než 2–3 hodiny), aby bylo usnadněno podávání velkých objemů. Za těchto okolností, nebo je-li zkoušená chemická látka podávána inhalací, by měl být harmonogram odběru buněk stanoven na základě doby podání poslední dávky nebo ukončení expozice.

Pro tuto zkoušku je k dispozici málo údajů o vhodnosti protokolu s opakovanými dávkami. Avšak za situace, kdy je žádoucí integrovat tuto zkoušku se zkouškou toxicity po opakovaných dávkách, by se mělo dbát na to, aby nedošlo ke ztrátě mitotických buněk s poškozenými chromozómy, což může nastat u toxických dávek. Taková integrace je přijatelná, pokud nejvyšší dávka je větší než limitní dávka nebo je stejná (viz odstavec 29) a pokud je exponované skupině podávána limitní dávka po dobu trvání expozice. Je-li žádoucí integrace s jinými studiemi, měl by být za vhodnou zkoušku na chromozómových aberacích in vivo považován mikronukleus test (zkušební metoda B.12).

Vzorky kostní dřeně by měly být odebrány ve dvou různých intervalech od jednorázové aplikace. U hlodavců by se odběr měl provádět po takové době od aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (jenž trvá obvykle 12–18 hodin od expozice). Poněvadž doba nezbytná pro příjem a metabolismus zkoušené chemické látky (látek) a rovněž pro účinky na kinetiku buněčného cyklu může mít vliv na optimální časový interval pro detekci chromozómových aberací, doporučuje se provést další odběr po 24 hodinách od prvního odběru. V prvním intervalu expozice by měly být aplikovány všechny exponované skupiny a proveden odběr buněk. V dalším intervalu (intervalech) expozice je potřebné podat pouze nejvyšší dávku. Je-li na základě vědeckého odůvodnění aplikace rozložena do více než jednoho dne, měl by být odběr zpravidla proveden po takové době od poslední aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu.

Po expozici a před odběrem vzorků se zvířatům intraperitoneálně podá vhodná dávka látky zastavující metafázi (např. colcemidu nebo kolchicinu) a po vhodné době se u nich odeberou vzorky. U myši je tato doba do odebrání vzorku přibližně 3–5 hodin a u potkana je to 2–5 hodin. Z kostní dřeně se odeberou buňky, zhotoví se nátěry, ty se fixují a obarví a buňky se analyzují se na chromozómové aberace (12).

Pozorování

Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maximálního účinku po podání látky. Nejméně dvakrát denně po dobu podávání dávek by měla být provedena prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Všechna zvířata by měla být zvážena na počátku studie, nejméně jednou týdně během studií s opakovanou dávkou a při utracení. Při studiích s alespoň týdenním trváním by se alespoň jednou týdně měla změřit spotřeba krmiva. Pokud je zkoušená chemická látka podávána v pitné vodě, měla by se spotřeba vody měřit při každé výměně vody a alespoň jednou týdně. Zvířata, která vykazují neletální indikátory nadměrné toxicity, by měla být humánně utracena před uplynutím doby zkoušky (11).

Expozice cílových tkání

Ve vhodnou dobu (vhodné doby) by měl být odebrán vzorek krve, aby mohlo být provedeno vyšetření hladiny zkoušené chemické látky v plazmě za účelem prokázání, že došlo k expozici kostní dřeně, pokud je to požadováno a pokud neexistují jiné údaje o expozici (viz odstavec 44).

Příprava kostní dřeně a chromozómů

Buňky kostní dřeně se získávají z femuru nebo tibie zvířat ihned po humánním utracení, hypotonizují se a fixují. Buňky v metafázi se poté zavedenými metodami nanesou na podložní sklíčka a obarví se (viz (3) (12)).

Analýza

Všechny preparáty, včetně preparátů pozitivních a negativních kontrol, by měly být před analýzou označeny samostatným kódem určeným náhodným výběrem tak, aby hodnotiteli nebyly známy zkušební podmínky.

Jako měřítko cytotoxicity by měl být u všech exponovaných zvířat (včetně pozitivních kontrol), neexponovaných zvířat pro negativní kontrolu a zvířat pro negativní kontrolu s vehikulem/rozpouštědlem stanoven mitotický index, a to alespoň u 1 000 buněk na jedno zvíře.

U každého zvířete by mělo být analyzováno alespoň 200 metafází na strukturní chromozómové aberace včetně gapů a s vyloučením gapů (6), Pokud však z historické databáze negativních kontrol vyplývá, že střední četnost spontánního výskytu strukturních chromozómových aberací v dané laboratoři je < 1 %, mělo by se zvážit vyhodnocení dalších buněk. Chromatidové a chromozómové aberace by měly být zaznamenávány odděleně a klasifikovány podle podtypů (zlomy, výměny). Postupy používané v laboratoři by měly zajistit, aby analýzu chromozómových aberací prováděli dobře odborně připravení hodnotitelé a a aby tato analýza případně byla podrobena odborné revizi. Vzhledem k tomu, že při přípravě preparátů často dochází k poškození části buněk v metafázi s následnou ztrátou chromozómů, měly by vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu nejméně 2n ± 2, kde n je haploidní počet chromozómů pro daný druh.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Zpracování výsledků

Údaje pro jednotlivá zvířata by měly být zpracovány ve formě tabulky. U každého zvířete by měl být uveden mitotický index, počet hodnocených buněk v metafázi, počet aberací na každou buňku v metafázi a procentuální podíl buněk se strukturními chromozomovými aberacemi. Pro exponované a kontrolní skupiny by měly být uvedeny různé typy strukturních chromozómových aberací s jejich počtem a četností. Gapy, jakož i polyploidní buňky a buňky s endoreplikovanými chromozómy se zaznamenávají odděleně. Četnost výskytu gapů se zaznamenává, ale do analýzy celkové četnosti strukturních aberací se nezahrnuje. Neexistuje-li důkaz o rozdílu v odpovědi mezi pohlavími, mohou být pro účely statistické analýzy tyto údaje sloučeny. Uvedeny by měly být i údaje o toxicitě u zvířat a klinické příznaky.

Kritéria přijatelnosti

Přijatelnost zkoušky určují tato kritéria:

Hodnocení a interpretace výsledků

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud:

Je-li v určitém konkrétním čase odběru zkoumána pouze nejvyšší dávka, je zkoušená chemická látka považována za jasně pozitivní, pokud existuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou a výsledky jsou mimo distribuci dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení). Doporučení ohledně vhodných statistických metod lze najít v literatuře (13). Při provádění analýzy dávky a odezvy by měly být analyzovány alespoň tři skupiny exponované různé dávce. Při statistických testech by mělo být zvíře použito jako experimentální jednotka. Pozitivní výsledky zkoušky na chromozómové aberace znamenají, že zkoušená látka indukuje strukturální chromozómové aberace v kostní dřeni druhu zvířat použitého k testování.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, je zkoušená chemická látka považována za jasně negativní, pokud ve všech zkoumaných zkušebních podmínkách:

Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (13). Důkazy o expozici kostní dřeně zkoušené chemické látce mohou zahrnovat pokles mitotického indexu nebo měření hladiny zkoušené chemické látky (látek) v plazmě nebo v krvi. V případě nitrožilního podání není důkazů o expozici zapotřebí. Alternativně mohou být k prokázání expozice kostní dřeně použity údaje o absorpci, distribuci, metabolismu a exkreci (ADME) získané při nezávislé studii za použití stejného způsobu expozice a se stejným druhem. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená chemická látka za podmínek zkoušky neindukuje strukturní chromozómové aberace v kostní dřeni druhu zvířat použitého k testování.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odpovědi se nepožaduje.

V případech, kdy odpověď není jasně negativní nebo pozitivní, a s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku (např. slabý nebo okrajový nárůst), by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším vyšetřením u provedených experimentů. V některých případech by mohlo být užitečné analyzovat více buněk nebo provést opakovaný experiment za použití upravených zkušebních podmínek.

V ojedinělých případech dokonce ani po dalším šetření nebude možné na základě daných údajů učinit závěr, zda zkoušená chemická látka přináší pozitivní či negativní výsledky, a proto bude učiněn závěr, že výsledek studie je neurčitý.

Četnost polyploidie a endoreduplikovaných metafází v celkovém počtu metafází by se měla zaznamenat odděleně. Nárůst počtu polyploidních buněk / endoreduplikovaných buněk může znamenat, že zkoušená chemická látka má schopnost potlačit mitotické procesy nebo progresi buněčného cyklu (viz odstavec 3).

Závěrečná zpráva

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

Souhrn

LITERATURA

5)

V části B se kapitola B.12 nahrazuje tímto:

„B.12   Mikronukleus test v savčích erytrocytech

ÚVOD

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 474 (2016). Je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument OECD, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které byly v těchto pokynech ke zkoušení provedeny (1).

Mikronukleus test v savčích erytrocytech in vivo je zvláště významný k posouzení genotoxicity, neboť zde probíhá aktivní metabolismus in vivo, farmakokinetika a procesy reparace DNA, které přispívají k účinku testované látky, jakkoli mohou být různé u různých druhů. Zkouška in vivo je rovněž užitečná pro další výzkum genotoxicity zjištěné v systémech in vitro.

Mikronukleus test v savčích erytrocytech in vivo je používán k detekci poškození chromozómů nebo mitotického aparátu erytroblastů, které je indukováno zkoušenou chemickou látkou. V tomto testu se hodnotí tvorba mikrojader v erytrocytech odebraných z kostní dřeně nebo z buněk periferní krve, obvykle hlodavců.

Účelem mikronukleus testu v savčích erytrocytech je identifikovat chemické látky, které způsobují cytogenetické poškození, jehož výsledkem je tvorba mikrojader obsahujících nereplikující se (lagging) chromozómové fragmenty nebo celé chromozómy.

Když se erytroblast kostní dřeně mění na nezralý erytrocyt (někdy též označovaný jako polychromatický erytrocyt nebo retikulocyt), hlavní jádro je vypuzeno a mikrojádra, která při tom mohou vzniknout, zůstávají v cytoplasmě. Zviditelnění nebo detekce mikrojader jsou v těchto buňkách usnadněny tím, že neobsahují hlavní jádro. Nárůst výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry v exponovaných zvířatech je známkou indukovaných strukturních nebo numerických chromozómových aberací.

Nově vytvořené erytrocyty s mikrojádry se zjišťují a kvantifikují obarvením a poté následuje buď vizuální hodnocení pomocí mikroskopu, nebo automatizovaná analýza. Počítání dostačujícího počtu nezralých erytrocytů v periferní krvi nebo kostní dřeni dospělých zvířat se značně usnadní použitím automatizovaného hodnotícího systému. Tyto systémy jsou přijatelnými alternativami manuálního hodnocení (2). Z komparativních studií vyplývá, že tyto metody, při nichž se používají vhodné kalibrační standardy, mohou zajistit lepší mezilaboratorní a vnitrolaboratorní reprodukovatelnost a větší citlivost než manuální hodnocení pomocí mikroskopu (3) (4). Automatizované systémy pro měření četnosti erytrocytů s mikrojádry zahrnují kromě jiného průtokové cytometry (5), platformy pro analýzu obrazu (6)(7) a laserové skenovací cytometry (8).

Ačkoli se to v rámci tohoto testu obvykle neprovádí, lze odlišit chromozómové fragmenty od celých chromozómů podle řady kritérií. Tato kritéria zahrnují identifikaci přítomnosti nebo nepřítomnosti kinetochoru nebo centromerické DNA, jež jsou obojí charakteristické pro neporušené chromozómy. Nepřítomnost kinetochoru nebo centromerické DNA naznačuje, že mikrojádro obsahuje pouze fragmenty chromozómů, zatímco jejich přítomnost ukazuje na ztrátu chromozómů.

Definice použitých termínů jsou uvedeny v dodatku 1.

VÝCHOZÍ ÚVAHY

Cílovou tkání pro genetická poškození v tomto testu je kostní dřeň mladých dospělých hlodavců, protože v této tkáni vznikají erytrocyty. Detekce mikrojader v nezralých erytrocytech v periferní krvi je možná i u jiných druhů savců, u nichž byla prokázána dostatečná citlivost při detekci chemické látky, které v těchto buňkách způsobují strukturní nebo numerické chromozómové aberace (indukcí mikrojader v nezralých erytrocytech), a je-li uvedeno vědecké zdůvodnění. Hlavním konečným ukazatelem je četnost výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry. Četnost výskytu zralých erytrocytů, jež obsahují mikrojádra v periferní krvi, může být rovněž použita jako koncový ukazatel u druhů bez silné slezinné selekce proti buňkám s mikrojádry a jsou-li zvířata trvale exponována po dobu, jež přesahuje délku života erytrocytu u použitého druhu (např. 4 týdny nebo více u myši).

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená chemická látka (chemické látky) nebo reaktivní metabolit (metabolity) nedostanou do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.

Před použitím této zkušební metody na směs za účelem získání údajů pro zamýšlené použití v právních předpisech by se mělo zvážit, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč je tomu tak. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.

PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

Zvířata se vhodným způsobem vystaví zkoušené chemické látce. Použije-li se kostní dřeň, zvířata se ve vhodném okamžiku po expozici humánně utratí, odebere se kostní dřeň, připraví se preparát a obarví se (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Při použití periferní krve se krev ve vhodném okamžiku (vhodných okamžicích) po expozici odebere, připraví se preparát a obarví se (12) (16) (17) (18). Při akutní expozici je důležité zvolit takové časy odběru kostní dřeně nebo krve, kdy je možné detekovat indukci nezralých erytrocytů s mikrojádry související s expozicí. V případě odběru periferní krve musí též uplynout dostatek času, aby se tyto jevy mohly objevit v cirkulující krvi. Preparáty se analyzují na přítomnost mikrojader, a to vizualizací pomocí mikroskopu, analýzou obrazu, průtokovou cytometrií nebo laserovou skenovací cytometrií.

OVĚŘENÍ ZPŮSOBILOSTI LABORATOŘE

Experimenty pro ověření způsobilosti

Aby bylo možné před zahájením rutinního zkoušení zjistit, zda laboratoř má s danou zkouškou dostatečné zkušenosti, měla by prokázat schopnost reprodukovat očekávané výsledky z publikovaných údajů (17) (19) (20) (21) (22), pokud jde o četnost výskytu mikrojader, nejméně se dvěma pozitivními kontrolními chemickými látkami (včetně slabých odpovědí indukovaných nízkými dávkami u pozitivních kontrol), např. látkami uvedenými v tabulce 1, a s kontrolami s kompatibilním vehikulem/rozpouštědlem (viz odstavec 26). Při těchto experimentech by se měly používat dávky, jež poskytují reprodukovatelné nárůsty v závislosti na dávce, a měly by prokázat citlivost a dynamické rozpětí zkušebního systému ve sledované tkáni (kostní dřeni nebo periferní krvi) za použití hodnotící metody, jež má být v laboratoři uplatňována. Tento požadavek neplatí pro laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají k dispozici historickou databázi, jak je definována v odstavci 14–18.

Historické kontrolní údaje

V průběhu šetření způsobilosti by laboratoř měla stanovit:

Při prvním získávání údajů o dosavadní distribuci negativních kontrol by měly být výsledky provedených negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji, pokud existují. S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by souběžné negativní kontroly v ideálním případě spadat do 95 % rozmezí této distribuce. Historická databáze negativních kontrol laboratoře by měla být statisticky robustní, aby byla zajištěna schopnost laboratoře posuzovat distribuci svých údajů o negativních kontrolách. V literatuře se doporučuje, že nezbytným minimem může být 10 experimentů, nejlépe však by databáze měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek. V laboratořích by měly být uplatňovány metody řízení jakosti, jako např. kontrolní diagramy (např.C-charts nebo X-bar charts (23)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“. Další doporučení, jak získat a používat dosavadní údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (24).

Pokud laboratoř neprovedla dostatečný počet experimentů, aby mohla během šetření způsobilosti (popsaného v odstavci 13) stanovit statisticky robustní distribuci negativních kontrol (viz odstavec 15), je přijatelné, aby distribuce byla stanovena během prvních rutinních zkoušek. Uplatňování tohoto přístupu by mělo vycházet z doporučení uvedených v literatuře (24) a výsledky negativních kontrol získané při těchto experimentech by měly zůstat v souladu s publikovanými údaji o negativních kontrolách.

Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich dopadu na výsledné údaje tak, aby zůstaly v souladu se stávající historickou kontrolní databází laboratoře. Pouze případy větších rozdílů ve zkušebním protokolu by měly vést k zavedení nové historické kontrolní databáze, přičemž její odlišnost od dřívější distribuce se stanoví na základě odborného posouzení (viz odstavec 15). V průběhu opětovného stanovení nemusí být k provedení aktuální zkoušky nutná úplná databáze negativních kontrol, pokud laboratoř prokáže, že hodnoty jejích souběžných negativních kontrol zůstávají v souladu s její předchozí databází nebo s odpovídajícími publikovanými údaji.

Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat výskyt nezralých erytrocytů s mikrojádry u každého zvířete. Výsledky souběžných negativních kontrol by v ideálním případě měly být v 95 % rozmezí distribuce v historické databázi negativních kontrol laboratoře. Pokud jsou údaje ze souběžných negativních kontrol mimo 95 % rozmezí, může být přijatelné je zařadit mezi dosavadní distribuci kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existuje důkaz o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz odstavec 15), a neexistuje důkaz o tom, že by došlo k technické nebo lidské chybě.

POPIS METODY

Příprava

Výběr druhu zvířat

Měly by být použity běžně používané laboratorní kmeny zdravých mladých pohlavně dospělých zvířat. Použit lze myši, potkany nebo jiné vhodné druhy savců. Při použití periferní krve se musí stanovit, že detekci indukovaných mikrojader u zvoleného druhu neohrozí odstraňování buněk s mikrojádry z krevního oběhu ve slezině. Toto bylo jasně prokázáno u periferní krve myši a potkana (2). Vědecké zdůvodnění použití jiných druhů než potkanů a myší by mělo být uvedeno ve zprávě. Jsou-li použity jiné druhy než hlodavci, doporučuje se měření indukovaných mikrojader začlenit do jiné vhodné zkoušky toxicity.

Podmínky chovu a krmení zvířat

Teplota v místnosti pro zvířata by u hlodavců měla být 22 °C (± 3 °C). Relativní vlhkost vzduchu by v ideálním případě měla být 50–60 %, ale minimálně 40 % a neměla by pokud možno přesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody. Výběr potravy může být ovlivněn nutností zajistit dostatečné mísení se zkoušenou látkou, je-li látka podávána touto cestou. Hlodavci by měli být chováni v malých skupinách (nejvýše po pěti v každé kleci) téhož pohlaví a se stejnou aplikací, pokud se nepředpokládá agresivní chování, přednostně v klecích s pevnou podlahou s vhodným obohacením životního prostředí. Zvířata mohou být umístěna v klecích individuálně, pouze je-li to vědecky odůvodněné.

Příprava zvířat

Obvykle se používají zdravá mladá dospělá zvířata (u hlodavců ideálně ve věku 6–10 týdnů na počátku expozice, ale přijatelná jsou i zvířata poněkud starší), která se náhodně přiřadí do kontrolních a experimentálních skupin. Jednotlivá zvířata se jednoznačně identifikují humánní, co nejméně invazivní metodou (např. kroužkováním, označením štítkem, pomocí mikročipu nebo biometrické identifikace, avšak nikoli nastřihnutím ucha nebo prstu dolní končetiny) a nechají se v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Mělo by se zabránit vzájemné kontaminaci pozitivní kontroly a zkoušené chemické látky. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti zvířat daného pohlaví.

Příprava dávek

Pevné zkoušené chemické látky by se měly rozpustit nebo suspendovat ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech nebo by měly být přimíchány do potravy nebo pitné vody před podáním dávky zvířatům. Kapalné zkoušené chemické látky mohou být podávány přímo nebo mohou být před podáním zředěny. Pro účely expozice inhalací lze zkoušené chemické látky v závislosti na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech podávat jako plyn, páru nebo pevný/kapalný aerosol. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování a nestanoví vhodné podmínky pro skladování.

Zkušební podmínky

Rozpouštědlo/vehikulum

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých úrovních dávek toxické účinky a nemělo by být schopno chemické reakce se zkoušenými chemickými látkami. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo referenčními údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejprve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul. Jako příklad běžně používaných kompatibilních rozpouštědel/vehikul lze uvést vodu, fyziologický roztok, roztok methylcelulosy, roztok sodné soli karboxymethylcelulosy, olivový olej a kukuřičný olej. Neexistují-li historické nebo publikované kontrolní údaje prokazující, že zvolené atypické rozpouštědlo/vehikulum neindukuje mikrojádra nebo jiné zhoubné účinky, měla by být provedena počáteční studie za účelem stanovení přijatelnosti kontroly s tímto rozpouštědlem/vehikulem.

Kontroly

Pozitivní kontroly

V každé zkoušce by měla být obvykle zařazena jedna skupina zvířat vystavených pozitivní kontrolní chemické látce. Od toho lze upustit, jestliže zkušební laboratoř prokázala způsobilost k provádění zkoušky a stanovila historické rozmezí pozitivních kontrol. Není-li zařazena souběžná pozitivní kontrolní skupina, měly by být v každém experimentu zařazeny hodnotící kontroly (fixované a nezbarvené preparáty nebo vzorky buněčné suspenze podle toho, co je vhodné pro danou hodnotící metodu). Tyto hodnotící kontroly lze získat tak, že se do hodnocení studie zařadí vhodné referenční vzorky, které byly získány a uchovány ze samostatného experimentu s pozitivními kontrolami prováděného pravidelně (např. každých 6–18 měsíců), například během testování způsobilosti a poté pravidelně podle potřeby.

Chemické látky pro pozitivní kontrolu by měly spolehlivě vyvolat pozorovatelné zvýšení výskytu buněk s mikrojádry nad spontánní úroveň. Při použití manuálního hodnocení za použití mikroskopie by dávky u pozitivní kontroly měly být zvoleny tak, aby byl účinek zřetelný, ale aby hodnotitel okamžitě nezjistil identitu kódovaného vzorku. Je přijatelné, aby látka v pozitivní kontrole byla podávána jiným způsobem než zkoušená chemická látka, podle odlišného harmonogramu expozice, a aby se odběr vzorků prováděl pouze v jediném okamžiku. Pro pozitivní kontrolu navíc může být vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické třídy, je-li to vhodné. Příklady pozitivních kontrolních chemických látek jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1.

Příklady chemických látek pro pozitivní kontroly.

Chemické látky a registrační číslo CAS (CASRN)

ethyl-methansulfonát [CASRN 62-50-0]

methyl-methansulfonát [CASRN 66-27-3]

1-ethyl-1-nitrosomočovina [CASRN 759-73-9]

mitomycin C [CASRN 50-07-7]

cyklofosfamid (cyklofosfamid monohydrát) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

2,4,6-tris(aziridin-1-yl)- 1,3,5-triazin [CASRN 51-18-3]

kolchicin [CASRN 64-86-8] nebo vinblastin [CASRN 865-21-4] – jako aneugeny

Negativní kontroly

V každém expozičním intervalu by měla být zařazena souběžná negativní kontrolní skupina zvířat, která jinak podstupují stejný proces jako exponované skupiny až na to, že nejsou vystavena zkoušené chemické látce. Používá-li se při podávání zkoušené chemické látky rozpouštědlo/vehikulum, měla by toto rozpouštědlo/vehikulum dostávat i kontrolní skupina. Pokud však dosavadní údaje o negativních kontrolách v různých intervalech expozice v dané zkušební laboratoři prokazují konzistentní údaje o variabilitě zvířat a četnosti buněk s mikrojádry, může být pro negativní kontrolu nezbytný pouze jeden odběr. Je-li u negativních kontrol použit jediný odběr, měl by se provést v prvním (nejkratším) intervalu expozice použitém ve studii.

Při použití periferní krve je u krátkodobých studií přijatelný vzorek odebraný před expozicí namísto souběžné negativní kontroly, pokud výsledné údaje jsou konzistentní s historickou kontrolní databází dané zkušební laboratoře. Bylo prokázáno, že u potkana vzorek s malými objemy odebraný před expozicí (např. méně než 100 μl/den) má minimální dopad na četnost výskytu mikrojader na pozadí (25).

POSTUP

Počet a pohlaví zvířat

Indukce mikrojader je v zásadě u samic a samců podobná, a většinu studií je proto možné provést s kterýmkoli z obou pohlaví (26). Existence údajů prokazujících významné rozdíly mezi samci a samicemi (např. rozdíly v systémové toxicitě, metabolismu, biologické dostupnosti, toxicita pro kostní dřeň atd. získané např. ve studii ke stanovení rozsahu dávek) by byla důvodem pro použití zvířat obojího pohlaví. V tomto případě může být vhodné provést studii s oběma pohlavími, např. jako součást studie toxicity po opakovaných dávkách. V případě použití obou pohlaví by mohlo být vhodné použít faktoriálního uspořádání experimentu. Podrobnosti ohledně toho, jak analyzovat údaje získané při tomto uspořádání experimentu, jsou uvedeny v dodatku 2.

Velikost skupin při zahájení studie by měla být stanovena tak, aby poskytla minimálně pět analyzovatelných zvířat jednoho pohlaví, nebo každého pohlaví, jsou-li použita obě, z každé skupiny. Je-li expozice člověka chemickým látkám specifická pro určité pohlaví, jako je tomu například u některých léčivých přípravků, měla by být zkouška provedena se zvířaty odpovídajícího pohlaví. Určitým vodítkem pro maximální typické požadavky na počet zvířat může být, že studie s kostní dření prováděné podle parametrů uvedených v odstavci 37 se třemi exponovanými skupinami a souběžnými negativními a kontrolními skupinami (každá skupina složena z pěti zvířat jednoho pohlaví) by vyžadovala 25 až 35 zvířat.

Dávkování

Provádí-li se studie pro zjištění rozsahu dávek, poněvadž nejsou k dispozici vhodné údaje, jež by mohly pomoci při stanovení dávek, měla by být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, které se použijí v hlavní studii (27). Cílem studie by mělo být zjistit maximální tolerovanou dávku, která je definována jako nejvyšší dávka, která bude po dobu trvání zkoušky tolerována bez příznaků toxicity omezující studii (např. vyvolání poklesu tělesné hmotnosti nebo cytotoxicity hematopoetického systému, avšak nikoli smrti nebo příznaků bolesti, utrpení nebo strádání, kdy je nezbytné zvířata humánně utratit (28)).

Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka vyvolávající v kostní dřeni toxicitu (např. snížení podílu nezralých erytrocytů z celkového počtu erytrocytů v kostní dřeni nebo v periferní krvi o více než 50 %, avšak nejméně na 20 % kontrolní hodnoty). Při analýze CD71 pozitivních buněk v periferním krevním oběhu (tj. pomocí průtokové cytometrie) tato velmi mladá frakce nezralých erytrocytů odpovídá na toxické podněty rychleji než větší kohorta nezralých erytrocytů s pozitivní RNA. Vyšší zjevná toxicita proto může být zřejmá při uspořádání s akutní expozicí, kdy se zkoumá frakce CD71 pozitivních nezralých erytrocytů v porovnání s těmi uspořádáními, jež identifikují nezralé erytrocyty na základě obsahu RNA. A proto, jestliže se při experimentech využívá pěti nebo méně dnů expozice, může být nejvyšší dávka chemické látky způsobující toxicitu definována jako dávka, která způsobuje statisticky významné snížení podílu nezralých CD71 pozitivních erytrocytů z celkového množství erytrocytů, avšak nikoli na úroveň menší než 5 % kontrolní hodnoty (29).

Výjimku z kritérií pro stanovení dávek mohou představovat chemické látky, jež vykazují saturaci toxikokinetických vlastností nebo indukují detoxifikační procesy, které mohou vést ke snížení expozice po dlouhodobé aplikaci, a jež by měly být hodnoceny v každém jednotlivém případě.

Aby bylo možné získat informace o dávce a účinku, měla by úplná studie zahrnovat negativní kontrolní skupinu a minimálně tři úrovně dávek, které jsou zpravidla odstupňovány faktorem 2, avšak nepřevyšujícím 4. Pokud zkoušená chemická látka ve studii ke stanovení rozsahu dávek nebo na základě existujících údajů nevyvolává toxicitu, měla by být nejvyšší dávka 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den při době podávání 14 dní nebo delší nebo 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den při dobách podávání kratších než 14 dní. Pokud však zkoušená chemická látka způsobuje toxicitu, měla by být největší podávanou dávkou maximální tolerovaná dávka a úrovně dávek by měly přednostně pokrývat rozmezí od maximální dávky až po dávku vyvolávající malou toxicitu nebo nevyvolávající žádnou toxicitu. Je-li toxicita pro cílovou tkáň (kostní dřeň) pozorována na všech testovaných úrovních dávek, doporučuje se další studie s netoxickými dávkami. Studie, jejichž cílem je úplnější charakteristika kvantitativních informací o dávce a odezvě, mohou vyžadovat zařazení doplňkových skupin zvířat exponovaných dalším dávkám. Pro některé typy zkoušených chemických látek (např. humánních léčivých přípravků), na něž se vztahují specifické požadavky, se tyto limity mohou lišit.

Limitní zkouška

Pokud experimenty pro určení rozsahu dávek nebo existující údaje získané u příbuzných kmenů zvířat naznačují, že aplikace limitní dávky (viz níže) nevyvolá pozorovatelné toxické účinky (ani pokles proliferace kostní dřeně nebo jiné příznaky cytotoxicity cílové tkáně), a není-li na základě studií genotoxicity in vitro nebo na základě údajů o látkách, které mají příbuznou strukturu, očekávána genotoxicita, nepovažuje se úplná studie se třemi úrovněmi dávky za nutnou, za předpokladu, že bylo prokázáno, že zkoušená chemická látka (látky) dosahuje (dosahují) cílové tkáně (kostní dřeně). V takových případech může být postačující jediná úroveň expozice v limitní dávce. Pro 14denní a delší aplikaci je limitní dávka 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den. Pro kratší než 14denní aplikaci je limitní dávka 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den.

Podávání dávek

Při plánování zkoušky by měl být zvážen předpokládaný způsob expozice člověka. Proto lze zvolit odůvodněné způsoby expozice např. potravou, v pitné vodě, lokálně, subkutánně, nitrožilně, orálně (pomocí žaludeční sondy), inhalací, intratracheálně nebo implantací. Způsob podávání by měl být v každém případě zvolen tak, aby zajistil odpovídající expozici cílové tkáně (tkání). Intraperitoneální injekce se obecně nedoporučují, protože se nejedná o předpokládaný způsob expozice člověka, a mohla by být použita pouze s konkrétním vědeckým zdůvodněním. Je-li zkoušená chemická látka přimíchána do potravy nebo pitné vody, zejména v případě jednorázové dávky, mělo by se dbát na to, že prodleva mezi příjmem krmiva a vody a odběrem vzorku by měla být dostatečná, aby umožnila detekci účinků (viz odstavec 37). Maximální objem kapaliny, který může být najednou podán žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti pokusného zvířete. Toto množství by obvykle nemělo překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít maximálně 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití objemů větších než tento by mělo být odůvodněno. Až na dráždivé a žíravé zkoušené chemické látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující podávání konstantního objemu v závislosti na tělesné hmotnosti při všech úrovních dávky.

Plán expozice

Přednostně se provádějí 2 nebo více aplikací v intervalu 24 hodin, zejména při začlenění tohoto testu do jiných studií toxicity. Alternativně lze podat jedinou dávku, pokud je to vědecky odůvodněno (např. chemické látky, o nichž je známo, že blokují buněčný cyklus). Zkoušené chemické látky mohou být podávány také ve dvou dávkách, tzn. dvě nebo více dávek v týž den v rozmezí ne více než 2–3 hodiny, aby bylo usnadněno podávání velkých objemů. Za těchto okolností, nebo je-li zkoušená chemická látka podávána inhalací, by měl být harmonogram odběru buněk stanoven na základě doby podání poslední dávky nebo ukončení expozice.

Zkouška může být prováděna na myších nebo potkanech jedním z těchto způsobů:

Popřípadě mohou být použity jiné režimy podávání dávek nebo odběru vzorků, je-li to vědecky zdůvodněno a k usnadnění integrace s jinými zkouškami toxicity.

Pozorování

Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maximálního účinku po podání látky. Nejméně dvakrát denně po dobu podávání dávek by měla být provedena prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Všechna zvířata by měla být zvážena na počátku studie, nejméně jednou týdně během studií s opakovanou dávkou a při utracení. Při studiích s alespoň týdenním trváním by se alespoň jednou týdně měla změřit spotřeba krmiva. Pokud je zkoušená chemická látka podávána v pitné vodě, měla by se spotřeba vody měřit při každé výměně vody a alespoň jednou týdně. Zvířata, která vykazují neletální indikátory nadměrné toxicity, by měla být humánně utracena před uplynutím doby zkoušky (28). Za určitých okolností by mohla být sledována tělesná teplota zvířete, protože hypertermie a hypotermie indukovaná expozicí může způsobovat falešné výsledky (32) (33) (34).

Expozice cílových tkání

Krevní vzorek by měl být odebrán ve vhodnou dobu (vhodné doby), aby mohlo být provedeno vyšetření hladiny zkoušené chemické látky v plazmě za účelem prokázání, že došlo k expozici kostní dřeně, pokud je to požadováno a pokud neexistují jiné údaje o expozici (viz odstavec 48).

Příprava kostní dřeně nebo krve

Buňky kostní dřeně se obvykle získávají z femuru nebo tibie zvířat ihned po jejich humánním usmrcení. Buňky se odeberou a zavedenými metodami se preparují a obarví. Malé objemy periferní krve lze podle příslušných standardů dobrého zacházení se zvířaty získat buď postupem, který umožňuje přežití zkušebního zvířete, např. odběrem z ocasní žíly nebo jiné vhodné krevní cévy, anebo srdeční punkcí nebo odběrem vzorku z velké cévy při utracení zvířete. U erytrocytů získaných z kostní dřeně nebo z periferní krve je možné, v závislosti na metodě analýzy, buňky ihned supravitálně obarvit (16) (17) (18), připravit preparáty roztěrem a poté je obarvit pro mikroskopii nebo vhodně fixovat a obarvit pro analýzu pomocí průtokové cytometrie. Použitím barviva specifického pro DNA [např. akridinová oranž (35) nebo Hoechst 33258 a pyronin-Y (36)] se lze vyhnout některým artefaktům spojeným s použitím barviva nespecifického pro DNA. Tato výhoda nebrání použití konvenčních barviv (např. Giemsa pro analýzu pod mikroskopem). Přídavné systémy [např. celulosová kolona k odstranění buněk obsahujících jádra (37) (38)] lze použít za předpokladu, že se prokázalo, že jsou kompatibilní se systémy pro preparaci vzorků v laboratoři.

Jsou-li tyto metody použitelné, lze k identifikaci povahy mikrojader (chromozóm/chromozómový fragment) využít protilátky proti kinetochorům (39), hybridizační metodu FISH využívající pan-centromerické DNA-sondy (40), případně značení in situ pomocí primerů se specifickou pan-centromerickou vazbou spolu s vhodným kontrastním barvením DNA (41), aby bylo možné určit, zda mechanismus indukce mikrojader je důsledkem klastogenního a/nebo aneugenního působení. K rozlišení mezi klastogeny a aneugeny lze použít i jiné metody, pokud se ukázaly jako účinné.

Analýza (manuální a automatizovaná)

Všechny preparáty nebo vzorky k analýze, včetně preparátů nebo vzorků pozitivní a negativní kontroly, by měly být před kterýmkoli typem analýzy označeny samostatným kódem a určeny náhodným výběrem tak, aby hodnotiteli používajícímu ruční postupy nebyly známy podmínky expozice; takové kódování není nutné při použití automatizovaných systémů hodnocení, které nejsou závislé na vizuální kontrole a nemohou být ovlivněny neobjektivností obsluhy. Pro každé zvíře se stanoví podíl nezralých erytrocytů z celkového (nezralé + zralé) množství erytrocytů, přičemž se v případě kostní dřeně použije celkově alespoň 500 erytrocytů a v případě periferní krve alespoň 2 000 erytrocytů (42). U každého zvířete by se mělo vyšetřit alespoň 4 000 nezralých erytrocytů na výskyt mikrojader v nezralých erytrocytech (43). Pokud z historické databáze negativních kontrol vyplývá, že střední četnost výskytu nezralých erytrocytů s mikrojádry v dané laboratoři je < 0,1 %, mělo by se zvážit vyhodnocení dalších buněk. Při analýze vzorků by podíl počtu nezralých erytrocytů z celkového počtu všech hodnocených erxtrocytů u exponovaných zvířat neměl být menší než 20 % podílu v kontrolách s vehikulem/rozpouštědlem při hodnocení pod mikroskopem a ne méně než přibližně 5 % podílu nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů v kontrolách s vehikulem/rozpouštědlem při hodnocení CD71 + nezralých erytrocytů cytometrickými metodami (viz odstavec 31) (29). Například ve zkoušce s kostní dření, která je hodnocena mikroskopicky, pokud by podíl nezralých erytrocytů v kostní dřeni u kontrol byl 50 %, horní limit toxicity by představoval 10 % nezralých erytrocytů.

Poněvadž slezina potkanů erytrocyty s mikrojádry zachycuje a ničí, v zájmu zachování vysoké citlivosti zkoušky při analýze periferní krve potkana se upřednostňuje omezit analýzu nezralých erytrocytů s mikrojádry na nejmladší frakci. Při použití automatizovaných analytických metod lze tyto nejnezralejší erytrocyty identifikovat na základě jejich vysokého obsahu RNA nebo vysoké hladiny transferinových receptorů (CD71+) vyjádřené na jejich povrchu (31). Z přímého srovnání různých metod barvení však vyplynulo, že uspokojivé výsledky lze získat různými metodami, včetně konvenčního zbarvení akridinovou oranží (3)(4).

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Zpracování výsledků

Údaje pro jednotlivá zvířata by měly být zpracovány ve formě tabulky. Pro každé analyzované zvíře by měl být uveden počet vyšetřených nezralých erytrocytů, počet nezralých erytrocytů s mikrojádry a podíl nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů. Jestliže jsou myši exponovány nepřetržitě čtyři týdny nebo déle, měly by být také uvedeny údaje o počtu a podílu zralých erytrocytů s mikrojádry, byly-li shromažďovány. Uvedeny by měly být i údaje o toxicitě u zvířat a klinické příznaky.

Kritéria přijatelnosti

Přijatelnost zkoušky určují tato kritéria:

Hodnocení a interpretace výsledků

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud:

Je-li v určitém konkrétním čase odběru zkoumána pouze nejvyšší dávka, je zkoušená chemická látka považována za jasně pozitivní, pokud existuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou a výsledky jsou mimo distribuci dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. mimo 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení). Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (44) (45) (46) (47). Při provádění analýzy dávky a účinku by měly být analyzovány alespoň tři skupiny exponované různé dávce. Při statistických testech by mělo být zvíře použito jako experimentální jednotka. Pozitivní výsledky mikronukleus testu znamenají, že zkoušená látka indukuje mikrojádra, jež jsou důsledkem chromozómového poškození nebo poškození mitotického aparátu erytroblastu testovaného druhu. V případě, že cílem zkoušky bylo detekovat centromery v mikrojádrech, pak indukce mikrojader obsahujících centromery (centromerickou DNA nebo kinetochory, jež ukazují na ztrátu celých chromozómů) zkoušenou chemickou látkou je důkazem, že zkoušená chemická látka je aneugenní.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, je zkoušená chemická látka považována za jasně negativní, pokud ve všech zkoumaných zkušebních podmínkách:

Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (44) (45) (46) (47). Důkazy o expozici kostní dřeně zkoušené chemické látce mohou zahrnovat pokles poměru nezralých a zralých erytrocytů nebo měření hladiny zkoušené chemické látky v plazmě nebo krvi. V případě nitrožilního podání není důkazů o expozici zapotřebí. Alternativně mohou být k prokázání expozice kostní dřeně použity údaje o absorpci, distribuci, metabolismu a exkreci (ADME) získané při nezávislé studii za použití stejného způsobu expozice a se stejným druhem. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená chemická látka za podmínek zkoušky neprodukuje mikrojádra v nezralých erytrocytech druhu zvířat použitého k testování.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odpovědi se nepožaduje.

V případech, kdy odpověď není jasně negativní nebo pozitivní, a s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku (např. slabý nebo okrajový nárůst), by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším vyšetřením u provedených experimentů. V některých případech by mohlo být užitečné analyzovat více buněk nebo provést opakovaný experiment za použití upravených zkušebních podmínek.

V ojedinělých případech dokonce ani po dalším šetření nebude možné na základě daných údajů učinit závěr, zda zkoušená chemická látka přináší pozitivní či negativní výsledky, a proto bude učiněn závěr, že výsledek studie je neurčitý.

Závěrečná zpráva

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

LITERATURA

6)

V části B se zrušuje kapitola B.15.

7)

V části B se zrušuje kapitola B.16.

8)

V části B se zrušuje kapitola B.18.

9)

V části B se zrušuje kapitola B.19.

10)

V části B se zrušuje kapitola B.20.

11)

V části B se zrušuje kapitola B.24.

12)

V části B se kapitola B.47 nahrazuje tímto:

„B.47   Zkušební metoda využívající zákal a propustnost rohovky skotu pro identifikaci i) chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí a ii) chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí

ÚVOD

Tato metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 437 (2013). Zkušební metodu pro zákal a propustnost rohovky u skotu (BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability) hodnotil Koordinační výbor mezi různými organizacemi pro ověřování platnosti alternativních metod (ICCVAM) spolu s Evropským střediskem pro validaci alternativních metod (ECVAM) a Japonským střediskem pro validaci alternativních metod (JaCVAM) v letech 2006 a 2010 (1) (2). Při prvním hodnocení byla zkušební metoda BCOP hodnocena z hlediska její užitečnosti pro identifikaci chemických látek (látek a směsí) vyvolávajících závažné poškození očí (1). Při druhém hodnocení byla zkušební metoda BCOP hodnocena z hlediska její užitečnosti pro identifikaci chemických látek (látek a směsí), které nejsou klasifikovány jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí (2). Databáze pro validaci BCOP obsahovala celkem 113 látek a 100 směsí (2) (3). Na základě těchto hodnocení a jejich odborné revize se dospělo k závěru, že tato zkušební metoda může správně identifikovat chemické látky (látky i směsi) vyvolávající vážné poškození očí (kategorie 1) a také látky, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí, jak je definuje Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek (GHS) Organizace spojených národů (OSN) (4) a nařízení (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí (CLP) (7), a byla proto potvrzena jako vědecky platná pro oba výše uvedené účely. Vážným poškozením očí se rozumí vyvolání poškození oční tkáně nebo zhoršení vidění po aplikaci zkoušené chemické látky na povrch oka, které není plně vratné do 21 dnů po aplikaci. Zkoušené chemické látky vyvolávající vážné poškození očí jsou klasifikovány v kategorii 1 GHS OSN. Chemické látky, které nejsou klasifikovány jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí, jsou definovány jako chemické látky, které nesplňují požadavky pro klasifikaci v kategorii 1 nebo 2 (2A nebo 2B) GHS OSN, tj. označují se jako chemické látky bez kategorie GHS OSN. V této zkušební metodě je uvedeno doporučené použití i to, jaká jsou omezení zkušební metody BCOP na základě jejích hodnocení. Hlavní rozdíly mezi původní verzí Pokynu OECD pro zkoušení z roku 2009 a aktualizovanou verzí z roku 2013 se mimo jiné týkají: použití zkušení metody BCOP k identifikaci chemických látek, které není nutné klasifikovat podle systému GHS OSN (odstavce 2 a 7); vyjasnění týkajících se použitelnosti zkušební metody BCOP pro testování alkoholů, ketonů a pevných látek (odstavce 6 a 7) a látek a směsí (odstavec 8); vyjasnění toho, jak by měla být testována smáčedla a směsi smáčedel (odstavec 28); aktualizace a vyjasnění týkajících se pozitivních kontrol (odstavce 39 a 40); aktualizace kritérií rozhodování zkušební metody BCOP (odstavec 47); aktualizace kritérií přijatelnosti studie (odstavec 48); aktualizace prvků protokolu o zkoušce (odstavec 49); aktualizace dodatku 1 týkající se definic; vložení dodatku 2 o prediktivní schopnosti zkušební metody BCOP v různých klasifikačních systémech; aktualizace dodatku 3 týkající se seznamu chemických látek pro prokázání způsobilosti; a aktualizace dodatku 4 týkající se držáku rohovky pro zkoušku BCOP (odstavec 1) a opacitometru (odstavce 2 a 3).

V současnosti se obecně uznává, že jediná zkouška dráždivých účinků na oči in vitro nemůže v dohledné budoucnosti nahradit Draizeovu oční zkoušku in vivo, pokud jde o předpověď celé škály dráždivosti různých tříd chemických látek. Draizeovu oční zkoušku (5) však možná bude možné nahradit strategickou kombinací několika alternativních zkušebních metod v rámci strategie (odstupňovaného) zkoušení. Postup „shora dolů“ (5) má být použit, pokud se na základě existujících informací očekává, že chemická látka má vysokou schopnost vyvolávat dráždivé účinky, zatímco postup „zdola nahoru“ (5) se má použít, jestliže se na základě existujících informací předpokládá, že chemická látka nevyvolává tak intenzivní dráždivé účinky, aby vyžadovaly její klasifikaci. Zkušební metoda BCOP je zkušební metoda in vitro, kterou lze za určitých okolností a s některými omezeními použít pro klasifikaci nebezpečnosti chemických látek pro oči a pro označování těchto chemických látek. I když se BCOP nepovažuje za úplnou náhradu za oční test in vivo na králících, doporučuje se tuto zkušební metodu použít jako počáteční krok v rámci strategie zkoušení, jako je např. postup „shora dolů“, jejž navrhuje Scott et al. (5) pro identifikaci chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí, tj. chemických látek, které je třeba klasifikovat v kategorii 1 GHS OSN bez dalšího zkoušení (4). Zkušební metodu BCOP se rovněž doporučuje použít k identifikaci chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí, jak jsou definovány v systému GHS OSN (látky bez kategorie GHS OSN) (4), a to v rámci strategie zkoušení, jako je např. postup „zdola nahoru“ (5). U chemické látky, o níž se na základě výsledků zkušební metody BCOP nepředpokládá, že vyvolává vážné poškození očí nebo naopak nemůže být klasifikována jako látka mající dráždivé účinky na oči / vyvolávající vážné poškození očí (látka bez kategorie), by však pro stanovení konečné klasifikace bylo nutné další zkoušení (in vitro a/nebo in vivo).

Účelem této zkušební metody je popsat postupy používané k hodnocení potenciálních nebezpečných účinků zkoušené chemické látky na oči měřené její schopností způsobit zákal a zvýšit propustnost v izolované rohovce skotu. Toxické účinky na rohovku se měří: i) sníženou propustností světla (zákal) a ii) zvýšenou propustností barviva fluoresceinu sodného (propustnost). Hodnocení zákalu a propustnosti rohovky po expozici zkoušené chemické látce se kombinují ve výsledné skóre podráždění in vitro (IVIS – In Vitro Irritancy Score), které se používá pro klasifikaci úrovně dráždivých účinků zkoušené chemické látky.

Definice jsou uvedeny v dodatku 1.

VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ

Tato zkušební metoda je založena na protokolu zkušební metody BCOP vypracovaném výborem ICCVAM (6) (7), který byl původně vyvinut na základě informací získaných z protokolu Institutu pro vědu in vitro (IIVS) a INVITTOX protokolu č. 124 (8). Protokol INVITTOX byl použit pro studii o předběžném ověřování platnosti sponzorovanou Evropským společenstvím a vypracovanou v letech 1997–1998. Oba tyto protokoly vycházely z metodiky zkušební metody BCOP poprvé publikované Gautheronem et al. (9).

Zkušební metodu BCOP je možné použít k identifikaci chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí, jak je definováno v systému GHS OSN, tj. chemických látek, které je třeba klasifikovat v kategorii 1 GHS OSN (4). Je-li zkušební metoda BCOP použita pro tento účel, má celkovou přesnost 79 % (150/191), míru falešné pozitivity 25 % (32/126) a míru falešné negativity 14 % (9/65) ve srovnání s údaji ze zkušební metody in vivo na očích králíků klasifikovanými podle klasifikačního systému GHS OSN (3) (viz dodatek 2, tabulka 1). Pokud se z databáze vyloučí zkoušené chemické látky v určitých chemických (tj. alkoholy, ketony) nebo fyzikálních třídách (tj. pevné látky), má zkušební metoda BCOP v klasifikačním systému GHS OSN celkovou přesnost 85 % (111/131), míru falešné pozitivity 20 % (16/81) a míru falešné negativity 8 % (4/50) (3). Potenciální nedostatky zkušební metody BCOP, je-li použita k identifikaci chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí (kategorie 1 GHS OSN), vyplývají z vysoké míry falešné pozitivity pro alkoholy a ketony a z vysoké míry falešné negativity pro pevné látky sledované v databázi ověřování platnosti (1) (2) (3). Jelikož však ne všechny alkoholy a ketony jsou zkušební metodou BCOP nepřiměřeně určeny a některé jsou správně určeny jako látky v kategorii 1 GHS OSN, nejsou tyto dvě organické funkční skupiny považovány za skupiny nacházející se mimo oblasti použitelnosti této zkušební metody. Je na uživateli této zkušební metody, aby rozhodl, zda případnou nepřiměřenou předpověď u alkoholu nebo ketonu lze akceptovat, nebo zda by mělo být provedeno další zkoušení s použitím přístupu založeného na posuzování závažnosti důkazů. Pokud jde o míru falešné negativity u pevných látek, je třeba poznamenat, že v Draizeově zkoušce dráždivých účinků na oči in vivo mohou pevné látky vést k různým a extrémním podmínkám expozice, což může v důsledku vyústit v irelevantní předpovědi jejich skutečné schopnosti vyvolávat dráždivé účinky (10). Nutno též podotknout, že míra falešné negativity zjištěná ve validační databázi ICCVAM (2) (3) v rámci identifikace chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí (kategorie 1 GHS OSN) v žádném případě nevedla k hodnotě IVIS ≤ 3, což je kritérium používané k identifikaci zkoušené chemické látky jako látky bez kategorie GHS OSN. Míry falešné negativity BCOP v této souvislosti navíc nejsou kriticky důležité, protože všechny zkoušené chemické látky, které indukují hodnotu 3 < IVIS ≤ 55, by byly následně zkoušeny dalšími náležitě validovanými zkouškami in vitro nebo, jako poslední možnost, na králících, v závislosti na požadavcích právních předpisů, s využitím strategie postupného zkoušení v rámci přístupu hodnocení závažnosti důkazů. Vzhledem k tomu, že některé pevné chemické látky zkušební metoda BCOP správně určuje jako látky v kategorii 1 GHS OSN, ani toto skupenství není považováno za nacházející se mimo oblast použitelnosti této zkušební metody. Zkoušející by mohli zvážit použití této zkušební metody na všechny druhy chemických látek, přičemž hodnota IVIS > 55 by měla být považována za ukazatel reakce indukující vážné poškození očí, které je třeba klasifikovat v kategorii 1 GHS OSN bez dalšího zkoušení. Jak již však bylo uvedeno, kladné výsledky získané u alkoholů a ketonů by se měly z důvodu možné nadhodnocené předpovědi interpretovat opatrně.

Zkušební metodu BCOP lze též použít k identifikaci chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí podle klasifikačního systému GHS OSN (4). Je-li zkušební metoda BCOP použita pro tento účel, má celkovou přesnost 69 % (135/196), míru falešné pozitivity 69 % (61/89) a míru falešné negativity 0 % (0/107) ve srovnání s údaji ze zkušební metody in vivo na očích králíků klasifikovanými podle klasifikačního systému GHS OSN (3) (viz dodatek 2, tabulka 2). Zjištěná míra falešné pozitivity (chemické látky bez kategorie GHS OSN ve zkouškách in vivo indukují hodnotu IVIS > 3, viz odstavec 47) je značně vysoká, avšak v této souvislosti nikoli kriticky důležitá, protože všechny zkoušené chemické látky, které indukují hodnotu 3 < IVIS ≤ 55, by byly následně zkoušeny jinými náležitě validovanými zkouškami in vitro nebo, jako poslední možnost, zkouškou na králících, v závislosti na požadavcích právních předpisů, s využitím strategie postupného zkoušení v rámci přístupu posuzování váhy důkazů. Zkušební metoda BCOP nevykazuje žádné specifické nedostatky v případě zkoušení alkoholů, ketonů a pevných látek, pokud je jejím účelem identifikovat chemické látky, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí (tj. látky bez kategorie GHS OSN) (3). Zkoušející by mohli zvážit použití této zkušební metody na všechny druhy chemických látek, přičemž negativní výsledek (hodnota IVIS ≤ 3) by měl být uznán jako ukazatel toho, že látku není nutné klasifikovat (tj. látky bez kategorie GHS OSN). Jelikož zkušební metodou BCOP lze správně identifikovat pouze 31 % chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí, neměla by být tato zkušební metoda první volbou pro zahájení postupu „zdola nahoru“ (5), pokud jsou k dispozici jiné validované a uznané metody in vitro s podobně vysokou citlivostí, ale s vyšší specifičností.

Databáze pro validaci BCOP obsahovala celkem 113 látek a 100 směsí (2) (3). Zkušební metoda BCOP je proto považována za použitelnou jak ke zkoušení látek, tak ke zkoušení směsí.

Zkušební metoda BCOP se nedoporučuje pro identifikaci zkoušených chemických látek, které by měly být klasifikovány jako látky mající dráždivé účinky na oči (kategorie 2 nebo kategorie 2A GHS OSN), nebo zkoušených chemických látek, které by měly být klasifikovány jako látky mající mírně dráždivé účinky na oči (kategorie 2B GHS OSN), vzhledem k značnému počtu chemických látek kategorie 1 GHS OSN podhodnoceně klasifikovaných v kategorii 2, 2A nebo 2B GHS OSN a látek bez kategorie GHS OSN nadhodnoceně klasifikovaných v kategorii 2, 2A nebo 2B GHS OSN (2) (3). Pro tento účel může být nezbytné další zkoušení s použitím jiné vhodné metody.

V případě všech postupů týkajících se očí skotu a rohovek skotu by se měly dodržovat právní předpisy a postupy pro zacházení s materiály získanými ze zvířat, které kromě jiného zahrnují tkáně a mimobuněčné tekutiny. Doporučují se univerzální laboratorní preventivní opatření (11).

Zkušební metoda nebere v úvahu poškození spojivky a duhovky, ale zabývá se účinky na rohovku, které jsou důležitým faktorem pro stanovení klasifikace in vivo při posuzování klasifikace GHS OSN. Reverzibilitu lézí rohovky nelze zkušební metodou BCOP hodnotit samu o sobě. Na základě studií prováděných na očích králíků bylo navrženo, aby se posouzení počáteční hloubky poškození rohovky použilo k identifikaci některých typů nevratných účinků (12). Jsou však nezbytné další vědecké poznatky pro pochopení toho, jakým způsobem dochází k nevratným účinkům, které nejsou spojeny s počáteční vysokou úrovní poškození. A konečně je třeba uvést, že zkušební metoda BCOP neumožňuje posouzení možnosti systémové toxicity spojené s expozicí očí.

Tato zkušební metoda se bude pravidelně aktualizovat, tak jak budou zohledňovány nové informace a údaje. Bude-li například zapotřebí komplexněji charakterizovat poškození rohovky, může být potenciálně užitečná histopatologie. Jak je uvedeno v Dokumentu OECD (GD) č. 160 (13), uživatelům se doporučuje, aby uchovali rohovku a připravili vzorky pro histopatologii, které lze použít pro vytvoření databáze a kritérií rozhodování, jež mohou dále zvýšit přesnost této zkušební metody.

Každá laboratoř, která provádí tuto zkušební metodu poprvé, by měla použít referenční chemické látky uvedené v dodatku 3. Laboratoř může použít tyto chemické látky k prokázání své odborné způsobilosti k provádění zkušební metody BCOP před předložením výsledků získaných zkušební metodou BCOP pro regulační účely klasifikace nebezpečnosti.

PODSTATA ZKOUŠKY

Zkušební metoda BCOP je organotypický model, který zajišťuje krátkodobé udržování běžné fyziologické a biochemické funkce rohovky skotu in vitro. V této zkušební metodě se poškození zkoušenou chemickou látkou posuzuje kvantitativním měřením změn v zákalu a propustnosti rohovky za pomoci opacitometru (přístroje na měření průhlednosti) a spektrofotometru, který pracuje ve viditelné oblasti spektra. Obě měření se používají k výpočtu skóre podráždění in vitro (IVIS) za účelem přidělení klasifikační kategorie nebezpečnosti z hlediska podráždění in vitro, která slouží pro předpovídání potenciálu očního podráždění zkoušenou chemickou látkou in vivo (viz kritéria rozhodování v odstavci 48).

Zkušební metoda BCOP používá izolované rohovky z očí čerstvě poráženého skotu. Zákal rohovky se měří kvantitativně jako množství průchodu světla rohovkou. Propustnost se měří kvantitativně jako množství barviva fluoresceinu sodného, které prochází celou tloušťkou rohovky a zjišťuje se v mediu zadní komory. Zkoušené chemické látky se aplikují na epiteliální povrch rohovky přidáním do přední komory držáku rohovky. V dodatku 4 je uveden popis a schématický nákres držáku rohovky používaný ve zkušební metodě BCOP. Držáky rohovky lze komerčně získat z různých zdrojů, nebo je lze zkonstruovat.

Zdroj a věk očí skotu a výběr druhů zvířat

Skot posílaný na jatka se zpravidla poráží buď pro lidskou spotřebu, nebo pro jiná komerční použití. Jako zdroj rohovek pro použití ve zkušební metodě BCOP se používají pouze zdravá zvířata, vyhovující požadavkům pro vstup do lidského potravinového řetězce. Jelikož skot má široký rozsah hmotnosti v závislosti na chovu, věku a pohlaví, neexistuje žádné doporučení týkající se hmotnosti zvířat v době porážky.

Mohou se vyskytnout rozdíly ve velikosti rohovky, když se používají oči od zvířat různého věku. Rohovky o vodorovném průměru > 30,5 mm a s hodnotami základní tloušťky rohovky (CCT) ≥ 1100 μm se obvykle získávají ze skotu staršího osmi let, zatímco rohovky o vodorovném průměru < 28,5 mm a CCT < 900 μm se obvykle získávají ze skotu mladšího pěti let (14). Z těchto důvodů se zpravidla nepoužívají oči ze skotu staršího 60 měsíců. Oči ze skotu mladšího 12 měsíců se tradičně nepoužívají, protože oči se ještě vyvíjejí a tloušťka a průměr rohovky jsou mnohem menší, než jsou zaznamenány u očí dospělého skotu. Používání rohovek z mladých zvířat (tj. 6 až 12 měsíců starých) je však přípustné, jelikož mají určité výhody, např. zvýšená dostupnost, úzký věkový rozsah a nižší nebezpečnost související s potenciální expozicí zaměstnanců bovinní spongiformní encefalopatii (15). Protože by bylo účelné další hodnocení vlivu velikosti nebo tloušťky rohovky na reakci na leptavé a dráždivé chemické látky, uživatelům se doporučuje oznamovat odhadovaný věk a/nebo hmotnost zvířat, které poskytují rohovky používané ve studii.

Získávání a doprava očí do laboratoře

Oči shromažďují zaměstnanci jatek. Aby se minimalizovaly mechanické a jiné druhy poškození očí, měly by se oči odstranit co nejdříve po úmrtí a okamžitě po odstranění i během dopravy by měly být chlazeny. Aby se zamezilo expozici očí potenciálně dráždivým chemickým látkám, zaměstnanci jatek by neměli při oplachování hlavy zvířete používat čisticí prostředky.

Oči by měly být ve vhodně velké nádobě úplně ponořeny do vychlazeného Hanksova vyváženého solného roztoku (HBSS) a dopraveny do laboratoře tak, aby se minimalizovalo poškození a/nebo bakteriální znečištění. Jelikož oči se získávají během procesu porážení, mohou být vystaveny krvi a jiným biologickým materiálům, včetně baktérií a jiných mikroorganismů. Proto je důležité zajistit, aby riziko znečištění bylo minimalizováno (např. držením nádoby, která obsahuje oči, v mokrém ledu, přidáním antibiotik do Hanksova vyváženého solného roztoku (HBSS) použitého k uchování očí během dopravy [např. penicilín se 100 m.j./ml a streptomycin se 100 μg/ml]).

Časový interval mezi získáním očí a použitím rohovky ve zkušební metodě BCOP by měl být co nejkratší (získání a použití se uskutečňuje zpravidla tentýž den) a měl by být prokázán, aby se nenarušily výsledky analýzy. Tyto výsledky jsou založeny na kritériích výběru očí a také na reakcích na pozitivní a negativní kontroly. Všechny oči použité v analýze by měly být ze stejné skupiny očí získaných v určitý den.

Kritéria výběru očí používaných ve zkušební metodě BCOP

Jakmile se oči dostanou do laboratoře, jsou pečlivě vyšetřeny z hlediska vad, včetně zvýšeného zákalu, škrábanců a neovaskularizace. Smějí se používat pouze rohovky z očí, které tyto vady nemají.

Kvalita každé rohovky se také hodnotí v pozdějších krocích analýzy. Rohovky, které mají zákal větší než sedm zákalových jednotek nebo zákal odpovídající pro použitý opacitometr a držáky rohovky i po počáteční jednohodinové době vyrovnání, se vyřadí (POZNÁMKA: opacitometr by měl být kalibrován podle norem zákalu používaných k určení zákalových jednotek, viz dodatek 4).

Každá zkušební skupina (zkoušená chemická látka, paralelní negativní a pozitivní kontroly) pozůstává nejméně ze třech očí. V případě rohovek pro negativní kontrolu by se ve zkušební metodě BCOP měly používat tři rohovky. Protože všechny rohovky jsou vyříznuty z celé oční koule a vloženy do držáku rohovky, existuje při zpracování možnost vzniku artefaktů, které pak mohou mít vliv na hodnoty zákalu a propustnosti rohovky (včetně negativní kontroly). Kromě toho se hodnoty zákalu a propustnosti rohovek z negativních kontrol používají ke korekci hodnot zákalu a propustnosti rohovek získaných u pozitivních kontrol a u rohovek ovlivněných zkoušenou látkou ve výpočtech IVIS.

POSTUP

Příprava očí

Rohovky, které nemají vady, se vyřezávají s 2 až 3mm okrajem očního bělma, který zůstává a pomáhá v následném ošetření, přičemž se musí dávat pozor, aby se zamezilo poškození epitelu a endotelu rohovky. Oddělené rohovky se zasazují do zvlášť k tomu určených držáků rohovek složených z předních a zadních částí, které které jsou ve styku s epiteliální nebo endoteliální stranou rohovky. Obě komory se úplně zaplní předehřátým Eaglovým minimálním médiem (EMEM = Eagle's Minimum Essential Medium) bez fenolové červeně (nejdříve zadní komora), při tom je třeba zajistit, aby se nevytvořily žádné bubliny. Zařízení se potom temperuje na teplotu 32 ± 1 °C nejméně po dobu jedné hodiny, aby se rohovky mohly teplotně vyrovnat s médiem a dosáhnout v co největším rozsahu běžné metabolické aktivity (přibližná teplota povrchu rohovky in vivo je 32 °C).

Po vyrovnání teplot se čerstvé předehřáté médium EMEM bez fenolové červeně přidá do obou komor a pro každou rohovku se změří základní hodnoty zákalu. Všechny rohovky, které vykazují makroskopické poškození tkání (např. poškrábání, pigmentace, neovaskularizace) nebo zákal větší než sedm jednotek zákalu nebo větší než odpovídající hodnota pro použitý opacitometr a držáky rohovky, se vyřadí. Minimálně tři rohovky se vyberou jako rohovky pro negativní kontrolu (nebo pro kontrolu s rozpouštědlem). Zbylé rohovky se potom rozdělí do zkušebních skupin a do skupin pro pozitivní kontrolu.

Jelikož tepelná kapacita vody je ve srovnání se vzduchem vyšší, voda poskytuje stabilnější teplotní podmínky pro inkubaci. Proto se doporučuje používání vodní lázně pro udržování držáku rohovky a jeho obsahu při teplotě 32 ± 1 °C. Vzduchové inkubátory však lze také použít za předpokladu, že budou přijata opatření k zachování tepelné stability (např. předehřátím držáků a médií).

Aplikace zkoušené chemické látky

Používají se dva různé zkušební protokoly, jeden pro tekutiny a smáčedla (pevná nebo tekutá) a jeden pro pevné látky, které nejsou smáčedla.

Tekutiny se zkoušejí neředěné. Obdobně jako tekutiny se zpravidla zkoušejí polotuhé, krémové a voskovité látky. Čistá smáčedla se zkoušejí při koncentraci 10 % (m/V) v 0,9 % roztoku chloridu sodného, destilované vody nebo jiného rozpouštědla, u něhož se prokázalo, že nemá nepříznivé účinky na zkušební systém. U alternativních koncentrací roztoku by mělo být předloženo příslušné zdůvodnění. Směsi obsahující smáčedla by se měly zkoušet nezředěné nebo zředěné na vhodnou koncentraci v závislosti na příslušném scénáři expozice in vivo. Pro zkoušenou koncentraci by mělo být předloženo příslušné zdůvodnění. Rohovky jsou vystaveny tekutinám a smáčedlům po dobu 10 minut. Použití jiných dob expozice by mělo být doprovázeno odpovídajícím vědeckým zdůvodněním. Definice smáčedla a směsi obsahující smáčedla jsou uvedeny v dodatku 1.

Pevné látky, které nejsou smáčedla, se zpravidla zkoušejí jako roztoky nebo suspenze při koncentraci 20 % m/V v 0,9 % roztoku chloridu sodného, destilované vody nebo jiného rozpouštědla, u něhož se prokázalo, že nemá nepříznivé účinky na zkušební systém. Za určitých okolností a s náležitým vědeckým zdůvodněním se pevné látky mohou zkoušet také čisté s přímou aplikací na povrch rohovky a s použitím metody otevřených komor (viz odstavec 32). Rohovky jsou vystaveny pevným látkám po dobu čtyř hodin, ale podobně jako u tekutých látek a smáčedel lze s odpovídajícím vědeckým zdůvodněním použít alternativní doby expozice.

Je možné použít různé metody zkoušení v závislosti na fyzické povaze a chemických vlastnostech zkoušené chemické látky (např. pevné látky, tekutiny, viskózní látky versus neviskózní tekutiny). Kritický faktorem je nutnost zajistit, že zkoušená chemická látka náležitě pokrývá epiteliální povrch a že je příslušně odstraněna během oplachování. Metoda uzavřených komor se obvykle používá pro neviskózní až mírně viskózní tekuté zkoušené chemické látky, zatímco metoda otevřených komor se zpravidla používá pro poloviskózní a viskózní tekuté zkoušené chemické látky a pro čisté pevné látky.

V metodě uzavřených komor se dostatečné množství zkoušené chemické látky (750 μL) k pokrytí epiteliální strany rohovky zavádí do přední komory přes dávkovací otvory na horním povrchu komory a otvory jsou potom během expozice uzavřeny komorovými zátkami. Je důležité zajistit, aby každá rohovka byla vystavena zkoušené chemické látce po příslušnou dobu.

V metodě otevřených komor se před zkoušením odstraní z přední komory zajišťovací kroužek okénka a skleněné okénko. Kontrolní nebo zkoušená chemická látka (750 μl nebo dostatečné množství zkoušené chemické látky, aby úplně pokryla rohovku) se aplikuje přímo na epiteliální povrch rohovky pomocí mikropipety. Pokud je zkoušenou látku obtížné pipetovat, lze použít objemovou tlakovou pipetu (positive displacement pipette), což pomůže v dávkování. Špička objemové pipety se zasune do dávkovací špičky injekční stříkačky tak, aby látku bylo možné zavést pod tlakem do špičky vytěsňování. Píst injekční stříkačky se stlačí současně s tím, jak se píst pipety vytahuje nahoru. Pokud se ve špičce pipety objeví vzduchové bubliny, zkoušená chemická látka se odstraní (vytlačí) a postup se opakuje, dokud špička není naplněná bez vzduchových bublin. V případě potřeby lze použít běžnou injekční stříkačku (bez jehly), protože umožňuje měření přesného objemu zkoušené chemické látky a snadnější aplikaci na epiteliální povrch rohovky. Po dávkování se skleněné okénko umístí znovu na přední komoru, aby se obnovil uzavřený systém.

Inkubace po expozici

Po době expozice se zkoušená chemická látka, chemická látka pro negativní kontrolu nebo chemická látka pro pozitivní kontrolu odstraní z přední komory a epitel se nejméně třikrát opláchne (nebo se oplachuje tak dlouho, dokud nepřestanou být viditelné stopy zkoušené chemické látky) médiem EMEM (obsahující fenolovou červeň). Na oplachování se používá médium obsahující fenolovou červeň, protože změnou barvy fenolové červeně lze sledovat, jak účinné bylo oplachování kyselých nebo alkalických zkušebních chemických látek. Rohovky se proplachují více než třikrát, pokud je fenolová červeň ještě zbarvená (do žluta nebo do nachova), nebo pokud je zkoušená chemická látka stále viditelná. Jakmile již v médiu není zkoušená chemická látka, rohovky se naposledy opláchnou médiem EMEM (bez fenolové červeně). EMEM (bez fenolové červeně) se používá na konečný oplach proto, aby se před měřením zákalu zajistilo odstranění fenolové červeně z přední komory. Přední komora se pak naplní čerstvým EMEM bez fenolové červeně.

U tekutin nebo smáčedel se rohovky po oplachu inkubují po dobu dalších dvou hodin při teplotě 32 ± 1 °C. Delší doba po expozici by byla za určitých okolností účelná a mohla by se zvážit případ od případu. Rohovky zkoušené s pevnými látkami se důkladně propláchnou na konci doby čtyřhodinové expozice, ale nevyžadují si další inkubaci.

Zákal a propustnost každé rohovky se v případě tekutých látek a smáčedel zaznamená na konci doby inkubace po expozici a v případě pevných látek, které nejsou smáčedla, na konci doby čtyřhodinové expozice. Každá rohovka se sleduje rovněž vizuálně a případná pozorování se zaznamenají (např. odlupování tkáně, zbytky zkoušené chemické látky, nejednotné struktury rohovky). Tato pozorování by mohla být důležitá, protože mohou souviset se změnami v údajích opacitometru.

Chemické látky pro kontrolu

Do každého pokusu se zařazují souběžné negativní kontroly nebo kontroly s rozpouštědlem/vehikulem a pozitivní kontroly.

Když se zkouší tekutá látka při 100 % koncentraci, souběžná negativní kontrola (např. 0,9 % roztok chloridu sodného nebo destilovaná voda) se zahrne do zkušební metody BCOP, takže jemožné zjistit nespecifické změny ve zkušebním systému a zajistit základní úroveň účinku pro konečné analýzy. Tím se rovněž zajistí, že podmínky analýzy nebudou mít za následek nevhodnou dráždivou reakci.

Když se zkouší rozředěná tekutina, smáčedlo nebo pevná látka, skupina pro souběžnou kontrolu s rozpouštědlem/vehikulem se zahrne do zkušební metody BCOP tak, aby bylo možné zjistit nespecifické změny ve zkušebním systému a zajistit základnu pro koncové body analýzy. Lze použít pouze rozpouštědlo/vehikulum, u kterého se prokázalo, že nemá nepříznivé účinky na zkušební systém.

Do každého pokusu se zařadí chemická látka, o níž se ví, že vyvolává pozitivní reakce, jako souběžná pozitivní kontrola, aby se ověřila integrita zkušebního systému a jeho správné fungování. Aby bylo možné vyhodnotit proměnlivost reakce na pozitivní kontrolu v čase, rozsah dráždivé reakce by neměl být nadměrný.

Příklady pozitivních kontrol pro kapalné zkoušené chemické látky jsou 100 % ethanol nebo 100 % dimethylformamid. Příkladem pevných zkoušených látek pro pozitivní kontrolu je 20 % (m/V) imidazol v 0,9 % roztoku chloridu sodného.

Srovnávací chemické látky jsou účelné pro hodnocení potenciálu podráždění očí neznámými chemickými látkami nebo specifickými třídami chemických látek či produktů nebo pro hodnocení potenciálu relativního podráždění látkou s dráždivými účinky na oči ve specifickém rozmezí dráždivých reakcí.

Měřené koncové účinky

Zákal se určuje množstvím průchodu světla rohovkou. Zákal rohovky se kvantitativně měří za pomoci opacitometru a výsledkem jsou hodnoty zákalu měřené v kontinuálním rozsahu.

Propustnost se určuje množstvím barviva fluoresceinu sodného, které proniká všemi vrstvami buněk rohovky (tj. epitelem na vnějším povrchu rohovky přes endotel na vnitřním povrchu rohovky). Jeden ml roztoku fluoresceinu sodného (4 nebo 5 mg/ml, když se příslušně zkoušejí tekuté látky a smáčedla nebo pevné látky, které nejsou smáčedla) se přidává do přední komory držáku rohovky, která je spojena s epiteliální stranou rohovky, zatímco zadní komora, která je spojena s endoteliální stranou rohovky, se naplní čerstvým médiem EMEM. Držák se potom ve vodorovné poloze inkubuje po dobu 90 ± 5 min. na teplotu 32 ± 1 °C. Množství fluoresceinu sodného, který přechází do zadní komory, se kvantitativně měří za pomoci spektrofotometrie UV/VIS. Spektrofotometrická měření hodnocená ve 490 nm se zaznamenají jako optická hustota (OD490) nebo hodnoty absorbance, které se měří v kontinuálním rozsahu. Hodnoty propustnosti fluoresceinu se stanoví s použitím hodnot OD490 na základě spektrofotometru viditelného světla s použitím běžné optické délky 1 cm.

Alternativně se může použít analyzátor destiček s 96 jamkami, pokud i) lze stanovit rozsah linearity měření analyzátoru destiček pro určení hodnot fluoresceinu OD490; a ii) v 96jamkové destičce je použit správný objem vzorků, jehož výsledkem jsou hodnoty OD490 odpovídající běžné optické délce 1 cm (to by si mohlo vyžadovat úplně plnou jamku [obvykle 360μL]).

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Hodnocení údajů

Jakmile se hodnoty zákalu a střední hodnoty propustnosti (OD490) upraví na zákal pozadí a hodnoty propustnosti OD490pro negativní kontrolu, střední hodnoty zákalu a propustnosti OD490pro každou zkušební skupinu by se měly spojit do empiricky odvozeného vzorce, aby se vypočítal stav podráždění in vitro (IVIS) pro každou zkušební skupinu takto:

IVIS = střední hodnota zákalu + (15 × střední hodnota propustnosti OD490).

Sina et al. uvádějí, že tento vzorec byl odvozen během laboratorních a mezilaboratorních studií. Údaje vytvořené pro řady 36 sloučenin v multilaboratorní studii byly předmětem vícerozměrné analýzy s cílem určit nejvhodnější rovnováhu mezi údaji in vivo a in vitro. Tuto analýzu provedli vědci ve dvou samostatných firmách a odvodili téměř totožné rovnice.

Hodnoty zákalu a propustnosti by se měly rovněž posuzovat samostatně, aby se určilo, zda zkoušená chemická látka způsobuje poleptání nebo silné podráždění pomocí pouze jednoho nebo dvou koncových účinků (viz kritéria rozhodování).

Kritéria rozhodování

Dále jsou uvedeny hraniční hodnoty IVIS pro identifikaci zkoušených chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí (kategorie 1 GHS OSN) a zkoušených chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí (bez kategorie GHS OSN):

Kritéria přijatelnosti studie

Zkouška se považuje za přijatelnou, pokud pozitivní kontrola vykazuje IVIS spadající do obvyklých odchylek historické střední hodnoty, kterou je třeba aktualizovat nejméně každé tři měsíce nebo pokaždé, když se přijatelná zkouška vykonává v laboratořích, kde se zkoušky nedělají často (tj. méně než jednou měsíčně). Výsledkem reakce na negativní kontrolu nebo na kontrolu s rozpouštědlem/vehikulem by měly být hodnoty zákalu a propustnosti, které jsou nižší než stanovené horní meze pro hodnoty zákalu pozadí a prostupnosti u rohovek skotu exponované příslušnou negativní kontrolou nebo kontrolou s rozpouštědlem/vehikulem. U zkoušené chemické látky s jednoznačnou výslednou klasifikací by mělo stačit jedno provedení zkoušky za použití alespoň tří rohovek. Avšak v případě hraničních výsledků při prvním provedení zkoušky by se mělo zvážit druhé provedení zkoušky (ale není nezbytně nutné) a v případě nesouhlasných výsledků střední hodnoty IVIS mezi prvními dvěma provedeními zkoušky i třetí provedení zkoušky. V této souvislosti se výsledek prvního provedení zkoušky považuje za hraniční, pokud předpovědi na základě tří rohovek byly nesouhlasné tak, že:

Závěrečná zpráva

Závěrečná zpráva by měla zahrnovat následující informace, pokud jsou relevantní pro provedení studie:

LITERATURA

Dodatek 4

DRŽÁK ROHOVEK BCOP

Držáky rohovek pro BCOP se vyrábějí z inertního materiálu (např. polypropylenu). Držáky se skládají ze dvou polovin (přední a zadní komora) a mají dvě podobné cylindrické vnitřní komory. Každá komora je zkonstruována tak, že pojme objem přibližně 5 ml a končí skleněným okénkem, přes které se zaznamenávají měření zákalu. Každá vnitřní komora má průměr 1,7 cm a hloubku 2,2 cm (11). Použije se těsnící kroužek umístěný na zadní komoře, aby se zamezilo úniku látky. Rohovky jsou umístěny na endoteliální straně pod těsnícím kroužkem zadních komor a přední komory se nacházejí na epiteliální straně rohovek. Komory se udržují na místě za pomoci třech šroubů z nerezové oceli umístěných na vnějších okrajích komory. Na konci každé komory se nachází skleněné okénko, které lze odstranit, aby byl snadný přístup k rohovce. Jeden těsnící kroužek je také umístěn mezi skleněným okénkem a komorou, aby se zamezilo úniku látky. Dva otvory v horní části každé komory umožňují zavedení a odstranění média a zkoušených chemických látek. Po dobu zkoušení a inkubace jsou uzavřeny gumovými uzávěry. Průchod světla přes držáky rohovky se potenciálně může měnit, neboť účinky běžného opotřebení nebo nahromadění reziduí určitých chemických látek ve vyvrtaných otvorech nebo na skleněném okénku vnitřní komory mohou ovlivnit rozptyl nebo odrazivost světla. Důsledkem by mohla být zvýšení nebo snížení základního průchodu světla (a tedy snížení nebo zvýšení naměřených údajů zákalu) přes držáky rohovky a ta se mohou projevit jako znatelné změny původně očekávaných naměřených údajů zákalu rohovky v jednotlivých komorách (tj. původní hodnoty zákalu rohovky v konkrétních držácích rohovky se mohou běžně lišit o více než 2 nebo 3 jednotky zákalu od očekávaných základních hodnot). Každá laboratoř by měla zvážit zavedení programu pro hodnocení změn průchodu světla přes držáky rohovky v závislosti na povaze zkoušených chemismů a na frekvenci použití komor. Ke stanovení základních hodnot je možné držáky rohovky před běžným použitím zkontrolovat změřením základních hodnot zákalu (nebo průchodu světla) komor naplněných kompletním médiem bez rohovek. Držáky rohovky se pak pravidelně kontrolují na změny průchodu světla během doby použití. Každá laboratoř může stanovit frekvenci kontrol držáků rohovky na základě zkoušených chemických látek, frekvenci použití a pozorování změn základních hodnot zákalu rohovky. Jsou-li pozorovány znatelné změny průchodu světla přes držáky rohovky, je nutno zvážit přiměřené postupy čištění a/nebo leštění vnitřního povrchu držáku rohovky nebo jejich výměnu.

Držák rohovky: viz připojený nákres.

13)

V části B se kapitola B.48 nahrazuje tímto:

„B.48   Zkušební metoda odděleného kuřecího oka pro zjišťování i) chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí a ii) chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí

ÚVOD

Tato metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 438 (2013). Zkušební metodu odděleného kuřecího oka (ICE – Isolated Chicken Eye) hodnotil Koordinační výbor mezi různými organizacemi pro ověřování platnosti alternativních metod (ICCVAM) spolu s Evropským střediskem pro validaci alternativních metod (ECVAM) a Japonským střediskem pro validaci alternativních metod (JaCVAM) v letech 2006 a 2010 (1) (2) (3). Při prvním hodnocení byla zkušební metoda ICE schválena jako vědecky platná zkušební metoda, kterou lze použít jako screeningovou zkoušku pro zjišťování chemických látek (látek a směsí) vyvolávajících vážné poškození očí (kategorie 1), jak ho definuje Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek (GHS) Organizace spojených národů (OSN) (1) (2) (4) a nařízení (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí (nařízení CLP) (12). Při druhém hodnocení byla zkušební metoda ICE hodnocena z hlediska jejího použití jako screeningové zkoušky pro identifikaci chemických látek, které nejsou klasifikovány jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí, jak je definuje GHS OSN (3) (4). Na základě výsledků validační studie a doporučení komise odborné revize bylo ponecháno původní doporučení na používání zkušební metody ICE pro klasifikaci chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí (kategorie 1 GHS OSN) a dostupná databáze zůstala od původní validace, kterou provedl výbor ICCVAM, beze změn. V té době nebyla předložena žádná doporučení na rozšíření oblasti použitelnosti zkušební metody ICE také na další kategorie. Bylo provedeno nové hodnocení souboru údajů in vitro a in vivo použitého při validační studii, se zaměřením na hodnocení užitečnosti zkušební metody ICE pro zjišťování chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky vyvolávající podráždění očí nebo vážné poškození očí (5). Toto nové hodnocení dospělo k závěru, že zkušební metodu ICE lze též použít pro zjišťování chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí, jak je definuje GHS OSN (4) (5). V této zkušební metodě jsou uvedena doporučená použití a omezení zkušební metody ICE na základě těchto hodnocení. Hlavními rozdíly mezi původní verzí z roku 2009 a aktualizovanou verzí Pokynů OECD ke zkoušení z roku 2013 jsou mimo jiné použití zkušební metody ICE pro zjišťování chemických látek, které není nutné klasifikovat podle klasifikačního systému GHS OSN, aktualizace prvků protokolu o zkoušce, aktualizace dodatku 1 týkající se definic a aktualizace dodatku 2 týkající se chemických látek pro prokázání způsobilosti.

V současnosti se obecně uznává, že jediná zkouška dráždivých účinků na oči in vitro nemůže v dohledné budoucnosti nahradit Draizeovu oční zkoušku in vivo, pokud jde o předpověď celé škály dráždivosti různých tříd chemických látek. Draizeovu oční zkoušku (6) však možná bude možné nahradit strategickou kombinací několika alternativních zkušebních metod v rámci strategie (odstupňovaného) zkoušení. Postup „shora dolů“ (7) má být použit, pokud se na základě existujících informací očekává, že chemická látka má vysokou schopnost vyvolávat dráždivé účinky, zatímco postup „zdola nahoru“ (7) se má použít, jestliže se na základě existujících informací předpokládá, že chemická látka nevyvolává tak intenzivní dráždivé účinky, aby vyžadovaly její klasifikaci. Zkušební metoda ICE je zkušební metoda in vitro, kterou lze za určitých okolností a s některými omezeními, jež jsou popsány v odstavcích 8 až 10, použít pro klasifikaci nebezpečnosti chemických látek pro oči a pro označování chemických látek. I když se zkušební metoda ICE nepovažuje za úplnou náhradu za oční test in vivo na králících, doporučuje se tuto zkušební metodu použít jako počáteční krok v rámci strategie zkoušení, jako je např. postup „shora dolů“, jejž navrhuje Scott et al. (7) pro identifikaci chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí, tj. chemických látek, které je třeba klasifikovat v kategorii 1 GHS OSN bez dalšího zkoušení (4). Zkušební metodu ICE se rovněž doporučuje použít pro zjišťování chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí, jak je definuje systém GHS OSN (látky bez kategorie) (4), a lze ji tedy použít jako počáteční krok v rámci strategie zkoušení postupem „zdola nahoru“ (7). U chemické látky, o níž se na základě použití zkušení metody ICE nepředpokládá, že vyvolává vážné poškození očí nebo že by měla být klasifikována jako látka mající dráždivé účinky na oči / vyvolávající vážné poškození očí, by však pro stanovení konečné klasifikace bylo nutné další zkoušení (in vitro a/nebo in vivo). Použití zkušební metody ICE v rámci postupu „zdola nahoru“ podle jiných klasifikačních systémů než GHS OSN by mělo být předem konzultováno s příslušnými regulačními orgány.

Účelem této zkušební metody je popsat postupy používané k hodnocení potenciálních nebezpečných účinků zkoušené chemické látky na oči měřené její schopností způsobit či nezpůsobit toxicitu v izolovaném kuřecím oku. Toxické účinky na rohovku se měří i) kvalitativním hodnocením zákalu, ii) kvalitativním hodnocením poškození epitelu na základě aplikace fluoresceinu do oka (zadržování fluoresceinu), iii) kvantitativním měřením zvýšené tloušťky (otok) a iv) kvalitativním hodnocením makroskopického morfologického poškození povrchu. Hodnocení zákalu a otoku rohovky a poškození po expozici zkoušené chemické látce se posuzuje samostatně a potom se spojí za účelem odvození klasifikace dráždivých účinků na oči.

Definice jsou uvedeny v dodatku 1.

VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ

Tato zkušební metoda je založena na protokolu doporučeném v pokynu OECD č. 160 (8) zpracovaném v návaznosti na mezinárodní studii ICCVAM o ověřování platnosti (1) (3) (9) s přispěním Evropského střediska pro ověřování platnosti alternativních metod, Japonského střediska pro validaci alternativních metod a oddělení toxikologie a aplikované farmakologie TNO Quality of Life (Nizozemsko). Protokol vychází z informací získaných z uveřejněných protokolů a také z aktuálního protokolu, který používá TNO (10) (11) (12) (13) (14).

Při validaci této zkušební metody byla testována široká škála chemických látek a empirická databáze validační studie obsahuje celkem 152 chemických látek, včetně 72 látek a 80 směsí (5). Zkušební metodu lze použít pro pevné látky, kapaliny, emulze a gely. Kapaliny mohou být vodné či nevodné, pevné látky mohou být ve vodě rozpustné či nerozpustné. Plyny a aerosoly dosud nebyly ve validační studii hodnoceny.

Zkušební metodu ICE je možné použít k identifikaci chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí, tj. chemických látek, které je třeba klasifikovat v kategorii 1 GHS OSN (4). Při použití pro tento účel zjištěná omezení zkušební metody ICE vyplývají z vysoké míry falešné pozitivity pro alkoholy a z vysoké míry falešné negativity pro pevné látky a smáčedla (1) (3) (9). Míra falešné pozitivity však v této souvislosti (chemické látky kategorie 1 GHS OSN identifikované jako látky, které nepatří do kategorie 1) není kriticky důležitá, neboť všechny zkoušené chemické látky, jež byly shledány negativními, by byly následně zkoušeny jinou náležitě validovanou zkouškou (zkouškami) in vitro nebo, jako poslední možnost, zkouškou na králících, v závislosti na požadavcích právních předpisů, s využitím strategie postupného zkoušení v rámci přístupu založeného na posuzování závažnosti důkazů. Je třeba poznamenat, že v Draizeově zkoušce dráždivých účinků na oči in vivo mohou pevné látky vést k různým a extrémním podmínkám expozice, což může v důsledku vyústit v irelevantní předpovědi jejich skutečné schopnosti vyvolávat dráždivé účinky (15). Zkoušející by mohli zvážit použití této zkušební metody na všechny druhy chemických látek, přičemž pozitivní výsledek by měl být považován za ukazatel vážného poškození očí, tj. klasifikace v kategorii 1 GHS OSN, bez dalšího zkoušení. Kladné výsledky získané u alkoholů by se však měly interpretovat opatrně z důvodu rizika nepřiměřené předpovědi.

Je-li zkušební metoda ICE použita pro zjišťování chemických látek vyvolávajících vážné poškození očí (kategorie 1 GHS OSN), má celkovou přesnost 86 % (120/140), míru falešné pozitivity 6 % (7/113) a míru falešné negativity 48 % (13/27) ve srovnání s údaji ze zkušební metody in vivo na očích králíků klasifikovanými podle klasifikačního systému GHS OSN (4) (5).

Zkušební metodu ICE lze též použít k identifikaci chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky mající dráždivé účinky na oči nebo vyvolávající vážné poškození očí podle klasifikačního systému GHS OSN (4). Použití zkušební metody ICE v rámci postupu „zdola nahoru“ podle jiných klasifikačních systémů by mělo být předem konzultováno s příslušnými regulačními orgány. Tuto zkušební metodu lze použít pro všechny druhy chemických látek, přičemž negativní výsledek by mohl být uznán pro neklasifikování chemické látky jako látky mající dráždivé účinky na oči a vyvolávající vážné poškození očí. Na základě jednoho výsledku z validační databáze však u barviv s účinkem proti usazeninám obsahujících organická rozpouštědla může dojít k předpovědi podhodnocující jejich potenciál dráždivých účinků (5).

Je-li zkušební metoda ICE použita pro zjišťování chemických látek, které není nutné klasifikovat jako látky vyvolávající dráždivé účinky na oči a vážné poškození očí, má celkovou přesnost 82 % (125/152), míru falešné pozitivity 33 % (26/79) a míru falešné negativity 1 % (1/73) ve srovnání s údaji ze zkušební metody in vivo na očích králíků klasifikovanými podle systému GHS OSN (4) (5). Pokud se z databáze vyloučí zkoušené chemické látky v určitých chemických třídách (tj. barviva s účinkem proti usazeninám obsahující organická rozpouštědla), je přesnost zkušební metody ICE v klasifikačním systému GHS OSN 83 % (123/149), míra falešné pozitivity 33 % (26/78) a míra falešné negativity 0 % (0/71) (4) (5).

Zkušební metoda ICE se nedoporučuje pro identifikaci zkoušených chemických látek, které by měly být klasifikovány jako látky mající dráždivé účinky na oči (kategorie 2 nebo kategorie 2A GHS OSN), nebo zkoušených chemických látek, které by měly být klasifikovány jako látky mající mírně dráždivé účinky na oči (kategorie 2B GHS OSN), vzhledem k značnému počtu chemických látek kategorie 1 GHS OSN podhodnoceně klasifikovaných v kategorii 2, 2A nebo 2B GHS OSN a látek bez kategorie GHS OSN nadhodnoceně klasifikovaných v kategorii 2, 2A nebo 2B GHS OSN. Pro tento účel může být nezbytné další zkoušení s použitím jiné vhodné metody.

Veškeré postupy u kuřecích očí by měly dodržovat právní předpisy a postupy pro zacházení s lidskými materiály nebo materiály získanými ze zvířat, které kromě jiného zahrnují tkáně a mimobuněčné tekutiny. Doporučují se univerzální laboratorní preventivní opatření (16).

Zkušební metoda ICE nebere v úvahu poškození spojivky a duhovky, které se hodnotí ve zkušební metodě dráždivosti pro oči u králíků, ale zabývá se účinky na rohovku, které jsou důležitým faktorem pro stanovení klasifikace in vivo při posuzování klasifikace GHS OSN. Ačkoli reverzibilitu lézí rohovky nelze ve zkušební metodě ICE hodnotit samu o sobě, na základě studií o očích králíků bylo přesto navrženo, že by se posouzení počáteční hloubky poškození rohovky mohlo použít k určení některých druhů nevratných účinků (17). Jsou zejména nezbytné další vědecké poznatky pro pochopení toho, jakým způsobem dochází k nevratným účinkům, které nejsou spojeny s počáteční vysokou úrovní poškození. A konečně je třeba uvést, že zkušební metoda ICE neumožňuje posouzení potenciálu systémové toxicity spojené s expozicí očí.

Tato zkušební metoda se bude pravidelně aktualizovat, tak jak budou zohledňovány nové informace a údaje. Bude-li například zapotřebí komplexněji charakterizovat poškození rohovky, může být potenciálně užitečná histopatologie. Pro vyhodnocení této možnosti se uživatelům doporučuje, aby uchovali oči a připravili vzorky pro histopatologii, které lze použít pro vytvoření databáze a kritérií rozhodování, jež mohou dále zvýšit přesnost této zkušební metody. Organizace OECD vypracovala pokyny k použití zkušebních metod pro hodnocení oční toxicity in vitro, jež zahrnují podrobné postupy při shromažďování histopatologických vzorků a informace, kam mají být vzorky a/nebo histopatologické údaje zasílány (8).

Každá laboratoř, která zavádí tuto analýzu, by měla použít chemické látky pro zkoušení způsobilosti uvedené v dodatku 2. Laboratoř může použít tyto chemické látky k prokázání své odborné způsobilosti v používání zkušební metody ICE před předložením údajů ICE pro regulační účely klasifikace nebezpečí.

PODSTATA ZKOUŠKY

Zkušební metoda ICE je organotypický model, který zajišťuje krátkodobé uchování kuřecího oka in vitro. V této zkušební metodě se poškození zkoušenou chemickou látkou posuzuje určením otoku a zákalu rohovky a zadržování fluoresceinu. Zatímco dva poslední parametry se týkají kvalitativního hodnocení, analýza otoku rohovky zajišťuje kvantitativní hodnocení. Každé měření se buď převádí na kvantitativní hodnotu používanou k výpočtu celkového ukazatele podráždění, nebo je přiřazeno kvalitativní kategorizaci, která se používá ke stanovení klasifikace nebezpečnosti pro oči in vitro buď v kategorii 1 GHS OSN, nebo jako látky neklasifikované v systému GHS OSN. Každý z těchto výsledků potom může být použit k předpovědi schopnosti zkoušené látky vyvolávat vážné poškození očí in vivo nebo k předpovědi, že se nevyžaduje klasifikace nebezpečnosti zkoušené chemické látky pro oči (viz kritéria rozhodování). Není však možné stanovit klasifikaci chemických látek, u nichž nebylo s použitím zkušební metody ICE předpovězeno, že vyvolávají vážné poškození očí nebo že je není nutné klasifikovat.

Zdroj a věk kuřecích očí

Tradičně se pro tuto analýzu používají kuřecí oči získané z jatek, kde se kuřata zabíjejí pro lidskou spotřebu, čímž se eliminuje potřeba laboratorních zvířat. Používají se pouze oči zdravých zvířat, které se považují za vhodné pro vstup do lidského potravinového řetězce.

Ačkoli nebyla zpracována kontrolní studie pro hodnocení optimálního věku kuřat, věk a hmotnost kuřat tradičně používaných v této zkušební metodě odpovídá mladým kuřatům tradičně zpracovávaným na jatkách pro drůbež (tj. přibližně 7 týdnů staré, o váze 1,5–2,5 kg).

Shromažďování a doprava očí do laboratoře

Hlavy by se měly odstranit ihned po usmrcení kuřat obvykle elektrickým šokem a naříznutím krku za účelem zbavení krve. Místní zdroj kuřat blízko laboratoře by měl být umístěn tak, aby hlavy kuřat mohly být dopraveny z jatek do laboratoře dostatečně rychle s cílem minimalizovat poškození a/nebo bakteriální znečištění. Časový interval mezi shromážděním kuřecích hlav, odstraněním očí a jejich umístěním do superfúzní komory by měl být co nejkratší (zpravidla do dvou hodin), aby se zajistilo splnění kritérií přijatelnosti zkoušky. Všechny oči použité v analýze by měly být ze stejné skupiny očí shromážděných v určitý den.

Protože oči se oddělují v laboratoři, neporušené hlavy se dopravují z jatek za okolní teploty (obyčejně mezi 18 °C a 25 °C) v umělohmotných krabicích, které jsou navlhčeny ubrousky namočenými v izotonickém fyziologickém roztoku.

Kritéria výběru a počet očí používaných v ICE

Oči, které po enukleaci mají vysoké základní zbarvení fluoresceinem (tj. > 0,5) nebo vysokou hodnotu zákalu rohovky (tj. > 0,5), se vyřadí.

Každá zkušební skupina a souběžná pozitivní kontrola pozůstává nejméně ze třech očí. Skupina pro negativní kontrolu nebo pro kontrolu s rozpouštědlem (používá-li se jiné rozpouštědlo než fyziologický roztok) pozůstává nejméně z jednoho oka.

V případě pevných látek, které vedou k výsledku, kdy látku není nutné klasifikovat v systému GHS OSN, se doporučuje druhé provedení zkoušky se třema očima, která negativní výsledek potvrdí nebo vyvrátí.

POSTUP

Příprava očí

Oční víčka se opatrně vyříznou a přitom se dává pozor, aby se nepoškodila rohovka. Neporušenost rohovky se rychle posoudí kápnutím 2 % (objemové hmotnosti) fluoresceinu sodného aplikovaného na povrch rohovky po dobu několika vteřin, který se potom opláchne izotonickým fyziologickým roztokem. Oči ošetřené fluoresceinem se pak zkoumají pod mikroskopem se štěrbinovou lampou, aby se zajistilo, že se rohovka nepoškodí (tj. hodnoty zadržení fluoresceinu a zákalu rohovky ≤ 0,5).

Není-li oko poškozeno, vyřízne se z lebky a přitom se dává pozor, aby se nepoškodila rohovka. Oční bulbus se vyjme z očnice tak, že se chirurgickou pinzetou pevně uchopí mžurka a oční sval se ustřihne zahnutými tupě zakončenými nůžkami. Je důležité zamezit poškození rohovky nadměrným tlakem (tj. kompresní artefakty).

Když je oko vyjmuto z očnice, viditelná část očního nervu by se měla ponechat. Jakmile se oko vyjme z očnice, položí se na absorpční podložku a mžurka a jiné pojivové tkáně se ustřihnou.

Odstraněné oko se nasadí na držák z nezeravějící oceli s rohovkou ve svislé poloze. Držák se potom přenese do komory superfúzního aparátu (18). Držáky by se měly v tomto speciálním zkušebním přístroji postavit tak, aby se kapky izotonického fyziologického roztoku dostávaly k celé rohovce (3–4 kapky za minutu nebo 0,1 až 0,15 ml/min). Teplota komor přístroje by měla být řízena na 32 ± 1,5 °C. V dodatku 3 je schématický nákres typického superfúzního aparátu a očních držáků, které je možné obchodně získat nebo zkonstruovat. Přístroje mohou být upraveny, aby splňovaly potřeby jednotlivé laboratoře (např. umístění různého počtu očí).

Když se oči vloží do superfúzního aparátu, znovu se prozkoumají pod mikroskopem se štěrbinovou lampou, aby se zjistilo, zda nebyly poškozeny během vyřezávání. Tloušťka rohovky by se v této době měla také měřit na vrcholu rohovky s použitím zařízení pro měření hloubky na mikroskopu se štěrbinovou lampou. Oči s i) hodnotou zadržení fluoresceinu > 0.5; (i) zákalem rohovky > 0.5 nebo iii) jakýmikoli dalšími znaky poškození by se měly vyměnit. V případě očí nevyřazených na základě jakéhokoli z těchto kritérií se musí vyřadit jednotlivé oči s tloušťkou rohovky, která se o víc než 10 % odchyluje od střední hodnoty pro všechny oči. Uživatelé by si měli být vědomi toho, že mikroskopy se štěrbinovou lampou by mohly ukazovat různou tloušťku rohovky, je-li rozdílné nastavení šířky štěrbiny. Šířka štěrbiny by se měla nastavit na 0,095 mm.

Poté, co byly oči prozkoumány a schváleny, inkubují se po dobu přibližně 45 až 60 minut, aby se uvedly do rovnováhy se zkušebním systémem před dávkováním. Po době vyrovnání se pro tloušťku rohovky a zákal zaznamená nulové referenční měření, které slouží jako základ (tj. čas = 0). Skóre fluoresceinu stanovené při pitvě je základní hodnotou pro měření tohoto koncového účinku.

Aplikace zkoušené chemické látky

Ihned po nulovém referenčním měření se oči (v držáku) vyjmou ze superfúzního aparátu, postaví se do vodorovné polohy a na rohovku se aplikuje zkoušená chemická látka.

Tekuté zkoušené chemické látky se zpravidla zkoušejí neředěné, mohou se však ředit, pokud se to považuje za nutné (např. jako součást návrhu studie). Preferovaným roupouštědlem pro ředěné chemické látky je fyziologický roztok. Za řízených podmínek lze však také použít alternativní rozpuštědla, ale vhodnost jiných rozpouštědel než fyziologického roztoku by se měla prokázat.

Tekuté zkoušené chemické látky se aplikují na rohovku tak, že celý povrch rohovky se rovnoměrně pokryje zkoušenou chemickou látkou; obvyklý objem je 0,03 ml.

Podle možnosti by se pevné zkoušené chemické látky měly co nejjemněji rozetřít pomocí třecí misky a těrky nebo srovnatelným drticím prostředkem. Prášek se aplikuje na rohovku tak, že se celý povrch rohovky rovnoměrně pokryje zkoušenou chemickou látkou; obvyklé množství je 0,03 g.

Zkoušená chemická látka (tekutá nebo pevná) se aplikuje po dobu 10 vteřin a pak se z oka opláchne izotonickým fyziologickým roztokem (přibližně 20 ml) při okolní teplotě. Oko (v držáku) se potom v původní svislé poloze vrátí do superfúzního aparátu. V případě potřeby lze použít další opláchnutí po desetivteřinové aplikaci a v následných časových intervalech (např. po zjištění reziduí zkoušené chemické látky na rohovce). Množství fyziologického roztoku dodatečně použitého pro opláchnutí obecně není kriticky důležité, ale pozorování přilnutí chemické látky k rohovce je důležité.

Chemické látky pro kontrolu

Do každého pokusu by měly být zařazeny souběžné negativní kontroly nebo kontroly s rozpouštědlem/vehikulem a pozitivní kontroly.

Když se zkoušejí 100 % tekuté látky nebo pevné látky, fyziologický roztok se ve zkušební metodě ICE používá pro souběžnou negativní kontrolu, aby se zjistily nespecifické změny ve zkušebním systému a aby se zajistilo, že podmínky analýzy nebudou mít za následek nevhodnou dráždivou reakci.

Když se zkoušejí zředěné tekuté látky, do zkušební metody se zařadí skupina pro souběžnou kontrolu s rozpouštědlem/vehikulem, aby se zjistily nespecifické změny ve zkušebním systému a aby se zajistilo, že podmínky analýzy nebudou mít za následek nevhodnou dráždivou reakci. Jak je uvedeno v bodě 31, lze použít pouze rozpouštědlo/vehikulum, u kterého se prokázalo, že nemá nepříznivé účinky na zkušební systém.

Do každého pokusu se zařadí známá látka s dráždivými účinky na oči jako souběžná pozitivní kontrola, aby se ověřilo, že je vyvolána odpovídající reakce. Protože analýza ICE se v této zkušební metodě používá ke zjišťování leptavých nebo silných dráždivých látek, pozitivní kontrola by měla být takovou referenční chemickou látkou, která v této zkušební metodě vyvolá silnou reakci. Aby se však zajistilo, že proměnlivost v reakci na pozitivní kontrolu bude možné časem vyhodnotit, rozsah silné reakce by neměl být nadměrný. Měl by se nashromáždit dostatek údajů pro pozitivní kontrolu in vitro, aby bylo možné vypočítat statisticky definovaný, přijatelný rozsah pozitivní kontroly. Nejsou-li údaje o zkušební metodě ICE z minulosti pro určitou pozitivní kontrolu k dispozici, bude nutné uskutečnit studie za účelem získání těchto informací.

Příklady tekutých zkoušených chemických látek pro pozitivní kontroly jsou 10 % kyselina octová nebo 5 % benzalkonium chlorid, zatímco příklady pevných zkoušených chemických látek pro pozitivní kontroly jsou hydroxid sodný nebo imidazol.

Srovnávací chemické látky jsou účelné pro hodnocení potenciálu podráždění očí neznámými chemickými látkami nebo specifickými třídami chemických látek či produktů nebo pro hodnocení potenciálu relativního podráždění látkou s dráždivými účinky na oči ve specifickém rozmezí dráždivých reakcí.

Měřené koncové účinky

Zkoušené rohovky se hodnotí před expozicí a po 30, 75, 120, 180 a 240 minutách (± 5 minut) po oplachu po ošetření. Tyto časové body zajišťují odpovídající počet měření během čtyřhodinové doby zkoušení a přitom ponechávají dostatek času mezi měřeními, aby potřebná pozorování byla uskutečněna pro všechny oči.

Hodnocené koncové účinky jsou zákal rohovky, zduření rohovky, zadržení fluoresceinu v rohovce a morfologické účinky (např. tvorba jamek nebo uvolnění epitelu). Všechny koncové účinky kromě zadržování fluoresceinu (který se určuje pouze před expozicí a 30 minut po expozici zkoušené látce) se určují v každém výše uvedeném časovém intervalu.

Doporučují se fotografické snímky, aby se zdokumentoval zákal rohovky, zadržování fluoresceinu, morfologické účinky a histopatologie, pokud se provádí.

Po poslední prohlídce po 4 hodinách se uživatelům doporučuje uložit oči do vhodného fixačního média (např. neutrálního pufrovaného formalínu) pro případné histopatologické zkoumání (podrobněji viz odstavec 14 a odkaz (8)).

Otok rohovky se určuje měřením tloušťky rohovky, které se provádí optickým pachymetrem pod mikroskopem se štěrbinovou lampou. Vyjadřuje se jako procento a vypočítává se z měření tloušťky rohovky podle následujícího vzorce:

Střední procento otoku rohovky se u všech zkoušených očí vypočítává pro všechny časové body pozorování. Na základě nejvyšší střední hodnoty otoku rohovky pozorované v jakémkoli časovém bodu se potom každé zkoušené chemické látce přidělí celková hodnota kategorie (viz odstavec 51).

Zákal rohovky se vyhodnotí s použitím plochy rohovky pro hodnocení, která je nejvíce zakalená, jak je uvedeno v tabulce 1. Střední hodnota zákalu rohovky se u všech zkoušených očí vypočítává pro všechny časové body pozorování. Na základě nejvyšší střední hodnoty zákalu rohovky pozorované v jakémkoli časovém bodě se potom každé zkoušené chemické látce přidělí celková hodnota kategorie (viz odstavec

Tabulka 1.

Hodnoty zákalu rohovky.

Zadržení fluoresceinu se hodnotí pouze při měření v časovém intervalu 30 minut, jak je uvedeno v tabulce 2. Střední hodnota zadržování fluoresceinu se poté u všech zkoušených očí vypočítává pro časový interval 30minutového pozorování a používá pro celkovou hodnotu kategorie přidělenou každé zkoušené chemické látce (viz odstavec 51).

Tabulka 2.

Hodnoty zadržování fluoresceinu.

Morfologické účinky zahrnují „jizvy“ na epiteliálních buňkách rohovky, „uvolňování“ epitelu, „zdrsnění“ povrchu rohovky a „nalepení“ zkoušené látky na rohovku. Tato zjištění se mohou ve své závažnosti měnit a mohou se vyskytovat souběžně. Klasifikace těchto zjištění je subjektivní podle interpretace výzkumníka.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Hodnocení údajů

Výsledky ze zákalu a otoku rohovky a zadržování fluoresceinu by se měly hodnotit zvlášť, aby se pro každý koncový účinek vytvořila třída ICE. Třídy ICE pro každý koncový účinek se pak spojí za účelem vytvoření klasifikace dráždivých účinků pro každou zkoušenou chemickou látku.

Kritéria rozhodování

Poté, co byl každý koncový účinek vyhodnocen, lze na základě předem určeného rozmezí přiřadit třídy ICE. Interpretace otoku (tabulka 3) a zákalu rohovky (tabulka 4) a zadržování fluoresceinu (tabulka 5) s použitím čtyř tříd ICE se uskutečňuje podle níže uvedených měřítek. Je důležité poznamenat, že hodnoty otoku rohovky uvedené v tabulce 3 platí pouze v případě, že se tloušťka měří mikroskopem se štěrbinovou lampou (například Haag-Streit BP900) se zařízením pro měření hloubky č. 1 a při nastavení šířky štěrbiny 9, která se rovná 0,095 mm. Uživatelé by si měli být vědomi, že mikroskopy se štěrbinovou lampou mohou poskytovat různé naměřené hodnoty tloušťky rohovky, je-li nastavena odlišná šířka štěrbiny.

Tabulka 3.

Klasifikační kritéria ICE pro otok rohovky.

Tabulka 4.

Klasifikační kritéria ICE pro zákal.

Tabulka 5.

Klasifikační kritéria ICE pro střední zadržování fluoresceinu.

Klasifikace in vitro zkoušené chemické látky se hodnotí pomocí klasifikace GHS, která odpovídá kombinaci kategorií získaných pro otok rohovky, zákal rohovky a zadržování fluoresceinu, jak je popsáno v tabulce 6.

Tabulka 6.

Celkové klasifikace in vitro.

Kritéria přijatelnosti studie

Zkouška se považuje za přijatelnou, pokud vede ke zjištění, že souběžné negativní kontroly nebo kontroly s vehikulem/rozpouštědlem odpovídají chemickým látkám neklasifikovaným podle systému GHS a souběžné pozitivní kontroly odpovídají chemickým látkám klasifikovaným v kategorii 1 systému GHS.

Závěrečná zpráva

Závěrečná zpráva by měla zahrnovat následující informace, pokud jsou relevantní pro provedení studie: