1.

Коефициентът на разпределение (Р) се дефинира като съотношението между равновесните концентрации на разтвореното вещество в двуфазна система, която се състои от два практически несмесващи се разтворителя. В случая с n-октанол и вода

коефициентът на разпределение (Р) представлява съотношение между две концентрации, безразмерна величина е и обикновено се дава във формата на десетичен логаритъм.

2.

Pow е ключов параметър при проучвания на съдбата в околната среда на химични вещества. Установена е висока значимост на взаимовръзката между Pow вещества в нейонизирана форма и тяхната биоакумулация в рибата. Освен това е доказано, че Pow е полезен параметър при прогнозиране на адсорбцията върху почвата и седиментите, и за определяне на количествените зависимости структура-активност за широк спектър от биологични ефекти.

3.

Първоначалното предложение за този метод за изпитване се основаваше на статия с автори C.V. Eadsforth и P. Moser (1). Разработването на метода за изпитване беше координирано с междулабораторно сравнително изпитване на ОИСР от Агенцията по околна среда на Федерална република Германия през 1986 г. (2).

4.

Стойности на log Pow в диапазона от -2 до 4 (в някои случаи до 5 и повече) (1) могат да бъдат опитно определени по метода „разклащане в стъкленица“ (глава А.8 от настоящото приложение; насоки за изпитване 107 на ОИСР). Методът с ВЕТХ обхваща log Pow в диапазон от 0 до 6 (1) (2) (3) (4) (5). Този метод може да изисква прогнозна оценка на Pow за определяне на подходящи референтни вещества и за подкрепа на всички заключения, направени въз основа на данните, получени от изпитването. Методите за изчисляване са разгледани накратко в допълнението към настоящия метод за изпитване. ВЕТХ е в изократен режим на работа.

5.

Стойностите на Pow зависят от условията на околната среда, като например температурата, pH, йонната сила и т.н., и те следва да бъдат определени в експеримента за правилното интерпретиране на данните за Pow. За веществата, които могат да съществуват в йонизирано състояние, е възможно друг метод (напр. проект за насоки на ОИСР относно рН-метричен метод за йонизирани вещества (6)) да стане наличен и да се използва като алтернативен метод. Въпреки че този проект за насоки на ОИСР може да е подходящ за определянето на Pow за посочените вещества, които могат да съществуват в йонизирано състояние, в някои случаи е по-целесъобразно да се използва методът с ВЕТХ при стойности на рН, срещани в околната среда (вж. параграф 9).

6.

Изпитването с ВЕТХ с обърната фаза се провежда в аналитични колони, запълнени с налична в търговската мрежа твърда фаза, съдържаща въглеводороди с дълги вериги (например С8, C18), химически свързани със силикагел.

7.

При пренасянето си от подвижната фаза през колоната химикалът, инжектиран в такава колона, се разпределя между подвижната фаза на разтворителя и неподвижната фаза на въглеводородите. Веществата се задържат пропорционално на своите коефициенти на разпределение въглеводород-вода, като хидрофилните вещества се елуират първи, а липофилните вещества — последни. Времето на задържане се описва с капацитета „k“, който се дава с израза:

където tR = времето на задържане на изпитваното вещество, a t0 = мъртвото време, т.е., средното време, необходимо на една молекула от разтворителя да премине през колоната. Не се изисква прилагането на количествени аналитични методи и е необходимо единствено определянето на времената на задържане.

8.

Коефициентът на разпределение октанол/вода на дадено изпитвано вещество може да се изчисли чрез опитно определяне на капацитета „k“ за него и след това поставяне на „k“ в следната формула:

където

Уравнението по-горе може да бъде получено чрез линейна регресия на log на коефициентите на разпределение октанол/вода на референтни вещества спрямо log на капацитетите на тези референтни вещества.

9.

Методът на ВЕТХ с обърната фаза позволява коефициентите на разпределение да се определят в диапазон на log Pow от 0 до 6, но той може да бъде разширен така, че да обхване диапазон на log Pow между 6 и 10 в изключителни случаи. За тази цел може да е необходимо модифициране на подвижната фаза (3). Методът не може да се прилага за силни киселини и основи, метални комплекси, вещества, които реагират с елуента или повърхностно активни средства. При веществата, които могат да съществуват в йонизирано състояние, измервания могат да се извършват върху тяхната нейонизирана форма (свободна киселина или свободна основа) само чрез използване на подходящ буфер с pH, по-ниско от pKa за свободната киселина или по-високо от pKa за свободната основа. Алтернативно, pH-метричният метод за изпитване на веществата, които могат да съществуват в йонизирано състояние (6) може да стане наличен и да се използва като алтернативен метод (6). Ако стойността на log Pow се определя за използване при класифициране на опасността за околната среда или в оценката на риска за околната среда, изпитването трябва да се провежда при обхват от стойности на рН, срещан в естествени условия, т.е., обхват от 5,0 — 9.

10.

В някои случаи присъствието на примеси може да затрудни интерпретирането на резултатите, защото определянето на пиковете става несигурно. За смеси, които водят до неразделена ивица, следва да бъдат протоколирани горната и долната граница на log Pow и % от площта за всеки log Pow пик. За смеси, които са група от хомолози, следва също да се посочи среднопретеглената стойност на log Pow (7), изчислена въз основа на отделните стойности на Pow и съответните им стойности за % от площта (8). Всички пикове, които дават площ от 5 % или повече спрямо общата площ на пиковете, трябва да се вземат под внимание при изчислението (9):

Среднопретеглената стойност на log Pow е валидна само за вещества или смеси (напр. талово масло), състоящи се от хомолози (напр. от алкани). Смеси могат да бъдат измервани със смислени резултати, при условие че използваният аналитичен детектор има същата чувствителност към всички вещества в сместа, и че те могат да бъдат измерени по подходящ начин.

11.

Дисоциационната константа, структурната формула и разтворимостта в подвижната фаза следва да бъдат известни преди използването на метода. Освен това би била полезна и информация относно хидролизата.

12.

За да се увеличи доверителността на резултатите, трябва да се правят по две определяния.

13.

Междулабораторното сравнително изпитване е показало, че по метода на ВЕТХ могат да бъдат получени стойности на log Pow в рамките на ± 0,5 единици от тези по метода „разклащане в стъкленица“ (2). Други сравнения могат да бъдат намерени в посочената литература (4) (5) (10) (11) (12). Графиките с корелациите, основаващи се на структурно свързани референтни вещества, дават най-точните резултати (13).

14.

За да се определи корелация между измерения капацитет k на дадено вещество и неговия Pow, трябва да се изготви калибрационна графика, като се използват най-малко 6 точки (вж. параграф 24). Подборът на подходящи референтни вещества е по преценка на потребителя. Референтните вещества обикновено следва да имат стойности на log Pow, които обхващат log Pow на изпитваното вещество, т.е., най-малко едно референтно вещество трябва да има по-високо Pow от това на изпитваното вещество, а друго — по-ниско Pow от това на изпитваното вещество. Екстраполация трябва да се използва само в изключителни случаи. За предпочитане е тези референтни вещества да са структурно свързани с изпитваното вещество. Стойностите на log Pow на референтните вещества, използвани за калибрирането, следва да се основават на надеждни експериментални данни. Въпреки това, за вещества с високи стойности на log Pow (обикновено повече от 4) могат да се използват изчислени стойности, освен ако не са налични надеждни експериментални данни. Ако са използвани екстраполирани стойности, трябва да се посочи пределна стойност.

15.

В литературните източници (14) и (15) могат да се намерят подробни списъци със стойностите на log Pow за много групи от химикали. Ако не са налични данни за коефициентите на разпределение на структурно свързани вещества, може да се използва по-общо калибриране, извършено с други референтни вещества. В таблица 1 са посочени препоръчителни референтни вещества и техните Pow стойности. За веществата, които могат да съществуват в йонизирано състояние, дадените стойности се отнасят за нейонизираната форма. Стойностите са проверени по отношение на достоверността и качеството по време на междулабораторното сравнително изпитване.

Таблица 1

Препоръчителни референтни вещества

16.

Ако е необходимо, коефициентът на разпределение на изпитваното вещество се оценява, за предпочитане, чрез изчислителни методи (вж. допълнението) или, когато е уместно, чрез използването на съотношението на разтворимостите на изпитваното вещество в чистите разтворители (10).

17.

Изисква се течен хроматограф, оборудван с помпа с ниско равнище на пулсации и подходящ детектор. УВ детекторът с дължина на вълната 210 nm или рефрактометричният детектор са приложими към голямо разнообразие групи от химикали. Присъствието на полярни групи в неподвижната фаза може значително да влоши действието на колоната за ВЕТХ. Затова неподвижните фази трябва да имат минимален процент от полярни групи (16). Могат да се използват търговските пълнители от микрочастици за обърнати фази или готови напълнени колони. Между инжекционната система и аналитичната колона може да се постави предпазна колона.

18.

За изготвянето на елуиращи разтворители (които се дегазират преди употреба) се използват метанол и дестилирана или дейонизирана вода с чистота „за ВЕТХ“. Използва се изократно елуиране. Следва да се използват съотношения метанол/вода с минимално съдържание на вода от 25 %. Обикновено сместа метанол-вода 3:1 (v/v) е подходяща за елуиране на вещества с log P = 6 в рамките на един час при скорост на потока = 1 ml/min. За вещества със стойности на log P по-високи от 6 може да се наложи намаляване на времето за елуиране (също и на референтните вещества), като се намали полярността на подвижната фаза или дължината на колоната.

19.

Както изпитваните, така и референтните вещества трябва да са разтворими в подвижната фаза в концентрации, достатъчни да позволят откриването им. Добавките към сместа от метанол и вода могат да се използват само в изключителни случаи, тъй като те променят свойствата на колоната. В тези случаи трябва да се потвърди, че времето на задържане на изпитваните и референтните вещества не е повлияно. Ако сместа метанол-вода не е подходяща, може да се използва смес от друг органичен разтворител и вода, например етанол-вода, ацетонитрил-вода или изопропилов алкохол (2-пропанол)-вода.

20.

Стойността на рН на елуента е решаваща за веществата, които могат да съществуват в йонизирано състояние. Тя трябва да бъде в работния обхват от рН на колоната, обикновено между 2 и 8. Препоръчва се използването на буфери. Трябва да се внимава да се избегне утаяването на соли и замърсяването на колоната, което се получава при някои смеси органична фаза/буфер. Измерванията с ВЕТХ с неподвижна фаза на базата на силикагел при рН над 8 обичайно не се препоръчват, тъй като употребата на алкална подвижна фаза може да доведе до бързо влошаване на качествата на колоната.

21.

Изпитваните и референтните вещества трябва да са достатъчно чисти, за да се определят пиковете за съответните вещества в хроматограмите. Ако е възможно, веществата, които ще се изпитват, и тези, които ще се използват за калибриране, се разтварят в подвижната фаза. Ако за разтваряне на изпитваните и референтните вещества се използва различен от подвижната фаза разтворител, подвижната фаза следва да се използва за крайното разреждане преди инжектирането.

22.

Температурата по време на измерването не бива да се променя с повече от ± 1 °C.

23.

Мъртвото време t0 може да бъде измерено чрез използване на органични вещества, които не се задържат (например тиоуреа или формамид). Мъртвото време може да бъде получено по-прецизно с измерените времена на задържане, измерено или с набор от около седем члена на хомоложен ред (например n-алкилметилкетони) (17). Времената на задържане tR (nC + 1) се нанасят срещу tR (nC), където nC е броят на въглеродните атоми. Получава се права линия tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 – A)t0, където A, представляващо k(nC + 1)/k(nC), е константа. Мъртвото време t0 се получава от отсечката (1 – A)t0 и наклона A.

24.

Следващата стъпка е да се начертае корелация на log k спрямо log P за подходящи референтни вещества със стойности на log P близки до очакваната стойност на изпитваното вещество. На практика се инжектират едновременно от 6 до 10 референтни вещества. Времената на задържане се определят за предпочитане на записващ интегратор, свързан към детектора. Съответните логаритми от капацитета, log k, се нанасят като функция от log P. Регресионното уравнение се съставя през равномерни интервали поне веднъж дневно, така че да бъдат отчетени възможните изменения в работата на колоната.

25.

Изпитваното вещество се инжектира в най-малките откриваеми количества. Времето на задържане се определя с две повторения. Коефициентът на разпределение на изпитваното вещество се получава чрез интерполация на изчисления капацитет върху калибрационната крива. За много ниски или много високи коефициенти на разпределение се налага да се извърши екстраполация. Особено в тези случаи внимание трябва да се обърне на доверителните граници на регресионната права. Ако времето на задържане на дадена проба е извън диапазона на времената на задържане, получени за еталоните, следва да бъде посочена пределна стойност.

26.

В протокола трябва да се включи следното:

(1)

C.V. Eadsforth and P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.

(2)

W. Klein, W. Kördel, M. Weiss and H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.

(3)

C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.

(4)

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.

(5)

B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.

(6)

OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals — Partition Coefficient (n-octanol/water): pH-metric Method for Ionisable Substances. Draft Guideline, November 2000.

(7)

OSPAR (1995). „Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995“, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), Annex 10, Oviedo, 20–24 February 1995.

(8)

M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez and C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Version 1.0, 3. August.

(9)

E. A. Vik, S. Bakke and K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software Vol. 13, pp. 529-537.

(10)

L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.

(11)

W.E. Hammers, G.J.Meurs and C.L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.

(12)

J.E. Haky and A.M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.

(13)

S. Fujisawa and E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.

(14)

C. Hansch and A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, New York.

(15)

C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity — Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711.

(16)

R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 14, 479.

(17)

G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.

1.

Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 201 (2006, приложение, коригирано през 2011 г.). Установена е необходимост от разширяване на обхвата на метода на изпитване, за да се включат допълнителни видове, и от актуализиране, с оглед съответствие с изискванията за оценяване на риска и класифициране на химикали. Това преразглеждане беше извършено въз основа на обширен практически опит, на научния напредък в сферата на изследванията за токсичност при водораслите и широкообхватна регулаторна употреба, която е налице след първоначалното приемане.

2.

Определенията, които са използвани, са дадени в допълнение 1.

3.

Целта на настоящото изпитване е да се определят въздействията на даден химикал върху растежа на сладководните микроводорасли и/или цианобактерии. Експоненциално растящите изпитвани организми са изложени на действието на изпитвания химикал в периодични култури, обикновено за период от 72 часа. Въпреки относително кратката продължителност на изпитването могат да бъдат оценени въздействията върху няколко поколения.

4.

Откликът на системата е намаляване на растежа в серии култури от водорасли (изпитвани единици), изложени на действието на различни концентрации на изпитвания химикал. Откликът се оценява като функция на концентрацията на експозиция в сравнение със средния растеж на повторни, неизложени на въздействие контролни култури. За пълното представяне на отклика на системата на токсични въздействия (оптимална чувствителност) на културите се дава възможност за неограничен експоненциален растеж в условия на достатъчно хранителни вещества и непрекъсната светлина в течение на достатъчен период от време, за да се измери намаляването на специфичната скорост на растеж.

5.

Растежът и потискането на растежа се определят количествено чрез измервания на биомасата от водорасли като функция на времето. Биомасата на водорасли се определя като сухо вещество за единица обем, например mg водорасли на литър изпитван разтвор. Въпреки това сухото вещество се измерва трудно и следователно се използват сурогатни параметри. От тези сурогати най-често се използва броят клетки. Други сурогатни параметри включват обем на клетката, флуоресценция, оптична плътност и т.н. Трябва да е известен факторът на преобразуване между измервания сурогатен параметър и биомасата.

6.

Крайната точка на изпитването е потискането на растежа, изразено като логаритмично нарастване в биомасата (средната специфична скорост на растеж) по време на периода на експозиция. От средните специфични скорости на растеж, регистрирани в серия от изпитвани разтвори, се определя концентрацията, при която се осъществява потискане на скоростта на растежа до определените x % (например 50 %) и се изразява като ErCx (напр. ErC50).

7.

Допълнителна зависима променлива, използвана в настоящия метод на изпитване, е добивът, който може да е необходим, за да бъдат изпълнени специфични регулаторни изисквания в някои държави. Той се определя като биомасата в края на периода на експозиция минус биомасата в началото на периода на експозиция. От добива, регистриран в серия от разтвори на изпитване, се изчислява концентрацията, при която се осъществява потискане на добива до определените x % (например 50 %) и се изразява като EyCx (напр. EyC50).

8.

В допълнение най-ниската концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) и концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) могат да бъдат определени статистически.

9.

Информацията за изпитвания химикал, която може да се използва при установяването на условията за изпитване, включва структурната формула, чистотата, устойчивостта на светлина, устойчивостта при условията на изпитването, свойствата на поглъщане на светлината, pKa и резултатите от изследванията на трансформацията, включително биоразградимостта във вода.

10.

Разтворимостта във вода, коефициентът на разпределение октанол/вода (Pow) и парното налягане на изпитвания химикал трябва да са известни и да е на разположение валидиран метод за количествено определяне на химикала в изпитваните разтвори с отчетени коефициент на аналитичния добив и граница на откриването.

11.

За да е валидно изпитването, трябва да бъдат изпълнени следните критерии за резултати:

12.

Референтният химикал (референтните химикали), като например 3,5-дихлорофенол, използван в международното кръгово изпитване (1), може да бъде изпитван като средство за проверка на процедурата за изпитване. Калиевият дихромат също може да бъде използван като референтен химикал за зелените водорасли. Желателно е референтният химикал да се изпитва най-малко два пъти годишно.

13.

Настоящият метод за изпитване е най-лесно приложим към водоразтворими химикали, за които е вероятно при условията на изпитването да останат във водата. За изпитването на химикали, които са летливи, силно адсорбиращи, оцветени, със слаба водоразтворимост или химикали, които могат да повлияят на наличността на хранителни вещества или минерали в средата на изпитване, може да са нужни определени изменения на описаната процедура (например затворена система, кондициониране на съдовете за изпитване). Указания за някои подходящи изменения са дадени в (2)(3) и (4).

14.

Съдовете за изпитване и другите апарати, които ще бъдат в контакт с изпитваните разтвори, трябва да бъдат направени изцяло от стъкло или друг химически инертен материал. Елементите трябва да бъдат добре почистени, за да се гарантира, че няма органични или неорганични замърсители, които да повлияят на растежа на водораслите или върху състава на изпитваните разтвори.

15.

Съдовете за изпитване обикновено са стъклени колби с размери, които позволяват обем на културата, достатъчен за измервания по време на изпитването, и достатъчно масопренасяне на CO2 от атмосферата (вижте параграф 30). Да се има предвид, че обемът на течността трябва да бъде достатъчен за аналитично определяне (вж. точка 37).

16.

В допълнение могат да се изискват някои или всички от следните уреди:

17.

Могат да се използват няколко вида неприкрепени микроводорасли и цианобактерии. Щамовете, изброени в допълнение 2, са демонстрирани като подходящи при използването на процедурата на изпитване, определена в настоящия метод на изпитване.

18.

Ако се използват други видове, следва да се протоколира щамът и/или произходът. Трябва да бъде потвърдено, че експоненциалният растеж на избраните изпитвани водорасли може да бъде поддържан по време на периода на изпитване при преобладаващите условия.

19.

Препоръчват се две алтернативни среди на растеж, средите на ОИСР и на AAP. Съставът на тези среди е показан в допълнение 3. Да се има предвид, че първоначалната стойност на pH и буферният капацитет (регулиращ увеличаването на pH) на двете среди са различни. Следователно резултатите от изпитванията могат да бъдат различни в зависимост от използваната среда, особено когато се изпитват йонизиращи химикали.

20.

Може да е необходимо изменение на средата на растеж за определени цели, например когато се изпитват метали или хелатни агенти или за изпитване при различни стойности на pH. Използването на изменена среда трябва да бъде подробно описано и обосновано (3) (4).

21.

Началната биомаса в изпитваните култури трябва да бъде еднаква във всички изпитвани култури и достатъчно ниска, за да позволява експоненциален растеж през целия инкубационен период без риск от изчерпване на хранителните вещества. Началната биомаса не трябва да превишава 0,5 mg/l като сухо тегло. Препоръчват се следните начални концентрации на клетки:

22.

Диапазонът на концентрациите, в който е възможно да настъпят въздействия, може да бъде определен на базата на резултати от изпитвания за определяне на обхвата. За крайното определящо изпитване трябва да се изберат поне пет концентрации, подредени в геометрична прогресия с частно, което не превишава 3,2. За изпитвани химикали, показващи полегата крива концентрация-отклик, може да бъде обосновано и по-високо частно. Поредицата от концентрации трябва по възможност да обхваща диапазона, при който се постига 5—75 % потискане на скоростта на растеж на водораслите.

23.

Планът на изпитването следва да включва три повторения от всяка една изпитвана концентрация. Ако не се изисква определяне на NOEC, планът на изпитването може да бъде изменен, за да се увеличи броят на концентрациите и да се намали броят на повторенията за всяка концентрация. Броят на контролните повторения трябва да бъде поне три и в най-добрия случай следва да бъде два пъти повече от броя на повторенията, използвани за всяка една изпитвана концентрация.

24.

Може да бъде приготвен отделен набор от изпитвани разтвори за аналитично определяне на концентрациите на изпитвания химикал (вж. точки 36 и 38).

25.

Когато се използва разтворител, за да се разтвори изпитваният химикал, в плана на изпитването трябва да бъдат включени допълнителни контролни проби, съдържащи разтворителя в същата концентрация, каквато е използвана в изпитваните култури.

26.

За да се адаптират изпитваните водорасли към условията за изпитване и да се гарантира, че водораслите са във фаза на експоненциален растеж, когато се използват за инокулация на изпитваните разтвори, се приготвя инокулант в изпитваната среда 2 — 4 дни преди започване на изпитването. Биомасата от водорасли следва да бъде приспособена, за да се осигури преобладаване на експоненциалния растеж в инокуланта до започване на изпитването. Инокулантът се инкубира при същите условия като изпитваните култури. Измерва се увеличаването на биомасата в инокуланта, за да се гарантира, че растежът е в рамките на нормалния диапазон за изпитвания щам при условията за култивиране. В допълнение 4 е описан пример за процедурата на култивиране на водорасли. За да се избегне синхронното делене на клетките по време на изпитването, би могло да се наложи втори стадий в размножаването на инокуланта.

27.

Всички разтвори за изпитване трябва да съдържат еднакви концентрации на средата на растеж и начална биомаса на изпитваните водорасли. Изпитваните разтвори на избраните концентрации обикновено се приготвят чрез смесване на изходен разтвор на изпитвания химикал със средата на растеж и инокуланта. Изходните разтвори обикновено се приготвят чрез разтваряне на химикала в изпитваната среда.

28.

Разтворители, като например ацетон, трет-бутилов алкохол и диметилформамид, могат да се използват като носители за добавяне към изпитваната среда на химикали с малка разтворимост във вода (2)(3). Концентрацията на разтворителя не трябва да превишава 100 μl/l и към всички култури (включително и контролните) в изпитваните серии следва да се добави същата концентрация на разтворителя.

29.

Съдовете за изпитване се запушват с въздухопропускливи запушалки. Съдовете се разклащат и поставят в апаратурата за култивиране. По време на изпитването е необходимо водораслите да се държат в суспензия и да се улесни преносът на CO2. За тази цел следва да се извършва постоянно разклащане или разбъркване. Културите трябва да се поддържат при температура от 21 до 24 °C с регулиране в границите на ± 2 °C. За видовете, различни от посочените в допълнение 2, например тропическите видове, може да са подходящи по-високи температури, при условие че могат да бъдат изпълнени критериите за валидност. Препоръчва се колбите да бъдат поставяни на случаен принцип и местата им в инкубатора да бъдат сменяни всеки ден.

30.

Стойността на pH на контролната среда не трябва да се повишава с повече от 1,5 единици по време на изпитването. За метали и химикали, които частично се йонизират при стойности на pH около стойността на pH при изпитването, може да е нужно ограничаване на отклонението на pH, за да се получат възпроизводими и добре дефинирани резултати. Отклонение < 0,5 pH единици е технически осъществимо и може да бъде постигнато с осигуряване на адекватна скорост на масопренасяне на CO2 от заобикалящия въздух към изпитвания разтвор, например чрез увеличаване на честотата на разклащане. Друга възможност е да се намали потребността от CO2 чрез намаляване на първоначалната биомаса или продължителността на изпитването.

31.

Повърхността, където културите се инкубират, следва да получава непрекъсната, хомогенна флуоресцентна светлина, например от вида „студена бяла светлина“ или „дневна светлина“. Щамовете от водорасли и цианобактерии се различават по отношение на изискванията си за светлина. Интензитетът на светлината следва да бъде избран така, че да подхожда на използвания изпитван организъм. За препоръчваните видове зелени водорасли интензитетът на светлината на нивото на изпитваните разтвори се избира в диапазона от 60—120 μE · m– 2 s– 1, когато се измерва във фотосинтетично ефективния диапазон от дължини на вълната от 400—700 nm с използването на подходящ рецептор. Някои видове, по-специално Anabaena flos-aquae, растат добре при по-ниски интензитети на светлина и могат да бъдат увредени при високи интензитети. За такива видове следва да се избере среден интензитет на светлината в диапазона 40—60 μE · m– 2 · s– 1. (За уреди за измерване на светлината, калибрирани в lux, еквивалентният диапазон от 4 440—8 880 lux за студена бяла светлина съответства приблизително на препоръчвания интензитет на светлината от 60—120 μE·m– 2 · s– 1). Светлинният интензитет се поддържа в рамките на ± 15 % от средния интензитет на светлината над инкубационната площ.

32.

Продължителността на изпитването обикновено е 72 часа. Въпреки това може да се използва по-кратка или по-дълга продължителност на изпитванията, при условие че могат да бъдат спазени всички критерии за валидност в параграф 11.

33.

Биомасата от водорасли във всяка колба се определя най-малко веднъж дневно по време на изпитването. Ако измерванията се правят на малки обеми, взети от изпитвания разтвор с пипета, те не бива да се връщат обратно.

34.

Измерването на биомасата се извършва чрез ръчно преброяване на клетките с микроскоп или електронен брояч на частици (чрез преброяване на клетки и/или обем на биомасата). Могат да се използват алтернативни техники, например поточна цитометрия, in vitro или in vivo хлорофилна флуоресценция (5) (6) или оптична плътност, при условие че може да бъде демонстрирана задоволителна корелация с биомасата в диапазона на биомасата, който се среща по време на изпитването.

35.

Стойността на pH на разтворите се измерва в началото и в края на изпитването.

36.

При условие че е налице аналитична процедура за определяне на изпитвания химикал в използвания диапазон на концентрацията, изпитваните разтвори следва да бъдат анализирани, за да се потвърдят първоначалните концентрации и поддържането на концентрациите на експозиция по време на изпитването.

37.

Анализът на концентрацията на изпитвания химикал в началото и в края на изпитването при ниска и висока изпитвана концентрация, както и на концентрация около очакваната EC50 може да е достатъчен в случаите, при които има вероятност концентрациите на експозиция да варират с по-малко от 20 % от номиналните стойности по време на изпитването. Препоръчва се анализ на всички изпитвани концентрации в началото и в края на изпитването, ако вероятността концентрациите да останат в рамките на 80—120 % от номиналните е малка. За летливи, нестабилни или силно адсорбиращи изпитвани химикали се препоръчва допълнително вземане на проби за анализ на 24-часови интервали по време на периода на експозиция, за да се определи по-добре загубата на изпитвания химикал. За тези химикали може да са необходими допълнителни повторения. Във всички случаи е необходимо определянето на концентрациите на изпитвания химикал да бъде извършвано само в един съд с повторна проба при всяка една изпитвана концентрация (или в обединеното съдържание на съдовете от повторенията).

38.

Изпитваната среда, приготвена специално за анализ на концентрации на експозиция по време на изпитването, следва да бъде третирана по същия начин както тези, използвани за изпитването, т.е., тя трябва да бъде инокулирана с водорасли и инкубирана при същите условия. Ако се изисква анализ на концентрацията на разтворения изпитван химикал, може да е нужно да се отделят водораслите от средата. За предпочитане е отделянето да се прави чрез центрофугиране при ниска сила на притегляне, достатъчна за утаяване на водораслите.

39.

Ако има доказателство, че през цялото време на изпитването концентрацията на химикала, който се изпитва, е била задоволително поддържана в рамките на ± 20 % от номиналната или измерената първоначална концентрация, анализът на резултатите може да бъде базиран на номиналната или на измерената първоначална стойност. Ако отклонението от номиналната или измерената първоначална концентрация е по-голямо от ± 20 %, анализът на резултатите следва да се основава на средногеометричната концентрация по време на експозиция или на модели, описващи намаляването на концентрацията на изпитвания химикал (3) (7).

40.

Изпитването за потискане на растежа на водораслите е по-динамична система за изпитване от повечето други краткосрочни изпитвания за токсичност във водна среда. Като следствие може да е трудно да се определят действителните концентрации на експозиция, особено за адсорбиращи химикали, изпитвани при ниски концентрации. В такива случаи изчезването на изпитвания химикал от разтвора чрез адсорбция към увеличаващата се биомаса от водорасли не означава, че той е изгубен от системата за изпитване. Когато се анализира резултатът от изпитването, следва да се провери дали намаляването на концентрацията на изпитвания химикал в процеса на изпитване се придружава от намаляване в потискането на растежа. Ако това е така, може да се обмисли прилагането на подходящ модел, който описва намаляването на концентрацията на изпитвания химикал (7). В противен случай може да е подходящо анализът да се базира на резултатите от първоначалните (номинални или измерени) концентрации.

41.

Следва да бъдат извършени наблюдения с микроскоп, за да се потвърди нормалният и здрав външен вид на инокуланта, както и да се види дали има отклоняващи се от нормата промени във външния вид на водораслите (които могат да бъдат причинени от експозицията на въздействието на изпитвания химикал) в края на изпитването.

42.

При определени условия, например когато предварителното изпитване показва, че изпитваният химикал няма токсични въздействия при концентрации до 100 mg/l или до неговата граница на разтворимост в изпитваната среда (в зависимост от това кое е по-ниско), може да бъде осъществено гранично изпитване, включващо сравнение на отклика в контролна група и в една от третираните групи (100 mg/l или концентрация, равна на границата на разтворимост). Настоятелно се препоръчва това да бъде подкрепено с анализ на концентрацията на експозиция. Всички предходно описани условия на изпитване и критерии за валидност се прилагат към граничното изпитване, с изключение на това, че броят на третираните повторения трябва да бъде най-малко шест. Зависимите променливи в контролната и третираната група могат да бъдат анализирани с използването на статистически тест за сравняване на средните стойности, например t-тест на Стюдънт. Ако дисперсиите в двете групи не са еднакви, трябва да бъде извършен t-тест, коригиран за нееднакви дисперсии.

43.

Биомасата в съдовете за изпитване може да се изрази в единици на сурогатния параметър, използван за измерване (например брой клетки, флуоресценция).

44.

Представя се в табличен вид изчислената концентрация на биомасата в изпитваните култури и контролните проби заедно с концентрациите на изпитвания материал и времената на измерване, записани с разделителна способност най-малко час, за да се начертаят графики на кривите на растежа. На този първи етап може да са полезни както логаритмични, така и линейни скали, но логаритмичните скали са задължителни и в общия случай дават по-добро представяне на вариациите в модела на растежа по време на периода за изпитване. Да се има предвид, че експоненциалният растеж дава права линия, когато се начертае в логаритмична скала, и че ъгълът на наклона на линията (наклон) показва специфичната скорост на растеж.

45.

Като се използват графиките, се проверява дали контролните култури растат експоненциално с очакваната скорост през цялото изпитване. Внимателно се разглеждат всички точки с данни и видът на графиките и се проверяват необработените данни и процедурите за евентуални грешки. По-специално, проверяват се точките с данни, за които изглежда, че се отклоняват поради системна грешка. Ако е очевидно, че с голяма вероятност могат да се установят и/или предположат процедурни грешки, специфичната точка с данни се маркира като стойност, силно различаваща се от нормалните, и не се включва в последващия статистически анализ. (Нулева концентрация на водорасли в един от двата или трите съда с повторения може да показва, че съдът не е инокулиран правилно или не е бил почистен добре). Причините за отхвърлянето на точка с данни като стойност, силно различаваща се от нормалните, трябва да се формулират ясно в протокола от изпитването. За приемливи причини се смятат само (редки) грешки в процедурата, а не просто недостатъчно добра прецизност. Статистическите процедури за идентифициране на стойности, силно различаващи се от нормалните, имат ограничено използване за този тип проблем и не могат да заменят експертната преценка. Препоръчително е стойностите, силно различаващи се от нормалните (маркирани като такива), да се запазят между точките с данни, показани в последващите графични или таблични представяния на данни.

46.

Целта на изпитването е да се определят въздействията на изпитвания химикал върху растежа на водораслите. Настоящият метод за изпитване описва две зависими променливи, тъй като различните юрисдикции имат различни предпочитания и регулаторни нужди. За да се приемат резултатите от изпитването във всички държави членки, въздействията следва да се оценяват с използването и на двете зависими променливи a) и б), описани по-долу.

а)    Средна специфична скорост на растеж : тази зависима променлива се изчислява на базата на логаритмичното нарастване на биомасата през периода на изпитването, изразено за ден

б)    Добив : тази зависима променлива представлява биомасата в края на изпитването минус началната биомаса.

47.

Следва да се отбележи, че стойностите на токсичността, изчислени с помощта на тези две зависими променливи, не са сравними и тази разлика трябва да се разпознава, когато се използват резултатите от изпитването. Стойностите на ECx, базирани на средната специфична скорост на растеж (ErCx), по правило ще бъдат по-високи от резултатите, базирани на добива (EyCx), ако се придържате към условията за изпитване на настоящия метод за изпитване, което се дължи на математическата основа на съответните подходи. Това не трябва да се интерпретира като разлика в чувствителността между двете зависими променливи — стойностите просто са различни от математическа гледна точка. Понятието за средна специфична скорост на растеж се основава на общия модел на експоненциален растеж на водораслите в неограничени култури, където токсичността се оценява на базата на въздействията върху скоростта на растежа, без да зависи от абсолютното ниво на специфичната скорост на растеж на контролната проба, от наклона на кривата концентрация-отклик или от продължителността на изпитването. Противоположно на това, резултатите, базирани на зависимата променливата за добива, зависят от всички тези други променливи. EyCx зависи от специфичната скорост на растеж на вида водорасли, използвани във всяко от изпитванията, и от максималната специфична скорост на растеж, която може да варира между видовете и дори между различните щамове на водорасли. Тази зависима променлива не трябва да се използва за сравняване на чувствителността към токсични вещества между видовете водорасли или дори между различните щамове. Докато използването на средната специфична скорост на растеж за оценяване на токсичността е за предпочитане от научна гледна точка, оценките за токсичността, базирани на добива, също са включени в настоящия метод за изпитване, за да удовлетворят действащите регулаторни изисквания в някои държави.

48.

Средната специфична скорост на растеж за определен период се изчислява като логаритмичното нарастване на биомасата от уравнението за всеки отделен съд с контролни проби и третирани проби [1]:

където:

Изчислява се средната стойност за скоростта на растеж заедно с оценки на дисперсията за всяка група третирани проби и контролна група.

49.

Изчислява се средната специфична скорост на растеж в течение на целия период на изпитването (обикновено дни 0—3) с използване на номинално инокулираната биомаса като начална стойност, а не измерената начална стойност, защото по този начин обикновено се получава по-голяма прецизност. Ако оборудването, което се използва за измерване на биомасата, позволява достатъчно прецизно определяне на малката биомаса на инокулума (например поточен цитометър), тогава може да се използва измерената първоначална концентрация на биомаса. Освен това се оценява скоростта на растеж по сектори, изчислена като специфичните скорости на растеж за всеки ден по време на изпитването (дни 0 — 1, 1 — 2 и 2 — 3), и се проверява дали скоростта на растеж на контролната проба остава постоянна (вж. критериите за валидност, точка 11). Значително по-ниската специфична скорост на растеж в първия ден в сравнение с общата средна специфична скорост на растеж може да е показател за латентна фаза. Докато латентната фаза може да се сведе до минимум и практически да се елиминира в контролните култури чрез правилното размножаване на предварителна култура, латентната фаза в експонираната култура може да е индикатор за възстановяване след първоначален токсичен стрес или намалена експозиция поради загуба на изпитван химикал (включително сорбция върху биомасата на водораслите) след първоначалната експозиция. От тук следва, че скоростта на растеж по сектори може да се оцени, за да се направи оценка на въздействията на изпитвания химикал, които възникват при процеса на експозиция. Значителните различия между скоростта на растеж по сектори и средната скорост на растеж показват, че има отклонение от постоянния експоненциален растеж, както и основание за внимателна проверка на кривите на растежа.

50.

Процентното потискане на скоростта на растежа за всяка третирана повторна проба се изчислява от уравнението [2]:

където:

51.

Когато за приготвянето на изпитваните разтвори се използват разтворители, за изчисляването на процентното потискане следва да се използват контролните проби на разтворителите, а не контролните проби без разтворители.

52.

Добивът се изчислява като биомасата в края на изпитването минус началната биомаса за всеки отделен съд с контролни проби и с третирани проби. За всяка изпитвана концентрация и контрола се изчислява средната стойност на добива, заедно с оценките на дисперсията. Процентното потискане на добива (% Iy) може да се изчисли за всяко третирано повторение, както следва:

където:

53.

Нанася се процентът на потискане като функция на логаритъма на концентрацията на изпитвания химикал и внимателно се проверява графиката, като не се отчитат точките с данни, които са отхвърлени в първата фаза като стойности, силно различаващи се от нормалните. Прекарарва се гладка линия през точките с данни на око или чрез компютърна интерполация, за да се получи първо впечатление за съотношението концентрация-отклик, а след това се продължава, като се прилага по-подробен метод, за предпочитане компютризиран статистически метод. В зависимост от предназначението на данните; качеството (прецизността) и количеството на данните, както и наличието на инструменти за анализ на данни, може да се реши (и понякога е добре обосновано) на този етап анализът на данните да се прекрати и просто да се отчетат ключовите величини EC50 и EC10 (и/или EC20) от нанесената на око крива (вж. също раздела по-долу относно стимулиращите въздействия). Обоснованите причини да не се използва статистически метод може да включват:

54.

Целта е да се получи количествено съотношение концентрация-отклик чрез регресионен анализ. Може да се използва претеглена линейна регресия след извършване на линеаризираща трансформация на данните от отклика — например в пробит, или логит, или Вейбул единици (8), но предпочитаните процедури са тези на нелинейната регресия, които по-добре обработват неизбежните неравномерности и отклонения от гладките разпределения. При приближаване на нула или пълно инхибиране подобни неравномерности може да бъдат увеличени от трансформацията, като по този начин пречат на анализа (8). Следва да се отбележи, че стандартните методи на анализ с помощта на пробит, логит или Вейбул трансформации са предназначени за използване при двоични данни (например смъртност или преживяване) и трябва да бъдат изменени, за да се приспособят към данните за растежа или биомасата. Специфични процедури за определяне на стойности на ECx от непрекъснати данни могат да се намерят в (9), (10) и (11). Използването на нелинеен регресионен анализ е допълнително описано в допълнение 5.

55.

За анализа на всяка от зависимите променливи се използва съотношението концентрация-отклик, за да се изчислят точковите оценки на стойностите на ECx. По възможност трябва да се определят 95 % доверителни граници за всяка от оценките. Съгласието на данните от отклика с регресионния модел следва да се оцени графично или статистически. Регресионният анализ трябва да се извърши, като се използват отклиците при индивидуалните повторения, а не средните стойности за групите от третирани проби. Ако обаче изглаждането на нелинейната крива е трудно или несполучливо поради твърде голямото разсейване в данните, проблемът може да се заобиколи чрез извършване на регресия върху груповите средни стойности като практичен начин за намаляване на влиянието на предполагаемите стойности, силно различаващи се от нормалните. Използването на тази възможност следва да се отбележи в протокола от изпитването като отклонение от нормалната процедура, тъй като изглаждането на кривата с индивидуални повторения не е дало добър резултат.

56.

Оценките на EC50 и доверителните граници могат да се получат също и чрез използване на линейна интерполация с boostrap процедура (13), ако наличните регресионни модели/методи са неподходящи за данните.

57.

За оценяването на LOEC, и следователно на NOEC, и за въздействието на изпитвания химикал върху скоростта на растеж е необходимо да се сравнят средните стойности на третираните проби като се използват техниките на дисперсионния анализ (ANOVA). Средната стойност за всяка концентрация след това трябва да се сравни със средната стойност на контролна проба с помощта на съответния метод за множествени сравнения или трендов тест. Тестовете на Дънет или на Уйлямс могат да бъдат от полза (12)(14)(15)(16)(17). Необходимо е да се оцени дали е удовлетворено допускането при ANOVA за хомогенност на дисперсията. Тази оценка може да се извърши графично или чрез формален тест (17). Подходящи са тестовете на Левин или на Бартлет. Невъзможността за удовлетворяване на допускането за хомогенност на дисперсиите понякога може да се коригира чрез логаритмична трансформация на данните. Ако хетерогенността на дисперсията е екстремална и не може да се коригира чрез трансформация, следва да се обмисли анализ с методи като теста на Йонкхере за определяне на тренд със стъпка назад. Допълнителни насоки относно определянето на NOEC могат да се намерят в (11).

58.

В най-новите научни разработки е дадена препоръка концепцията за NOEC да бъде изоставена и заменена с базирани на регресия точкови оценки на ECx. Не е установена подходящата стойност на x за това изпитване на водорасли. Изглежда, че диапазонът от 10 до 20 % е подходящ (в зависимост от избраната зависима променлива) и се предпочита да бъде отчетена както EC10, така и EC20.

59.

Понякога се наблюдава стимулиране на растежа (отрицателно потискане) при ниски концентрации. Това може да е резултат от хормезис („токсична стимулация“) или от добавянето на стимулиращи растежа фактори с изпитвания материал към използваната минимална среда. Да се има предвид, че добавянето на неорганични хранителни вещества не би трябвало да има пряко въздействие, защото изпитваната среда следва да поддържа излишък от хранителни вещества през цялото време на изпитването. Обикновено стимулацията при ниска доза може да се пренебрегне при изчисляването на EC50, освен ако не е екстремална. При все това, ако е екстремална или ако трябва да се изчисли стойността на ECx за ниско x, може да са необходими специални процедури. Ако е възможно, от анализа на данните следва да се избягва изключване на отклици, показващи стимулация, а ако наличният софтуер за изглаждане на криви не може да приеме незначителна стимулация, може да се използва линейна интерполация с boostrap процедура. Ако стимулацията е екстремална, може да се обмисли използване на модел с хормезис (18).

60.

Поглъщащите светлина изпитвани материали могат да предизвикат намаляване на скоростта на растежа, тъй като засенчването намалява количеството налична светлина. Такива въздействия от физическо естество следва да бъдат отделени от токсичните въздействия чрез изменение на условията на изпитването, като въздействията от физическо естество следва да се отчитат отделно. Насоки могат да се намерят в (2) и (3).

61.

В протокола от изпитването се включва следното:

(1)

International Organisation for Standardisation (1993). ISO 8692 Water quality — Algal growth inhibition test.

(2)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO/DIS 14442. Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(4)

International Organisation for Standardisation (1998). ISO 5667-16 Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.

(5)

Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531.

(6)

Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925

(7)

Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.

(8)

Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.

(9)

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.

(10)

Bruce, R.D.,and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.

(11)

ОИСР проект (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.

(12)

Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121

(13)

Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.

(14)

Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.

(15)

Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.

(16)

Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.

(17)

Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition. Wiley, New York.

(18)

Brain, P. and Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

1.

Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 209 (2010). Настоящият метод за изпитване описва начин за определяне на въздействието на даден химикал върху микроорганизми от активна утайка (предимно бактерии) чрез измерване на тяхната скорост на дишане (окисляване на въглерод и/или амониеви йони) при определени условия в присъствие на различни концентрации на изпитвания химикал. Този метод за изпитване се базира на изпитването на ETAD (Асоциация в областта на екологията и токсикологията на отрасъла за производство на багрила) (1) (2), на предходните насоки на ОИСР TG 209 (3), както и на преработения стандарт ISO 8192 (4). Целта на това изпитване е да се осигури метод за бърз скрининг за оценка на въздействията от химикали върху микроорганизмите в активната утайка от биологичната (аеробна) фаза в пречиствателни станции за отпадъчни води. Резултатите от изпитването могат да служат също като показател за подходящи непотискащи концентрации на изпитваните химикали, които да се използват при изпитвания за биоразградимост (например глави В.4 А—Е, В.9, В.10, В.12 и В.29 от настоящото приложение, ОИСР TG 302C). В този случай изпитването може да се проведе като скринингов тест, сходен с изпитванията за определяне на обхвата дефинитивното или с граничните изпитвания (вж. точка 39), като се има предвид само общото дишане. Тази информация обаче следва да се приема с необходимото внимание за изпитванията за пълна биоразградимост (глави В.4 А—Е и В.29 от настоящото приложение), за които концентрацията на инокулума е значително по-ниска от използваната в настоящия метод за изпитване. Всъщност в резултат от липсата на потискане в настоящото изпитване на дишането не се стига автоматично до условия на липса на потискане в изпитванията за пълна биоразградимост от глави В.4 А—Е или В.29 от настоящото приложение.

2.

Изпитването за потискане на дишането като цяло изглежда е прилагано успешно, откакто е публикувано за първи път, но в някои случаи са протоколирани недостоверни резултати, напр. (2) (4) (5). Кривите на връзката между концентрацията и дишането понякога са двуфазни, графиките на зависимостта доза-отклик са били изкривени и стойностите на EC50 са били неочаквано ниски (5). Чрез проучвания беше показано, че тези резултати са получени, когато използваната при изпитването активна утайка претърпява значителна нитрификация и изпитваният химикал оказва по-голямо въздействие върху окисляването на амониевите йони, отколкото върху общото хетеротрофно окисляване. Следователно тези недостоверни резултати могат да бъдат избегнати чрез провеждането на допълнително изпитване, като се използва специален инхибитор на нитрификацията. Чрез измерване на скоростта на усвояване на кислорода при наличие и в отсъствие на такъв инхибитор, напр. N-алилтиоуреа (ATU), могат да бъдат изчислени поотделно общата скорост на усвояване на кислород и скоростта на усвояване на кислород при хетеротрофното окисление и при нитрификацията (4) (7) (8). Така може по обичайния начин да бъде определено потискащото въздействие на изпитвания химикал върху двата процеса и да се изчислят стойностите на EC50 както за окисляването на органичния въглерод (хетеротрофно окисляване), така и за окисляването на амониевите йони (нитрификацията). Следва да се отбележи, че в някои редки случаи потискащият ефект на N-алилтиоуреа може да бъде частично или напълно премахнат в резултат на образуване на комплексни съединения с изпитвани химикали или добавки в средата, например Cu++ йони (6). Cu++ йоните са от съществено значение за Nitrosomonas, но са токсични в по-висока концентрация.

3.

Необходимостта от нитрификация в аеробното пречистване на отпадъчни води, като необходима стъпка в процеса на отстраняването на азотните съединения от отпадъчните води посредством денитрификация чрез газообразни продукти, е спешно необходима, особено в европейските страни; Понастоящем ЕС е определил по-ниски гранични стойности на концентрацията на азот в пречистените отпадъчни води, зауствани в приемниците (5).

4.

За повечето цели методът за оценка на въздействието върху процесите на окисляване на органичен въглерод сам по себе си е достатъчен. Въпреки това, в някои случаи изследването на въздействието само върху нитрификацията, или поотделно както върху нитрификацията, така и върху и органичния въглерод, е необходимо за тълкуването на резултатите и за разбирането на въздействията.

5.

Скоростта на дишане на проби от активна утайка, захранена със синтетични отпадъчни води, се измерва в затворена камера, съдържаща кислороден електрод след време за контакт от 3 часа. При разглеждане на реалистичния сценарий на експозиция може да бъде подходящо по-продължително време за контакт. Ако изпитваният химикал се разгражда бързо, например абиотично чрез хидролиза, или ако е летлив и концентрацията не може да се поддържа по адекватен начин, може да се използва в допълнение по-кратък период на експозиция, например 30 минути. Чувствителността на всяка партида активна утайка трябва да се проверява с подходящ референтен химикал в деня на експозицията. Изпитването обикновено се използва за определяне на ECx (например EC50) на изпитвания химикал и/или за концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC).

6.

Потискането на усвояването на кислород от микроорганизмите, окисляващи органичен въглерод, може да бъде изразено отделно от това на микроорганизмите, окисляващи амониеви йони, чрез измерване на усвояването на кислород в отсъствие и при наличие на N-алилтиоуреа, специфичен инхибитор на окисляването на амониевия йон до нитрит от нитрифициращите бактерии от първата фаза. В този случай процентът на потискане на скоростта на усвояване на кислород се изчислява чрез сравняване на скоростта на усвояване на кислород в присъствието на изпитван химикал със средната скорост на усвояване на кислород на съответните контроли, които не съдържат изпитван химикал, както в присъствие, така и при отсъствие на специфичния инхибитор, N-алилтиоуреа.

7.

Всяко усвояване на кислород, произтичащо от абиотични процеси, може да бъде открито чрез определяне на скоростта в смеси от изпитван химикал, среда от синтетични отпадъчни води и вода, без активна утайка.

8.

Необходимо е да са известни идентичността (за предпочитане CAS номерът), наименованието (по IUPAC), чистотата, водоразтворимостта, парното налягане, летливостта и адсорбционните характеристики на изпитвания химикал, за да е възможно да се извърши правилно тълкуване на резултатите. По принцип летливите химикали не могат да бъдат адекватно изпитвани, освен ако не са взети специални предпазни мерки (вж. точка 21).

9.

Методът за изпитване може да се прилага за разтворими във вода, малко разтворими и летливи химикали. Не винаги обаче е възможно да се получат стойности на EC50 при химикали с ограничена разтворимост, а валидни резултати при летливи химикали могат да бъдат получени само при условие че по-голямата част (например > 80 %) от изпитвания химикал остава в реакционната смес в края на периода(ите) на експозиция. Допълнителни подкрепящи аналитични данни следва да бъдат представени за по-точно определяне на концентрацията за ECx, когато съществува каквато и да е несигурност по отношение на стабилността или летливостта на изпитвания химикал.

10.

Референтните химикали следва да се изпитват периодично, за да се гарантира, че методът за изпитване и условията на изпитване са надеждни, и за да се провери чувствителността на всяка партида активна утайка, използвана като микробен инокулум в деня на експозицията. Химикалът 3,5-дихлорофенол (3,5-DCP) се препоръчва като референтен инхибиращ химикал, тъй като е познат инхибитор на дишането и се използва в много видове изпитвания за потискане/токсичност (4). Също така като референтен химикал за потискане на общо дишане може да се използва меден(II) сулфат пентахидрат (9). Като специфичен референтен инхибитор на нитрификацията може да бъде използван N-метиланилин (4).

11.

Стойността на скоростта на усвояване на кислород при празните контролни проби (без изпитван химикал или референтен химикал) следва да бъде не по-малко от 20 mg кислород на един грам активна утайка (сухо тегло на суспендираните твърди вещества) за един час. Ако скоростта е по-ниска, изпитването трябва да се повтори с промита активна утайка или с утайка от друг източник. Коефициентът на вариация на скоростта на усвояване на кислород в контролните повторения не трябва да бъде повече от 30 % в края на окончателното изпитване.

12.

През 2004 г. в международно кръгово изпитване, организирано от ISO (4), с използване на активна утайка, получена от битови отпадъчни води, е било установено, че стойността на EC50 на 3,5-DCP е в диапазон от 2 mg/l до 25 mg/l за общото дишане, от 5 mg/l до 40 mg/l за хетеротрофното дишане и от 0,1 mg/l до 10 mg/l за дишането, дължащо се на нитрификация. Ако стойността на EC50 на 3,5-DCP не попада в очаквания диапазон, изпитването трябва да се повтори с активна утайка от друг източник. Стойността на EC50 на меден(II) сулфат пентахидрат трябва да се намира в диапазона 53 — 155 mg/l за общото дишане (9).

13.

Следва да се използва стандартно лабораторно оборудване, както и следното:

14.

През цялото време се използват реактиви с квалификация „чист“.

15.

Следва да се използва дестилирана или дейонизирана вода, със съдържание РОВ под 1 mg/l, освен в случаите, когато е посочена чешмяна вода без хлор.

16.

Средата трябва да бъде изготвена така, че да съдържа следните съставки в посочените количества:

17.

Стойността на рН на разтвора следва да бъде 7,5 ± 0,5. Ако приготвената среда не се използва веднага, тя се съхранява на тъмно при температура от 0 °C до 4 °C не по-дълго от 1 седмица, или при условия, които не водят до промяна в нейния състав. Следва да се отбележи, че тази синтетична отпадъчна вода представлява 100-кратен концентрат на посочената в Техническия доклад на ОИСР от 11 юни 1976 г.„Предложение за метод за определяне на биоразградимост на повърхностноактивни вещества, използвани в синтетичните детергенти“, към който е добавен дикалиев хидрогенфосфат.

18.

Като алтернатива, преди съхранението компоненти на средата могат да бъдат стерилизирани индивидуално, или пептонът и месният екстракт могат да бъдат добавени малко преди провеждането на изпитването. Преди употреба, средата трябва да бъде старателно разбъркана и pH следва да бъде коригирано, ако е необходимо, до pH 7,5 ± 0,5.

19.

Изходен разтвор се приготвя за много разтворимите във вода изпитвани вещества до максималната им разтворимост във вода (не се допуска утаяване). Малко разтворимите във вода вещества, смесите с компоненти с различна разтворимост във вода и адсорбиращите се вещества следва пряко да се претеглят в съдовете за изпитване. В тези случаи използването на изходни разтвори може да бъде алтернатива, ако концентрациите на разтворените изпитвани химикали са аналитично определени в съдовете за изпитване (преди добавянето на активната утайка). Ако се изготвя водна фаза, съдържаща фракция от компоненти на смеси в разтвор, диспергирани или като емулсии (WAF), от съществено значение е и аналитичното определяне на концентрациите на разтворените изпитвани химикали в съдовете за изпитване. Използването на органични разтворители, диспергиращи добавки или емулгатори за подобряване на разтворимостта следва да се избягва. Ултрасонификацията на изходни разтвори и предварителното разбъркване на суспензии, напр. през нощта, е възможно, когато има подходяща налична информация относно стабилността на изпитвания химикал при такива условия.

20.

Изпитваният химикал може да повлияе неблагоприятно върху pH в системата за изпитване. Стойността на рН на смесите, третирани с изпитвания химикал, следва да се определи при предварително изпитване преди опитната установка, за да се провери дали ще е необходима корекция на pH преди основното изпитване, и отново в деня на основното изпитване. Ако е необходимо, разтворите/суспензиите на изпитвания химикал във вода трябва да бъдат неутрализирани преди добавяне на инокулум. Обаче, тъй като при неутрализацията е възможно изменение на химичните свойства на химикала, могат да се извършат допълнителни изпитвания, в зависимост от целите на изследването, за да се оцени въздействието на изпитвания химикал върху утайката без коригиране на рН.

21.

Токсичните ефекти на летливи химикали, особено при изпитвания, при които през системата преминава въздух чрез барботиране, могат да доведат до вариране в равнищата на въздействие, настъпващо вследствие на загубите на вещество по време на периода на експозиция. С такива вещества трябва да се действа предпазливо, чрез извършване на анализ, специфичен за веществата в контролните смеси, съдържащи веществото, и чрез изменение на режима на аериране.

22.

Ако като референтен химикал се използва 3,5-дихлорофенол, следва да бъде изготвен разтвор на 1,00 g 3,5-дихлорофенол в 1 000 ml вода (15). Следва да се използва топла вода и/или ултрасонификация за ускоряване на разтварянето и за допълване на разтвора до пълния обем след охлаждането му до стайна температура. Следва обаче да се гарантира, че референтният химикал не е претърпял структурни промени. Стойността на рН на разтвора следва да бъде проверена и, ако е необходимо, коригирана до pH 7 — 8 с NaOH или H2SO4.

23.

Ако се използва меден(II) сулфат пентахидрат като референтен химикал, се използват концентрации от 58 mg/l, 100 mg/l и 180 mg/l (коефициент 1,8). Веществото се претегля директно в съдовете за изпитване (29 — 50 — 90 mg за 500 ml общ обем). След това то се разтваря с 234 ml автоклавирана чешмяна вода. Медният(II) сулфат пентахидрат е много разтворим. При започване на изпитването се добавят 16 ml синтетична отпадъчна вода и 250 ml активна утайка.

24.

Следва да се изготви изходен разтвор от 2,32 g/l N-алилтиоуреа (ATU). Добавянето на 2,5 ml от този изходен разтвор в инкубационна смес с окончателен обем от 500 ml води до получаването на крайна концентрация от 11,6 mg ATU/l (10– 4 mol/l), за която е известно, че е достатъчна (4) да предизвика 100 % потискане на нитрификацията в нитрифицираща активна утайка, съдържаща 1,5 g/l суспендирани твърди вещества.

25.

При някои редки условия изпитван химикал, който е силен редуктор, може да доведе до измерима абиотична консумация на кислород. В такива случаи са необходими абиотични контроли, за да се направи разграничаване между абиотично усвояване на кислород, причинено от изпитвания химикал, и микробното дишане. Абиотичните контроли могат да бъдат приготвени като не се поставя инокулум в изпитваните смеси. По подобен начин могат да бъдат включени абиотични контроли без инокулум, когато се извършват подкрепящи аналитични измервания за определяне на постигнатата концентрация по време на фазата на експозиция на изпитването, например когато се използват изходни разтвори на малко разтворими във вода химикали с компоненти с различна разтворимост във вода. В определени случаи може да е необходимо да се подготви абиотична контрола със стерилизиран инокулум (напр. чрез автоклавиране или добавяне на стерилизиращи токсични вещества). Някои химикали могат да доведат до реакция на освобождаване или свързване на кислород само ако съответната площ е достатъчно голяма за тази реакция, дори ако по принцип за тях е нужна много по-висока температура или налягане за такава реакция. В тази връзка специално внимание следва да се обърне на пероксидите. Стерилизираният инокулум предоставя голяма площ.

26.

За обща употреба активната утайка следва да бъде събрана на изхода от резервоара за аериране или близо до изхода от резервоара, в добре експлоатирана пречиствателна станция за отпадъчни води, получаваща предимно битови отпадъчни води. В зависимост от целта на изпитването, други подходящи видове или източници на активна утайка, например утайки, отглеждани в лабораторни условия, могат също така да бъдат използвани при подходящи концентрации на суспендирани твърди вещества от 2 g/l до 4 g/l. Съществува обаче вероятност утайките от различните пречиствателни станции да притежават различни характеристики и чувствителност.

27.

Утайката може да се използва във вида, в който е събрана, но грубите частици трябва да бъдат отстранени чрез краткотрайно утаяване, например за 5 до 15 минути, и отливане на горния слой по-фини твърди частици, или пресяване (напр. с размер на отворите 1 mm2). Като алтернатива утайката може да бъде хомогенизирана с помощта на хомогенизатор за около 15 секунди или по-дълго, но е необходима предпазливост по отношение на силите на разкъсване и температурните промени, които могат да настъпят при периоди на хомогенизиране.

28.

Често е необходимо измиване на утайката, напр. ако собствената скорост на дишането е ниска. Утайката следва първо да се центрофугира определен период от време за получаване на бистър супернатант и гранули от твърди вещества от утайката, например 10 минути при около 10 000 m/s2. Супернатантната течност трябва да бъде изхвърлена, а утайката се ресуспендира в чешмяна вода без съдържание на хлор, с разклащане, след което се отстранява водата за отмиването чрез повторно центрофугиране и изхвърляне. Ако е необходимо, процесът на измиване и центрофугиране трябва да се повтори. Трябва да се определи сухата маса на предварително известен обем от ресуспендираната утайка и утайката следва да се концентрира чрез отстраняване на течност или да се разреди допълнително в чешмяна вода без съдържание на хлор до получаване на необходимата концентрация от 3 g/l твърди вещества в утайката. Активната утайка трябва непрекъснато да се аерира (напр. 2 l/минута) при температурата на изпитването и по възможност да се използва в деня на събирането. Ако това не е възможно, утайката трябва да се захранва ежедневно със синтетични отпадъчни води (50 ml синтетични отпадъчни води на един литър активна утайка) в продължение на два допълнителни дни. След това утайката се използва за целите на изпитването и резултатите се приемат за валидни, при условие че не е настъпила съществена промяна в нейната активност, оценена чрез нейните ендогенни скорости на хетеротрофно дишане и на дишане, дължащо се на нитрификация.

29.

Могат да възникнат трудности, ако се образува пяна по време на инкубацията, доколкото пяната и поетите от нея твърди вещества от утайката се отстраняват от съдовете за аериране. В редки случаи образуването на пяна може просто да е резултат от наличието на синтетични отпадъчни води, но образуването на пяна трябва да се очаква, ако изпитваният химикал представлява повърхностноактивно средство или съдържа такова. Загубата на твърди вещества от утайката от изпитваните смеси води до изкуствено занижаване на скоростта на дишане, което може да бъде изтълкувано погрешно като резултат от инхибиране. В допълнение, аерирането на разтвор на повърхностноактивно средство концентрира повърхностноактивното средство в слоя от пяна; загубата на пяна в изпитвателната система понижава концентрациите на експозиция. Образуването на пяна може да бъде контролирано чрез прости механични методи (напр. спорадично ръчно разбъркване със стъклена пръчка) или чрез добавяне на силиконова антипенителна емулсия, която не съдържа повърхностноактивни средства, и/или чрез метод на аериране чрез разклащане в стъкленица. Ако проблемът е свързан с наличието на синтетични отпадъчни води, съставът на отпадъчните води следва да бъде изменен, като се включи реактив антипенител, например при 50 μl/l. Ако пяната се образува от изпитвания химикал, количеството, необходимо за намаляването, следва да се определя при максималната концентрация на изпитването, и след това всички отделни съдове за аериране следва да бъдат третирани по еднакъв начин (включително тези, в които отсъства пяна, като напр. празните контролни проби и референтните съдове). Ако се използват антипенители, те следва да не взаимодействат с инокуланта и/или изпитвания химикал.

30.

Могат да бъдат определени три различни вида подтискане на усвояването на кислород — общо, само хетеротрофно и дължащо се на нитрификация. Обикновено измерването на потискането на общото усвояване на кислород следва да е достатъчно. Въздействието върху хетеротрофното усвояване на кислород от окисляването на органичния въглерод и това, дължащо се на окисляването на амониевите йони, са необходими, когато съществува специално изискване за тези две отделни крайни точки за даден химикал, или (като вариант) за обясняване на нетипични криви доза-отклик, получени за общото усвояване на кислород.

31.

Изпитването трябва да се извършва при температура в диапазон 20 ± 2 °C.

32.

Смесите за изпитване (FT като в таблица 1), съдържащи вода, синтетични отпадъчни води и изпитвания химикал, следва да бъдат приготвени по такъв начин, че да се получат различни номинални концентрации на изпитвания химикал (вж. таблица 1 за пример с обеми на съставните части). Стойността на pH трябва да се коригира до 7,5 ± 0,5, ако е необходимо; смесите следва да се разредят с вода и да се добави инокулумът за получаване на равни окончателни обеми в съдовете и за започване на аерирането.

33.

Смесите (FR) следва да се изготвят с референтния химикал, например 3,5-дихлорофенол, на мястото на изпитвания химикал, по същия начин, както и изпитваните смеси.

34.

Празни контролни проби (FB) следва да се изготвят в началото и в края на периода на експозиция при изпитвания, в които изпитвателните бехерови чаши се подават последователно на интервали. При изпитванията, извършвани с оборудване, което позволява едновременното измерване на потреблението на кислород, във всяка партида, подлагана на едновременен анализ, следва да бъдат включени най-малко две празни контролни проби. Празните контроли съдържат еднакъв обем активна утайка и синтетична среда, но не съдържат нито изпитван, нито референтен химикал. Те трябва да се разредят с вода до същия обем като изпитваните и референтните смеси.

35.

Ако е необходимо, например ако за даден изпитван химикал се знае или се предполага, че е силен редуктор, трябва да се изготви смес FA за измерване на абиотичното потребление на кислород. Сместа трябва да съдържа същите количества изпитван химикал и синтетични отпадъчни води и да е със същия обем като изпитваните смеси, но да е без активна утайка.

36.

Изпитваните и референтните смеси, и празните и абиотичните контроли се инкубират при температурата на изпитването в условията на принудително аериране (от 0,5 до 1 l/min), за да се запази концентрацията на разтворения кислород над 60-70 % насищане и парчетата утайка да се поддържат в суспензия. За да се поддържат в суспензия парчетата утайка е необходимо също така и разбъркване на културите. За започване на инкубацията се счита първоначалният контакт на инокулума от активна утайка с другите съставки на крайната смес. В края на инкубацията, след определените периоди на експозицията, обичайно равни на 3 часа, пробите се изваждат за измерване на скоростта на намаляване на концентрацията на разтворения кислород в камерата, предназначена за тази цел (фигура 2 от допълнение 3) или в изцяло запълнена бутилка за БПК. Начинът, по който започват инкубациите, зависи също така и от капацитета на оборудването, което се използва за измерване на скоростта на потреблението на кислород. Например, ако то включва само един кислороден електрод, измерванията се извършват индивидуално. В този случай следва да бъдат изготвени различните смеси, необходими за изпитването в синтетични отпадъчни води, но инокулумът следва да бъде задържан и необходимите части от утайката трябва да се добавят към всеки от поредицата съдове. Всяка инкубация трябва да бъде започната поотделно, на подходящо избрани интервали от време, например от 10 до 15 минути. Като алтернатива, измервателната система може да се състои от няколко електрода, които улесняват множество едновременни измервания; в този случай инокулумът може да се добави по едно и също време в съответните групи съдове.

37.

Номиналната концентрация на активната утайка във всички изпитвани, контролни и празни проби със смеси (но не и в абиотичните контроли) е 1,5 g/l суспендирани твърди вещества. Потреблението на кислород следва да се измерва след 3-часова експозиция. Измервания с допълнителна 30-минутна експозиция следва да се извършат при необходимост и както е описано в параграф 5.

38.

За да се реши дали утайката нитрифицира и, ако нитрифицира — с каква скорост, следва да бъдат изготвени смеси (FB) като тази в празната контролна проба, и допълнителни „контролни“ смеси (FN), но които съдържат също така и 11,6 mg/l N-алилтиоуреа. Смесите следва да се аерират и инкубират при 20 ° ± 2 °C за 3 часа. След това се измерват стойностите на скоростта на усвояване на кислород и се изчислява скоростта на усвояване на кислород, дължащо се на нитрификация.

39.

Когато е необходимо, се използва предварително изпитване, за да се оцени диапазонът на концентрациите на изпитвания химикал, необходим за окончателно изпитване за определяне на потискането на потреблението на кислород. Като алтернатива, липсата на потискане на потреблението на кислород от изпитвания химикал при предварителни изпитвания може да покаже, че окончателно изпитване не е необходимо, но следва да бъде включено трикратно повторение на предварителното изпитване при най-високата изпитвана концентрация (обикновено 1 000 mg/l, но в зависимост от изискването за данни).

Таблица 1

Примери за смеси за предварителното изпитване

40.

Изпитването следва да се извършва с използване най-малко на три концентрации на изпитвания химикал, например 10 mg/l, 100 mg/l и 1 000 mg/l с празна контролна проба и, ако е необходимо, най-малко три абиотични контроли с най-високите концентрации на изпитвания химикал (вж. като пример Таблица 1). В идеалния случай най-ниската концентрация следва да не оказва въздействие върху потреблението на кислород. Ако е относимо, следва да се изчислят скоростите на усвояването на кислород и скоростта на нитрификацията; след това следва да се изчисли процентът на потискане. В зависимост от целта на изпитването, също така е възможно просто да се определи токсичността при пределна концентрация, например 1 000 mg/l. Ако не се наблюдава статистически значим токсичен ефект при тази концентрация, не е необходимо по-нататъшно изпитване при по-високи или по-ниски концентрации. Следва да се отбележи, че малко разтворимите във вода вещества, смесите с компоненти с различна разтворимост във вода и адсорбиращите се вещества следва да се претеглят директно в съдовете за изпитване. В този случай обемът, запазен за изходния разтвор на изпитваното вещество, следва да бъде заменен с вода за разреждане.

41.

Изпитването следва да се извършва с използване на диапазон от концентрации, получен въз основа на предварителното изпитване. С цел да се получи както NOEC, така и ECx (напр. EC50), в повечето случаи се препоръчват шест контроли и пет концентрации на третиране в геометрична прогресия, с пет повторения. За абиотичната контрола не е необходимо повторение, ако не е установено усвояване на кислород при предварителното изпитване, но ако се установи значително усвояване, трябва да бъдат включени абиотични контроли за всяка концентрация на изпитвания химикал. Чувствителността на утайката трябва да се провери, като се използва референтен химикал 3,5-дихлорофенол. Тъй като е известно, че чувствителността варира, чувствителността на утайката трябва да бъде проверявана за всяка поредица от изпитвания. Във всички случаи, пробите се изваждат от съдовете за изпитване след 3 часа и допълнително след още 30 минути, ако е необходимо, за измерване на скоростта на усвояване на кислород в камерата с кислороден електрод. От събраните данни се изчисляват конкретните скорости на дишането за контролните и изпитваните смеси; след това процентът на потискане се изчислява по уравнение 7 по-долу.

42.

Използването на специфичен инхибитор на нитрификацията, ATU, дава възможност за пряка оценка на потискащото въздействие на изпитвани химикали върху хетеротрофното окисляване, и въздействието върху скоростта на дишането, дължащо се на нитрификация, може да бъде изчислено чрез изваждане на скоростта на усвояването на кислород в присъствието на ATU от общата скорост на усвояването (при отсъствие на ATU). В съответствие с планирането на изпитванията за ECx или NOEC, описано в точка 41, следва да се изготвят два набора от реакционни смеси, но в допълнение следва да се добави ATU към всяка смес от даден набор в крайна концентрация от 11,6 mg/l, за която има данни, че потиска напълно нитрификацията в утайка със суспендирани твърди вещества в концентрации до 3 000 mg/l (4). Скоростите на усвояването на кислород следва да се измерват след периода на експозиция; тези директни стойности представляват само хетеротрофното дишане, а различията между тях и съответните общи скорости на дишането представляват нитрификацията. След това се изчисляват различните степени на потискане.

43.

След периода(ите) на експозиция проба от първия съд за аериране следва да бъде прехвърлена в камерата с кислороден електрод (фигура 1 от допълнение 2) и незабавно следва да бъде измерена концентрацията на разтворения кислород. Ако на разположение има система с множество електроди, могат да се извършат едновременни измервания. От съществено значение е разбъркването (посредством магнит с покритие) да е със същата скорост, както при калибрирането на електрода, за да се гарантира, че електродът отговаря с минимално забавяне на променящите се концентрации на кислород, и да се осигури възможност за регулярни и възпроизводими измервания на кислорода в съда за измерване. Обикновено системата от няколко саморазбъркващи се кислородни електроди е достатъчна. Камерата трябва да се изплаква с вода между измерванията. Като алтернатива, пробата може да се използва за запълване на бутилка за БПК (фигура 2 от допълнение 3), снабдена с магнитна бъркалка. След това в гърлото на бутилката се вкарва кислороден електрод с адаптираща се втулка и се стартира магнитната бъркалка. И в двата случая концентрацията на разтворения кислород следва да се измерва и записва непрекъснато през даден период, обикновено от 5 до 10 минути, или докато концентрацията на кислорода падне под 2 mg/l. Електродът се отстранява, сместа се връща в съда за аериране и се продължава с аерирането и разбъркването, ако е необходимо измерване след по-дълги периоди на експозиция.

44.

За някои цели може да е необходимо да се измери концентрацията на изпитвания химикал в съдовете за изпитване. Следва да се отбележи, че ако се използват изходни разтвори на:

разтворената фракция е неизвестна, и действителната концентрация на изпитвания химикал, прехвърлян в съдовете за изпитване, не е известна. За характеризиране на експозицията е необходима аналитична оценка на концентрациите на изпитвания химикал в съдовете за изпитване. С цел опростяване, аналитичната оценка следва да се извършва преди добавянето на инокулума. Поради факта, че само разтворените фракции ще бъдат прехвърлени в съдове за изпитване, измерените концентрации могат да бъдат много ниски.

45.

За да се избегнат отнемащи време и скъпоструващи анализи, препоръчва се изпитваният химикал да се претегля директно в съдовете за изпитване и при последващите изчисления да се прави позоваване на първоначалната претеглена номинална концентрация. Не е необходимо разграничаване между разтворени, неразтворени или адсорбирани фракции на изпитвания химикал, тъй като всички тези фракции съществуват и в реални условия в една пречиствателна станция за отпадъчни води, като тези фракции могат да варират в зависимост от състава на отпадъчните води. Целта на настоящия метод за изпитване е да се направи реалистична оценка за концентрацията, при която не се наблюдава подтискане, и той не е подходящ за проучване кои фракции допринасят за подтискане на организмите в активната утайка. Накрая, адсорбиращите се вещества също следва да се претеглят директно в съдовете за изпитване; и съдовете следва да бъдат силанизирани с цел да се сведат до минимум загубите чрез адсорбция.

46.

Скоростите на усвояването на кислород следва да се изчисляват на базата на средноаритметичната стойност от измерените стойности, напр. от линейната част на графиките на концентрацията на кислород в зависимост от времето, като изчисленията се ограничават за концентрации на кислород между 2,0 mg/l и 7,0 mg/l, тъй като по-високите и по-ниските концентрации могат сами по себе си да повлияят скоростта на потребление. Преминаването в области от концентрации под или над тези стойности понякога е неизбежно и необходимо, например, когато дишането е силно потиснато и следователно е много бавно, или ако дишането на дадена активна утайка е много бързо. Това е приемливо, при условие че разширените участъци от графиката на усвояването са прави и техните градиенти не се променят при преминаването през границите от 2,0 mg/l или 7,0 mg/l O2. Всякакви извити части на графиката показват, че системата за измерване е в процес на стабилизиране, или че скоростта на усвояване се променя, и не следва да се използват за изчисляването на скоростите на дишане. Скоростта на усвояването на кислород следва да се изразява в милиграми на литър на час (mg/lh) или в милиграми на грам суха утайка на час (mg/gh). Скоростта на потреблението на кислород, R в mg/lh, може да бъде изчислена или интерполирана от линейната част на графиката със записаните данни за намалението на кислорода съгласно уравнение 1:

където:

47.

Специфичната скорост на дишане (RS) се изразява като количеството усвоен кислород на g сухо тегло на утайка на час (mg/gh) съгласно уравнение 2:

където SS е концентрацията на суспендираните твърди вещества в изпитваната смес (g/l).

48.

Различните индекси на R, които могат да се съчетават, са:

49.

Връзката между общото дишане (RT), дишането, дължащо се на нитрификация (RN) и хетеротрофното дишане (RH) се изразява с уравнение 3:

където:

50.

Това съотношение е валидно за стойностите на празните проби (RNB, RTB, RHB), абиотичните контроли (RNA, RTA, RHA) и изследванията с изпитвани химикали (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Специфичните скорости на дишане се изчисляват от:

51.

Ако стойността на RN не е значима (например < 5 % от RT в празни контроли) при предварително изпитване, може да се допусне, че хетеротрофното усвояване на кислород е равно на общото усвояване и че не протича нитрификация. Ако при изпитванията трябва да се разглеждат въздействията върху хетеротрофните и нитрифициращите микроорганизми, би бил необходим алтернативен източник на активна утайка. Окончателно изпитване се провежда при наличие на доказателства за потискане на скоростите на усвояването на кислород при различни концентрации на изпитвания химикал.

52.

Процентът на потискане, IT, на общото потребление на кислород при всяка концентрация на изпитвания химикал, се определя по уравнение 7:

53.

Аналогично, процентът на потискане на хетеротрофното усвояване на кислород IH при всяка концентрация на изпитвания химикал, се определя по уравнение 8:

54.

Накрая, потискането на усвояването на кислород IN, дължащо се на нитрификация, при всяка концентрация, се определя по уравнение 9:

55.

Процентът на потискане на усвояването на кислород следва да се нанесе на графиката спрямо логаритъма на концентрацията на изпитвания химикал (крива на потискане, виж фигура 3 от допълнение 4). Кривите на потискане се начертават за всеки период на аериране от 3 часа (h) или допълнително след 30 min. Концентрацията на изпитвания химикал, която възпрепятства усвояването на кислород с 50 % (EC50), следва да бъде изчислена или интерполирана от графиката. Ако са налични подходящи данни, могат да бъдат изчислени или интерполирани 95 %-ни доверителни граници на EC50, наклонът на кривата и подходящи стойности за отбелязване на началото на потискането (например EC10 или EC20) и края на диапазона на потискането (например EC80 или EC90).

56.

Следва да се отбележи, че с оглед на варирането, често наблюдавано при резултатите, в много случаи може да е достатъчно допълнително изразяване на резултатите като порядък, например:

57.

Стойностите на ECx, включително свързаните с тях долни и горни 95 %-ни доверителни граници за параметъра, се изчисляват с помощта на подходящи статистически методи (например пробит-анализ, логистична функция или функция на Вейбул, метод на Спирмън-Карбър с изключване на данни, или обикновена интерполация (11)). Стойност на ECx се получава чрез добавяне на стойност, съответстваща на x % от средната стойност на контролна проба в уравнението. За изчисляване на EC50 или всяка друга стойност ECx, средните стойности от всяко третиране (x) следва да бъдат подложени на регресионен анализ.

58.

Ако със статистическия анализ се цели определяне на NOEC, необходими са статистики за всеки отделен съд (индивидуалните съдове се разглеждат като повторения). Трябва да се използват подходящи статистически методи съгласно документа на ОИСР относно настоящите подходи за статистически анализ на данни за екотоксичност (Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data): ръководство за прилагане (11). По принцип неблагоприятните въздействия на изпитвания химикал в сравнение с контролата се проучват чрез проверяване на (по-малката) едностранна хипотеза при p ≤ 0,05.

59.

Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:

(1)

Brown, D., Hitz, H.R. and Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.

(2)

King, E. F. and Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.

(3)

OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.

(4)

ISO (2007). ISO 8192 Water Quality- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation, International Organization for Standardization.

(5)

Bealing, D. J. (2003). Document ISO/TC147/WGI/N.183, International Organization for Standardization.

(6)

Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.

(7)

Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.

(8)

Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.

(9)

Fiebig S. and Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test — acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.

(10)

ISO (1995). ISO 10634 Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in aqueous medium, International Organization for Standardization.

(11)

OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Series on testing and assessment No. 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paris.

1.

Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 221 (2006). Той е предназначен за оценяване на токсичността на химикали по отношение на сладководни растения от род Lemna (водна леща). Той се базира на съществуващи методи (1)(2)(3)(4)(5)(6), но включва и модификации на тези методи с цел да бъдат отразени най-съвременните научни изследвания и консултации по редица ключови въпроси. Настоящият метод за изпитване е валидиран чрез международно кръгово изпитване (7).

2.

Настоящият метод за изпитване описва изпитване за токсичност с използване на Lemna gibba и Lemna minor, като и двата вида са били пространно изследвани и са предмет на посочените по-горе стандарти. Таксономията на Lemna spp. е трудна, тъй като е усложнена от съществуването на широк кръг от фенотипове. Въпреки че за Lemna може да възникне генетична изменчивост като реакция на токсични вещества, към момента няма достатъчно данни относно този източник на изменчивост, за да бъде препоръчан специфичен клон, който да бъде използван с настоящия метод за изпитване. Следва да се отбележи, че изпитването не е проведено при пълно отсъствие на чужди организми, но по време на процедурата за изпитване се предприемат поетапни стъпки за поддържане на минимално замърсяване с други организми.

3.

Описани са подробности от изпитването с обновяване (полустатично или проточно) на изпитвания разтвор и без обновяване (статично) на изпитвания разтвор. В зависимост от целите на изпитването и регулаторните изисквания се препоръчва да се обмисли прилагането на полустатичния метод и на проточния метод, например за химикали, които бързо се губят от разтвора в резултат на изпаряване, фоторазграждане, утаяване или биоразграждане. Допълнителни насоки са дадени в (8).

4.

Определенията, които са използвани, са дадени в допълнение 1.

5.

Дадена е възможност експоненциално растящите растителни култури от род Lemna да растат като монокултури при различни концентрации на изпитвания химикал за период от седем дни. Целта на изпитването е да се определят количествено свързаните с химикала въздействия върху вегетативния растеж през този период, на базата на оценки на избрани измервани променливи. Броят на листовидните тела е главната измервана променлива. Най-малко още една измервана променлива (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло) също се измерва, тъй като някои химикали могат да окажат много по-голямо въздействие върху други измервани променливи, отколкото върху броя на листовидните тела. За количествено определяне на свързани с химикалите въздействия, растежът в изпитваните разтвори се сравнява с този на контролните проби и концентрацията, при която се осъществява потискане на растежа до определените x % (например 50 %) се определя и се изразява като ECx (например EC50).

6.

Крайната точка на изпитването е потискането на растежа, изразено като логаритмично нарастване на измерваната променлива (средна специфична скорост на растеж) през периода на експозицията. От средните специфични скорости на растеж, регистрирани в серия от изпитвани разтвори, се определя концентрацията, при която се осъществява потискане на скоростта на растежа до определените x % (например 50 %) и тя се изразява като ErCx (напр. ErC50).

7.

Допълнителна зависима променлива, използвана в настоящия метод на изпитване, е добивът, който може да е необходим, за да бъдат изпълнени специфични регулаторни изисквания в някои държави. Той се определя като измерваните променливи в края на периода на експозиция минус измерваните променливи в началото на периода на експозиция. От добива, регистриран в серия от разтвори на изпитване се изчислява концентрацията, при която се осъществява потискане на добива до определените x % (например 50 %) и се изразява като EyCx (напр. EyC50).

8.

В допълнение най-ниската концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) и концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) могат да бъдат определени статистически.

9.

Следва да е възможно използването на аналитичен метод с достатъчна чувствителност за количествено определяне на химикала в средата на изпитване.

10.

Информацията относно изпитвания химикал, която може да бъде полезна при установяване на условията на изпитване, включва структурната формула, чистотата, водоразтворимостта, стабилността във вода и на светлина, pKa, Kow, парното налягане и биоразградимостта. Разтворимостта във вода и парното налягане може да се използват за изчисляване на константата по закона на Хенри, която ще покаже дали се очакват значителни загуби на изпитвания химикал през периода на изпитването. Това ще помогне да се разбере дали следва да се предприемат определени стъпки за контролиране на тези загуби. Когато информацията за разтворимостта и стабилността на изпитвания химикал е несигурна, се препоръчва те да бъдат оценени в условията на изпитване, т.е., среда на растеж, температура, режим на осветеност, които ще бъдат използвани при изпитването.

11.

Когато контролът върху pH на средата на изпитването е особено важен, например при изпитване на метали или химикали, които са неустойчиви на хидролиза, се препоръчва добавянето на буфер към средата на растеж (вж. точка 21). Допълнителни насоки за изпитване на химикали, чиито физични и химични свойства затрудняват тяхното изпитване, са дадени в (8).

12.

За да е валидно изпитването, времето за удвояване на броя листовидни тела в контролната проба трябва да бъде по-малко от 2,5 дни (60 часа), съответстващо на седемкратно увеличение за седем дни и средна специфична скорост на растеж от 0,275 d– 1. Използването на средата и на условията на изпитване, описани в настоящия метод за изпитване, позволяват постигането на този критерий с помощта на статичен режим на изпитване (5). Очаква се също, че този критерий е достижим и в условия на полустатично и проточно изпитване. Изчисляването на времето за удвояване е показано в точка 49.

13.

Референтният химикал (референтните химикали), като например 3,5-дихлорофенол, използван в международното кръгово изпитване (7), може да бъде изпитван като средство за проверка на процедурата за изпитване. Желателно е референтният химикал да се изпитва най-малко два пъти годишно или, когато изпитването се извършва по-рядко, да се извършва едновременно с определянето на токсичността на изпитвания химикал.

14.

Цялото оборудване в контакт със средата на изпитване следва да е направено от стъкло или друг химически инертен материал. Стъклените съдове, използвани за отглеждане на култури и за изпитване, трябва да бъдат почистени от химични замърсители, които биха могли да проникнат в средата на изпитване, както и да бъдат стерилни. Съдовете за изпитването трябва да са достатъчно широки, така че листовидното тяло от различни колонии в контролните съдове да расте без припокриване в края на изпитването. Няма значение дали корените докосват дъното на съдовете за изпитване, но се препоръчва минимална дълбочина от 20 mm и минимален обем от 100 ml за всеки съд за изпитване. Изборът на съдовете за изпитването не е от решаващо значение, при условие че тези изисквания са изпълнени. Доказано е, че подходящи за целта са стъклени бехерови чаши, блюда кристализатори или стъкла на Петри с нужните размери. Съдовете за изпитването трябва да бъдат покрити с оглед минимизиране на изпарението и на случайното замърсяване, като същевременно се даде възможност за циркулиране на въздуха. Подходящите съдове за провеждане на изпитването и особено капаците трябва да предотвратяват засенчването или промените в спектралните характеристики на светлината.

15.

Културите и съдовете за изпитването не трябва да се съхраняват заедно. Това се постига най-добре с използването на осигуряващи необходимите за растежа параметри на околната среда отделни климатични камери, инкубатори или помещения. Необходимо е осветлението и температурата да могат да се контролират и да се поддържат на постоянно ниво (вж. точки 35—36).

16.

Организмът, използван за настоящото изпитване, е Lemna gibba или Lemna minor. Кратки описания на видовете водна леща, използвани за изпитване за токсичност, са дадени в допълнение 2. Растителният материал може да бъде получен от колекция от култури, от друга лаборатория или на място. Ако са събрани на място, растенията следва да се съхраняват в култура в същата среда, която се използва за изпитването, в течение на минимум осем седмици преди да се използват. Полевите обекти за събиране на място на началните култури трябва да са без явни източници на замърсяване. Ако са получени от друга лаборатория или от колекция от култури, те следва да се съхраняват по същия начин в течение на минимум три седмици. За източника на растителен материал, вида и клона (ако е известен), използвани в изпитването, трябва винаги да се протоколира.

17.

Трябва да бъдат използвани монокултури, които нямат видимо замърсяване с други организми като водорасли и протозоа. Здравите растения от L. minor трябва да се състоят от колонии, включващи между две и пет листовидни тела, докато здравите колонии от L. gibba могат да съдържат до седем листовидни тела.

18.

Качеството и еднородността на използваните за изпитването растения оказват значително влияние върху резултата от изпитването и поради това растенията трябва да бъдат грижливо подбрани. Трябва да се използват млади, бързорастящи растения без видими повреди или обезцветяване (хлороза). Признак за култури с добро качество е големият брой колонии, съставени от поне две листовидни тела. Голям брой отделни листовидни тела е показателен за екологичен стрес, например ограничаване на хранителните вещества, и растителен материал от такива култури не трябва да се използва за изпитване.

19.

За намаляване на честотата за поддръжка на културата (например когато не са планирани изпитвания с Lemna за известен период), културите могат да се съхраняват при намалено осветление и температура (4—10 °C). Подробности за култивирането са дадени в допълнение 3. Очевидни признаци за замърсяване с водорасли или други организми могат да изискват стерилизация на повърхността на подпроба от листообразните тела на Lemna, последвана от прехвърляне в прясна среда (вж. допълнение 3). В такъв случай останалата замърсена култура трябва да се изхвърли.

20.

Най-малко седем дни преди изпитването достатъчно колонии се прехвърлят по стерилен начин в прясна стерилна среда и се култивират в течение на 7—10 дни при условията на изпитването.

21.

Препоръчват се различни среди за Lemna minor и за Lemna gibba, както е описано по-долу. Трябва внимателно да се прецени включването на pH буфер в средата на изпитване (MOPS — 4-морфолинпропансулфонова киселина, CAS №: 1132-61-2) в средата за L. minor и NaHCO3 в средата за L. gibba), когато има предположения, че буферът може да реагира с изпитвания химикал и да повлияе на изразяването на неговата токсичност. Средата на Steinberg (9) също е приемлива, при условие че критериите за валидност са изпълнени.

22.

За култивиране и изпитване с L. minor се препоръчва модификация на средата на растеж за Lemna по шведския стандарт (SIS). Съставът на тази среда е даден в допълнение 4.

23.

Средата на растеж, 20X — AAP, както е описана в допълнение 4, се препоръчва за култивиране и изпитване с L. gibba.

24.

Средата на Steinberg, както е описана в допълнение 4, също е подходяща за L. minor, но би могла да се използва и за L. gibba, при условие че са изпълнени критериите за валидност.

25.

Разтворите за изпитване обикновено се приготвят чрез разреждане на изходен разтвор. Изходните разтвори на изпитвания химикал обикновено се приготвят чрез разтваряне на химикала в среда на растеж.

26.

Най-високата изпитвана концентрация на изпитвания химикал обикновено не трябва да надвишава разтворимостта във вода на химикала при условията за провеждане на изпитването. Следва да се отбележи обаче, че Lemna spp. плава на повърхността и може да бъде изложен на въздействието на химикали, които се събират на границата между водата и въздуха (например, слабо разтворими във вода или хидрофобни химикали или повърхностноактивни химикали). При такива обстоятелства експозицията ще произтича от материал, различен от този в разтвора, и изпитваните концентрации могат, в зависимост от характеристиките на изпитвания химикал, да надвишат разтворимостта във вода. За изпитвани химикали с малка водоразтворимост може да е необходимо да се приготви концентриран изходен разтвор или химикалът да се диспергира, като се използва органичен разтворител или диспергиращо средство, за да се улесни добавянето на точни количества от изпитвания химикал към средата на изпитване и да се подпомогне неговото диспергиране и разтваряне. Трябва да се положат всички усилия, за да се избегне използването на такива материали. Не трябва да има фитотоксичност в резултат на използването на спомагателни разтворители и диспергиращи средства. Например обичайно използваните разтворители, които не предизвикват фитотоксичност при концентрации до 100 μl/l, включват ацетон и диметилформамид. Ако се използва разтворител или диспергиращо средство, трябва да бъде отчетена неговата крайна концентрация и тя да се поддържа на минимално ниво (≤ 100 μl/l), а всички третирани и контролни проби трябва да съдържат еднаква концентрация на разтворителя или диспергиращото средство. Допълнителни насоки относно използването на диспергиращи средства са дадени в (8).

27.

Предварителното познаване на токсичността на изпитвания химикал по отношение на Lemna, например от изпитване за определяне на обхват, ще помогне при избирането на подходящи изпитвани концентрации. В окончателното изпитване за токсичност обикновено би следвало да има най-малко пет изпитвани концентрации, подредени в геометрична прогресия. За предпочитане е кратността на разделяне между изпитваните концентрации да не надхвърля 3,2, но могат да се използват и по-големи стойности, при които кривата концентрация-отклик е полегата. Трябва да се представи обосновка, ако са използвани по-малко от пет концентрации. При всяка от изпитваните концентрации трябва да се използват най-малко три повторения.

28.

При задаването на диапазона на изпитваните концентрации (за изпитване за определяне на обхват и/или за окончателно изпитване за токсичност), трябва да се има предвид следното:

29.

Всяко изпитване трябва да включва контролни проби, състоящи се от същата хранителна среда, същия брой листовидни тела и колонии, същите условия на околната среда и процедури както при съдовете за изпитване, но без изпитвания химикал. Ако се използва спомагателен разтвор или диспергиращо средство, трябва да бъде включена допълнително контролна третирана проба, като разтворителят/диспергиращото средство трябва да присъстват в същата концентрация като тази в съдовете с изпитвания химикал. Броят на съдовете за повторни контролни проби (и съдовете с разтворител, ако е приложимо) трябва да е най-малко равен, а в идеалния случай да е два пъти по-голям от броя на съдовете, използвани за всяка изпитвана концентрация.

30.

Ако не се изисква определяне на NOEC, планът за изпитването може да бъде променен, като се увеличи броят на концентрациите и се намали броят на повторенията за всяка от концентрациите. Но все пак броят на повторните контролни проби трябва да е най-малко три.

31.

Колониите, състоящи се от 2 до 4 видими листовидни тела, се прехвърлят от инокулираната култура и се поставят на случаен принцип в съдовете за изпитване при стерилни условия. Всеки съд за изпитване трябва да съдържа общо от 9 до 12 листовидни тела. Броят на листовидните тела и колониите трябва да е еднакъв във всеки съд за изпитване. Придобитият опит за настоящия метод и данните от кръговото изпитване показват, че използването на три повторения на третиране, като всяко повторение съдържа в началото от 9 до 12 листовидни тела, е достатъчно за откриването на различия в растежа от приблизително 4 до 7 % от потискането, изчислено чрез скоростта на растежа (10 до 15 %, изчислени чрез добива) между третираните проби (7).

32.

За минимизиране на влиянието на пространствените различия в интензитета на светлината и температурата се изисква схема за случаен подбор за разполагане на съдовете за изпитване в инкубатора. При извършване на наблюдения също се изискват блокова схема или промяна на разполагането чрез случаен подбор (или по-честа промяна на разполагането).

33.

Ако предварителното изпитване за стабилност показва, че концентрацията на изпитвания химикал не може да бъде поддържана (т.е., измерената концентрация пада под 80 % от първоначално измерената концентрация) за времето на изпитването (7 дни), се препоръчва полустатичен режим на изпитване. В този случай колониите трябва да бъдат експонирани в прясно приготвени разтвори за изпитване и за контролни проби най-малко два пъти по време на изпитването (например, ден 3 и 5). Честотата на експониране в прясна среда ще зависи от стабилността на изпитвания химикал; може да е необходима по-голяма честота, за да се поддържа почти постоянна концентрация за силно нестабилни или летливи вещества. При някои обстоятелства може да се изисква процедура с протичане (8)(10).

34.

Сценарият на експозиция чрез прилагане към листата (пръскане) не е включен в настоящия метод за изпитване; вместо това вж. (11).

35.

Трябва постоянно да се използва топло или студено бяло флуоресцентно осветление, за да се осигури интензитет на светлината в диапазона 85—135 μE · m– 2s– 1, когато се измерва във фотосинтетично активно излъчване (400—700 nm) в точки, чието разстояние от източника на светлина е еднакво с това на листовидните тела на Lemna (еквивалентно на 6 500—10 000 lux). Разликите от избрания интензитет на светлината върху площта на изпитването не трябва да нахвърлят ± 15 %. Методът за засичане и измерване на светлината, особено видът на сензора, ще оказват влияние върху измерваната стойност. Сферичните сензори (които реагират на светлина, излъчвана от всички ъгли над и под равнината на измерване) и „косинусовите“ сензори (които реагират на светлината, излъчвана от всички ъгли над равнината на измерване), са за предпочитане пред еднопосочните сензори и ще отчитат по-високи стойности за описания тук тип многоточков източник на светлина.

36.

Температурата в съдовете за изпитване трябва да бъде 24 ± 2 °C. Стойността на pH на контролната среда не трябва да се повишава с повече от 1,5 единици по време на изпитването. Въпреки това, отклонение с повече от 1,5 единици не прави изпитването невалидно, при условие че може да се покаже, че критериите за валидност са изпълнени. Необходимо е да се обърне допълнително внимание на отклонението в стойността на pH в някои специални случаи, например когато се изпитват нестабилни химикали или метали. Вж. (8) за допълнителни насоки.

37.

Изпитването се прекратява 7 дни след прехвърлянето на растенията в съдовете за изпитване.

38.

В началото на изпитването се преброяват листовидните тела в съдовете за изпитване и броят им се записва, като се внимава да бъде гарантирано отчитането на подаващите се, ясно видими листовидни тела. Броят на листовидните тела, които изглеждат нормални или анормални, следва да се определи в началото на изпитването, най-малко веднъж на всеки 3 дни по време на експозицията (т.е. в най-малко 2 случая по време на 7-дневния период), както и при завършване на изпитването. Трябва да бъдат отбелязани промените в развитието на растението, например в размера на листовидните тела, външния вид, показания за некроза, хлороза или издутост, разпадане на колонията или загуба на плавателността, както и в дължината и външния вид на корените. Трябва да се отбележат и значими характеристики на средата на изпитване (например наличието на неразтворен материал, растеж на водорасли в съда за изпитване).

39.

В допълнение към определянето на броя на листовидните тела по време на изпитването, трябва да се оценят и въздействията на изпитвания химикал върху една (или повече) от следните измервани променливи:

40.

Общата площ на листовидните тела има предимство, че може да се определи за всеки изпитван и контролен съд в началото, по време и в края на изпитването. Сухото или свежото тегло трябва да се определят в началото на изпитването от проба на инокулираната култура, представителна по отношение това, което се използва за начало на изпитването, както и в края на изпитването с растителен материал от всеки съд за изпитване и всеки контролен съд. Ако не се измерва площта на листовидните тела, за предпочитане е сухото пред свежото тегло.

41.

Общата площ на листовидните тела, сухото тегло и свежото тегло могат да бъдат определени, както следва:

42.

Ако се използва схема за статично изпитване, pH на всяка третирана проба трябва да се измери в началото и в края на изпитването. Ако се използва схема за полустатично изпитване, pH трябва да се измерва във всяка партида от „свеж“ разтвор за изпитване преди всяко подновяване, както и в съответните „изчерпани“ разтвори.

43.

Интензитетът на светлината трябва да се измерва в климатичната камера, в инкубатора или помещението в точки, които са на разстояние от източника на светлина, което е еднакво с това на листовидните тела на Lemna. Измерванията трябва да се извършват най-малко веднъж по време на изпитването. Температурата на средата в заместващия съд, който се държи при същите условия в климатичната камера, инкубатора или помещението, трябва да се записва най-малко веднъж дневно.

44.

По време на изпитването концентрациите на изпитвания химикал се определят през подходящи интервали. При статични изпитвания минималното изискване е концентрациите да се определят в началото и в края на изпитването.

45.

При полустатични изпитвания, при които концентрацията на изпитвания химикал не се очаква да остане в рамките на ± 20 % от номиналната концентрация, е необходимо да се анализират всички прясно приготвени изпитвани разтвори и същите разтвори при всяко обновяване (вж. точка 33). Обаче при тези изпитвания, при които измерената начална концентрация на изпитвания химикал не е в рамките на ± 20 % от номиналната, но за които може да се предоставят достатъчно доказателства, показващи че началните концентрации са повторяеми и стабилни (т.е., в диапазона 80—120 % от началната концентрация), химичните определяния могат да се извършат само за най-високата и най-ниската изпитвана концентрация. Във всички случаи определянето на концентрациите на изпитвания химикал преди обновяването е необходимо да се извършва само за един съд с повторение, за всяка изпитвана концентрация (или съдържанието на съдовете, обединени в пул от повторения).

46.

Ако се използва проточно изпитване, подходящ е режим за взимане на проби, подобен на описания при полустатичните изпитвания, включително анализа в началото, по средата и в края на изпитването, но измерванията на „изчерпаните“ разтвори в този случай не са подходящи. В този тип на изпитване скоростта на потока на разредителя и изпитвания химикал или изходния разтвор на изпитвания химикал трябва да се проверяват ежедневно.

47.

Ако има доказателство, че през цялото време на изпитването концентрацията на химикала, който се изпитва, е била задоволително поддържана в рамките на ± 20 % от номиналната или измерената първоначална концентрация, анализът на резултатите може да бъде базиран на номиналната или на измерената първоначална стойност. Ако отклонението от номиналната или измерената първоначална концентрация не е в рамките на ± 20 %, анализът на резултатите трябва да се базира на средногеометричната стойност на концентрацията по време на експозицията или на модели, които описват намаляването на концентрацията на изпитвания химикал (8).

48.

При определени условия, например когато предварителното изпитване показва, че изпитваният химикал няма токсични въздействия при концентрации до 100 mg/l или до неговата граница на разтворимост в изпитваната среда (в зависимост от това кое е по-ниско), може да бъде осъществено гранично изпитване, включващо сравнение на отклика в контролна група и в една от третираните групи (100 mg/l или концентрация, равна на границата на разтворимост). Настоятелно се препоръчва това да бъде подкрепено с анализ на концентрацията на експозиция. Всички предходни условия на изпитване и критерии за валидност се прилагат и за гранично изпитване, с изключение на това, че броят на третираните повторни проби трябва да се удвои. Растежът в контролната и третираната група може да се анализира чрез използване на статистическо изпитване за сравняване на средните стойности, например t-тест на Стюдънт.

49.

За определяне на времето за удвояване (Td ) на броя на листовидните тела и придържането към този критерий за валидност при изследването (точка 12) се използва следната формула с данните, получени от контролните съдове:

Td = ln 2/μ

където μ е средната специфична скорост на растеж, определена според описанието в точки 54—55.

50.

Целта на изпитването е да се определят въздействията на изпитвания химикал върху вегетативния растеж на Lemna. Настоящият метод за изпитване описва две зависими променливи, тъй като различните юрисдикции имат различни предпочитания и регулаторни нужди. За да се приемат резултатите от изпитването във всички държави членки, въздействията следва да се оценяват с използването и на двете зависими променливи a) и б), описани по-долу.

51.

Следва да се отбележи, че стойностите на токсичността, изчислени с помощта на тези две зависими променливи, не са сравними и тази разлика трябва да се разпознава, когато се използват резултатите от изпитването. Стойностите на ECx, базирани на средната специфична скорост на растеж (ErCx), по правило ще бъдат по-високи от резултатите, базирани на добива (EyCx), ако се придържате към условията за изпитване на настоящия метод за изпитване, което се дължи на математическата основа на съответните подходи. Това не трябва да се интерпретира като разлика в чувствителността между двете зависими променливи — стойностите просто са различни от математическа гледна точка. Концепцията за средната специфична скорост на растеж се основава на общия експоненциален модел за растежа на водната леща в неограничени култури, където токсичността се оценява на базата на въздействието върху скоростта на растежа, без да зависи от абсолютното ниво на специфичната скорост на растеж на контролната проба, от наклона на кривата на концентрация-отклик или продължителността на изпитването. Противоположно на това, резултатите, базирани на зависимата променливата за добива, зависят от всички тези други променливи. EyCx зависи от специфичната скорост на растеж на вида водна леща, използван във всяко от изпитванията, и от максималната специфична скорост на растеж, която може да варира между видовете и дори между различните клонове. Тази зависима променлива не следва да се използва за сравняване на чувствителността към токсични вещества между видовете водна леща и дори различните клонове. Докато използването на средната специфична скорост на растеж за оценяване на токсичността е за предпочитане от научна гледна точка, оценките за токсичността, базирани на добива, също са включени в настоящия метод за изпитване, за да удовлетворят действащите регулаторни изисквания в някои юрисдикции.

52.

Оценките за токсичността трябва да са базирани на броя на листовидните тела и на още една допълнителна измервана променлива (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло), тъй като някои химикали могат да въздействат на други измервани променливи много повече, отколкото на броя на листовидните тела. Това въздействие не може да бъде открито само чрез изчисляване на броя на листовидните тела.

53.

Броят листовидни тела, както и всяка друга записана измервана променлива, т.е., общата площ на листовидните тела, сухото тегло или свежото тегло, се представят в табличен вид заедно с концентрациите на изпитвания химикал за всеки измерван случай. Последващият анализ на данни, например оценяването на LOEC, NOEC или ECx, трябва да се основава на стойностите за отделните повторения, а не на изчислените средни стойности за група третирани проби.

54.

Средната специфична скорост на растеж за определен период се изчислява като логаритмичното нарастване в променливите за растеж — брой на листовидните тела и още една измервана стойност (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло) — като се използва формулата, дадена по-долу, за всяко повторение на контролната проба и третираните проби:

където:

Изчислява се средната стойност на скоростта на растеж заедно с оценки на дисперсията за всяка група третирани проби и контролна група.

55.

Средната специфична скорост на растеж трябва да се изчисли за целия период на изпитване (времето „i“ в горната формула е началото на изпитването, а времето „j“ е краят на изпитването). За всяка изпитвана и контролна концентрация се изчислява средната стойност на скоростта за растеж заедно с оценките на дисперсията. Допълнително трябва да се оцени скоростта на растеж сектор по сектор с цел да се оценят въздействията на изпитвания химикал, които възникват в периода на експозиция (например чрез проверка на логаритмично преобразуваните криви на растежа). Значителните различия между скоростта на растеж по сектори и средната скорост на растеж показват, че е налице отклонение от постоянния експоненциален растеж и че има основание за внимателна проверка на кривите на растежа. В този случай консервативният подход ще бъде да се сравнят специфичните скорости на растежа на третираните култури в течение на времевия интервал на максимално потискане с тези за контролните проби за същия времеви интервал.

56.

Процентът на потискане на скоростта на растежа (Ir) тогава може да се изчисли за всяка изпитвана концентрация (група от третирани проби) съгласно следната формула:

където:

57.

Въздействията върху добива се определят на базата на две измервани променливи, броя на листовидните тела и още една измервана променлива (обща площ на листовидните тела, сухо тегло или свежо тегло), които присъстват във всеки съд за изпитване в началото и в края на изпитването. За сухото тегло или свежото тегло началната биомаса се определя на базата на проба от листовидни тела, взета от същата партида, която е използвана за инокулацията на съдовете за изпитване (вж. точка 20). За всяка изпитвана концентрация и контрола се изчислява средната стойност на добива, заедно с оценките на дисперсията. Процентното потискане на добива (% Iy) може да се изчисли за всяка третирана група, както следва:

където: