Kommissionens direktiv 2006/56/EG

Komisijas Direktīva 2006/56/EK

av den 12 juni 2006

( 2006. gada 12. jūnijs),

om ändring av bilagorna till rådets direktiv 93/85/EEG om bekämpning av ljus ringröta på potatis

ar ko groza pielikumus Padomes Direktīvā 93/85/EEK par kartupeļu gaišās gredzenpuves kontroli

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu,

med beaktande av rådets direktiv 93/85/EEG av den 4 oktober 1993 [1] om bekämpning av ljus ringröta på potatis, särskilt artikel 12, och

ņemot vērā Padomes 1993. gada 4. oktobra Direktīvu 93/85/EEK [1] par kartupeļu gaišās gredzenpuves kontroli, un jo īpaši tās 12. pantu,

av följande skäl:

tā kā:

(1) En av de viktigaste skadegörarna på potatis är Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., den sjukdomsalstrande organism som orsakar ljus ringröta på potatis (nedan kallad "skadegöraren").

(1) Viens no kartupeļiem īpaši kaitīgiem organismiem, kas izraisa kartupeļu gredzenpuvi, ir Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al. (turpmāk tekstā "organisms").

(2) Den här skadegöraren förekommer fortfarande i vissa delar av gemenskapen.

(2) Šis organisms joprojām ir sastopams dažās Kopienas teritorijās.

(3) I direktiv 93/85/EEG fastställs detaljerade åtgärder som skall vidtas inom medlemsstaterna mot skadegöraren för att lokalisera den och kartlägga dess utbredning, förhindra dess förekomst och spridning, samt, om den konstateras, förhindra dess spridning och bekämpa den i syfte att utrota den.

(3) Ar Padomes Direktīvu 93/85/EEK ir pieņemti sīki izstrādāti pasākumi, kas dalībvalstīs jāpieņem attiecībā uz šo organismu, lai noteiktu tā atrašanās vietu un izplatību, nepieļautu tā parādīšanos un izplatīšanos, un, konstatējot šo organismu, nepieļautu izplatīšanos, un to apkarotu vai izskaustu.

(4) Sedan dess har en betydande utveckling skett när det gäller förståelsen av skadegörarens biologi samt av förfarandena för att upptäcka och identifiera den. Erfarenheterna från bekämpning av skadegöraren i praktiken visar dessutom att det fordras en översyn av ett flertal tekniska bestämmelser knutna till bekämpningsåtgärderna.

(4) Kopš direktīvas pieņemšanas būtiski mainījusies izpratne par šī organisma bioloģiju, noteikšanas un identifikācijas procedūrām. Turklāt atbilstīgi pieredzei, kas gūta, īstenojot organisma kontroles pasākumus, ir jāpārskata daži ar kontroles pasākumiem saistīti tehniski noteikumi.

(5) Därför förefaller det nödvändigt att se över och uppdatera bestämmelserna i bilagorna till direktiv 93/85/EEG.

(5) Sakarā ar šīm izmaiņām ir jāpārskata un jāatjaunina pasākumi, kas iekļauti Direktīvas 93/85/EEK pielikumos.

(6) När det gäller förfarandena för upptäckt och identifiering har dels nyutvecklade förfaranden, såsom FISH ("fluorescent in-situ hybridization") och PCR ("polymerase chain reaction"), dels förbättringar av olika tekniska komponenter i nuvarande förfaranden för upptäckt och identifiering tagits med.

(6) Attiecībā uz noteikšanas un identifikācijas procedūrām ir iekļautas nesen izstrādātas procedūras, piemēram, in situ fluorescences hibridizācija (FISH) un polimerāzes ķēdes reakcija (PCR), kā arī pašreizējo noteikšanas un identifikācijas procedūru dažādu tehnisko elementu uzlabojumi.

(7) När det gäller de tekniska komponenterna i bekämpningsåtgärderna har följande förbättrade bestämmelser fastställts: det sätt som proverna förvaras på för att möjliggöra spårning av skadegöraren, de beståndsdelar som krävs för att fastställa omfattningen hos den troliga smittan, närmare uppgifter om varje anmälan om bekräftad närvaro av skadegöraren och om det relevanta smittade området, åtgärder att vidta på produktionsplatser som har förklarats smittade inom de avgränsade områdena.

(7) Pilnveidoti ar kontroles pasākumu tehniskajiem elementiem saistītie nosacījumi attiecībā uz pārbaudīto paraugu konservācijas veidu, lai nodrošinātu organisma izsekojamību, noteikumi par elementiem, kas nepieciešami potenciālās inficēšanās pakāpes noteikšanai, precizēta informācija, kas ikreiz, kad apstiprināta organisma klātbūtne, jāsniedz šajā sakarā un par attiecīgo inficēto teritoriju, pasākumiem, kas īstenojami ražošanas vietās, kuras atzītas par inficētām, un norobežojošajās zonās ap tām.

(8) De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för växtskydd.

(8) Šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Pastāvīgās augu veselības komitejas atzinumu,

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU.

Artikel 1

1. pants

Bilagorna till direktiv 93/85/EEG skall ersättas med motsvarande bilagor till det här direktivet.

Ar šo Direktīvas 93/85/EEK pielikumus aizstāj ar atbilstošajiem tekstiem šīs direktīvas pielikumā.

Artikel 2

2. pants

1. Medlemsstaterna skall senast den 31 mars 2007 anta och offentliggöra de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast överlämna texterna till dessa bestämmelser till kommissionen tillsammans med en jämförelsetabell för dessa bestämmelser och bestämmelserna i detta direktiv.

1. Dalībvalstis vēlākais līdz 2007. gada 31. martam pieņem un publicē normatīvos un administratīvos aktus, kas vajadzīgi, lai izpildītu šīs direktīvas prasības. Dalībvalstis nekavējoties iepazīstina Komisiju ar šo tiesību aktu tekstu un šo tiesību aktu un direktīvas atbilstības tabulu.

De skall tillämpa dessa bestämmelser från och med den 1 april 2007.

Dalībvalstis piemēro minētos tiesību aktus no 2007. gada 1. aprīļa.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

Dalībvalstis, pieņemot šos tiesību aktus, tajos ietver atsauci uz šo direktīvu vai arī šādu atsauci pievieno to oficiālai publikācijai. Dalībvalstis nosaka, kā izdarāma šāda atsauce.

2. Medlemsstaterna skall omgående till kommissionen överlämna texten till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.

2. Dalībvalstis tūlīt dara Komisijai zināmus savu tiesību aktu galvenos noteikumus, ko tās pieņem jomā, uz kuru attiecas šī direktīva.

Artikel 3

3. pants

Detta direktiv träder i kraft den tredje dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Šī direktīva stājas spēkā trešajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

Artikel 4

4. pants

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm.

Utfärdat i Bryssel den 12 juni 2006.

Briselē, 2006. gada 12. jūnijā

På kommissionens vägnar

Komisijas vārdā –

Markos Kyprianou

Komisijas loceklis

Ledamot av kommissionen

Markos Kyprianou

[1] EGT L 259, 18.10.1993, s. 2.

[1] OV L 259, 18.10.1993., 2. lpp.

--------------------------------------------------

BILAGA I

I PIELIKUMS

TESTPROGRAM FÖR ATT DIAGNOSTICERA, UPPTÄCKA OCH IDENTIFIERA DEN BAKTERIE SOM ORSAKAR LJUS RINGRÖTA, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

GAIŠĀS GREDZENPUVES IZRAISĪTĀJAS BAKTĒRIJAS CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. DIAGNOSTIKAS, NOTEIKŠANAS UN IDENTIFIKĀCIJAS TESTĒŠANAS SHĒMA

TESTPROGRAMMETS OMFATTNING

TESTĒŠANAS SHĒMAS DARBĪBAS JOMA

I programmet beskrivs de olika förfaranden som ingår i

Turpmākajā shēmā aprakstītas dažādas procedūras, kas saistītas ar:

i) diagnos av ljus ringröta på potatisknölar och potatisplantor,

i) gaišās gredzenpuves diagnosticēšanu kartupeļu bumbuļos un lakstos;

ii) upptäckt av Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i prover av potatisknölar och potatisplantor,

ii) Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus konstatēšanu kartupeļu bumbuļos un lakstos;

iii) identifiering av Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. ssp. sepedonicus).

iii) Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus) identificēšanu.

ALLMÄNNA PRINCIPER

VISPĀRĪGI PRINCIPI

Optimerade protokoll för de olika metoderna, validerade reagenser och närmare uppgifter om beredningen av test- och kontrollmaterial finns i tilläggen. En förteckning över de laboratorier som togs med i optimeringen och valideringen av protokoll finns i tillägg 1.

Papildinājumos iekļauti metožu optimizētie protokoli, ziņas par validētiem reaģentiem, testu sagatavošanu un kontroles materiāliem. Protokolu optimizācijas un validācijas procesā iesaistīto laboratoriju saraksts noteikts 1. papildinājumā.

Eftersom protokollen omfattar upptäckt av en karantänsorganism och användning av C. m. subsp. sepedonicus som kontrollmaterial, är det nödvändigt att förfarandena tillämpas under lämpliga karantänförhållanden med lämpliga anordningar för avfallshantering och i enlighet med lämpliga licenser utfärdade av de officiella växtinspektionsmyndigheterna.

Tā kā protokolos paredzēts, ka ir jānosaka bīstams karantīnas organisms, un tajos paredzēta dzīvotspējīgu C. m. subsp. sepedonicus kultūru izmantošana kontroles materiāla veidā, procedūras īstenojamas piemērotos karantīnas apstākļos ar atbilstošu atkritumu iznīcināšanu un ievērojot attiecīgas licences noteikumus, kuru izsniegusi oficiāla augu karantīnas iestāde.

Testparametrarna skall utformas så att de säkerställer enhetliga och reproducerbara upptäckter av halter av C. m. subsp. sepedonicus på de fastställda tröskelvärdena i de valda metoderna.

Testēšanas parametriem jānodrošina sistēmiska un reproducējama C. m. subsp. sepedonicus līmeņa noteikšana, ievērojot izvēlētajām metodēm noteiktos sliekšņus.

En noggrann förberedning av de positiva kontrollerna är av största vikt.

Pozitīvo kontrolparaugu precīza sagatavošana ir obligāta.

Testning i enlighet med de föreskrivna tröskelvärdena fordrar även att utrustningen ställs in, underhålls och kalibreras på ett korrekt sätt, att reagenserna handhas och förvaras varsamt och att samtliga åtgärder för att förhindra nedsmittning mellan prover vidtas, t.ex. separering av positiva kontroller från prover. Standarder för kvalitetskontroll skall tillämpas för att undvika administrativa och andra fel, särskilt när det gäller märkning och dokumentering.

Testēšana atbilstoši paredzētajiem sliekšņiem paredz arī iekārtu pareizu regulēšanu, uzturēšanu un kalibrēšanu, uzmanīgu rīkošanos ar reaģentiem un visus pasākumus, lai novērstu inficēšanos starp paraugiem, piemēram, pozitīvo kontrolparaugu nodalīšanu no testa paraugiem. Jāpiemēro kvalitātes kontroles standarti, lai izvairītos no administratīvām un cita veida kļūdām, jo īpaši attiecībā uz marķēšanu un dokumentēšanu.

En misstänkt förekomst enligt artikel 4.2 i direktiv 93/85/EEG innebär ett positivt resultat vid diagnostiska tester eller screeningtester som utförs på ett prov i enlighet med vad som anges i flödesdiagrammen.

Kā minēts 4. panta 2. punktā Direktīvā 93/85/EEK, aizdomas par organisma parādīšanos nozīmē pozitīvu rezultātu diagnosticēšanas vai skrīninga testos, kas veikti attiecībā uz paraugu, kā tas ir norādīts shēmās.

Om det första screeningtestet (IF eller PCR/FISH) är positivt, misstänks nedsmittning med C. m. subsp. sepedonicus och ett andra screeningtest skall göras. Om det andra screeningtestet är positivt bekräftas misstanken (misstänkt förekomst) och testerna i enlighet med programmet skall fortsätta. Om det andra screeningtestet är negativt betraktas provet som icke smittat med C. m. subsp. sepedonicus.

Ja pirmais skrīninga tests (IF vai PCR/FISH) ir pozitīvs, pastāv aizdomas par inficēšanos ar Cms, un jāveic otrs skrīninga tests. Ja otrais skrīninga tests ir pozitīvs, tad aizdomas apstiprinās (aizdomas par organisma klātbūtni), un jāturpina testēšana atbilstoši shēmai. Ja otrais skrīninga tests ir negatīvs, uzskata, ka paraugs nav inficēts ar Cms.

Ett positivt IF-test enligt artikel 4.2 definieras som en positiv IF-avläsning verifierad av ett andra screeningtest (PCR/FISH).

Tādēļ pozitīvs IF tests, kā minēts 4. panta 2. punktā, ir definēts kā pozitīvs IF nolasījums, ko apstiprina otrais skrīninga tests (PCR/FISH).

Bekräftad närvaro enligt artikel 5.1 i direktiv 93/85/EEG innebär isolering och identifiering av en renkultur av C. m. subsp. sepedonicus med bekräftad patogenitet.

Saskaņā ar 5. panta 1. punktu Direktīvā 93/85/EEK apstiprināta klātbūtne paredz C. m. subsp. sepedonicus tīrkultūras izolēšanu un identifikāciju, apstiprinot patogenitāti.

1. FRAMSTÄLLNING VIA FLÖDESDIAGRAM

1. SHĒMA

1.1 Program för diagnos på ljus ringröta på potatisknölar och potatisplantor med symptom på ljus ringröta

1.1. Kartupeļu gaišās gredzenpuves noteikšanas shēma tās diagnosticēšanai tādu kartupeļu bumbuļos un lakstos, kuriem ir gaišās gredzenpuves simptomi

Testförfarandet är avsedd för potatisknölar och potatisplantor som uppvisar typiska eller misstänkta symptom på ljus ringröta. Den omfattar ett snabbscreeningtest, isolering av patogenet från infekterad kärlringsvävnad på diagnostiskt substrat och vid positivt utslag identifiering av kulturen som C. m. subsp. sepedonicus.

Testa procedūra paredzēta kartupeļu bumbuļiem un lakstiem, kuriem ir gaišajai gredzenpuvei raksturīgi simptomi vai attiecībā uz ko ir aizdomas par inficēšanos ar to. Tā ietver ātro skrīninga testu, patogēna izolēšanu no inficētajiem vadaudiem diagnostikas barotnē, un, ja iegūts pozitīvs rezultāts, kultūras identificēšanu kā C. m. subsp. sepedonicus.

+++++ TIFF +++++

1.2 Program för upptäckt och identifiering av Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i prover av asymptomatiska potatisknölar

1.2. Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus noteikšanas un identifikācijas shēma asimptomātiskos kartupeļu bumbuļu paraugos

Princip

Princips

Syftet med testförfarandet är att upptäcka latenta infektioner i potatisknölar. Minst två positiva screeningtest baserade på olika biologiska principer skall verifieras genom isolering av patogenet, vid isolering av typiska kolonier följt av identifiering av en renkultur som C. m. subsp. sepedonicus. Endast ett positivt screeningtest är inte tillräckligt för att provet skall kunna betraktas som misstänkt.

Testēšanas procedūra paredzēta latento infekciju noteikšanai kartupeļu bumbuļos. Vismaz divu uz dažādiem bioloģiskiem principiem balstītu skrīninga testu pozitīvs rezultāts ir jāapstiprina ar patogēna izolāciju; tipisku koloniju izolācijas gadījumā tam seko C. m. subsp. sepedonicus tīrkultūras apstiprināšana. Tikai ar viena skrīninga testa pozitīvu rezultātu nepietiek, lai uzskatītu, ka pastāv aizdomas par parauga inficēšanos.

Screening- och isoleringstesterna skall möjliggöra en bestämningsgräns på 103–104 celler/ml återsuspenderade pellet, som är medtagna som positiva kontroller i varje testserie.

Skrīninga un izolācijas testos noteikšanas slieksnim ir jābūt robežās no 103 līdz 104 šūnas mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, ko katrā testu sērijā iekļauj kā pozitīvo kontrolparaugu.

+++++ TIFF +++++

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(11)

(9)

(12)

(10)

+++++ TIFF +++++

1.3 Program för upptäckt och identifiering av Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i prover av asymptomatiska potatisplantor

1.3. Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus noteikšanas un identifikācijas shēma asimptomātiskos kartupeļu lakstu paraugos

+++++ TIFF +++++

2. OKULÄR UNDERSÖKNING AVSEENDE SYMPTOM PÅ LJUS RINGRÖTA

2. GAIŠĀS GREDZENPUVES SIMPTOMU VIZUĀLA NOTEIKŠANA

2.1 Potatisplantor

2.1. Kartupeļu laksti

På grund av de klimatförhållanden som råder i Europa påträffas symptom sällan på ute på fältet och ofta endast i slutet av säsongen. Dessutom är symptomen ofta dolda eller förväxlas med andra sjukdomar, åldrande eller mekaniska skador. Därför kan symptom lätt förbigås vid fältinspektioner. Vissningssymptomen skiljer sig avsevärt från symptomen på mörk ringröta. Vissningen är vanligtvis långsam och begränsad till bladkanterna. Unga infekterade blad fortsätter ofta att utvecklas, om än i mindre utsträckning i infekterade områden. Detta ger upphov till blad med oregelbundna former. Blad vars kärlringvävnad blockerats längre ned på stjälken utvecklar ofta bleka områden på bladytan i olika nyanser av gul och orange. Småblad och blad, och även stjälkar, kan till slut dö. Ofta krymper blad och knölar emellertid endast i storlek. Ibland försvagas plantornas tillväxt. Färgbilder av en rad symptom finns på kommissionens webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Eiropas klimatiskajos apstākļos simptomi ir novērojami reti, un parasti tie kļūst redzami tikai sezonas beigās. Turklāt simptomi parasti ir slēpti, vai tos jauc ar citu slimību simptomiem, vecuma pazīmēm vai mehāniskiem bojājumiem. Tādēļ apskatē uz lauka simptomus var viegli neievērot. Vītes simptomi ievērojami atšķiras no tumšās gredzenpuves simptomiem; vīte parasti noris lēni un tā redzama tikai uz lapu malām. Jaunas inficētas lapas bieži turpina attīstīties, kaut arī mazāk nekā zonās, kuras nav inficētas. Tādējādi rodas neparastas formas lapas. Lapām, kuras vadaudu bloķēšana skārusi zemāk uz stublāja, vidusdaļa bieži ir hlorotiska, dzeltena vai oranža. Beigās inficētās lapas un pat stublāji var atmirt. Bieži lapas un bumbuļi ir vienkārši mazāki pēc izmēra. Dažkārt augi ir nīkulīgi. Iespējamo simptomu krāsaini attēli ir atrodami Komisijas tīmekļa vietnē http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2.2 Potatisknölar

2.2. Kartupeļu bumbuļi

De första symptomen är lätt glasaktighet eller genomskinlighet hos vävnaden, särskilt nära naveländan, utan att området runt kärlsystemet har mjukats upp. Kärlringen vid naveländan kan vara en aning mörkare än normalt. Det första klart identifierbara symptomet är att kärlringen har en gulaktig färg, och då knölen pressas försiktigt tränger strängar av ostliknande material fram ur kärlringen. Denna utsöndring innehåller miljontals bakterier. Kärlringsvävnaden kan bli brunaktig, och symptomen hos knölarna är på detta stadium snarlika dem på mörk ringröta orsakad av Ralstonia solanacearum. Först kan dessa symptom begränsas till en del av ringen, inte nödvändigtvis nära naveländan, och de kan gradvis breda ut sig till hela ringen. Då infektionen fortsätter förstörs kärlringen, och yttre cortex kan skiljas från inre cortex. I ett framskridet stadium av infektionen uppträder sprickor på ytan av knölen, som ofta är rödbrun vid kanterna. I Europa har nyligen ett flertal fall inträffat där inre cortex ruttnar på samma gång som kärlringen, vilket leder till ett sekundärt angrepp med inre urgröpning och nekros. Sekundära svamp- eller bakterieangrepp kan dölja symptomen, och det kan vara svårt, till och med omöjligt, att skilja symptom på framskriden ljus ringröta från andra former av röta hos knölar. Atypiska symptom kan förekomma. Färgbilder på en rad symptom finns på kommissionens webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Agrīnās pazīmes ir viegls audu stiklainums vai caurspīdīgums ap vadaudu sistēmu bez audu mīkstināšanās, jo īpaši tuvāk stolona pamatnei. Vadaudu gredzena krāsa pie stolona pamatnes var būt nedaudz tumšāka nekā parasti. Pirmā viegli nosakāmā pazīme ir vadaudu gredzena dzeltenīgā krāsa un sierveida masas strūklveida izdalīšanās no bumbuļa vadaudiem, viegli saspiežot bumbuli. Šis eksudāts satur miljoniem baktēriju. Šajā slimības stadijā vadaudi var kļūt brūngani, un bumbuļu simptomi šajā stadijā ir līdzīgi Ralstonia solanacearum izraisītās tumšās gredzenpuves simptomiem. Sākumā šīs pazīmes var būt vērojamas tikai vienā vadaudu gredzena daļā, kas var nebūt tuvu pie stolona pamatnes, bet ar laiku pakāpeniski izplatīties visā vadaudu gredzenā. Infekcijai izplatoties, notiek vadaudu sairšana; mizas un ārējo audu slānis var atdalīties no iekšējo audu slāņa Slimības vēlīnajās stadijās bumbuļu virsmā parādās plaisas, parasti ar sarkanīgi brūnas krāsas malām. Pēdējā laikā Eiropā ir konstatēti vairāki gadījumi, kad vidējais mizas slānis pūst vienlaicīgi ar vadaudu gredzenu, izraisot sekundāru infekciju ar iekšēju dobumu veidošanos un nekrozi. Sekundāra sēnīšu vai baktēriju infekcija var apslēpt slimības pazīmes, un tādēļ var būt grūti vai pat neiespējami atšķirt kartupeļu gaišās gredzenpuves vēlīnās stadijas pazīmes no kādas citas bumbuļu puves. Iespējami arī atipiski simptomi. Iespējamo simptomu krāsaini attēli ir atrodami Komisijas tīmekļa vietnē http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3. PREPARERING AV PROVER

3. PARAUGU SAGATAVOŠANA

3.1 Potatisknölar

3.1. Kartupeļu bumbuļi

Anmärkning:

Piezīme:

- Den standardiserade provmängden är 200 knölar per test. Vid intensivare provtagning krävs fler tester på prover av denna storlek. Ett större antal knölar i provet medför inhibering eller svårighet att tolka resultaten. Förfarandet kan emellertid användas för prover med färre än 200 knölar, om det endast finns färre knölar tillgängliga.

- Standarta paraugs ir 200 bumbuļi katram testam. Intensīvākai paraugu ņemšanai nepieciešami papildu testi, izmantojot šāda lieluma paraugu. Ja bumbuļu skaits paraugā ir lielāks, iespējams, tests nedos rezultātus vai tie būs grūti interpretējami. Tomēr, ja nav pieejams nepieciešamais daudzums, šī procedūra labi izmantojama arī paraugiem, kuros ir mazāk nekā 200 bumbuļu.

- Valideringen av samtliga nedan behandlade metoder för upptäckt har skett på grundval av test av stickprover på 200 knölar.

- Visas turpmāk aprakstītās metodes validētas, testējot paraugus no 200 bumbuļiem.

- Det nedan beskrivna potatisextraktet kan även användas för upptäckt av den bakterie som orsakar mörk ringröta hos potatis, Ralstonia solanacearum.

- Turpmāk aprakstīto kartupeļu ekstraktu var izmantot arī kartupeļu tumšās gredzenpuves baktēriju Ralstonia solanacearum noteikšanai.

Frivillig förbehandling före provpreparering:

Papildu pirmapstrāde pirms parauga sagatavošanas:

Tvätta knölarna. Använd lämpliga desinfektionsmedel (vid PCR-test klorföreningar för att avlägsna eventuellt patogent DNA) och tvättmedel mellan varje stickprov. Lufttorka knölarna. Detta rengöringsförfarande är användbart (men det inte är obligatoriskt) i synnerhet vid jordiga prover och om ett PCR-test eller ett direkt isoleringstest skall göras.

Nomazgāt kartupeļu bumbuļus. Izmantot atbilstošus dezinfekcijas līdzekļus (ja veic PCR testu, izmanto hlora savienojumus, lai notīrītu iespējamo patogēna DNS) un mazgāšanas līdzekļus katram paraugam. Ļaut bumbuļiem nožūt. Mazgāšana ir īpaši lietderīga (taču nav obligāta) paraugiem, uz kuriem ir lieka augsnes kārta, un gadījumos, ja jāveic PCR tests vai tiešās izolācijas tests.

3.1.1 Avlägsna med en ren, desinficerad skalpell eller grönsakskniv epidermis från varje knöls navelända så att kärlvävnaden blir synlig. Skär försiktigt ur en liten kärna av kärlringvävnad i naveländan och minimera mängden icke-kärlringvävnad (se kommissionens webbplats på adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

3.1.1. Ar tīru dezinficētu skalpeli vai dārzeņu nazi noņemt mizu pie katra bumbuļa stolona pamatnes, atsedzot vadaudus. Uzmanīgi izgriezt nelielu vadaudu gabalu no stolona pamatnes, cenšoties izgriezt pēc iespējas mazāk bumbuļa mīkstuma (sk. tīmekļa vietnē http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Anmärkning:

Piezīme:

Lägg undan alla knölar med misstänkta symptom på brunröta och testa dem separat.

Atlasīt visus bumbuļus, kuriem ir gaišās gredzenpuves iespējami simptomi, un testēt tos atsevišķi.

Om misstänkta symptom på ljus ringröta iakttas vid avlägsnandet av naveländan bör en okulär inspektion av denna knöl ske efter det att knölen skurits av nära naveländan. Alla skurna knölar med misstänkta symptom bör förvaras i två dagar i rumstemperatur och lagras under karantänförhållanden (4–10 °C) tills alla tester slutförts. Alla knölar i provet, inklusive dem med misstänkta symptom, bör förvaras i enlighet med bilaga II.

Ja stolona pamatnes vidus gabala atdalīšanas laikā redzami gaišās gredzenpuves simptomi, jāveic attiecīgā bumbuļa vizuāla pārbaude, bumbuli iegriežot pie stolona pamatnes. Visus bumbuļus, kuriem ir attiecīgi gredzenpuves simptomi, ne mazāk kā 2 dienas glabā istabas temperatūrā, lai notiktu pārkoksnēšanās, pēc tam bumbuļi jāglabā vēsumā (4–10 °C temperatūrā) karantīnā līdz testēšanas beigām. Visi bumbuļi, tostarp tie, kuriem ir aizdomīgi simptomi, jāuzglabā, kā noteikts II pielikumā.

3.1.2 Samla naveländarna i oanvända avfallsbehållare som kan tillslutas och/eller förseglas (om behållare återanvänds bör de rengöras noggrant och desinficeras med klorföreningar). Naveländarna bör helst behandlas omedelbart. Om detta inte är möjligt bör de förvaras i behållaren, utan tillsats av buffert, nedkylda under högst 72 timmar eller i rumstemperatur under högst 24 timmar. Torkning och förkorkning av ändarna samt framväxt av saprofyter under förvaringen kan hindra att den bakterie som orsakar ljus ringröta upptäcks.

3.1.2. Savākt stolona pamatnes vidus gabalus jaunos vienreizlietojamos konteineros, kurus var aizvērt un/vai cieši noslēgt (ja izmanto vairākkārt lietojamus traukus, tie ir rūpīgi jāiztīra un jādezinficē ar hloru saturošiem savienojumiem). Stolona pamatnes ieteicams apstrādāt nekavējoties. Ja tas nav iespējams, tās ne ilgāk kā 72 stundas atvēsinātā veidā un ne vairāk kā 24 stundas istabas temperatūrā var konteinerā uzglabāt, nepievienojot buferšķīdumu. Vadaudu gabalu izžūšana, pārkoksnēšanās un saprofītu augšana uzglabāšanas laikā var traucēt gaišās gredzenpuves izraisītājas baktērijas noteikšanu.

3.1.3 Behandla naveländarna enligt något av följande förfaranden: antingen

3.1.3. Apstrādāt stolona pamatnes vadaudu gabalus, izmantojot vienu no turpmākajām metodēm:

a) täck naveländarna genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 3) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur lägre än 24 °C eller under 16–24 timmar nedkylt,

a) stolona pamatnes vadaudu gabalus pārliet ar pietiekamu daudzumu ekstrakcijas buferšķīduma (apm. 40 ml) (3. papildinājums) un 4 stundas kratīt rotācijas kratītājā (50–100 apgr./min) temperatūrā, kas zemāka par 24 °C, vai 16–24 stundas gadījumā, ja tie ir atdzesēti,

eller

vai

b) homogenisera naveländarna i en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 3), antingen i en mixer (t.ex. Waring mixer eller Ultra Thurrax) eller genom att krossa dem i en förseglad engångspåse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller stark polyten från Bioreba, 150 × 250 mm, steriliserad genom strålning) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex).

b) vadaudu gabalus homogenizēt mikserī (Waring vai Ultra Thurax), ar pietiekamu (apm. 40 ml) daudzumu ekstrakcijas buferšķīduma (3. papildinājums), vai ar gumijas āmuru vai atbilstošu smalcinātāju (piemēram, Homex) sasmalcināt cieši noslēgtā vienreizlietojamā macerācijas maisiņā (piem., Stomacher vai Bioreba jonizējošā starojumā sterilizētā polietilēna 150 mm × 250 mm maisiņā).

Anmärkning:

Piezīme:

Risken för korskontaminering av proverna är hög när de homogeniseras med en mixer. Vidta försiktighetsåtgärder så att det inte alstras aerosoler eller uppkommer spill under extraheringen. Se till att nyligen steriliserade mixerblad och behållare används för varje prov. Om PCR-test skall användas, undvik överföring av DNA till behållare eller malapparat. Krossning i engångspåsar och användning av engångsrör rekommenderas när PCR-test används.

Ja paraugi tiek homogenizēti mikserī, savstarpējas inficēšanās risks ir ļoti augsts. Veic piesardzības pasākumus, lai izvairītos no aerosola veidošanās vai izlīšanas ekstrakcijas procesa laikā. Nodrošina, ka katram paraugam tiek izmantoti sterilizēti miksera asmeņi un trauki. Ja jāveic PCR tests, jāizvairās no DNS pārnešanas uz traukiem vai smalcināšanas ierīcēm. PCR testam sasmalcināšanu veic vienreizlietojamos maisiņos vai traukos.

3.1.4 Dekantera supernatanten. Om den är mycket grumlig, separera genom långsam centrifugering (högst 180 g under 10 minuter vid en temperatur på 4–10 °C) eller genom vakuumfiltrering (40–100 µm), varvid filtret tvättas med ytterligare (ca 10 ml) extraktionsbuffert (tillägg 3).

3.1.4. Virsējo dzidro šķidruma slāni dekantēt. Ja šķidrums ir pārāk duļķains, tas jādzidrina, lēni centrifugējot (10 min 4–10 °C temperatūrā, ne vairāk kā ar 180 g) vai izmantojot vakuumfiltrēšanu (40–100 µm) un mazgājot filtru ar papildu ekstrakcijas šķīdumu (~10ml) (3. papildinājums).

3.1.5 Koncentrera bakteriedelen genom centrifugering vid 7000 g under 15 minuter (eller 10000 g under 10 minuter) vid en temperatur av 4–10 °C och häll bort supernatanten utan att störa pelleten.

3.1.5. Koncentrēt baktēriju frakcijas, 4–10 °C temperatūrā 15 min centrifugējot ar 7000 g (vai 10 min ar 10000 g), virsējo dzidro šķidruma slāni dekantēt, neuzduļķojot nogulsnes.

3.1.6 Återsuspendera pelleten i 1,5 ml pelletbuffert (tillägg 3). Använd 500 µl för att testa för C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl för Ralstonia solanacearum och 500 µl i referenssyfte. Tillsätt steril glycerol till en slutkoncentrationen av 10–25 volymprocent till 500 µl av referensdelprovet och till det återstående testdelprovet. Skaka och förvara vid –16 till –24 °C (veckor) eller vid –68 till –86 °C (månader). Förvara testdelproven vid 4–10 °C under testningen.

3.1.6. Nogulsnes vēlreiz suspendēt 1,5 ml buferšķīduma (3. papildinājums). Izmantot 500 µl C. m. subsp. sepedonicus testēšanai, un 500 µl Ralstonia solanacearum un 500 µl references vajadzībām. References alikvotai un atlikušajai testa alikvotai pievienot sterilu glicerīnu, līdz galīgai koncentrācijai 10–25 % (v/v), 500 µl, sajaukt un glabāt –16 līdz –24 °C temperatūrā (nedēļas) vai –68 līdz –86 °C (mēnešus). Testēšanas laikā alikvotas glabāt 4–10 °C temperatūrā.

Upprepade nedfrysningar och upptiningar är inte tillrådliga.

Atkārtoti sasaldēt un atkausēt nav ieteicams.

Om transport av extraktet krävs, se till att leveransen sker i en kall behållare inom 24–48 timmar.

Ja ekstraktu transportē, tas jāpārvadā aukstumkastē 24–48 stundu laikā.

3.1.7 Det är absolut nödvändigt att alla C. m. subsp. sepedonicus-positiva kontroller och prover hanteras separat för att undvika nedsmittning. Detta gäller även för IF-glas och samtliga test.

3.1.7. C. m. subsp. sepedonicus pozitīvie kontrolparaugi un paraugi obligāti jāapstrādā atsevišķi, lai izvairītos no inficēšanās. Tas attiecas uz IF priekšmetstikliņiem un uz visiem testiem.

3.2 Potatisplantor

3.2. Kartupeļu laksti

Anmärkning:

Piezīme:

För upptäckt av latenta populationer av C. m. subsp. sepedonicus rekommenderas testning av blandprover. Förfarandet kan även lätt användas för blandprover bestående av upp till 200 stjälkdelar. (Om undersökningar görs bör dessa grundas på ett statistiskt representativt prov av den plantpopulation som undersöks.)

Lai noteiktu latentas C. m. subsp. sepedonicus populācijas, ieteicams testēt apvienotos paraugus. Procedūru var izmantot arī apvienotiem paraugiem no ne vairāk kā 200 stublāju daļām. (Apsekojumos jāizmanto statistiski reprezentatīvi izmeklējamās augu populācijas paraugi.)

3.2.1 Med en ren, desinficerad kniv eller sekatör avlägsnas ett 1–2 cm långt segment av basen på varje stjälk strax ovanför markytan.

3.2.1. Ar tīru dezinficētu nazi vai atzarošanas šķērēm atdalīt 1–2 cm lielu segmentu no katra stublāja pamata pavisam nedaudz virs augsnes līmeņa.

Desinficera stjälksegmentet hastigt i 70-procentig etanol och torka omedelbart med mjukpapper.

Neilgu laiku dezinficēt stublāju segmentus ar 70 % metanolu un nekavējoties nosusināt ar papīra salveti.

Samla stjälksegmenten i en tillsluten steril behållare enligt följande provtagningsförfaranden:

Ielikt stublāju segmentus slēgtā sterilā traukā, ievērojot šādas paraugu ņemšanas procedūras:

3.2.2 Behandla stjälksegmenten enligt något av följande förfaranden: antingen

3.2.2. Apstrādāt stumbru segmentus pēc vienas no turpmāk minētajām metodēm:

a) täck segmenten genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (appendix 3) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur under 24 °C eller under 16-24 timmar nedkylt,

a) apliet stublāju segmentus ar pietiekamu daudzumu (aptuveni 40 ml) ekstrakcijas buferšķīduma (3. papildinājums) un kratīt rotācijas kratītājā (50–100 apgr./min) 4 stundas temperatūrā zem 24 °C vai 16–24 stundas atvēsinātā veidā,

eller

vai

b) behandla omedelbart segmenten genom att krossa dem i en kraftig förseglad engångspåse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller Bioreba) i en tillräcklig mängd extraktionsbuffert (tillägg 3) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex). Om detta inte är möjligt, förvara stjälksegmenten under högst 72 timmar nedkylda eller under högst 24 timmar i rumstemperatur.

b) apstrādāt nekavējoties. Stublāju segmentus homogenizēt ar daudzumu ekstrakcijas šķīdumu (3. papildinājums) izturīgā macerācijas maisiņā (piemēram, Stomacher vai Bioreba), sasmalcinot tos ar gumijas āmuru vai atbilstošu smalcinātāju (piemēram, Homex). Ja uzreiz apstrādāt nevar, stublāju segmentus vēsumā var uzglabāt līdz 72 stundām, bet istabas temperatūrā – līdz 24 stundām.

3.2.3 Dekantera supernatanten efter det att blandningen fått stå och sjunka under 15 minuter.

3.2.3. Nostādināt 15 min, tad virsējo dzidro slāni dekantēt.

3.2.4 Ytterligare klarnande av extraheringen eller koncentrationen av bakteriedelen krävs vanligtvis inte men kan åstadkommas genom filtrering och/eller centrifugering enligt avsnitten 3.1.4–3.1.6.

3.2.4. Baktēriju frakcijas ekstraktu vai koncentrātu parasti nav nepieciešams papildus dzidrināt, bet to var izdarīt filtrējot un/vai centrifugējot, kā aprakstīts 3.1.4.–3.1.6. sadaļā.

3.2.5 Dela det outspädda eller koncentrerade provextraktet i två lika stora delar. Bibehåll ena hälften vid en temperatur av 4–10 °C under testet och lagra den andra hälften med 10–25-procentig (v/v) steril glycerol vid en temperatur av –16 till –24 °C (veckor) eller –68 till –86 °C (månader) för det fall att ytterligare tester krävs.

3.2.5. Sadalīt neatšķaidīto vai koncentrēto parauga ekstraktu 2 vienādās daļās. Vienu daļu uzglabāt 4–10 °C temperatūrā visu testa laiku, otru daļu, ja nepieciešama turpmāka testēšana, pēc 10–25 % (v/v) sterila glicerīna pievienošanas glabāt –16 līdz –24° C temperatūrā (nedēļām ilgi) vai –68 līdz –86 °C temperatūrā (mēnešiem).

4. IF-TEST

4. IF TESTS

Princip

Princips

Det rekommenderas att IF-test används som huvudsakligt screeningtest på grund av dess dokumenterade effektivitet när det gäller att uppnå de föreskrivna bestämningsgränserna.

IF testu ieteicams izmantot par galveno skrīninga testu, jo ir pierādīts tā robustums nepieciešamo sliekšņu sasniegšanai.

Om IF-testet används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest med PCR- eller FISH-tester göras. Om IF-testet används som ett andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att analysen skall bli fullständig.

Ja IF testu izmanto kā galveno skrīninga testu un IF testa rezultāts ir pozitīvs, par otro skrīninga testu izmanto PCR vai FISH testu. Ja IF testu izmanto kā otro skrīninga testu un tā rezultāts ir pozitīvs, lai pabeigtu analīzes, saskaņā ar testēšanas shēmu jāveic papildu testēšana.

Anmärkning:

Piezīme:

Använd alltid en polyklonal antikropp om IF-test används som huvudsakligt screeningtest. Om ett IF-test med en polyklonal antikropp är positivt, kan ytterligare screening av provet med en monoklonal antikropp ge högre specificitet men vara mindre känsligt.

Ja par galveno skrīninga testu izmanto IF testu, noteikti jālieto poliklonālā antiviela. Gadījumā, ja IF testam ar poliklonālo antivielu ir pozitīvs rezultāts, papildus skrīningam ar monoklonālo antivielu var būt labāks specifiskums, bet zemāka jutība.

Använd antikroppar till en referensstam av C. m. subsp. sepedonicus. Det rekommenderas att titer bestäms för varje nytt parti antikroppar. Titern definieras som den högsta utspädning vid vilken en optimal reaktion sker när en suspension av 105–106 celler per ml av den homologa stammen av C. m. subsp. sepedonicus testas och när ett lämpligt fluorescein isothiocyanat konjugat (FITC) i överensstämmelse med tillverkarens rekommendationer används. De monoklonala eller polyklonala antikropparna bör ha en IF-titer av minst 1:2000. Vid testningen bör antikropparna användas vid en arbetsutspädning (arbetsutspädningar) nära eller vid titern. Använd validerade antikroppar (se kommissionens webbplats på adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Jāizmanto C. m. subsp. sepedonicus references celma antivielas. Ieteicams noteikt titru katrai jaunai antivielu partijai. Titrs tiek definēts kā vislielākais atšķaidījums, pie kura panāk optimālu reakciju, testējot suspensiju, kuras vienā mililitrā ir 105 līdz 106 homologa C. m. subsp. sepedonicus celma šūnu, un saskaņā ar ražotāja norādījumiem izmantojot atbilstošu fluoresceīna izotiocianāta (FITC) konjugātu. Neattīrītu poliklonālo un monoklonālo antivielu IF titram jābūt vismaz 1:2 000. Testēšanas laikā antivielas jāizmanto darba atšķaidījumā (DA), kas vienāds ar titru vai tam tuvu. Izmantot validētas antivielas (sk. tīmekļa vietnē http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Testet bör göras på nypreparerade provextrakt. Vid behov kan det göras på extrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur på –68 till –86 °C. Glycerolen kan avlägsnas från provet genom tillsats av 1 ml pelletbuffert (tillägg 4), omcentrifugering under 15 minuter vid 7000 g och återsuspension i en lika stor volym av pelletbuffert. Detta krävs vanligtvis inte, särskilt inte om glasproverna har fixerats på glasen med flambering (se 2.2).

Testu veic, izmantojot tikko sagatavotus paraugu ekstraktus. Nepieciešamības gadījumā testu var sekmīgi veikt, izmantojot ekstraktus, kas glabāti –68 līdz –86 °C temperatūrā glicerīna šķīdumā. Glicerīnu no parauga atdala, pievienojot 1 ml ekstrakta koncentrāta buferšķīduma (4. papildinājums), atkārtoti 15 min centrifugējot ar 7000 g un vēlreiz suspendējot tāda paša daudzuma ekstrakta koncentrāta buferšķīdumā. Dažkārt tas nav nepieciešams, jo īpaši, ja paraugs ir fiksēts uz priekšmetstikliņa ar liesmu (sk. 2.2.).

Bered separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av C. m. subsp. sepedonicus, som suspenderats i potatisextrakt, såsom anges i tillägg 2, alternativt i en buffert.

Sagatavot atsevišķus pozitīvās kontroles priekšmetstikliņus homologam celmam vai kādam citam references C. m. subsp. sepedonicus celmam, suspendējot kartupeļu ekstraktā, kā noteikts 2. papildinājumā, vai buferšķīdumā.

Naturligt infekterad vävnad (som har bevarats genom frystorkning eller nedfrysning vid en temperatur av –16 till –24 °C) bör om möjligt användas som en liknande kontroll på samma glas.

Ja iespējams, uz tā paša priekšmetstikliņa par līdzīgu kontrolparaugu jāizmanto dabīgi inficēti audi (kas saglabāti, liofilizējot vai sasaldējot –16 līdz –24 °C temperatūrā).

Som negativ kontroll använd delprover av provextrakt som tidigare givit negativt svar när de testats.

Par negatīvo kontrolparaugu izmantot parauga ekstrakta alikvotu, kas iepriekš uzrādījis negatīvu rezultātu.

Använd multispot-objektglas med helst 10 fönster av minst 6 mm diameter.

Izmantot daudzlodziņu priekšmetstikliņus, kuriem vēlams būt 10 lodziņiem ar diametru vismaz 6 mm.

Testa kontrollmaterialen på exakt samma sätt som provet (proven).

Kontroles materiālu testē tāpat kā paraugu.

4.1 Preparera testobjektglasen enligt något av följande förfaranden:

4.1. Sagatavot testu priekšmetstikliņus, izmantojot vienu no šādām procedūrām:

i) För pelletar med relativt litet stärkelsesediment:

i) ekstrakti ar relatīvi nelielām cietes nogulsnēm:

Pipettera på det första glaset en uppmätt standardvolym (15 µl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av en 1/100-utspädning av den återsuspenderade potatispelleten. Pipettera en motsvarande volym av koncentrerad pellet (1/1) på de återstående fönstren på raden. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 1.

Uz pirmā lodziņa ar pipeti pārnest standartdaudzumu (15 µl atbilst lodziņam ar 6 mm diametru – lielākiem lodziņiem šo daudzumu proporcionāli palielināt) atkārtoti suspendēta kartupeļu ekstrakta koncentrāta šķīdumā 1/100. Pēc tam līdzīgu daudzumu neatšķaidīta ekstrakta koncentrāta (1/1) iepilināt atlikušajos lodziņos rindā. Otro rindu var izmantot kā dublikātu vai otram paraugam, kā parādīts 1. attēlā;

ii) För andra pelletar:

ii) citi ekstrakti:

Preparera decimala utspädningar (1/10 och 1/100) av den återsuspenderade pelleten i pelletbuffert. Pipettera en uppmätt standardvolym (15 µl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av den återsuspenderade pelleten och varje utspädning på en fönsterrad. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 2.

Sagatavot atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta decimālatšķaidījumus (1/10 un 1/100) buferšķīdumā. Lodziņu rindā ar pipeti pārnest standartdaudzumu (15 µl atbilst lodziņam ar 6 mm diametru – lielākiem lodziņiem šo daudzumu proporcionāli palielināt) tīras ekstrakta suspensijas un katra šķīduma. Otro rindu var izmantot kā dublikātu vai otram paraugam, kā parādīts 2. attēlā.

4.2 Torka dropparna i omgivande temperatur eller genom uppvärmning vid en temperatur av 40–45 °C. Fixera bakteriecellerna på glaset antingen genom upphettning (15 minuter vid 60 °C), flambering med 95-procentig etanol eller enligt särskilda instruktioner från leverantören av antikropparna.

4.2. Pilienus izžāvēt apkārtējās vides temperatūrā vai sildot 40–45 °C. Baktēriju šūnas nofiksēt uz priekšmetstikliņa, karsējot (15 min 60 °C temperatūrā), apdedzinot ar liesmu, izmantojot 95 % etanolu vai saskaņā ar antivielu piegādātāju īpašām instrukcijām.

Vid behov får fixerade glas lagras frysta i en torkad låda under så kort tid som möjligt (maximalt 3 månader) innan vidare testning sker.

Nepieciešamības gadījumā fiksētos priekšmetstikliņus līdz turpmākai testēšanai var glabāt sasaldētā veidā sausā noslēgtā kamerā iespējami neilgi (ne ilgāk kā 3 mēnešus).

4.3 IF-förfarande

4.3. IF procedūra:

i) Enligt testglaspreparering i 4.1 i:

i) saskaņā 4.1. punkta i) apakšpunktu sagatavo testēšanai priekšmetstikliņus:

Bered en serie dubbla utspädningar av antikroppen i IF-buffert. Den första brunnen bör ha 1/2 av titern (T/2), de övriga 1/4 av titern (T/4), 1/2 av titern (T/2), titern (T) och två gånger titern (2T).

Sagatavot antivielu divkāršus atšķaidījumus IF buferšķīdumā. Pirmajā iedobē jābūt 1/2 titra (T/2), pārējās – 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), pilnam titram (T) un divkāršam titram (2T);

ii) Enligt testglaspreparering i 4.1 ii:

ii) saskaņā 4.1. punkta ii) apakšpunktu sagatavo testēšanai priekšmetstikliņus:

Preparera arbetsutspädningen av antikropp i IF-buffert. Arbetsutspädningen påverkar specificiteten.

Sagatavot antivielu darba atšķaidījumu (DA) IF buferšķīdumā. Darba atšķaidījums ietekmē specifiskumu.

Figur 1. Preparering av testglaset enligt 4.1 i och 4.3 i.

1. attēls. Testa priekšmetstikliņa sagatavošana atbilstoši 4.1. punkta i) apakšpunktam un 4.3. punkta i) apakšpunktam.

| Utspädningar av återsuspenderade pelletar |

| Atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta atšķaidījumi |

1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Utspädning av återsuspenderad pellet |

1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta atšķaidījums |

(T = titer) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Dubbla utspädningar av antiserum/antikropp |

(T = titrs) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Divkāršie imūnseruma/antivielas atšķaidījumi |

+++++ TIFF +++++

1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

+++++ TIFF +++++

punkta 1. parauga dublikāts vai 2. paraugs | | | | | |

6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Figur 2. Preparering av testglaset enligt 4.1 ii och 4.3 ii.

2. attēls. Testa priekšmetstikliņa sagatavošana atbilstoši 4.1. ii) apakšpunktam un 4.3. punkta ii) apakšpunktam.

| Arbetsutspädning av antiserum/antikropp |

| Imūnseruma/antivielas darba atšķaidījumi |

1/1 | 1/10 | 1/100 | tom | tom |  | Decimal utspädning av återsuspenderad pellet |

1/1 | 1/10 | 1/100 | Tukšs | Tukšs |  | Atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta decimālatšķaidījums |

+++++ TIFF +++++

1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

+++++ TIFF +++++

6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

4.3.1 Ordna glasen på fuktigt mjukpapper. Täck varje testfönster fullständigt med antikropputspädning(ar). Den volym antikroppar som tillsätts varje fönster skall vara minst lika stor som volymen tillsatt extrakt.

4.3.1. Priekšmetstikliņus novietot uz samitrināta papīra. Katru testēšanas lodziņu pilnībā pārklāt ar antivielas atšķaidījumu(-iem). Antivielu daudzumam, kas uzpilināts katrā lodziņā, jābūt vismaz vienādam ar ņemtā ekstrakta tilpumu.

Följande förfarande bör följas om det saknas särskilda instruktioner från leverantören av antikropparna:

Ja nav īpašu norādījumu no antivielu piegādātājiem, jāveic šāda procedūra.

4.3.2 Inkubera objektglasen på fuktigt papper övertäckta under 30 minuter vid omgivande temperatur (18–25 °C).

4.3.2. Priekšmetstikliņus 30 min inkubē uz samitrināta papīra apsegtā veidā apkārtējās vides temperatūrā (18–25 °C).

4.3.3 Skaka av dropparna från glaset och skölj glasen noga med IF-buffert. Tvätta genom att under 5 minuter sänka ned i IF-buffert – Tween (tillägg 3) och därefter under 5 minuter i IF-buffert. Undvik uppkomst av aerosoler eller överföring av droppar som kan orsaka korskontaminering. Avlägsna noga överskottsfukt genom att försiktigt torka med läskpapper.

4.3.3. Nokrata pilienus no katra priekšmetstikliņa un rūpīgi noskalo ar IF buferšķīdumu. Mazgā, uz 5 minūtēm iemērcot IF-Tween buferšķīdumā (3. papildinājums) un pēc tam uz 5 minūtēm IF buferšķīdumā. Izvairīties no aerosolu vai pilienu pārnešanas, kas var izraisīt sasvstarpēju inficēšanos. Uzmanīgi noņemt lieko mitrumu, viegli nosusinot.

4.3.4 Ordna glasen på fuktigt mjukpapper. Täck testfönstren med den utspädning av FITC-konjugat som används för att bestämma titern. Den volym konjugat som tillsätts fönstren skall vara lika med volymen tillsatt antikropp.

4.3.4. Priekšmetstikliņus novietot uz mitrām papīra salvetēm. Nosegt testa lodziņus ar FITC konjugāta atšķaidījumu, ko izmantoja titra noteikšanai. Konjugāta tilpumam, kas uzklāts lodziņiem, jābūt vienādam ar izmantoto antivielu tilpumu.

4.3.5 Inkubera glasen på fuktigt papper övertäckta under 30 minuter vid omgivande temperatur (18–25 °C).

4.3.5. Priekšmetstikliņus 30 min inkubē uz samitrināta papīra apsegtā veidā apkārtējās vides temperatūrā (18–25 °C).

4.3.6 Skaka av konjugatdropparna från glaset. Skölj och tvätta som ovan (4.3.3).

4.3.6. Nokratīt konjugāta pilienus no priekšmetstikliņa. Noskalot un nomazgāt (sk. 4.3.3.).

Avlägsna noga överskottsfukt.

Rūpīgi nosusināt lieko šķidrumu.

4.3.7 Pipettera 5–10 µl 0,1 M fosfatbuffrad glycerol (tillägg 3) eller en inbäddningslösning som motverkar blekning som finns tillgänglig i handeln på varje fönster och lägg på ett täckglas.

4.3.7. Ar pipeti katrā lodziņā pārnest 5–10 µl 0,1 M fosfātbuferēta glicerīna (3. papildinājums) vai tirdzniecībā pieejamas saistvielas, kas sekmē krāsas noturīgumu, un uzlikt segstikliņu.

4.4 Avläsning av IF-testet:

4.4. IF testa rezultātu nolasīšana:

4.4.1 Undersök testglasen i ett epifluorescensmikroskop med filter lämpliga för FITC under olje- eller vattenimmersion vid 500–1000 gångers förstoring. Scanna fönstren utefter två diametrar i rät vinkel och runt perimetern. Om proverna inte uppvisar några eller ett litet antal celler, observera minst 40 mikroskopfält.

4.4.1. Testa priekšmetstikliņus pārbaudīt ar epifluorescences mikroskopu eļļas vai ūdens imersijā 500 līdz 1000 reižu palielinājumā, izmantojot filtrus, kas piemēroti darbam ar FITC. Lodziņus apskatīt pa diviem diametriem, kas krustojas taisnā leņķī, un pa perimetru. Attiecībā uz paraugiem, kuri uzrāda nelielu daudzumu šūnu, izskatīt vismaz 40 mikroskopa lauciņus.

Kontrollera glaset med positiv kontroll först. Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade vid den fastställda antikroppstitern eller arbetsutspädningen. IF-testet (avsnitt 4) skall återupprepas om färgningen är avvikande.

Vispirms pārbaudīt pozitīvā kontrolparauga priekšmetstikliņu. Šūnām jābūt spilgti fluorescējošām un pilnībā iekrāsotām pie noteiktā antivielu titra vai darba šķīduma. IF tests jāatkārto (4. sadaļa), ja krāsojumam ir novirze no normālā.

4.4.2 Sök efter ljusa fluorescerande celler med morfologi som är karakteristisk för C. m. subsp. Sepedonicus i testfönstren på testglasen (se kommissionens webbplats med adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescensintensiteten skall minst motsvara den positiva kontrollstammens vid samma antikroppsutspädning. Celler med ojämn eller ofullständig färgning eller med svag fluorescens skall ej beaktas.

4.4.2. Pārbaudīt, vai priekšmetstikliņu testa lodziņos ir redzamas spilgtas fluorescējošas šūnas ar C. m. subsp. sepedonicus raksturīgo morfoloģiju (sk. tīmekļa vietnē http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescences intensitātei jābūt tādai pašai kā pozitīvajam kontroles celmam tajā pašā antivielu atšķaidījumā vai intensīvākai. Šūnas ar nepilnīgu iekrāsojumu vai vāju fluorescenci netiek ņemtas vērā.

Om smitta misstänks skall testet upprepas. Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av smitta av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget.

Tests jāatkārto, ja ir aizdomas par inficēšanos. Tas var būt gadījumā, ja visi attiecīgās partijas priekšmetstikliņi uzrāda inficētas šūnas sakarā ar buferšķīduma inficēšanu vai ja inficētas šūnas tiek konstatētas uz segstikliņa (ārpus priekšmetstikliņa lodziņiem).

4.4.3 Immunofluorescenstestets specificitet ger upphov till ett flertal problem. Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som C. m. sepedonicus kan förekomma hos potatisar i naveländarna och i pelletar av stjälksegmentet.

4.4.3. Pastāv vairākas imunofluorescences testam raksturīgas problēmas. Netipiskas morfoloģijas fluorescento šūnu fona populācijas un nespecifiski reaģējošas saprofītās baktērijas, kuru izmērs un morfoloģija ir līdzīgi C. m. sepedonicus, varētu rasties kartupeļu ekstrakta koncentrātā no stolona pamanes gabaliem un kartupeļu lakstu segmentiem.

4.4.4 Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi vid titern eller vid arbetsutspädningen av antikropparna skall beaktas, såsom i 4.3.

4.4.4. Jāņem vērā tikai fluorescējošas šūnas ar izmēru un morfoloģiju, kas ir tipiska antivielu titra vai darba atšķaidījumam, kā minēts 4.3. punktā.

4.4.5 Tolkning av IF-testet:

4.4.5. IF testa nolasījuma interpretācija:

i) För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi, bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 4).

i) ja ir atrastas spilgti fluorescējošas šūnas ar raksturīgo morfoloģiju, noteikt raksturīgo šūnu vidējo skaitu mikroskopa lauciņā un aprēķināt raksturīgo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta (4. papildinājums).

IF-testet är positivt om proven innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet. Provet betraktas som potentiellt smittat och ytterligare tester krävs.

IF testa rezultātu uzskata par tiem paraugiem, kuros ir ne mazāk kā 5 × 103 tipisko šūnu uz 1 ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta. Paraugu uzskata par potenciāli inficētu un ir nepieciešama turpmāka testēšana;

ii) IF-testet är negativt om proven innehåller färre än 5 × 103 celler per ml återsuspenderad pellet och provet betraktas som negativt. Inga ytterligare tester krävs.

ii) IF testa rezultātu uzskata par negatīvu paraugiem, kuros ir mazāk nekā 5 × 103 tipisko un/vai netipisko šūnu uz 1 ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, un paraugu uzskata par negatīvu. Turpmāka testēšana nav jāveic.

5. FISH-TEST

5. FISH TESTS

Princip

Princips

Om FISH-testet används som första screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av ett IF-test göras. Om FISH-testet används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.

Ja FISH testu izmanto kā pirmo skrīninga testu un FISH testa rezultāts ir pozitīvs, kā otro obligāto skrīninga testu izmanto IF testu. Ja FISH testu izmanto kā otro skrīninga testu un tā rezultāts ir pozitīvs, lai noteiktu galīgo diagnozi, jāveic turpmāka testēšana saskaņā ar shēmu.

Anmärkning:

Piezīme:

Använd validerade C. m. subsp. sepedonicus-specifika oligo-prober (tillägg 7). Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av minst 103–104 celler av C. m. subsp. sepedonicus per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.

Izmantot validētās īpašās C. m. subsp. sepedonicus oligozondes (7. papildinājums). Obligāta ir prasība par to, ka iepriekšējiem testiem pēc šīs metodes jānodrošina reproducējama noteikšana 103–104 C. m. subsp. sepedonicus šūnas uz 1 ml, kuras pievienotas paraugu ekstraktiem, kas iepriekš uzrādījuši negatīvus rezultātus.

Följande förfarande bör helst tillämpas på nypreparerade provextrakt men kan även tillämpas på provextrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur av –16 till –24 °C eller –68 till –86 °C.

Turpmāk minēto procedūru ieteicams veikt uz tikko sagatavota ekstrakta parauga, bet to var veiksmīgi īstenot, izmantojot ekstrakta paraugus, kas glabāti glicerīna šķīdumā –16 līdz –24 °C vai –68 līdz –86 °C temperatūrā.

Som negativa kontroller använd delprover av provextrakt som tidigare givit negativt svar när de testats avseende C. m. subsp. sepedonicus.

Kā negatīvo kontrolmateriālu izmantot alikvotas no parauga ekstrakta, kas pirms tam uzrādīja negatīvu rezultātu attiecībā uz C. m. subsp. sepedonicus klātbūtni.

Som positiva kontroller preparera suspensioner innehållande 105–106 celler per ml av C. m. subsp. sepedonicus (dvs. stam NCPPB 4053 eller PD 406) i 0,01 M fosfatbuffert från en 3–5 dagar gammal kultur (preparering se tillägg 2). Preparera separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av C. m. subsp. sepedonicus, som suspenderats i potatisextrakt, såsom anges i tillägg 2.

Kā pozitīvos kontrolparaugus sagatavo suspensijas, kas satur 105 līdz 106 C. m. subsp. sepedonicus šūnas mililitrā (piemēram, NCPPB 4053 celms vai PD 406 celms) 0,01 M fosfāta buferšķīdumā (FB), izmantojot 3–5 dienu uzsējumu (sagatavošanu sk. 2. papildinājumā). Sagatavot atsevišķus homologu C. m. subsp. sepedonicus vai citu references celmu pozitīvo kontrolparaugu priekšmetstikliņus, izmantojot kartupeļu ekstrakta suspensiju, kā minēts 2. papildinājumā.

Användningen av FITC-märkt eubakteriell prob fungerar som en kontroll av hybridiseringsprocessen, eftersom den färgar alla eubakterier som finns i provet.

Ar FITC marķētās eubaktēriju oligozondes izmantošana paredz hibridizācijas procesa kontroli, jo tā iekrāso visas eubaktērijas, kas atrodas paraugā.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

Testēt kontroles materiālu tāpat kā paraugu(-us).

5.1 Fixering av potatisextrakt

5.1. Kartupeļu ekstrakta fiksēšana

Följande protokoll utgår ifrån Wullings et al., (1998):

Turpmāk izklāstītā protokola pamatā ir Wullings et al. (1998).

5.1.1 Preparera fixeringslösningen (se tillägg 7).

5.1.1. Sagatavot fiksējošo šķīdumu (sk. 7. papildinājumu).

5.1.2 Pipettera 100 µl av varje provextrakt i ett Eppendorf-rör och centrifugera under 8 minuter på 7000 g.

5.1.2. Pārnes 100 µl katra ekstrakta parauga mikromēģenē, un 8 min centrifugē ar 7000 g.

5.1.3 Avlägsna supernatanten och lös pelleten i 500 µl fixeringsvätska som preparerats < 24 timmar tidigare. Skaka och inkubera över natten i 4 °C.

5.1.3. Atdala virsējo slāni un ekstrakta koncentrātu izšķīdina 500 µl fiksatora, kas sagatavots vismaz 24 stundas pirms tam. Samaisa un 4 °C temperatūrā iztur līdz nākamajai dienai.

En alternativ fixeringsvätska är 96-procentig etanol. Vid användning av denna, lös pelleten från steg 5.1.2 i 50 µl 0,01 M fosfatbuffert och 50 µl 96-procentig etanol. Skaka och inkubera vid 4 °C under 30–60 minuter.

Kā alternatīvu fiksatoru var izmantot 96 % etanolu. Lai to izmantotu, izšķīdināt 5.1.2. punktā paredzēto ekstrakta koncentrātu, 50 µl 0,01M FB un 50 µl 96 % etanola. Samaisīt un 4 °C temperatūrā izturēt 30–60 min.

5.1.4 Centrifugera under 8 minuter på 7000 g, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 75 µl 0,01 M fosfatbuffert (se tillägg 3).

5.1.4. Centrifugēt 8 min ar 7000 g, atdalīt virsējo slāni un atkārtoti suspendēt ekstrakta koncentrātu 75 µl 0,01M FB (sk. 3. papildinājumu).

5.1.5 Droppa 16 µl av de fixerade suspensionerna på ett rent multitest-objektglas, såsom anges i fig. 3. Förse varje glas med två olika prover som är outspädda, och använd 10 µl för att göra en 1:100 utspädning (i 0,01 M fosfatbuffert). Den återstående provlösningen (49 µl) kan lagras vid –20 °C efter tillsats av 1 volym 96-procentig etanol. Om FISH-testet skall upprepas, avlägsna etanolen genom centrifugering, och tillsätt en lika stor volym 0,01 M fosfatbuffert (omskakas).

5.1.5. Pārnest 16 µl fiksējošās suspensijas uz tīra daudzkārt izmantojama priekšmetstikliņa, kā parādīts 3. attēlā. Uz katra priekšmetstikliņa uznes 2 dažādus neatšķaidītus paraugus, un 1:100 atšķaidījuma sagatavošanai (0,01M FB), izmanto 10 µl. Atlikušo šķīdumu (49 µl), pievienojot 1 tilp. 96 % etanola, var glabāt –20 °C temperatūrā. Gadījumā, ja FISH tests jāatkārto, etanolu atdala centrifugējot, un pievieno tādu pašu daudzumu 0,01M FB (samaisot ar vorteksu).

Figur 3. FISH-glasets layout

3. attēls. FISH priekšmetstikliņa shēma

+++++ TIFF +++++

| | | | |

+++++ TIFF +++++

| | | | |

Täckglas 1 | | Täckglas 2 |

1. segstikliņš | | 2. segstikliņš |

5.1.6 Lufttorka glasen (eller torka på objektglastork vid 37 °C) och fixera dem genom flambering.

5.1.6. Ļaut priekšmetstikliņiem nožūt (vai žāvēt eksikatorā 37 °C temperatūrā) un fiksēt ar liesmu.

Förfarandet kan på detta stadium avbrytas, och hybridiseringen kan fortsätta följande dag. Glasen bör förvaras dammfritt och torrt i rumstemperatur.

Šajā posmā procedūru var pārtraukt, un hibridizāciju var turpināt nākamajā dienā. Priekšmetstikliņi jāuzglabā istabas temperatūrā sausā telpā, kurā nav putekļu.

5.2 Förhybridisering och hybridisering

5.2. Hibridizācijas sagatavošana un hibridizācija

5.2.1 Preparera en lysozymlösning innehållande 10 mg lysozym (Sigma L-6876) i 10 ml buffert (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Denna lösning kan lagras men bör nedfrysas och upptinas endast en gång. Täck varje prov väl med ungefär 50 µl lysozymlösning och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur. Doppa därefter glasen i demineraliserat vatten en enda gång och torka med filterpapper.

5.2.1. Sagatavot lizocīma šķīdumu, kas satur 10 mg lizocīma (Sigma L-6876) 10 ml buferšķīduma (100 mM Tris-HCl, 59 mM ADTA, pH 8,0). Šo šķīdumu var uzglabāt, bet to drīkst sasaldēt un atkausēt tikai vienu reizi. Katru paraugu pārklāj ar aptuveni 50 µl lizocīma šķīduma un tur 10 min istabas temperatūrā. Tad priekšmetstikliņus vienu reizi iemērc demineralizētā ūdenī un nosusina ar filtrpapīru.

Alternativt kan man i stället för lysozym tillsätta 50 µl av 40–400µg ml–1 proteas K i en buffert (20 mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4) till varje brunn och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.

Alternatīvi lizocīma vietā katrā iedobē pārnes 50 µl 40–400 µg ml-1 K proteniāzes buferšķīdumā (20 mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4) un 37 °C temperatūrā inkubē 30 min.

5.2.2 Torka cellerna i en serie av etanol om 50 %, 80 % och 96 % under 1 minut vardera. Lufttorka glasen i en hållare för objektglas.

5.2.2. Šūnas dehidratēt, secīgi uz 1 min iemērcot 50 %, 80 % un 96 % etanolā. Priekšmetstikliņus nožāvē priekšmetstikliņu statīvā.

5.2.3 Preparera en fuktkammare för inkubation genom att täcka botten av en lufttät behållare med mjuk- eller filterpapper doppat i 1x hybmix (tillägg 7). Preinkubera behållaren i hybridiseringsugn vid 55 °C under minst 10 minuter.

5.2.3. Sagatavot mitro inkubācijas kameru, izklājot hermētiska boksa apakšu ar salveti vai filtrpapīru, kas iemērkts 1x hibridizācijas šķīdumā (7. papildinājums). Sagatavot boksu inkubācijai, vismaz uz 10 min ievietojot hibridizācijai žāvēšanas skapī 55 °C temperatūrā.

5.2.4 Preparera hybridiseringslösningen (tillägg 7) med 45 µl per glas, och preinkubera under 5 minuter vid 55 °C.

5.2.4. Sagatavot hibridizācijas šķīdumu (7. papildinājums), katram priekšmetstikliņam paredzot 45 µl, un 5 min turēt 55 °C temperatūrā.

5.2.5 Placera glasen på en värmeplatta vid 45 °C och tillsätt 10 µl hybridiseringslösning till var och en av de 4 brunnarna på glaset (glasen).

5.2.5. Novietot priekšmetstikliņus uz sildvirsmas 45 °C temperatūrā un pievienot pa 10 µl hibridizācijas šķīduma visos 4 iedobumos uz priekšmetstikliņa.

5.2.6 Anbringa 2 täckglas (24 × 24 mm) på varje glas utan att låta någon luft komma emellan. Placera glasen i den redan uppvärmda fuktkammaren och hybridisera över natten i ugn vid 55 °C i mörker.

5.2.6. Katram priekšmetstikliņam uzlikt 2 segstikliņus (24 x 24 mm), izspiežot gaisu. Hibridizācijai priekšmetstikliņus līdz nākamajai dienai novietot tumsā iepriekš uzsildītā mitruma kamerā 55 °C temperatūrā žāvēšanas skapī.

5.2.7 Preparera 3 bägare innehållande 1 l ultrarent vatten, 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix och 666 ml ultrarent vatten) och 1 l av 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix och 833 ml ultrarent vatten). Preinkubera var och en i vattenbad vid 55 °C.

5.2.7. Sagatavot 3 vārglāzes, kurās ir 1 l ultratīra ūdens, 1 litru 1x hibridizācijas maisījuma (334 ml 3x hibridizācijas maisījuma un 666 ml ultratīra ūdens) un 1 l 1/2x hibridizācijas maisījuma (167 ml 3x hibridizācijas maisījuma un 833 ml ultratīra ūdens). Tās sagatavot inkubācijai ūdens vannā 55 °C temperatūrā.

5.2.8 Avlägsna täckglasen från glasen och placera glasen i en hållare för objektglas.

5.2.8. No priekšmetstikliņiem noņemt segstikliņus un novietot priekšmetstikliņus statīvā.

5.2.9 Tvätta bort probe-överskott genom inkubation under 15 minuter i bägaren med 1x hybmix vid 55 °C.

5.2.9. Noskalot lieko parauga daudzumu, 15 min izturot vārglāzē ar 1x hibridizācijas maisījumu 55 °C temperatūrā.

5.2.10 För över hållaren för objektglas till 1/2 hybmix tvättlösning och inkubera under ytterligare 15 minuter

5.2.10. Ievietot priekšmetstikliņu statīvu 1/2 hibridizācijas maisījuma mazgāšanas šķīdumā un inkubēt vēl 15 min.

5.2.11 Doppa glasen hastigt i ultrarent vatten och placera dem på filterpapper. Avlägsna överskottsfukt genom att försiktigt täcka ytan med filterpapper. Pipettera 5–10 μl av inbäddningslösning som motverkar blekning (t.ex. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA eller liknande) på varje fönster och lägg ett stort täckglas (24 × 60 mm) över hela glaset.

5.2.11. Uz īsu brīdi iemērkt priekšmetstikliņus ultratīrā ūdenī un novietot uz filtrpapīra. Nosusināt lieko mitrumu, virsmu uzmanīgi pārsedzot ar filtrpapīru. Katrā lodziņā pievienot 5–10 μl krāsojuma noturīgumu sekmējoša histoloģiskā šķīduma (piemēram, Vectashield, Vecta Laboratories, Kanāda, ASV vai līdzvērtīga šķīduma) un visu priekšmetstikliņu nosegt ar lielo segstikliņu (24 × 60 mm).

5.3 Tolkning av FISH-testet

5.3. FISH testa rezultātu nolasīšana

5.3.1 Observera glasen omedelbart i ett mikroskop utrustat för epifluorescensmikroskopi vid 630 eller 1000x förstoring under oljeimmersion. Med ett filter lämpligt för fluoresceinisothiocyanat (FITC) färgas eubakteriecellerna (inklusive de flesta gramnegativa cellerna) i provet fluorescerande gröna. Med ett filter för tetrametylrodamin-5-isotiocyanat framträder Cy3-infärgade celler av C. m. subsp. sepedonicus som fluroscerande röda. Jämför cellmorfologin med de positiva kontrollernas cellmorfologi. Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade. FISH-testet (avsnitt 9.4) skall återupprepas om färgningen är avvikande. Scanna fönstren utefter två diametrar i rät vinkel och runt perimetern. På de prover som inte uppvisar några celler eller endast ett litet antal celler, observera minst 40 mikroskopfält.

5.3.1. Ar epifluorescences mikroskopu nekavējoties priekšmetstikliņus imersijas eļļā aplūkot 630 vai 1000 x palielinājumā. Ar filtru, kas piemērots fluoresceīna izotiocianātam (FITC), eubaktēriju šūnas (tostarp izteiktākās gramnegatīvās šūnas) paraugā krāso fluorescējoši zaļā krāsā. Izmantojot tetrametilrodamīna 5-izotiocianāta filtru, Cy3 iekrāsotās C. m. subsp. sepedonicus šūnas izskatās fluorescējoši sarkanas. Salīdzināt šūnu morfoloģiju ar pozitīvo kontrolmateriālu morfoloģiju. Šūnām jābūt spilgti luminiscējošām un pilnībā iekrāsotām. FISH tests (9.4. sadaļa) jāatkārto, ja krāsojumam ir novirze no normālā. Lodziņus apskatīt pa diviem diametriem, kas krustojas taisnā leņķī, un pa perimetru. Attiecībā uz paraugiem, kuri uzrāda nelielu daudzumu šūnu, aplūkot vismaz 40 mikroskopa lauciņus.

5.3.2 Sök efter klart fluorescerande celler med karakteristisk morfologi av C. m. subsp. sepedonicus i fönstren på glasen med prover (se kommissionens webbplats med adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensiteten hos fluorescensen skall vara likvärdig med eller större än fluorescensen hos den positiva kontrollstammen. Celler med ojämn eller ofullständig färgning eller med svag fluorescens beaktas inte.

5.3.2. Pārbaudīt, vai priekšmetstikliņu testa lodziņos ir redzamas spilgtas fluorescējošas šūnas ar C. m. subsp. sepedonicus raksturīgo morfoloģiju (sk. tīmekļa vietnē http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescences intensitātei jābūt tādai pašai kā pozitīvajam kontroles celmam vai intensīvākai. Šūnas ar nepilnīgu iekrāsojumu vai vāju fluorescenci netiek ņemtas vērā.

5.3.3 Om smitta misstänks skall testet upprepas. Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av smitta av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget.

5.3.3. Ja ir aizdomas par inficēšanos, tests jāatkārto. Tas var būt gadījumā, ja visi attiecīgās partijas priekšmetstikliņi uzrāda inficētas šūnas sakarā ar buferšķīduma inficēšanu vai ja inficētas šūnas tiek konstatētas uz segstikliņa (ārpus priekšmetstikliņa lodziņiem).

5.3.4 FISH-testets specificitet medför flera problem. Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som C. m. subsp. sepedonicus kan förekomma hos potatisar, dels i naveländarna, dels i pelletar av stjälksegmentet, även om de är mycket mer lågfrekventa än i IF-test.

5.3.4. Pastāv vairākas FISH testam raksturīgas problēmas. Ekstraktos no kartupeļu stolona pamatnēm un lakstu segmentiem varētu rasties netipiskas morfoloģijas fluorescences šūnu fona populācijas un nespecifiski reaģējošas saprofītās baktērijas, kuru izmērs un morfoloģija ir līdzīgi C. m. subsp. sepedonicus, taču tas notiek daudz retāk, nekā veicot IF testu.

5.3.5 Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi tas i beaktande (se 5.3.2).

5.3.5. Jāņem vērā tikai fluorescējošas šūnas ar tipisku morfoloģiju un raksturīgo izmēru, sk. 5.3.2. punktu.

5.3.6 Tolkning av resultaten från FISH-test:

5.3.6. FISH testa rezultātu interpretēšana:

i) Giltiga resultat från FISH-test erhålls om klart fluorescerande gröna celler med storlek och morfologi som är typiskt för C. m. subsp. sepedonicus observeras när ett FITC-filter används respektive klart fluorescerande röda celler när ett rodamin-filter används i alla positiva kontroller och inte i någon av de negativa kontrollerna. För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi, bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 4). Prover som innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som potentiellt smittade. Ytterligare provtagning krävs. Prover som innehåller färre än 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som negativa.

i) derīgus FISH testa rezultātus iegūst, ja visos pozitīvajos kontrolparaugos, izmantojot FITC filtru, konstatē koši zaļas fluorescējošas šūnas ar C. m. subsp. sepedonicus raksturīgo izmēru un morfoloģiju un, izmantojot rodamīna filtru, konstatē sarkanas fluorescējošas šūnas, un tās netiek konstatētas nevienā negatīvajā kontroltestā. Ja ir atrastas spilgti fluorescējošas šūnas ar raksturīgo morfoloģiju, noteikt raksturīgo šūnu vidējo skaitu mikroskopa lauciņā un aprēķināt raksturīgo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta (4. papildinājums). Paraugus, kuros konstatē ne mazāk kā 5 x 103 tipisko šūnu 1 ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, uzskata par potenciāli inficētiem. Nepieciešama turpmāka testēšana. Paraugus, kuros konstatē mazāk nekā 5 × 103 tipisko šūnu 1 ml atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta, uzskata par neinficētiem;

ii) FISH-testet är negativt om klart fluorescerande röda celler med storlek och morfologi som är typiskt för C. m. subsp. sepedonicus inte observeras när rodamin-filtret används, förutsatt att typiska klart fluorescerande röda celler observeras i de positiva kontrollpreparaten när rodamin-filtret används.

ii) FISH testa rezultāts ir negatīvs, ja, izmantojot rodamīna filtru, netiek konstatētas koši sarkanas fluorescējošas šūnas ar C. m. subsp. sepedonicus raksturīgo izmēru un morfoloģiju, ar nosacījumu, ka raksturīgās koši sarkanās fluorescējošās šūnas konstatē pozitīvajos kontrolparaugos, izmantojot rodamīna filtru.

6. PCR-TEST

6. PCR TESTS

Principer

Principi

Om ett PCR-test används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av ett IF-test göras. Om PCR-testet används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.

Ja PCR testu izmanto kā galveno skrīninga testu un tā rezultāts ir pozitīvs, kā otro obligāto skrīninga testu izmanto IF testu. Ja PCR testu izmanto kā otro skrīninga testu un tā rezultāts ir pozitīvs, lai noteiktu galīgo diagnozi, jāveic turpmāka testēšana saskaņā ar parauga testēšanas shēmu.

Fullt utnyttjande av denna metod som huvudsakligt screeningtest rekommenderas endast när särskild fackkompetens har uppnåtts.

Izmantot šo metodi kā galveno skrīninga testu ieteicams tikai gadījumos, kad ir iegūta pieredze tā izmantošanā.

Anmärkning:

Piezīme:

Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 celler av C. m. subsp. sepedonicus per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar. Optimeringsexperiment kan krävas för att uppnå maximal sensitivitets- och specificitetsnivå i alla laboratorier.

Iepriekšējiem testiem pēc šīs metodes jānodrošina reproducējama 103 līdz 104 C. m. subsp. sepedonicus šūnu uz 1 ml noteikšana, ja tās pievieno paraugu ekstraktiem, kas iepriekš uzrādījuši negatīvus rezultātus. Var būt nepieciešami optimizācijas eksperimenti, lai visās laboratorijās panāktu maksimālo jutību un specifiskumu.

Använd validerade PCR-reagens och PCR-protokoll. Välj helst en metod med internkontroll.

Izmantot validētus PCR reaģentus un protokolus. Ieteicams izvēlēties metodi ar iekšējo kontroli.

Vidta lämpliga åtgärder för att undvika nedsmittning av prover med mål-DNA. PCR-testerna bör utföras av erfarna tekniker i specialiserade molekylärbiologiska laboratorier för att minimera risken för nedsmittning av mål-DNA.

Veikt piemērotus piesardzības pasākumus, lai izvairītos no parauga inficēšanas ar mērķa DNS. PCR testu veic pieredzējuši speciālisti īpaši tam paredzētās molekulārās bioloģijas laboratorijās, lai samazinātu iespējas paraugu inficēt ar mērķa DNS.

Negativa kontroller (för DNA-extraktions- och PCR-förfaranden) bör alltid behandlas som slutliga prov i förfarandet för att tydligt kunna visa om överföring till mål-DNA har inträffat eller ej.

Negatīvie kontroltesti (DNS ekstrakcija un PCR) vienmēr jāizmanto kā procedūras galīgais paraugs, lai konstatētu, vai ir notikusi DNS pārnese.

Följande negativa kontroller bör ingå i PCR-testet:

PCR testā jāietver šādi negatīvie paraugi:

- Provextrakt som tidigare givit negativt svar när det testats med avseende på C. m. subsp. Sepedonicus.

- ekstrakta paraugs, kas pirms tam uzrādījis negatīvu rezultātu attiecībā uz C.m. subsp. Sepedonicus klātbūtni,

- Buffertkontroller som används för extrahering av bakterien och DNA från provet.

- buferšķīduma paraugi, kas izmantoti baktērijas un DNS ekstrahēšanai no parauga,

- PCR-reaktionsblandningen.

- PCR reakcijas maisījums.

Följande positiva kontroller bör tas med:

Jāiekļauj šādi pozitīvie kontrolparaugi:

- Delprover av återsuspenderad pellet till vilka C. m. subsp. sepedonicus har tillsatts (information om preparering finns i tillägg 2).

- atkārtoti suspendētu ekstraktu alikvotas, kurām pievienota C. m. subsp. sepedonicus (sagatavošanu sk. 2. papildinājumā),

- En suspension av 106 celler per ml av C. m. subsp. sepedonicus i vatten från ett virulent isolat (t.ex. NCPPB 2140 eller NCPPB 4053).

- no virulenta izolāta iegūta ūdens suspensija ar 106 C. m. subsp. sepedonicus šūnām uz 1 ml (piemēram, NCPPB 2140 vai NCPPB 4053),

- Om möjligt använd dessutom DNA från positiva kontrollprover i samband med att PCR-test.

- ja iespējams,, izmantot arī DNS, kas iegūta no pozitīvajiem kontrolparaugiem, veicot PCR testu.

För att undvika risk för smitta, preparera positiva kontroller i en separat omgivning från de prover som skall testas.

Lai izvairītos no iespējamās inficēšanās, pozitīvo kontrolparaugu sagatavošana telpiski jānodala atsevišķi no testējamajiem paraugiem.

Provextrakten bör vara så fria från jord som möjligt. Om PCR-protokoll skall användas kan det därför i vissa fall vara tillrådligt att preparera extraheringar från tvättade potatisar.

Paraugu ekstrakti iespējami jāattīra no augsnes. Tādēļ gadījumos, kad jāizmanto PCR protokols, ieteicams sagatavot ekstraktus no mazgātiem kartupeļiem.

6.1 Metoder för rening av DNA

6.1. DNS attīrīšanas metodes

Använd positiva och negativa kontrollprover såsom beskrivs ovan.

Izmantot pozitīvos un negatīvos kontrolparaugus saskaņā ar aprakstu iepriekš.

Preparera kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

Sagatavot kontroles materiālu tāpat kā paraugu(-us).

Det finns en rad olika metoder för att rena mål-DNA från komplexa provsubstrat och på så sätt avlägsna inhibitorer av PCR och andra enzymreaktioner och koncentrera mål-DNA i provextraktet.

Sarežģītu paraugu substrātu gadījumā mērķa DNS attīrīšanai ir pieejamas dažādas metodes, kas ļauj atdalīt PCR inhibitorus, novērst citas fermentatīvas reakcijas un koncentrēt mērķa DNS parauga ekstraktā.

Följande metod har optimerats för att användas tillsammans med den validerade PCR-metod som visas i tillägg 6.

Lietošanai kopā ar validēto PCR metodi, kas aprakstīta 6. papildinājumā, ir optimizēta šāda metode:

6.1 a) Metod enligt Pastrik (2000)

6.1.a) Pastrik (2000) metode.

1. Pipettera 220 µl av lyseringsbuffert (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.

1. Pārnest 220 µl līzes buferšķīduma (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml tilpuma mikromēģenē.

2. Tillsätt 100 µl provextrakt och placera i värmeblock eller vattenbad vid 95 °C under 10 minuter.

2. Pievienot 100 µl parauga ekstrakta un uz 10 min novietot sildīšanas blokā vai ūdens vannā 95 °C temperatūrā.

3. Ställ röret på kylning under 5 minuter.

3. Mēģeni 5 min turēt ledū.

4. Tillsätt 80 µl Lysozym utgångslösning (50 mg lysozym per ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0) och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.

4. Pievienot 80 µl lizocīma standartšķīduma (50 mg lizocīma uz 1 ml 10 mM Tris HCl, pH 8,0) un 30 min turēt 37 °C temperatūrā.

5. Tillsätt 220 µl Easy DNA® lösning A (Invitrogen), blanda väl genom skakning och inkubera vid 65 °C under 30 minuter.

5. Pievienot 220 µl Easy DNA® šķīduma A (Invitrogen), labi samaisīt un 30 min turēt 65 °C temperatūrā.

6. Tillsätt 100 µl Easy DNA® lösning B (Invitrogen), skaka kraftigt tills fällningen svävar fritt i röret och provet är jämnt trögflytande.

6. Pievienot 100 µl Easy DNA® šķīduma B (Invitrogen), rūpīgi samaisīt ar vorteksu, līdz paraugs kļūst viendabīgi viskozs.

7. Tillsätt 500 µl kloroform och skaka tills viskositeten ökar och blandningen är homogen.

7. Pievienot 500 µl hloroforma un maisīt, līdz viskozitāte samazinās un maisījums kļūst viendabīgs.

8. Centrifugera vid 15000 g under 20 minuter vid 4 °C för att separera faserna och bilda interfasen.

8. Centrifugēt 20 min 4 °C temperatūrā pie 15000 g, lai atdalītu fāzes un veidotu starpfāzi.

9. För över den övre fasen till ett rent Eppendorf-rör.

9. Pārnest virsējo fāzi tīrā mikromēģenē.

10. Tillsätt 1 ml 100-procentig etanol (–20 °C), skaka snabbt och inkubera under nedkylning under 10 minuter.

10. Pievienot 1 ml 100 % etanola (–20 °C), īsu brīdi maisīt vorteksā un izturēt uz ledus 10 minūtes.

11. Centrifugera vid 15000 g under 20 minuter vid 4 °C och avlägsna etanolen från pelleten.

11. Centrifugēt 20 min 4 °C temperatūrā pie 15000 g un atdalīt etanolu no ekstrakta koncentrāta.

12. Tillsätt 500 µl 80-procentig etanol (–20 °C) och blanda genom att vända upp och ned på röret.

12. Pievienot 500 µl 80 % etanola (–20 °C) un samaisīt, mēģeni apgriežot otrādi.

13. Centrifugera vid 15000 g under 10 minuter vid 4 °C, spara pelleten och avlägsna etanolen.

13. Centrifugēt 10 min 4 °C temperatūrā pie 15000 g, saglabāt ekstrakta koncentrātu un atdalīt etanolu.

14. Låt pelleten lufttorka eller torka i en DNA speed vac.

14. Ļaut ekstraktam izžūt istabas temperatūrā vai DNS vakuumžāvētājā.

15. Återsuspendera pelleten i 100 µl sterilt ultrarent vatten och låt stå i rumstemperatur under minst 20 minuter.

15. Atkārtoti suspendēt ekstrakta koncentrātu 100 µl sterila ultratīra ūdens un atstāt istabas temperatūrā vismaz uz 20 min.

16. Lagra vid –20 °C fram till användning för PCR.

16. Līdz izmantošanai PCR glabāt –20 °C temperatūrā.

17. Blanda ned alla eventuella vita fällningar genom centrifugering och använd 5 µl av supernatanten innehållande DNA till PCR.

17. Centrifugējot atdalīt baltas nogulsnes, ja tādas ir, un PCR izmantot 5 µl virsējā slāņa, kas satur DNS.

6.1 b) Andra metoder

6.1.b) Citas metodes

Andra metoder för extraktion av DNA (t.ex. Qiagen DNeasy Plant Kit) skulle kunna användas, förutsatt att det är belagt att de har lika stor inverkan när det gäller att rena DNA från kontrollprover innehållande 103–104 patogena celler per ml.

Citas DNS ekstrakcijas metodes (piemēram, Qiagen DNeasy Plant Kit) var izmantot ar nosacījumu, ka ir pierādīta to līdzvērtīga efektivitāte DNS attīrīšanā no kontrolparaugiem, kas 1 ml satur 103 līdz 104 patogēno baktēriju.

6.2 PCR

6.2. PCR

6.2.1 Preparera test- och kontrolltemplat för PCR enligt det validerade protokollet (tillägg 6). Preparera en decimal utspädning av DNA-provextrakt (1:10 i ultrarent vatten).

6.2.1. Sagatavot PCR testa un kontroles paraugus saskaņā ar validētu protokolu (6. papildinājums). Sagatavot vienu no parauga iegūta DNS ekstrakta decimālatšķaidījumu (1:10 ultratīrā ūdenī).

6.2.2 Preparera lämplig PCR-reaktionsblandning i en omgivning fri från smitta enligt det offentliggjorda protokollet (tillägg 6). Det validerade PCR-protokollet är en multiplexreaktion som även omfattar en intern PCR-kontroll.

6.2.2. Saskaņā ar publicēto protokolu (6. papildinājums) sagatavot atbilstošu PCR reakcijas maisījumu vidē, kurā nevar notikt inficēšanās. Validētais PCR protokols ir daudzkārtēja reakcija, kas ietver arī PCR iekšējo kontroli.

6.2.3 Tillsätt 5 µl DNA-extrakt per 25 µl PCR-reaktion i sterila PCR-rör.

6.2.3. Pievienot 5 µl DNS ekstrakta uz katriem 25 µl PCR reaģenta sterilās PCR mēģenēs.

6.2.4 Blanda i ett negativt kontrollprov innehållande PCR-reaktionsblandning och tillsätt ultrarent vatten av samma ursprung som det som användes i PCR-blandningen i stället för provet.

6.2.4. Sagatavot negatīvā kontroltesta paraugu, kas satur tikai PCR reakcijas maisījumu, un parauga vietā pievienot tās pašas izcelsmes sterilu ūdeni, kas tika izmantots PCR maisījumā.

6.2.5 Placera rören i samma termocykelapparat som användes vid föregående testning och kör lämpligt optimerat PCR-program (tillägg 6).

6.2.5. Ievietot mēģenes tajā pašā termokamerā, ko izmantoja iepriekšējās pārbaudēs, un īstenot optimizēto PCR programmu (6. papildinājums).

6.3 Analys av PCR-produkten

6.3. PCR produkta analīze

6.3.1 Lös PCR-produkten med agarosgelelektrofores. Använd minst 12 µl av amplifierad DNA-reaktionsblandning från varje prov blandat med 3 µl laddningsbuffert (tillägg 6) i 2,0 % (w/v) agarosgel i tris-acetat-EDTA (TAE)-buffert (tillägg 6) vid 5–8 V per cm. Använd en lämplig DNA-markör, t.ex. 100 bp storleksmarkör.

6.3.1. Sadalīt PCR amplikonus ar agarozes gela elektroforēzi. To veic ar 5–8 V/cm, ņemot vismaz 12 µl DNS pavairošanas reakcijas maisījuma no katra parauga, kas sajaukts ar 3 µl parauga uznešanas buferšķīduma (6. papildinājums) 2,0 % (m/v) agarozes gela tris-actetāt-EDTA (TAE) buferšķīdumā (6. papildinājums). Izmantot atbilstošu DNS marķieri, piemēram, "100 bp ladder".

6.3.2 Påvisa DNA-band genom att färga i etidiumbromid (0,5 mg per l) under 30-45 minuter, varvid lämpliga försiktighetsåtgärder bör vidtas vid hanteringen av mutagenen etidiumbromid.

6.3.2. Lai izceltu DNS joslas, 30–45 min tās krāsot ar etīdija bromīdu (0,5 mg/l), ievērojot atbilstošus piesardzības pasākumus darbam ar šo mutagēno vielu.

6.3.3 Observera det färgade gelet i kortvågs-UV-genomlysning (t.ex. λ = 302 nm) och sök efter amplifierade DNA-produkter av förväntad storlek (tillägg 6) och dokumentera.

6.3.3. PCR produktiem, kuru izmērs atbilst paredzētajam (6. papildinājums), izgaismot iekrāsoto gelu ar īsviļņu UV transiluminatoru (piemēram, λ = 302 nm), un ainu dokumentēt.

6.3.4 För varje ny upptäckt/nytt fall verifiera autenticiteten hos PCR-produkten genom att utföra restriktionsenzymanalys på ett prov av det återstående amplifierade DNA genom inkubation vid optimal temperatur och under optimal tid med en lämplig enzym och buffert (se tillägg 6). Lös de uppdelade fragmenten genom agarosgelelektrofores, som ovan, och observera det karakteristiska restriktionsfragmentsmönstret vid UV-genomlysning efter färgning i etidiumbromid, och jämför med den ouppdelade och uppdelade positiva kontrollen.

6.3.4. Visiem no jauna konstatētajiem gadījumiem salīdzināt PCR amplikona autentiskumu, veicot fermentu restrikcijas analīzi atlikušajam DNS pavairošanas paraugam, optimālā temperatūrā optimālu laiku inkubējot ar atbilstošu fermentu un buferšķīdumu (sk. 6. papildinājumu). Identificēt fragmentus, kas sašķelti agarozes gela elektroforēzē pēc iepriekš norādītās metodes, un izgaismot ar UV transiluminatoru fragmentu raksturīgo izvietojumu pēc restrikcijas ar fermentu un iekrāsošanas ar etīdija bromīdu. Salīdzināt pozitīvās liecības pirms sašķelšanas un pēc tās.

Tolkning av PCR-resultaten:

PCR testa rezultātu interpretācija

PCR-testet är negativt om det C. m. subsp. sepedonicus-specifika PCR-produkten av den förväntade storleken inte upptäcks i provet, men upptäcks i alla positiva kontrollprover (i fallet multiplex-PCR med plantspecifika interna kontrollprimrar skall en andra PCR-produkt av förväntad storlek amplifieras med provet i fråga).

PCR testa rezultāts ir negatīvs, ja C. m. subsp. sepedonicus raksturīgais paredzamā izmēra PCR amplikons attiecīgajā paraugā netiek konstatēts, bet to konstatē visos pozitīvajos kontroltestos daudzkārtējas PCR gadījumā ar augiem raksturīgiem iekšējās kontroles praimeriem: otrais paredzamā izmēra PCR produkts jāpavairo ar attiecīgo paraugu.

PCR-testet är positivt om det C. m. subsp. sepedonicus-specifika PCR-produkten av den förväntade storleken och det förväntade restriktionsmönstret (vid behov) upptäcks, förutsatt att det inte amplifierats från någon av de negativa kontrollproven. Tillförlitlig bekräftelse av ett positivt resultat kan även erhållas genom att testet upprepas med en andra uppsättning PCR-primrar (avsnitt 9.3).

PCR testa rezultāts ir pozitīvs, ja tiek konstatēts īpašais C. m. subsp. sepedonicus paredzamā izmēra PCR amplikons ar raksturīgo izvietojumu pēc restrikcijas (vajadzības gadījumā), ar nosacījumu, ka tas nav iegūts no kāda no negatīvo kontroltestu paraugiem. Drošu pozitīvā rezultāta apstiprinājumu var iegūt arī, atkārtojot testu ar otru PCR praimeru komplektu (9.3. sadaļa).

Anmärkning:

Piezīme:

Inhibering av PCR kan misstänkas om den förväntade produkten erhålls från det positiva kontrollprovet innehållande C. m. subsp. sepedonicus i vatten men negativa resultat erhålls från positiva kontroller med C. m. subsp. sepedonicus i potatisextrakt. I multiplexa PCR-protokoll med interna PCR-kontroller anges inhibering av reaktionen när inget av de båda produkterna erhålls.

Var rasties aizdomas par PCR traucējumiem, ja paredzamais amplikons ir iegūts no pozitīvā kontroltesta parauga, kas satur C. m. subsp. sepedonicus ūdenī, bet pozitīvie kontroltesti ar C. m. subsp. sepedonicus kartupeļu ekstraktā uzrāda negatīvus rezultātus. Daudzkārtējas PCR protokolos ar iekšējiem PCR kontroltestiem uz reakcijas traucējumiem norāda tas, ka neviens no abiem amplikoniem netiek iegūts.

Smitta kan misstänkas om den förväntade produkten erhålls från en eller flera av de negativa kontrollerna.

Aizdomas par inficēšanos var rasties, ja paredzamais amplikons ir iegūts no viena vai vairākiem negatīvajiem kontroltestiem.

7. BIOTEST

7. BIOPATOGENITĀTES TESTS

Anmärkning:

Piezīme:

Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 koloniformande enheter av C. m. subsp. sepedonicus per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar (information om prepareringen finns i tillägg 2).

Iepriekšējai orientējošai testēšanai pēc šīs metodes jānodrošina reproducējama noteikšana 103 līdz 104 C. m. subsp. sepedonicus kolonijas veidojošo vienību 1 ml, ja tās pievieno paraugu ekstraktiem, kas iepriekš uzrādījuši negatīvus rezultātus (sagatavošanu sk. 2. papildinājumā).

Högst känslighetsnivå för upptäckt kan förväntas då nyligen preparerade provextrakt används och optimala tillväxtförhållanden tillämpas. Metoden kan emellertid med framgång tillämpas på extrakt som har lagrats i glycerol vid –68 till –86 °C.

Visaugstākā noteikšanas jutība sagaidāma, izmantojot tikko sagatavotu paraugu ekstraktu un nodrošinot optimālus attīstības apstākļus. Tomēr šo metodi var veiksmīgi izmantot arī ekstraktiem, kas glabāti –68 līdz –86 °C temperatūrā glicerīna šķīdumā.

Vissa sorters äggplantor utgör ett utmärkt selektivt förökningssubstrat för tillväxt av C. m. subsp. sepedonicus, även i avsaknad av symptom, och är också utmärkta för bekräftande värdtest.

Dažas baklažānu šķirnes ir teicama selektīva barotne C. m. subsp. sepedonicus attīstībai pat tad, ja nav simptomu, kā arī nodrošina teicamu saimniekauga apstiprinājuma testu.

Tillväxtförhållandena bör vara optimala för att minska risken för falska negativa testresultat.

Lai samazinātu kļūdaini negatīvu testa rezultātu risku, attīstības apstākļiem jābūt optimāliem.

Detaljerad information om odling finns i tillägg 8.

Audzēšana sīkāk aprakstīta 8. papildinājumā.

7.1 Fördela hela det återstående testdelprovet av den återsuspenderade pelleten från avsnitt 3.1.6 eller 3.2.5 mellan äggplantorna genom att tillämpa en av nedan angivna metoder (7.3 eller 7.4). Använd endast plantor på bladstadium 2–3 upp till full utveckling av trebladsstadiet. För att säkerställa fullständig användning av den återsuspenderade pelleten och effektiv inokulation kommer de nedan beskrivna förfarandena att kräva 15–25 äggplantor per prov.

7.1. Sadalīt atkārtoti suspendētā ekstrakta koncentrāta visu atlikušo testa alikvotu, kā norādīts 3.1.6. vai 3.2.5. punktā baklažānu augiem, izmantojot vienu no turpmāk aprakstītajām metodēm (7.3. vai 7.4.). Izmantot tikai augus 2–3 lapu fāzē līdz brīdim, kad pilnīgi attīstījusies trešā īstā lapa. Lai nodrošinātu, ka atkārtoti suspendētais ekstrakta koncentrāts tiek izmantots pilnīgi un turpmāk minētie inokulācijas procesi būtu efektīvi, turpmāk aprakstīto procedūru izpildei nepieciešami paraugi, ko veido 15–25 baklažānu augi.

7.2 Undvik att vattna äggplantorna 1–2 dagar före inokulationen för att minska saftspänningen.

7.2. Baklažānu augus nelaistīt 1 līdz 2 dienas pirms inokulācijas sākuma, lai samazinātu turgora spiedienu.

7.3 Inokulation genom skåra

7.3. Inokulācija ar šķēlumu:

7.3.1 Håll plantan mellan två fingrar, droppa med hjälp av en pipett en droppe (ca 5–10 µl) av det uppslammade koncentrerade extraktet på stjälken mellan hjärtbladen och det första bladet.

7.3.1. Pieturot augu ar diviem pirkstiem, uz stublāja, starp dīgļlapām un pirmo lapu ar pipeti ievadīt vienu pilienu suspendēta ekstrakta koncentrātu (apmēram 5 līdz 10 μl).

7.3.2 Med en steril skalpell görs en diagonal skåra ungefär 1,0 cm lång och ungefär lika djup som två tredjedelar av stjälkens diameter med början vid droppen med det koncentrerade extraktet.

7.3.2. Ar sterilu skalpeli izdarīt aptuveni 1,0 cm garu un apmēram 2/3 no stublāja diametra dziļu diagonālu griezumu, griezienu sākot no punkta, kurā ievadīts ekstrakta koncentrāta piliens.

7.3.3 Förslut skåran med sterilt vaselin från en spruta.

7.3.3. Griezumu cieši noslēgt ar sterilu vazelīnu no šļirces.

7.4 Inokulation med en spruta

7.4. Inokulācija ar šļirci:

7.4.1 Inokulera äggplantornas stjälkar precis ovanför hjärtbladen med en spruta som är försedd med injektionsnål (minst 23G). Fördela provet mellan äggplantorna.

Baklažānu stublājus inokulēt uzreiz virs dīgļlapām, izmantojot šļirci ar adatu zemādas injekcijām (ne mazāku par 23G). Sadalīt ekstrakta koncentrātu starp baklažānu augiem.

7.5 Som positiva kontroller, inokulera 5 plantor med en vattensuspension av 105 till 106 celler per ml av känd kultur av C. m. subsp. sepedonicus och, vid behov, med naturligt angripen knölvävnad (se avsnitt 4) genom samma inokuleringsmetod (7.3 eller 7.4).

7.5. Pozitīviem kontroltestiem inokulēt 5 augus ar ūdens suspensiju, kuras 1 ml satur 105 līdz 106 zināmas C. m. subsp. sepedonicus kultūras šūnas, un, ja iespējams, ar dabīgi inficētu bumbuļu audiem (sk. 4. sadaļu), izmantojot to pašu inokulācijas metodi (7.3. vai 7.4.).

7.6 Som negativa kontroller, inympa 5 plantor med steril pelletbuffert genom samma inokuleringsmetod (7.3 eller 7.4).

7.6. Negatīviem kontroltestiem 5 augus inokulē ar sterilu ekstrakta koncentrāta šķīdumu, izmantojot to pašu inokulācijas metodi (7.3. vai 7.4.).

7.7 Inkubera plantorna i karantänsanläggningar upp till 4 veckor vid 18–24 °C. Inkubera plantorna med tillräckligt ljus och fuktighet (70–80 %) och vatten för att förhindra vattenmättnad eller vissnande på grund av vattenbrist. C. m. sepedonicus celler dör vid temperaturer över 30 °C, och den optimala temperaturen är 21 °C. För att undvika nedsmittning, inkubera positiva och negativa kontrollplantor på strikt separata bänkar i ett växthus eller odlingsrum eller, vid platsbrist, se till att hanteringen sker strikt separat. Om plantor från olika prover skall inkuberas tätt tillsammans, separera dem med lämpliga skärmar. Vid gödning, bevattning, inspektion och annan behandling, var noga med att undvika korskontaminering. Det är mycket viktigt att hålla växthus och odlingsrum fria från alla skadeinsekter eftersom de kan överföra bakterien från prov till prov.

7.7. Karantīnas apstākļos augus 18–24 °C temperatūrā inkubēt 4 nedēļas. Augi jāinkubē pietiekamā apgaismojumā, piemērotā mitrumā (70–80 %) un jālaista, lai novērstu ūdens izsīkšanu vai auga novīšanu ūdens trūkuma dēļ. C. m. sepedonicus šūnas iet bojā temperatūrā, kas pārsniedz 30 °C, bet optimālā attīstības temperatūra ir 21 °C. Lai nepieļautu inficēšanos, pozitīvo kontroltestu un negatīvo kontroltestu paraugus inkubēt uz atsevišķiem siltumnīcas plauktiem vai audzēšanas kamerās, vai, ja nepietiek vietas, stingri nodalīt apstrādes materiālus. Ja augi dažādiem paraugiem jāinkubē cieši blakus, tie jāatdala ar atbilstošiem aizslietņiem. Mēslojot, laistot, pārbaudot un veicot citas darbības, jābūt piesardzīgiem, lai neizraisītu savstarpēju inficēšanos. Ir ļoti svarīgi, lai siltumnīcās nebūtu kaitēkļu, jo tie var pārnest baktērijas no viena auga un citu.

7.8 Efter en vecka undersöks plantorna på vanligt sätt efter symptom. Räkna antalet plantor som uppvisar symptom. C. m. subsp. sepedonicus orsakar vissnade blad hos äggplantor, vilket kan börja som slapphet längs kanterna eller mellan nerverna. Vissnad vävnad kan till en början se mörkgrön eller fläckig ut, men bleknar innan den blir nekrotisk. Vissnade områden mellan bladnerverna ser ofta feta och vattenfyllda ut. Nekrotisk vävnad har ofta en klart gul kant. Plantorna dör nödvändigtvis inte; ju längre tid som går innan symptomen visar sig, desto större är chansen för överlevnad. Plantorna kan kväva infektionen. Unga äggplantor är mycket mottagligare för små populationer av C. m. subsp. sepedonicus än äldre plantor. Därför är det nödvändigt att använda plantor på eller lite före bladstadium 3.

7.8. Pēc nedēļas sākt simptomu regulāru pārbaudi. Saskaita, cik augiem ir raksturīgie simptomi. C. m. subsp. sepedonicus izraisa baklažānu lapu vīšanu, kas var sākties kā ļenganums lapu malās vai starp lapas dzīslām. Savītušiem audiem sākotnēji var būt tumši zaļa krāsa vai plankumi, bet pirms atmiršanas tie kļūst bālāki. Savītuši audi starp lapas dzīslām bieži izskatās kā taukaini un it kā piepildīti ar ūdeni. Atmirušiem audiem bieži ir spoži dzeltena robežlīnija. Augi var pilnībā neaiziet bojā, jo ilgāks ir periods, kad neparādās slimības pazīmes, jo lielāka ir augu izdzīvošanas iespēja. Augi var izturēt infekciju. Pret mikroorganismiem ieņēmīgi jauni baklažānu augi ir daudz jutīgāki pret mazām C. m. subsp. sepedonicus populācijām nekā vecāki augi, tādēļ ir nepieciešams izmantot augus 3. lapas stadijā vai tikko pirms tās.

Vissnandet kan också orsakas av andra bakterie- eller svamppopulationer som finns i det koncentrerade extraktet av knölarnas vävnad. Dessa kan utgöras av Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora och E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata och stora bestånd av saprofytiska bakterier. Särskilt Erwinia chrysanthemi kan orsaka bladsymptom och vissnande som är mycket lika symptomen på C. m. sepedonicus. Den enda skillnaden är svartnandet av stjälkarna vid infektion med Erwinia chrysanthemi. Andra typer av vissnande kan skiljas från det vissnande som orsakas av C. m. subsp. sepedonicus eftersom hela blad eller hela plantor vissnar snabbt. Även gramfärgning kan göras: detta test skiljer C. m. subsp. sepedonicus från Erwinia spp.

Vīšanu var izraisīt arī citu baktēriju vai sēnīšu populācijas, kas var būt bumbuļu audu ekstrakta koncentrātā. Tās var būt Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora, subsp. carotovora un E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, kā arī plašas saprofīto baktēriju populācijas. Jo īpaši Erwinia chrysanthemi var izraisīt lapu simptomus un vīti, kas ir ļoti līdzīga C. m. sepedonicus simptomiem. Vienīgā atšķirība ir stumbra melnēšana Erwinia chrysanthemi infekcijas gadījumā. Cita veida vīšanu var atšķirt no C. m. subsp. sepedonicus izraisītās vīšanas, tā kā veselas lapas vai pat veseli augi vīst ļoti ātri. Var sagatavot arī krāsojumu pēc Grama – šis tests atšķirs C. m. subsp. sepedonicus no Erwinia spp.

7.9 Så snart symptom observeras på äggplantorna bör en reisolation göras, varvid segment av vissnad bladvävnad eller stjälkvävnad används (information om finfördelning av vävnad finns i 3.1.3). Desinficera ytan på äggplantornas blad och stjälkar genom att torka av dem med 70-procentig etanol. Gör ett IF-test eller PCR-test på äggplantans växtsaft och isolera på lämpliga (selektiva) substrat (se avsnitt 8). Även gramfärgning (tillägg 9) kan prepareras. Identifiera renkulturer av presumtiv C. m. subsp. sepedonicus och bekräfta skadegöraren (se avsnitten 9 och 10).

7.9. Tiklīdz baklažānu augiem ir vērojami simptomi, jāveic atkārtota izolācija, izmantojot šo augu savītušos lapu audus un stublāja audus (par audu macerāciju sk. 3.1.3. sadaļu). Dezinficēt baklažānu lapu virsmas un stublājus, notīrot tos ar 70 % etanolu. Veikt baklažānu sulas IF testu vai PCR un izolēt atbilstošā (selektīvā) barotnē (sk. 8. sadaļu). Var sagatavot arī krāsojumu pēc Grama (9. papildinājums). Identificēt iespējamās C. m. subsp. sepedonicus tīrkultūras un apstiprināt patogenitāti (sk. 9. un 10. sadaļu).

7.10 Under vissa omständigheter, i synnerhet då tillväxtförhållandena inte är optimala, är det möjligt för C. m. subsp. sepedonicus att existera som en latent infektion i äggplantorna, till och med efter inkubationsperioder på upp till 4 veckor. Om inga symptom observeras efter 4 veckor: utför IF/PCR på ett blandprov av 1 cm stjälksegment från varje testplanta taget ovanför inokuleringsstället. Om testet är positivt bör en omisolering på lämpliga (selektiva) substrat göras enligt förfarandet i avsnitt 8. Identifiera renkulturer av presumtiv C. m. subsp. sepedonicus och bekräfta patogenitet (avsnitten 9 och 10).

7.10. Noteiktos apstākļos, jo īpaši tad, ja audzēšanas apstākļi nav optimāli, C. m. subsp. sepedonicus var saglabāties baklažānu augos kā latenta infekcija pat pēc 4 nedēļu inkubācijas. Ja simptomi netiek novēroti pēc 4 nedēļām, jāveic IF/PCR tests apvienotam paraugam, kas sastāv no 1 cm gariem stublāja posmiem, kuri no katra testa auga ņemti virs inokulācijas vietas. Ja testa rezultāts ir pozitīvs, pēc procedūras, kas minēta 8. pantā, jāveic atkārtota izolācija piemērotā (selektīvā) barotnē. Identificēt iespējamās C. m. subsp. sepedonicus tīrkultūras un apstiprināt patogenitāti (sk. 9. un 10. sadaļu).

Tolkning av resultatet av biotestet

Biopatogenitātes testa rezultātu interpretēšana

Giltiga resultat från biotest erhålls om plantor från den positiva kontrollen uppvisar typiska symptom, bakterier kan omisoleras från dessa plantor och inga symptom återfinns på de negativa kontrollerna.

Derīgus biopatogenitātes testa rezultātus iegūst, ja pozitīvā kontroltesta augiem konstatē tipiskus simptomus, no šiem augiem baktērijas var izolēt atkārtoti, un negatīvajos kontroltestos simptomus nekonstatē.

Biotestet är negativt om testplantorna inte är infekterade med C. m. subsp. sepedonicus och under förutsättning att C. m. subsp. sepedonicus påvisas i de positiva kontrollerna.

Biopatogenitātes testa rezultāti ir negatīvi, ja testa augi nav inficēti ar C. m. subsp. sepedonicus, ar nosacījumu, ka C. m. subsp. sepedonicus tiek konstatēta pozitīvajos kontroltestos.

Biotestet är positivt om testplantorna är infekterade med C. m. subsp. sepedonicus.

Biopatogenitātes testa rezultāts ir pozitīvs, ja augi ir inficēti ar C. m. subsp. sepedonicus.

8. ISOLERING AV C. M. SUBSP. SEPEDONICUS

8. C. m. SUBSP. SEPEDONICUS IZOLĒŠANA

Anmärkning:

Piezīme:

Diagnosen är endast fullständig om C. m. subsp. sepedonicus isoleras, därefter identifieras (se avsnitt 9) och bekräftas av ett patogenitetstest (avsnitt 10). Trots att C. m. subsp. sepedonicus är en skadegörare som är svår att hantera är det möjligt att isolera den utgående från vävnad som visar symptom på angrepp.

Diagnozi var apstiprināt tikai tad, kad C. m. subsp. sepedonicus ir izolēts, pēc tam identificēts (sk. 9. sadaļu) un apstiprināts ar patogenitātes testu (10. sadaļa). Kaut gan C. m. subsp. sepedonicus ir izvēlīgs organisms, to var izdalīt no audiem ar inficēšanās pazīmēm.

Den kan emellertid kvävas av snabbt växande saprofytiska bakterier och därför är det svårt att utföra isolering direkt från pelleten av stjälk- eller knölvävnad (avsnitt 3.1.6 eller 3.2.5). Med ett selektivt substrat och lämplig utspädning av den återsuspenderade pelleten från potatisarnas naveländar eller stjälkar kan det vara möjligt att utföra direkt isolering av C. m. subsp. sepedonicus.

Tomēr to var nomākt saprofītās baktērijas, kas ātri attīstās, un tāpēc tieša izdalīšana no bumbuļu vai stublāju audu ekstrakta koncentrāta (3.1.6. vai 3.2.5. sadaļa) ir sarežģīta. Ar selektīvu barotni un atbilstošu atkārtoti suspendētu kartupeļu stolona pamatņu vai stublāju ekstrakta koncentrāta šķīdumu ir iespējama tieša C. m. subsp. sepedonicus izolēšana.

Isolering bör göras från alla potatisknölar och stjälksegment och från äggplantor som visserligen inte uppvisat symptom vid observation men vars blandprov givit negativt svar vid IF-/PCR-test (se avsnitt 7.10). Om nödvändigt bör finfördelning av äggplantsstjälkar utföras som i avsnitt 3.1.3.

Izolēšanu veic visiem kartupeļu bumbuļiem vai stublāju segmentiem un baklažāniem, kuriem nav inficēšanās pazīmju, bet attiecībā uz kuriem rezultāts IF/PCR testam, izmantojot apvienoto paraugu (sk. 7.10. sadaļu), bija pozitīvs. Baklažānu augu stublāju macerāciju, ja nepieciešams, veic saskaņā ar aprakstu 3.1.3. sadaļā.

Som positiva kontroller preparera decimala utspädningar från en suspension av 106 kolonibildande enheter per ml av C. m. subsp. sepedonicus (t.ex. NCPPB 4053 eller PD 406). För att undvika risk för nedsmittning, preparera positiva kontroller som är fullständigt åtskilda från de prover som skall testas.

Pozitīviem kontroltestiem izmanto tādas suspensijas decimālatšķaidījumus, kurā ir 106 kolonijas veidojošo vienību C. m. subsp. sepedonicus mililitrā (piemēram, NCPPB 4053 vai PD 406). Lai izvairītos no iespējamās inficēšanās, pozitīvos kontroltestus pilnībā nodala no paraugiem, kurus paredzēts testēt.

För varje nyligen preparerat parti av selektivt substrat bör dess lämplighet för tillväxt av patogenet testas innan det används för att testa rutinprover.

Katrai tikko sagatavotai selektīvās barotnes partijai pirms paredzētās paraugu testēšanas pārbauda tās atbilstību patogēna attīstībai.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

Testēt kontroles materiālu tāpat kā paraugu(-us).

8.1 Odling på selektivt substrat

8.1. Selektīvie uzsējumi

8.1.1 Från ett delprov på 100 µl från ett återsuspenderat potatispelletprov eller äggplantsväxtsaft gör exponentiella utspädningar i en pelletbuffert (tillägg 3).

8.1.1. Izmantojot 100 µl atkārtoti suspendēta kartupeļu ekstrakta koncentrāta vai baklažānu sulas alikvotu, pagatavot desmitkārtīgu atšķaidījumu ekstrakta koncentrāta buferšķīdumā (3. papildinājums).

8.1.2 Isolering från outspädd potatispellet misslyckas vanligen på grund av den komplicerade tillväxtkaraktären hos C. m. subsp. sepedonicus och konkurrens från saprofyterna. Eftersom bakterien vanligen förekommer i stora populationer i infekterade vävnader kan saprofyter vanligen spädas, samtidigt som patogenet kvarstår. Det rekommenderas därför att 100 µl från varje prov, 1/100 till 1/10000 utspädningar sprids ut på MTNA-substrat eller NCP-88-substrat (tillägg 5) (om en 90 mm petriskål används, anpassa volymen efter alternativa skålstorlekar), varvid racklor och racklingsteknik används.

8.1.2. Izolēšana no neatšķaidīta kartupeļu ekstrakta koncentrāta parasti neizdodas, jo Cms ir ļoti jutīga attiecībā uz augšanas veidu un konkurenci ar saprofītiem. Tā kā baktērijas inficētajos audos parasti tiek konstatētas lielās populācijās, saprofītus var izšķīdināt saglabājot patogēnus. Tāpēc ir ieteicams no katra parauga 100 µl 1/100 līdz 1/10000 atšķaidījuma pārnest uz MTNA barotnes vai NCP-88 barotnes (5. papildinājums) (izmantojot Petri traukus ar diametru 90 mm, citiem trauku izmēriem attiecīgi pielāgo daudzumu), izmantojot stienīti (stikla stienīti) un ar metodi, kas paredz parauga izlīdzināšanu uz plates.

Anmärkning:

Piezīme:

Ett alternativt tillvägagångssätt är att sprida ut den ursprungliga 100 µl potatispelletdelprovet på en första agarplatta med en rackla och därefter överföra racklan till en andra agarplatta, där alla eventuella rester på racklan stryks ut. Upprepa slutligen förfarandet på en tredje platta för att på så sätt få till stånd en utspädningsplatt-effekt med hjälp av racklan.

Alternatīva iespēja ir 100 µl sākotnējā kartupeļu ekstrakta koncentrāta alikvotu izlīdzināt uz pirmās agara plates ar stienīti, un tad uz stienīša esošo atlikumu noslaucīt gar otro agara plati; visbeidzot to pašu atkārtot gar trešo plati, tādējādi ar stienīti uzsējot atšķaidījumu.

8.1.3 Inkubera plattorna i mörker vid 21–23 °C.

8.1.3. Izturēt plates tumsā 21–23 °C temperatūrā.

8.1.4 Inledande undersökningar av plattorna, inklusive, genom hänvisning till kontrollplattorna, räkning av alla C. m. subsp. sepedonicus–liknande kolonier sker efter 3 dagar, och ytterligare räkning sker efter 5, 7 och slutligen 10 dagar.

8.1.4. Sākotnējā plašu pārbaudē, tostarp salīdzinot ar kontroltestu platēm, pēc trīs dienām saskaita C. m. subsp. sepedonicus līdzīgās kolonijas, turpmāko skaitīšanu veicot pēc 5, 7 un beidzot pēc 10 dienām.

8.2 Rening av misstänkta kolonier

8.2. Aizdomīgo koloniju attīrīšana

Anmärkning:

Piezīme:

Subkulturodling av C. m. subsp. sepedonicus-liknande kolonier bör ske på YGM-substrat för inokulering av äggplantor och/eller efterföljande identifiering. Detta bör ske innan plantorna blir alltför stora, det vill säga helst efter 3–5 dagar.

Uz YGM barotnes jāveic C. m. subsp. sepedonicus līdzīgo koloniju uzsējums nolūkā turpmāk veikt baklažānu augu inokulāciju un/vai identifikāciju; tas jāveic, pirms plates ir pāraugušas, t. i., pēc 3–5 dienām.

8.2.1 Stryk C. m. subsp. sepedonicus-liknande kolonier på ett av följande substrat (formler anges i tillägg 5):

8.2.1. Uzsēt C. m. subsp. sepedonicus līdzīgās kolonijas uz vienas no šādām barotnēm: (to sastāvs norādīts 5. papildinājumā):

Näringsagar med dextros (endast för renkultur).

barojošs dekstrozes agars (izmantojams tikai pārsēšanai),

Agar med jäst, pepton och glukos.

rauga peptona glikozes agars,

Agar med jästextrakt och mineralsalter.

barojošs rauga ekstrakta minerālsāļu agars.

Inkubera i 21–24 °C i upp till 10 dagar.

Inkubēt 21–24 °C temperatūrā līdz 10 dienām.

C. m. subsp. sepedonicus växer långsamt och producerar knappnålsliknande, krämfärgade, kupolformade kolonier inom 10 dagar. (Foton på typiska kolonier av C. m. subsp. sepedonicus finns på kommissionens webbplats med adress http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

C. m. subsp. sepedonicus ir lēni augošs organisms, kas parasti 10 dienās veido niecīgi mazas (kā adatas smaile) krēmkrāsas kupolveidīgas kolonijas. C. m. subsp. sepedonicus raksturīgo koloniju fotoattēli atrodami Komisijas tīmekļa vietnē: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

8.2.2 Stryk på nytt för att uppnå renhet.

8.2.2. Pārsēšana tīrkultūru iegūšanai

Tillväxttakten förbättras genom renkulturodling. Typiska kolonier är krämvita eller elfenbensvita, ibland gula, runda, släta, upphöjda, kupolkonvexa, slemaktiga till flytande, har hela kanter och är vanligtvis 1–3 mm i diameter.

Augšanas ātrums palielinās pēc pārsēšanas. Tipiskas kolonijas ir krēmbaltā vai ziloņkaula krāsā, dažkārt dzeltenas, noapaļotas, gludas, paaugstinātas, ar izliektu kupolveidīgu formu, gļotaini šķidras, ar veselām malām un parasti 1 līdz 3 mm diametrā.

En enkel gramfärgning (tillägg 9) kan utföras för att underlätta att välja kolonier för ytterligare testning.

Parastā krāsošana pēc Grama (9. papildinājums) var palīdzēt izvēlēties kolonijas turpmākām pārbaudēm.

8.2.3 Identifiera presumtiva kulturer (se avsnitt 9) och gör ett patogenitetstest (se avsnitt 10).

8.2.3. Identificēt iespējamās kultūras (sk. 9. sadaļu) un veikt patogenitātes testu (sk. 10. sadaļu).

9. IDENTIFIERING

9. IDENTIFIKĀCIJA

Identifiera renkulturer av presumtiva C. m. subsp. sepedonicus-isolat genom att utföra minst två av följande tester baserade på olika biologiska principer.

Identificē iespējamās C. m. subsp. sepedonicus izolātu tīrkultūras, izmantojot vismaz divus no minētajiem testiem, kas balstīti uz dažādiem bioloģiskajiem principiem.

Ta med kända referensstammar när så är lämpligt vid varje test som utförs.

Attiecīgā gadījumā iekļaut zināmus references celmus katram veiktajam testam.

9.1 Nutrient- och enzymatiska identifikationstester

9.1. Audzēšanas barotnēs un fermentatīvās identifikācijas testi

Fastställ följande fenotypiska egenskaper som alltid är närvarande eller frånvarande i C. m. subsp. sepedonicus enligt metoderna Lelliott och Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001), anonym (1987).

Noteikt turpmāk norādītās fenotipiskās pazīmes, kas pastāvīgi ir vai nav konstatējamas C. m. subsp. sepedonicus saskaņā ar metodēm Lelliot un Stead (1987), Klement et.al. (1990), Schaad (2001), anonīms aut. (1987).

Alla substrat bör inkuberas vid 21 °C och undersökas efter 6 dagar. Om ingen tillväxt har skett, inkubera i upp till 20 dagar.

Visas barotnes inkubē 21 °C temperatūrā un apskata pēc sešām dienām. Ja augšana nenotiek, tās jāinkubē līdz 20 dienām.

Alla tester skall inbegripa en känd C. m. subsp. sepedonicus-kontroll. Näringstester och fysiologiska tester skall utföras med inokulat från subkulturer på näringsagar. De morfologiska jämförelserna skall göras på grundval av odlingar på näringsagar med dextros.

Visos testos jāiekļauj C. m. subsp. sepedonicus kontroltests. Barības vielu un fermentu identifikācijas testi jāveic attiecībā uz inokulātu no pārtikas agara uzsējuma. Morfoloģiskie salīdzinājumi jāveic, izmantojot kultūras, kas audzētas uz barojoša dekstrozes agara.

Försök | Förväntat resultat |

Testi | Sagaidāmais rezultāts |

Oxidations-/fermenteringstest (O/F-test) | Inert eller svagt oxidativa |

Oksidācijas/fermentācijas (O/F) tests | Inerta vai vāji oksidatīva |

Oxidasaktivitet | – |

Oksidāzes aktivitāte | – |

Tillväxt vid 37 °C | – |

Pieaugums 37 °C temperatūrā | – |

Ureasaktivitet | – |

Ureāzes izstrāde | – |

Hydrolys av aesculin | + |

Eskulīna hidrolīze | + |

Hydrolys av stärkelse | – eller svag |

Cietes hidrolīze | – vai vāji izteikta |

Tolerans hos 7-procentig NaCl | – |

Tolerance pret 7 % NaCl | – |

Produktion av indol | - |

Indola tests | – |

Katalasaktivitet | + |

Katalāzes aktivitāte | + |

Produktion av H2S | – |

H2S izstrāde | – |

Utnyttjande av citrat | – |

Citrāta patēriņš | – |

Smältning av gelatin | – |

Želatīna sašķidrināšana | – |

Syra från glycerol | - |

Skābe no glicerīna | – |

Syra från laktos | – eller svag |

Skābe no laktozes | – vai vāji izteikta |

Syra från ramnos | – |

Skābe no ramnozes | – |

Syra från salicin | – |

Skābe no salicīna | – |

Gramfärgning (tillägg 9) | + |

Krāsojums pēc Grama (9. papildinājums) | + |

9.2 IF-test

9.2. IF tests

a) Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i IF-buffert (tillägg 3).

a) Sagatavot suspensiju IF buferšķīdumā, kurā ir aptuveni 106 šūnas mililitrā (3. papildinājums).

b) Preparera en serie dubbla utspädningar av ett lämpligt antiserum.

b) Sagatavot atbilstošās antivielas divkāršu atšķaidījumu sērijas.

c) Tillämpa IF-förfarandet (avsnitt 4).

c) Veikt IF procedūru (4. sadaļa).

d) Ett positivt IF-test erhålls om kulturen har samma IF-titer som den positiva kontrollen.

d) IF testa rezultāts ir pozitīvs, ja kultūras IF titrs ir vienāds ar pozitīvā kontroltesta titru.

9.3 PCR-test

9.3. PCR tests

a) Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i ultrarent vatten.

a) Sagatavot suspensiju ultratīrā ūdenī, kurā ir aptuveni 106 šūnas ml.

b) Upphetta 100 µl av cellsuspensionen i tillslutna rör i värmeblock eller kokande vattenbad i 100 °C under 4 minuter. Vid behov, tillsats av nyligen preparerad NaOH till en slutkoncentration av 0,05 M kan bidra till lysering av cellen. Proverna kan därefter lagras i –16 till –24 °C fram till användning.

b) 100 µl šūnu suspensijas slēgtās mēģenēs termokamerā vai verdoša ūdens vannā 4 min karsē 100 °C temperatūrā. Nepieciešamības gadījumā tikko sagatavota NaOH pievienošana 0,05 M galīgajai koncentrācijai var palīdzēt šūnu līzei. Tad paraugus var glabāt –16 līdz –24 °C temperatūrā, līdz tie ir nepieciešami.

c) Tillämpa lämpliga PCR-förfaranden för att amplifiera C. m. subsp. sepedonicus-specifika PCR-produkter (t.ex. Pastrik, 2000; se tillägg 4; Li och de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik och Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

c) Veikt atbilstošās PCR procedūras, lai pavairotu C. m. subsp. sepedonicus raksturīgos amplikonus (piemēram, Pastrik, 2000; sk. 4. papildinājumu; Li un de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik un Rainey, 1999; Schaad et al., 1999.

d) En positiv identifiering av C. m. subsp. sepedonicus erhålls om PCR-produkterna har samma storlek och samma RFLP (restriction fragment length polymorphisms) som den positiva kontrollstammen.

d) C. m. subsp. sepedonicus identifikācija ir pozitīva, ja PCR amplikoniem ir tādi paši restrikcijas fragmentu garuma polimorfismi un amplikoni ir vienādi pēc izmēra ar pozitīvā kontroltesta celmu.

9.4 FISH-test

9.4. FISH tests

a) Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i ultrarent vatten.

a) Sagatavot suspensiju ultratīrā ūdenī kurā ir aptuveni 106 šūnas ml.

b) Tillämpa FISH-förfarandet (avsnitt 5).

b) Veikt FISH procedūru (5. sadaļa).

c) Ett positivt FISH-test föreligger om samma reaktioner erhålls från kulturen och den positiva kontrollen.

c) FISH testa rezultāts ir pozitīvs, ja uzsējuma un pozitīvā kontroltesta reakcijas ir vienādas.

9.5 Fettsyraprofilering (FAP)

9.5. Taukskābju sastāva profilēšanas tests (FAP)

a) Odla kulturen på trypticase-soja-agar (Oxoid) under 72 timmar i 21 °C (+/– 1°).

a) Audzēt kultūru uz triptāzes sojas agara (Oxoid) 72 stundas 21 °C temperatūrā (±1 °C).

b) Tillämpa ett lämpligt FAP-förfarande (Janse, 1991; Stead, 1992).

b) Izmantot atbilstošu FAP procedūru (Janse, 1991; Stead, 1992).

c) Ett positivt FAP-test erhålls om den presumtiva kulturen har samma profil som den positiva kontrollen. Förekomsten av karakteristiska fettsyror är 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso samt 16:0 och 17:0 Anteiso, vilket i hög grad tyder på C. m. sepedonicus. Andra sorter, såsom Curtobacterium, Arthrobacter and Micrococcus, innehåller också vissa av dessa syror, men 15:1 Anteiso A är en ovanligt syra i dessa bakterier. Den uppträder emellertid i alla Clavibacter spp. med en andel på 1–5 %. I C. m. sepedonicus är andelen vanligtvis omkring 5 %.

c) FAP testa rezultāts ir pozitīvs, ja iespējamās kultūras profils ir vienāds ar pozitīvā kontroltesta profilu. Taukskābes 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 un 17:0 Anteiso ir raksturīgas C. m. sepedonicus. Citām ģintīm piederīgām baktērijām, piemēram, Curtobacterium, Arthrobacter un Micrococcus, arī ir dažas no šīm taukskābēm, bet 15:1 Anteiso A ir reta skābe šajās baktērijās; tā ir visās Clavibacter spp. robežās no 1 % līdz 5 %. C. m. sepedonicus baktērijās šis daudzums parasti ir aptuveni 5 %.

9.6 BOX-PCR

9.6. BOX-PCR

a) Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i ultrarent vatten.

a) Sagatavot suspensiju ultratīrā ūdenī, kurā ir aptuveni 106 šūnas ml.

b) Utför testet enligt förfarandet (Smith et al., 2001).

b) Veikt testu saskaņā ar procedūru (Smith et al., 2001).

10. VERIFIERINGSTEST

10. APSTIPRINĀJUMA TESTS

Patogenitetstestet skall utföras som en slutlig bekräftelse på en diagnos av C. m. subsp. sepedonicus och för att bedöma virulensen hos kulturer identifierade som C. m. subsp. Sepedonicus.

Patogenitātes tests jāveic, lai galīgi apstiprinātu C. m. subsp. sepedonicus diagnozi un apstiprinātu kultūru virulenci, kas identificētas kā C. m. subsp. sepedonicus.

10.1 Preparera ett inokulat av ca 106 celler per ml av 3-dagarskulturer av det isolat som skall kontrolleras och en lämplig positiv kontrollstam av C. m. subsp. sepedonicus.

10.1. No testējamā izolāta 3 dienu uzsējuma sagatavot inokulātu, kurā ir aptuveni 106 šūnas ml, un sagatavot pozitīvā kontroltesta C. m. subsp. sepedonicus celmu.

10.2 Inokulera 5–10 äggplantsstjälkar av unga småplantor i bladstadium 3 (avsnitt 7.3 eller 7.4).

10.2. Inokulēt 5–10 jaunu baklažānu sēklaudžu stublājus 3 lapu fāzē (7.3. vai 7.4. sadaļa).

10.3 Inkubera i 18–24 °C med tillräckligt ljus och hög relativ luftfuktighet med lämplig bevattning för att undvika vattenmättnad eller stress till följd av torka (avsnitt 7.7). Med renkulturer bör typiskt vissnande uppnås inom 2 veckor, men plantor som inte visar symptom (se avsnitt 7.8) efter denna tid bör inkuberas i upp till 3 veckor vid temperaturer som främjar äggplantornas tillväxt men som inte överstiger 25 °C (tillägg 8). Om inga symptom föreligger efter 3 veckor, kan det inte fastslås att kulturen är en patogen form av C. m. subsp. sepedonicus.

10.3. Inkubēt 18–24 °C temperatūrā pietiekamā apgaismojumā, augstā relatīvajā mitrumā un laistīt, lai novērstu ūdens izsīkšanu vai auga novīšanu ūdens trūkuma dēļ (7.7. sadaļa). Tīrkultūrām raksturīgo vīti novēro 2 nedēļu laikā, taču augus, kuriem nav inficēšanās pazīmju pēc minētā laika (sk. 7.8. sadaļu), turpina audzēt līdz 3 nedēļu perioda sasniegšanai tādā temperatūrā, kas veicina baklažānu augu attīstību, bet nav augstāka par 25 °C (8. papildinājums). Ja pēc 3 nedēļām nav inficēšanās pazīmju, kultūru nevar apstiprināt kā C. m. subsp. sepedonicus patogēno formu.

10.4 Isolera från plantor med symptom genom att avlägsna ett segment från stjälken på 2 cm ovanför inokuleringspunkten. Finfördela och suspendera i en liten volym sterilt destillerat vatten eller 50 mM fosfatbuffert (tillägg 3). Isolera från suspensionen genom utspädning. Rackla eller stryk därefter på MTNA och YPGA (tillägg 5), inkubera under 3–5 dagar i 21–23 °C och observera bildandet av kolonier typiska för C. m. subsp. sepedonicus.

10.4. Augiem ar inficēšanās pazīmēm izolēt stumbra daļu, ko izgriež 2 cm virs inokulācijas vietas. Sasmalcināt un suspendēt nelielā daudzumā sterila destilēta ūdens vai 50 mM fosfāta buferšķīduma (3. papildinājums). Izolēt no suspensijas uzklājot vai uzsējot atšķaidījumu uz MTNA vai YPGA (5. papildinājums), 3–5 dienas inkubēt 21–23 °C temperatūrā un novērot C. m. subsp. sepedonicus tipisko koloniju veidošanos.

--------------------------------------------------

Tillägg 1

1. papildinājums

Laboratorier som utför optimering och validering av protokoll

Laboratorijas, kas piedalās protokolu optimizācijas un validācijas procesā

Laboratorium [1] | Plats | Land |

Laboratorija [1] | Atrašanās vieta | Valsts |

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Wien och Linz | Österrike |

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Vīne un Linca | Austrija |

Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgien |

Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Beļģija |

Plantedirektoratet | Lyngby | Danmark |

Plantedirektoratet | Lyngby | Dānija |

Central Science Laboratory | York | England |

Central Science Laboratory | Jorka | Anglija |

Scottish Agricultural Science Agency | Edinburgh | Skottland |

Scottish Agricultural Science Agenncy | Edinburga | Skotija |

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Frankrike |

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Francija |

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre | Le Rheu | Frankrike |

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre | Le Rheu | Francija |

Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Tyskland |

Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Vācija |

Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Tyskland |

Pflanzenschutzamt Hannover | Hannovere | Vācija |

State Laboratory | Dublin | Irland |

State Laboratory | Dublina | Īrija |

Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Nederländerna |

Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Nīderlande |

Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre | Ås | Norge |

Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre | Aas | Norvēģija |

Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lissabon | Portugal |

Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lisabona | Portugāle |

Nacionalni institut za biologijo | Ljubljana | Slovenien |

Nacionalni institut za biologijo | Ļubļana | Slovēnija |

Centro de Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Spanien |

Centro de Diagnóstico de Aldearrubia | Salamanka | Spānija |

[1] Kontaktuppgifter för personalen finns på kommissionens webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

[1] Zinātniekus kontaktpersonas sk. tīmekļa vietnē http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

--------------------------------------------------

Tillägg 2

2. papildinājums

Preparering av positiva och negativa kontroller för screeningtesterna av naveländar PCR/IF och FISH

Pozitīvo un negatīvo kontroltestu sagatavošana svarīgākajiem skrīninga testiem PCR/IF un FISH

Framställ en 72-timmarskultur av en virulent stam av C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 eller PD 406) på MTNA och suspendera i 10 mM fosfatbuffert för att erhålla en celltäthet av omkring 1-2 × 108 kolonibildande enheter per ml. Detta erhålls vanligtvis genom en svagt grumlig suspension med en optisk densitet av 0,20 vid 600 nm.

Sagatavot C. m. subsp. sepedonicus virulentā celma 72 stundu uzsējumu [NCPPB 4053 vai PD 406] uz MTNA barotnes un suspendēt 10 mM fosfātšķīdumā, lai iegūtu šūnu koncentrāciju aptuveni 1 līdz 2 x 108 kolonijas veidojošo vienību 1 ml. Tā parasti ir viegli duļķaina suspensija ar optisko blīvumu 0,20 pie 600 nm.

Avlägsna naveländarna från 200 knölar tagna från en odling som är känd för att vara fri från C. m. subsp. sepedonicus och där potatis med vitt skal odlas.

Atdalīt stolona pamatnes vadaudu gabalus 200 kartupeļu bumbuļiem no šķirnes ar baltu mizu, par kuriem zināms, ka tie ir brīvi no C. m. subsp. sepedonicus.

Behandla naveländarna på vanligt sätt och suspendera pelleten i 10 ml.

Apstrādāt stolona pamatnes kā parasti un atkārtoti suspendēt ekstrakta koncentrātu 10 ml.

Preparera 10 sterila 1,5 ml mikrorör med 900 µl av den återsuspenderade pelleten.

Sagatavot 10 sterilas 1,5 ml tilpuma mikromēģenes ar 900 µl atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta.

Överför 100 µl av suspensionen av C. m. subsp. sepedonicus till det första mikroröret. Skaka.

Pārnest 100 µl C. m. subsp. sepedonicus suspensijas pirmajā mikromēģenē. Homogenizēt, izmantojot vorteksu.

Fastställ decimala kontamineringsnivåer genom ytterligare spädning i de andra fem mikrorören.

Sagatavot decimālatšķaidījumus nākamajās piecās mikromēģenēs.

De sex smittade mikrorören används som positiva kontroller. De fyra icke-smittade mikrorören används som negativa kontroller. Märk mikrorören i överensstämmelse härmed.

Sešas inficētās mikromēģenes tiks izmantotas kā pozitīvie kontrolparaugi. Četras neinficētās mikromēģenes tiks izmantotas kā negatīvie kontrolparaugi. Mikromēģenes attiecīgi marķēt.

Preparera delprover på 100 µl i steril 1,5 ml mikrorör och erhåll på så sätt 9 repliker av varje kontrollprov. Lagra i –16 till –24 °C fram till användning.

Sagatavot 100 µl alikvotas 1,5 ml tilpuma mikromēģenēs, tādējādi iegūstot 9 katra kontrolparauga dublikātus. Līdz izmantošanai glabāt –16 līdz –24 °C temperatūrā.

Förekomsten och kvantifieringen av C. m. subsp. sepedonicus i kontrollproverna bör först bekräftas via IF.

C. m. subsp. sepedonicus klātbūtne un daudzums kontrolparaugos vispirms jāapstiprina ar IF testu.

För PCR-testet, gör DNA-extraktion från de positiva och negativa kontrollproven för varje serie av testprover.

PCR testam veikt DNS ekstrakciju no pozitīvajiem un negatīvajiem kontrolparaugiem katrā testa paraugu sērijā.

För IF- och FISH-testen, gör testerna på de positiva och negativa kontrollproven för varje serie av testprover.

IF un FISH testam veikt pozitīvo un negatīvo kontrolparaugu testēšanu katrā testa paraugu sērijā.

För IF-, FISH- and PCR-testerna skall C. m. subsp. sepedonicus påvisas i minst 106–104 celler/ml i de positiva kontrollerna och inte i någon i de negativa kontrollerna.

IF, FISH un PCR testiem minimālajai C. m. subsp. sepedonicus noteikšanas jutībai pozitīvajā kontrolē ir jābūt 106 un 104 šūnas/ml, un tās netiek atrastas nevienā negatīvajā kontrolparaugā.

--------------------------------------------------

Tillägg 3

3. papildinājums

Buffertar för testförfarandena

Buferšķīdumi testu procedūrām

ALLMÄN ANMÄRKNING: Oöppnade steriliserade buffertar kan förvaras i upp till ett år.

VISPĀRĪGI: Sterilus buferšķīdumus neatvērtā veidā var glabāt ne ilgāk kā vienu gadu.

1. Buffertar för extraktionsförfarande

1. Ekstrakcijas procedūras buferšķīdumi

1.1 Extraktionsbuffert (50 mM fosfatbuffert, pH 7,0)

1.1. Ekstrakcijas buferšķīdumi (50 mM fosfāta buferšķīdums, pH 7,0)

Denna buffert används för extraktion av bakterien från plantvävnader genom homogenisering eller skakning.

Šo buferšķīdumu izmanto baktēriju ekstrakcijai no augu audiem ar homogenizācijas vai kratīšanas metodi.

Na2HPO4 (vattenfri) | 4,26 g |

Na2HPO4 (bez ūdens) | 4,26 g |

KH2PO4 | 2,72 g |

Destillerat vatten | 1,00 l |

Destilēts ūdens | 1,00 l |

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

Ytterligare komponenter kan vara av nytta enligt följande:

Papildu komponentus var lietot šādi:

| Syfte | Kvantitet (per l) |

| Mērķis | Daudzums (uz l) |

Lubrolflingor | Deflockulering [1] | 0,5 g |

Lubrola pārslas | Deflokulants [1] | 0,5 g |

DC-silikonskumdämpning | Skumdämpningsmedel [1] | 1,0 ml |

DC silikona pretputu līdzeklis | Pretputošanas līdzeklis [1] | 1,0 ml |

Tetranatriumpyrofosfat | Antioxidant | 1,0 g |

Tetranātrija pirofosfāts | Antioksidants | 1,0 g |

Polyvinylpyrrolidon-40000 (PVP-40) | Bindning av PCR-inhibitorer | 50 g |

Polivinilpirolidons-40000 (PVP -40) | PCR inhibitoru saistīšnai | 50 g |

1.2 Pelletbuffert (10 mM fosfatbuffert, pH 7,2)

1.2. Nogulšņu buferšķīdumi (10 mM fosfāta buferšķīdums, pH 7,2)

Denna buffert används för återsuspension och utspädning av extrakt av naveländar från potatisknölar efter koncentration till en pellet följd av centrifugering.

Šo buferšķīdumu izmanto, lai atkārtoti suspendētu un atšķaidītu ekstraktu no kartupeļu bumbuļu stolona pamatnes gabaliem, kas koncentrēts ar centrifugēšanas metodi.

Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |

NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |

Destillerat vatten | 1,00 l |

Destilēts ūdens | 1,00 l |

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

2. Buffertar för IF-test

2. IF testa buferšķīdumi

2.1 IF-buffert (10 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2)

2.1. IF buferšķīdums (10 mM fosfātbuferēts nātrija hlorīda fizioloģiskais šķīdums, (PBS) pH 7,2)

Denna buffert används för utspädning av antikroppar.

Šo buferšķīdumu izmanto antivielu atšķaidīšanai.

Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |

NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |

NaCl | 8,0 g |

Destillerat vatten | 1,0 l |

Destilēts ūdens | 1,0 l |

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

2.2 IF-buffert – Tween

2.2. IF-Tween buferšķīdums

Denna buffert används för att tvätta objektglas.

Šo buferšķīdumu izmanto priekšmetstikliņu mazgāšanai.

Tillsätt 0,1 % Tween 20 till IF-bufferten.

Pievienot IF buferšķīdumam 0,1 % Tween 20.

2.3 Fosfatbuffrad glycerol, pH 7,6

2.3. Fosfātbuferēts glicerīns, pH 7,6.

Denna buffert används som monteringsvätska på fönstren av IF-glas för att förbättra fluorescensen.

Šo buferšķīdumu izmanto kā histoloģisko šķidrumu, ko uznes IF priekšmetstikliņa lodziņiem, lai pastiprinātu fluorescenci.

Na2HPO4.12H2O | 3,2 g |

NaH2PO4.2H2O | 0,15 g |

Glycerol | 50 ml |

Glicerīns | 50 ml |

Destillerat vatten | 100 ml |

Destilēts ūdens | 100 ml |

Inbäddningslösning som motverkar blekning finns i handeln, t.ex. Vectashield® (Vector Laboratories) och Citifluor® (Leica).

Pret izbalēšanu noturīgi histoloģiskie šķidrumi ir nopērkami gatavi, piemēram, Vectashield® (Vector Laboratories) vai Citifluor® (Leica).

[1] Används med homogeniseringsextraktionsmetoden.

[1] Izmantošanai ar homogenizācijas ekstrakcijas metodi.

--------------------------------------------------

Tillägg 4

4. papildinājums

Bestämning av kontamineringsnivå i IF- och FISH-tester

Inficēšanās līmeņa noteikšana ar IF un FISH testu

1. Räkna medeltalet typiska fluorescerande celler per synligt fält (c).

1. Saskaitīt raksturīgi fluorescējošo šūnu vidējo skaitu vienā laukā (c).

2. Beräkna antalet typiska fluorescerande celler per objektglasfönster (C).

2. Aprēķināt raksturīgi fluorescējošo šūnu skaitu vienā mikroskopa lodziņā (C).

C = c × S/s

där | S | = | multispotglasets fönsteryta, och |

kurā | S | = | daudzlodziņu priekšmetstikliņa viena lodziņa virsmas laukums un |

| s | = | objektivfältets yta |

| s | = | objektīva redzes lauka virsmas platība. |

s = πi2/4G2K2 | där | i | = | synfältskoefficient (varierar från 8 till 24 beroende på typen av okular) |

s = πi2/4G2K2 | kur | i | = | lauka koeficients (atkarībā no okulāra tipa tas var būt robežās no 8-24), |

| | K | = | tubkoefficient (1 eller 1,25) |

| | K | = | mēģenes koeficients (1 vai 1,25), |

| | G | = | objektivets förstoring (100×, 40× osv.). |

| | G | = | objektīva palielinājums (100x, 40x u. c.). |

3. Beräkna antalet typiska fluorescerande celler per ml återsuspenderad pellet (N)

3. Aprēķināt raksturīgo fluorescējošo šūnu skaitu vienā mililitrā atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta (N).

N = C × 1000/y × F

där | y | = | volym av återsuspenderad pellet på varje fönster, och |

kur | y | = | atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta daudzums katrā lodziņā un |

| F | = | den återsuspenderade pelletens utspädningsfaktor. |

| F | = | atkārtoti suspendēta ekstrakta koncentrāta atšķaidījuma pakāpe. |

--------------------------------------------------

Tillägg 5

5. papildinājums

Substrat för isolering och odling av C. m. subsp. sepedonicus

Barotne C. m. subsp. sepedonicus izolācijai un audzēšanai

a) Allmänna odlingssubstrat

a) Vispārējas augšanas barotnes

Näringsagar (NA)

Barojošs agars (NA)

Näringsagar (Difco) | 23,0 g |

Barojošs agars (Difco) | 23,0 g |

Destillerat vatten | 1,0 l |

Destilēts ūdens | 1,0 l |

Lös upp ingredienserna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Izšķīdināt sastāvdaļas un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

Näringsagar med dextros (NDA)

Barojošs dekstrozes agars (NDA)

Difco Bacto näringsagar innehållande 1-procentig D(+)-glukos (monohydrat). Steriliseras i autoklav vid 115 °C i 20 minuter.

Difco bacto Barojošs agars, kas satur 1 % D(+) glikozes (monohidrāta). Sterilizēt 20 min autoklāvā 115 °C temperatūrā.

Agar med jäst, pepton och glukos (YPGA)

Rauga peptona glikozes agars (YPGA)

Jästextrakt (Difco) | 5,0 g |

Rauga ekstrakts (Difco) | 5,0 g |

Bacto pepton (Difco) | 5,0 g |

Baktopeptons (Difco) | 5,0 g |

D(+)-glukos (monohydrat) | 10,0 g |

D(+)-glikoze (monohidrāts) | 10,0 g |

Bacto agar (Difco) | 15,0 g |

Baktoagars (Difco) | 15,0 g |

Destillerat vatten | 1,0 l |

Destilēts ūdens | 1,0 l |

Lös upp ingredienterna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Izšķīdināt sastāvdaļas un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

Agar med jästextrakt och mineralsalter (YGM)

Rauga ekstrakta minerālsāļu barotne (YGM)

Bacto jästextrakt (Difco) | 2,0 g |

Bakto rauga ekstrakts (Difco) | 2,0 g |

D(+)-glukos (monohydrat) | 2,5 g |

D(+) Glikoze (monohidrāts) | 2,5 g |

K2HPO4 | 0,25 g |

KH2PO4 | 0,25 g |

MgSO4.7H2O | 0,1 g |

MnSO4.H2O | 0,015 g |

MnSO4. H2O | 0,015 g |

NaCl | 0,05 g |

FeSO4.7H2O | 0,005 g |

Bacto agar (Difco) | 18 g |

Baktoagars (Difco) | 18 g |

Destillerat vatten | 1,0 l |

Destilēts ūdens | 1,0 l |

Lös upp ingredienserna och sterilisera 0,5 liter av substrat i autoklav vid 115 °C under 20 minuter.

Izšķīdināt sastāvdaļas un devās pa 0,5 l sterilizēt 20 min autoklāvā 115 °C temperatūrā.

b) Validerade selektiva odlingssubstrat

b) Validētās selektīvās augšanas barotnes

MTNA-substrat

MTNA barotne

Om inte annat anges kommer substratens beståndsdelar från BDH

Ja nav norādīts citādi, visi barotnes komponenti ir no BDH.

Jästextrakt (Difco) | 2,0 g |

Rauga ekstrakts (Difco) | 2,0 g |

Mannitol | 2,5 g |

Mannīts | 2,5 g |

K2HPO4 | 0,25 g |

KH2PO4 | 0,25 g |

NaCl | 0,05 g |

MgSO4.7H2O | 0,1 g |

MnSO4.H2O | 0,015 g |

MnSO4. H2O | 0,015 g |

FeSO4.7H2O | 0,005 g |

Agar (Oxoid nr 1) | 16,0 g |

Agars (Oxoid Nr. 1) | 16,0 g |

Destillerat vatten | 1,0 l |

Destilēts ūdens | 1,0 l |

Lös upp ingredienserna, justera pH till 7,2. Efter sterilisering i autoklav vid 121 °C i 15 minuter och nedkylning till 50 °C, tillsätt följande antibiotika: trimetoprim 0,06 g, nalidixinsyra 0,002 g och amfotericin B 0,01 g.

Izšķīdināt sastāvdaļas, līdzsvarot pH līdz 7,2. Pēc sterilizēšanas autoklāvā (15 min 121 °C temperatūrā) un atdzišanas līdz 50 °C pievienot antibiotikas: trimetroprimu 0,06 g, nalidiksīnskābi 0,002 g, amfotericīnu B 0,01 g.

Antibiotiska utgångslösningar: trimetoprim (Sigma) and nalidixinsyra (Sigma) (båda vid 5 mg/ml), i 96-procentig metanol, amfotericin B (Sigma) (1 mg/ml) i dimetylsulfoxid. Utgångslösningarna är filtersteriliserade.

Antibiotiku rezerves šķīdumi: trimetroprims (Sigma) un nalidiksīnskābe (Sigma) (abi 5 mg/ml), 96 % metanolā, amfotericīns B (Sigma) (1 mg/ml) dimetilsulfoksīdā. Standartšķīdumus sterilizē filtrējot.

Anmärkning:

Piezīme:

Bassubstratens hållbarhet är 3 månader. Efter tillsats av antibiotika är hållbarheten 1 månad vid förvaring nedkylt.

Pamatbarotnes derīguma termiņš ir 3 mēneši. Pēc antibiotiku pievienošanas derīguma termiņš ir 1 mēnesis, ja to uzglabā atdzesētu.

NCP-88-substrat

NCP-88 barotne

Näringsagar (Difco) | 23 g |

Barojošs agars (Difco) | 23 g |

Jästextrakt (Difco) | 2 g |

Rauga ekstrakts (Difco) | 2 g |

D-mannitol | 5 g |

D-mannīts | 5 g |

K2HPO4 | 2 g |

KH2PO4 | 0,5 g |

MgSO4.7H2O | 0,25 g |

Destillerat vatten | 1,0 l |

Destilēts ūdens | 1,0 l |

Lös upp ingredienserna, justera pH till 7,2. Efter sterilisering i autoklav och nedkylning till 50 °C, tillsätt följande antibiotika: polymyxin B-sulfat (Sigma) 0,003 g, nalidixinsyra (Sigma) 0,008 g och cykloheximid (Sigma) 0,2 g.

Izšķīdināt sastāvdaļas, noregulēt pH līdz 7,2. Pēc sterilizēšanas autoklāvā un atdzesēšanas līdz 50 °C pievienot šādas antibiotikas: polimiksīna B sulfātu (Sigma) 0,003 g, nalidiksīnskābi (Sigma) 0,008 g, cikloheksimīdu (Sigma) 0,2 g.

Lös antibiotikan i utgångslösningarna enligt följande: nalidixinsyra i 0,01 M NaOH, cykloheximid i 50 % etanol, polymyxin B-sulfat i destillerat vatten. Utgångslösningarna är filtersteriliserade.

Izšķīdināt antibiotikas rezerves šķīdumos šādā veidā: nalidiksīnskābi 0,01 M NaOH, cikloheksimīdu 50 % etanolā, polimiksīna B sulfātu destilētā ūdenī. Rezerves šķīdumus sterilizē filtrējot.

Anmärkning:

Piezīme:

Bassubstratens hållbarhet är 3 månader. Efter tillsats av antibiotika är hållbarheten 1 månad vid förvaring nedkylt.

Pamatbarotnes derīguma termiņš ir 3 mēneši. Pēc antibiotiku pievienošanas derīguma termiņš ir 1 mēnesis, ja to uzglabā atdzesētu.

--------------------------------------------------

Tillägg 6

6. papildinājums

Validerade PCR-protokoll och PCR-reagens

Validēts PCR protokols un reaģenti

Anmärkning:

Piezīme:

Preliminär testning bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av minst 103–104 celler av C. m. subsp. sepedonicus per ml provextrakt.

Obligāta ir prasība par to, lai iepriekšējo testu reproducējamā noteikšanas jutība būtu vismaz 103 līdz 104 C. m. sepedonicus šūnas mililitrā parauga ekstrakta.

Den preliminära testningen bör dessutom inte visa några falska positiva resultat med en grupp utvalda bakteriestammar.

Tāpat arī iepriekšējie testi nedrīkst uzrādīt nevienu šķietami pozitīvu rezultātu attiecībā uz izvēlēto baktēriju celmiem

1. Multiplexa PCR-protokoll med intern PCR-kontroll (Pastrik, 2000)

1. Multiplās PCR protokols ar iekšējo PCR kontroli (Pastrik, 2000)

1.1 Oligonukleotidprimrar

1.1. Oligonukleatīdu praimeri

Forward primer PSA-1 | 5′- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3′ |

Augšupejošais praimers PSA-1 | 5’- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3’ |

Reverse primer PSA -R | 5′- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3′ |

Augšupejošais praimers PSA-R | 5’- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3’ |

Forward primer NS-7-F | 5′- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3′ |

Augšupejošais praimers PNS-7-F | 5’- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3’ |

Reverse Primer NS-8-R | 5′- tcc gca ggt tca cct acg ga -3′ |

Lejupejošais praimers PNS-8-R | 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’ |

Förväntad storlek på produkter från DNA-templat från C. m. subsp. sepedonicus = 502 bp (PSA-primerset).

Paredzamais amplikona izmērs no C. m. subsp. sepedonicus DNS matricas –502 bp (PSA-Oligonukleotīdu pāris).

Förväntad storlek på produkter från 18S rRNA intern PCR-kontroll = 377 bp (NS-primerset).

Paredzamais amplikona izmērs no 18S rRNA iekšējās PCR kontroles –377 bp (NS Oligonukleotīdu pāris).

1.2 PCR-reaktionsblandningen

1.2. PCR reakcijas maisījums

Reagens | Kvantitet per reaktion | Slutlig koncentration |

Reaģents | Reaģenta daudzums | Galīgā koncentrācija |

Sterilt ultrarent vatten | 15,725 µl | |

Sterils ultratīrs ūdens | 15,725 µl | |

10× PCR-buffert [1] (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1× (1,5 mM MgCl2) |

10x PCR buferšķīdums [1] (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1x (1,5 mM MgCl2) |

BSA (fraktion V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |

BSA (V frakcija) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |

d-nTP-blandning (20 mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |

dNTP maisījums (20 mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |

Primer PSA-1 (10µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |

Praimers PSA-1 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |

Primer PSA-R (10µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |

Praimers PSA-R (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |

Primer NS-7-F (10µM) [2] | 0,1 µl | 0,04 µM |

Praimers NS-7-F (10 µM) [2] | 0,1 µl | 0,04 µM |

Primer NS-8-R (10µM) [2] | 0,1 µl | 0,04 µM |

Praimers NS-8-R (10 µM) [2] | 0,1 µl | 0,04 µM |

Taq polymerase (5U/µl) [1] | 0,2 µl | 1,0 U |

Taq polimerāze (5 U/µl) [1] | 0,2 µl | 1,0 U |

Provvolym | 5,0 µl | |

Parauga tilpums | 5,0 µl | |

Total volym | 25,0 µl | |

Kopējais tilpums: | 25,0 µl | |

1.3 PCR-reaktionsbetingelser

1.3. PCR reakcijas apstākļi

Kör följande program:

Veikt šādu programmu:

1 cykel: | i) | 3 minuter vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |

1 cikls | i) | 3 minūtes 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana) |

10 cykler: | ii) | 1 minut vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |

10 cikli | ii) | 1 minūti 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana) |

| iii) | 1 minut vid 64 °C (påkoppling av primers) |

| iii) | 1 minūti 64 °C temperatūrā (praimeru hibridizācija) |

| iv) | 1 minut vid 72 °C (förlängning av kopia) |

| iv) | 1 minūti 72 °C temperatūrā (kopijas sintēze) |

25 cykler: | v) | 30 sekunder vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |

25 cikli | v) | 30 sekundes 95 °C temperatūrā (DNS matricas denaturēšana) |

| vi) | 30 sekunder vid 62 °C (påkoppling av primers) |

| vi) | 30 sekundes 62 °C temperatūrā (praimeru kušana) |

| vii) | 1 minut vid 72 °C (förlängning av kopia) |

| vii) | 1 minūti 72 °C temperatūrā (kopijas sintēze) |

1 cykel: | viii) | 5 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning) |

1 cikls | viii) | 5 minūtes 72 °C temperatūrā (fragmentu galu aizpildīšana) |

| ix) | håll temperaturen vid 4 °C. |

| ix) | uzglabāt 4 °C temperatūrā |

Anmärkning:

Piezīme:

Det här programmet är optimerat för användning med en MJ Research PTC 200 termocykelapparat. Vid användning av andra modeller kan det komma att krävas modifiering av cyklerna ii, iii, iv, v, vi och vii.

Šī programma ir optimizēta izmantošanai ar MJ Research PTC 200 termisko ciklu kameru. Izmantojot citiem modeļiem, iespējams, ka jāmaina ii), iii), iv), v), vi) un vii) ciklu ilguma solis.

1.4 Restriktionsenzymanalys av produkten

1.4. Amplikona restriktāzes analīze

PCR-produkter som amplifierats från DNA från C. m. subsp. sepedonicus producerar distinkt RFLP ("restriction fragment length polymorphism") med enzymet Bgl II efter inkubation vid 37 °C under 30 minuter. De restriktionsfragment som erhållits från fragment specifika för C. m. subsp. sepedonicus är 282 bp och 220 bp i storlek.

No C. m. subsp. sepedonicus DNS pavairotie PCR produkti veido atšķirīgu restrikcijas fragmentu garuma polimorfismu ar fermentu Bgl II pēc 30 min ilgas inkubācijas 37 °C temperatūrā. No C. m. subsp. sepedonicus iegūto restrikcijas fragmentu raksturīgais izmērs ir 282 bp un 220 bp.

2. Preparering av laddningsbuffert

2. Parauga uznešanas buferšķīduma pagatavošana

2.1 Bromtymolblått (10-procentig utgångslösning)

2.1. Bromfenolzilais (10 % rezerves šķīdums)

Bromtymolblått | 5 g |

Bromfenolzilais | 5 g |

Destillerat vatten (dubbeldestillerat) | 50 ml |

Bidestilēts ūdens | 50 ml |

2.2 Laddningsbuffert

2.2. Parauga uznešanas buferšķīdums

Glycerol (86 %) | 3,5 ml |

Glicerīns (86 %) | 3,5 ml |

Bromtymolblått (5,1) | 300 µl |

Bromfenolzilais (5.1.) | 300 µl |

Destillerat vatten (dubbeldestillerat) | 6,2 ml |

Bidestilēts ūdens | 6,2 ml |

3. 10× Tris-Acetat-EDTA (TAE) buffert, pH 8,0

3. 10X tris-acetāt-EDTA (TAE) buferšķīdums, pH 8,0

Tris-buffert | 48,4 g |

Tris buferšķīdums | 48,4 g |

Iskall ättiksyra | 11,42 ml |

Ledus etiķskābe | 11,42 ml |

EDTA (dinatriumsalt) | 3,72 g |

EDTA (dinātrija sāls) | 3,72 g |

Destillerat vatten | 1,00 l |

Destilēts ūdens | 1, 00 l |

Späd till 1x före användning.

Pirms lietošanas atšķaidīt 1X.

Finns även att köpa i handeln (t.ex. Invitrogen eller motsvarande).

Pieejams arī tirdzniecībā (piemēram, Invitrogen vai līdzvērtīgs).

[1] Metoderna validerades med Taq polymeras från Perkin Elmer (AmpliTaq eller Gold) och Gibco BRL.

[1] Metodes validētas, izmantojot Taq polimerāzi no Perkin Elmer (AmpliTaq vai Gold) un Gibco BRL.

[2] Koncentrationen av primrarna NS-7 F och NS-8-R optimerades för extraktion av potatisars naveländar med användning av homogeniseringsmetoden och DNA-rening enligt Pastrik (2000) (se avsnitt 6.1 a och 6.2). Reoptimering av reagenskoncentrationerna krävs om extraktion genom skakning eller andra metoder för isolering av DNA används.

[2] NS-7 F un NS-8-R ologonukleotīdu praimera koncentrācija tika optimizēta kartupeļu stolona gabalu ekstrakcijai, izmantojot homogenizācijas metodi un DNS attīrīšanu pēc Pastrik (2000) metodes (sk. 6.1.a) un 6.2. sadaļu). Reaģentu koncentrācijas atkārtota optimizācija ir nepieciešama, ja izmanto ekstrakciju ar kratīšanas metodi vai citu DNS izolācijas metodi.

--------------------------------------------------

Tillägg 7

7. papildinājums

Validerade reagens för FISH-test

Validētie FISH testa reaģenti

1. Oligo-prober

1. Oligozondes

Cms-specifik probe CMS-CY3-01: | 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ |

Cms raksturīgā zonde CMS-CY3-01: | 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ |

Icke-specifik eubacterial prob EUB-338-FITC: | 5’- gct gcc tcc cgt agg agt-3’ |

Nespecifisko eubaktēriju zonde EUR-338-FITC: | 5’- gct gcc tcc cgt agg agt-3’ |

2. Fixeringslösning

2. Fiksējošais šķīdums

(VARNING! FIXERINGSVÄTSKAN INNEHÅLLER PARAFORMALDEHYD, SOM ÄR GIFTIG. BÄR HANDSKAR OCH ANDAS INTE IN GASEN. DET ÄR TILLRÅDLIGT ATT ARBETA I ETT DRAGSKÅP.)

[UZMANĪBU! FIKSĒJOŠAIS ŠĶĪDUMS SATUR PARAFORMALDEHĪDU, KAS IR TOKSISKS. LIETOT CIMDUS UN NEIEELPOT. IETEICAMS STRĀDĀT VELKMES SKAPĪ.]

i) Upphetta 9 ml vatten av molekylärbiologisk kvalitet (t.ex. ultrarent vatten) till ca 60 °C och tillsätt 0,4 g paraformaldehyd. Paraformaldehyden löses efter tillsats av 5 droppar 1N NaOH och omrörning med magnetomrörare.

i) Līdz aptuveni 60 °C uzsildīt 9 ml molekulāras tīrības klases ūdens (piemēram, ultratīru ūdeni (UPW)) un pievienot 0,4 g paraformaldehīda. Paraformaldehīdu izšķīdina, pievienojot 5 pilienus 1N NaOH un maisot ar magnētisko maisītāju.

ii) Justera pH till 7,0 genom tillsats av 1 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,0) och 5 droppar 1N HCl. Kontrollera pH med indikatorpapper och justera vid behov med HCl eller NaOH.

ii) Noregulēt pH līdz 7,0, pievienojot 0,1 M fosfāta buferšķīduma (PB, pH 7,0) un 5 pilienus 1N HCl. Pārbaudīt pH ar indikatorpapīru, ja nepieciešams koriģē, izmantojot HCl vai NaOH.

(VARNING! ANVÄND INTE EN PH-MÄTARE I VÄTSKOR MED PARAFORMALDEHYD.)

[UZMANĪBU! NEIZMANTOT PH-METRU ŠĶĪDUMOS, KAS SATUR PARAFORMALDEHĪDU.]

iii) Filtrera lösningen genom ett 0,22 µm membranfilter och förvara dammfritt i 4 °C fram till användning.

iii) Filtrēt šķīdumu caur 0,22 µm membrānfiltru un sargāt no putekļiem, turēt 4 °C temperatūrā līdz turpmākai izmantošanai.

iv) Anmärkning:

iv) Piezīme:

Alternativ fixeringslösning: 96-procentig etanol.

Alternatīvs fiksējošais šķīdums: 96 % etanols.

3. 3x Hybmix

3. 3X hibridizācijas maisījums

NaCl | 2,7 M |

Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |

EDTA (filter steriliserat och autoklaverat) | 15 mM |

EDTA (sterilizēts ar filtrēšanu un autoklavēts) | 15 mM |

Späd till 1× i enlighet med kraven.

Ja nepieciešams, atšķaidīt 1X.

4. Hybridiseringslösning

4. Hibridizācijas šķīdums

1x Hybmix

1X hibridizācijas šķīdums

Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,01 % |

Nātrija dodecilsulfāts (SDS) | 0,01 % |

prob EUB 338 | 5 ng/μl |

Zonde EUB 338 | 5 ng/μl |

prob CMSCY301 | 5 ng/μl |

Zonde CMSCY301 | 5 ng/μl |

Preparera de kvantiteter av hybridiseringslösning som anges i beräkningarna i tabell 1. För varje glas (innehållande 2 olika prover i duplikat) krävs 90 μl hybridiseringslösning.

Sagatavot hibridizācijas šķīduma daudzumus saskaņā ar 1. tabulu. Katram priekšmetstikliņam (kas satur 2 dažādus paraugus un to dublikātus) nepieciešami 90 μl hibridizācijas šķīduma.

Tabell: Föreslagna kvantiteter för preparering av hybridiseringslösning.

Tabula. Ieteicamie daudzumi hibridizācijas maisījuma pagatavošanai

| 2 glas | 8 glas |

| 2 priekšmetstikliņi | 8 priekšmetstikliņi |

Sterilt ultrarent vatten | 50,1 | 200,4 |

Sterils ultratīrs ūdens | 50,1 | 200,4 |

3x hybmix | 30,0 | 120,0 |

3x hibridizācijas maisījums | 30,0 | 120,0 |

1 % SDS | 0,9 | 3,6 |

Probe EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 |

Zonde EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 |

Probe CMSCY301 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 |

Zonde CMSCY301 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 |

Total volym (μl) | 90,0 | 360,0 |

Kopējais tilpums (μl) | 90,0 | 360,0 |

Anmärkning: Lagra alla lösningar innehållande ljuskänsliga oligo-prober mörkt i -20 °C. Skydda mot direkt solljus eller elektriskt ljus vid användning.

N.B. Šķīdumi, kas satur gaismjutīgas oligozondes, jāglabā tumsā -20 °C temperatūrā. Sargāt no tiešiem saules stariem vai elektriskā apgaismojuma to izmantošanas laikā.

5. 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,0

5. 0,1M fosfāta buferšķīdums, pH 7,0

Na2HPO4 | 8,52 g |

KH2PO4 | 5,44 g |

Destillerat vatten | 1,00 l |

Destilēts ūdens | 1,00 l |

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Izšķīdināt sastāvdaļas, pārbaudīt pH un 15 min sterilizēt autoklāvā 121 °C temperatūrā.

--------------------------------------------------

Tillägg 8

8. papildinājums

Odling av äggplantor

Baklažānu kultūra

Så fröer av äggplanta (Solanum melongena) i steril såjord. Plantera ut fröplantorna i steril planteringsjord då hjärtbladen är helt utvecklade (10 till 14 dagar).

Iesēt baklažānu (Solanum melongena) sēklas pasterizētā sēklaudzēšanas kompostā. Pārstādīt stādus ar pilnībā izplaukušām dīgļlapām (10 līdz 14 dienas) pasterizētā kompostā.

Äggplantor bör odlas i växthus under följande miljöförhållanden:

Baklažāna augus audzē siltumnīcā ar šādiem vides apstākļiem:

Dagslängd | | 14 timmar eller naturlig dagslängd om längre |

dienas ilgums | | 14 stundas vai dabīgs dienas garums, ja ilgāks; |

Temperatur: | dag: | 21–24 °C |

temperatūra | dienā | 21 līdz 24 °C; |

| natt: | 15 °C |

| naktī | 15 °C. |

Mottagliga äggplantssorter: | "Black Beauty" |

Piemērotās baklažānu augu šķirnes: | Black Beauty, |

| "Long Tom" |

| Long Tom, |

| "Rima" |

| Rima, |

| "Balsas" |

| Balsas. |

Information om leverantören finns på kommissionens webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Piegādātāji: sk. tīmekļa vietnē http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

--------------------------------------------------

Tillägg 9

9. papildinājums

Förfarande vid gramfärgning (Huckers modifikation) (Doetsch, 1981) [1]

Procedūra krāsošanai pēc Grama (Hucker modifikācija) (Doetsch, 1981) [1]

Lösning med kristallviolett

Kristālvioletā šķīdums

Lös upp 2 g kristallviolett i 20 ml 95-procentig etanol.

Izšķīdināt 2 g kristālvioletā 20 mililitros 95 % etanola.

Lös upp 0,8 g ammoniumoxalat i 80 ml destillerat vatten.

Izšķīdināt 0,8 g amonija oksalāta 80 ml destilēta ūdens.

Blanda de två lösningarna.

Šos abus šķīdumus sajaukt.

Lugols jod

Lugola joda šķīdums

Jod | 1 g |

Jods | 1 g |

Kalciumjodid | 2 g |

Kālija jodīds | 2 g |

Destillerat vatten | 300 ml |

Destilēts ūdens | 300 ml |

Sönderdela de fasta ämnena tillsammans i en mortel. Tillsätt till vattnet och rör om i en stängd behållare så att ämnena upplöses.

Cietvielu sastāvdaļas sajaukt piestalā ar piestu. Pievienot ūdenī un slēgtā traukā maisīt, lai izšķīstu.

Färgande lösning med saffranin

Safranīna šķīdums

Utgångslösning:

Rezerves šķīdums:

Safranin O | 2,5 g |

Safranīns O | 2,5 g |

95-procentig etanol | 100 ml |

95 % etanols | 100 ml |

Blanda och lagra.

Samaisīt un uzglabāt.

Spädes i förhållandet 1:10 för att få en arbetslösning.

Darba šķīdumu iegūst, atšķaidot 1:10.

Förfarande vid färgning

Krāsošana

1. Preparera utstrykningspreparaten, lufttorka och värmefixera dem.

1. Sagatavot uztriepes, ļaut tām izžūt un termiski fiksēt.

2. Dränk objektglaset i kristallviolettlösning i en minut.

2. Priekšmetstikliņu uz vienu minūti pārklāt ar kristālvioletā šķīdumu.

3. Tvätta snabbt med kranvatten.

3. Ātri noskalot ūdensvada ūdenī.

4. Dränk objektglaset i Lugols jod i en minut.

4. Uz 1 min pārklāt ar Lugola joda šķīdumu.

5. Tvätta i rinnande vatten och torka med läskpapper.

5. Skalot ūdensvada ūdenī un nosusināt.

6. Avfärga genom att tillsätta 95-procentig etanol droppvis tills ingen färg längre avlägsnas eller doppa glaset i etanol i 30 sekunder under försiktig omrörning.

6. Atkrāsot ar 95 % etanolu, pievienojot pa pilieniem līdz nemainīgai krāsai, vai 30 s turot etilspirtā un uzmanīgi maisot.

7. Tvätta med rinnande vatten och torka med läskpapper.

7. Skalot ūdensvada ūdenī un nosusināt.

8. Dränk objektglaset i saffraninlösning i 10 sekunder.

8. Uz 10 s pārklāt ar safranīna šķīdumu.

9. Tvätta i rinnande vatten och torka med läskpapper.

9. Skalot ūdensvada ūdenī un nosusināt.

Grampositiva bakterier färgas violett-blå; gramnegativa bakterier färgas rosa-röda.

Grampozitīvo baktēriju reakcija ir violeti zils krāsojums. Gramnegatīvo baktēriju reakcija ir rozīgi sarkans krāsojums.

REFERENSER

IZMANTOTĀ LITERATŪRA

1. Anonymous, 1987. Scheme of the detection and diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium sepedonicum in batches of potato tubers. Commission of the European Communities, Luxembourg. Publ EUR 11288 EN, 21 pp.

2. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218.

2. Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213–218.

3. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147-152.

3. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147–152.

4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21-23.

4. Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21–23.

5. Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-26.

5. Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24–26.

6. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

6. Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335–345.

7. Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., No 17, 1987, pp. 1-10.

7. Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., No 17, 1987, pp. 1–10.

8. Jansing, H. and K. Rudolph, 1998. Physiological capabilities of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590-601.

9. Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.

10. Klement Z.; Rudolph, K and D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

11. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-118.

11. Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114–118.

12. Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.

12. Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470–489.

13. Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101-106.

13. Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot [Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.] in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101–106.

14. Li, X. and S.H. de Boer, 1995. Selection of Polymerase Chain Reaction primers from RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Phytopathology, 85, 837-842.

15. Mills, D., Russell, B., W. and J., W. Hanus, 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA sequences isolated by subtraction hybridization. Phytopathology, 87, 8, 853-861.

16. Pastrik, K. -H. and R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibactermichiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687-693.

16. Pastrik, K.-H. and R.A. Rainey. 1999. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques. J. Phytopathology 147; 687–693.

17. Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

18. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

19. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. and Knorr, D. (1999) Detection of Clavibactermichiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095–1100.

19. Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. and Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83; 1095–1100.

20. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. — 3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp.

20. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. -3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp.

21. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.

22. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739-748.

22. Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the BOX-A1 Ralstonia solanacearum primer for rapid identification of plant pathogen Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. European Journal of Plant Pathology, 107 (7), 739–748.

23. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527.

23. Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481–527.

24. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

24. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281–295.

25. Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Janse, J. D. and A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4546–4554.

[1] I handeln tillgängliga lösningar och färgningskit kan även användas.

[1] Var izmantot arī nopērkamus gatavus šķīdumus un krāsošanas komplektus.

--------------------------------------------------

BILAGA II

II PIELIKUMS

1. Vid varje misstänkt förekomst för vilken ett eller flera positiva screeningtester har utförts enligt de metoder som avses i bilaga I bör, i avvaktan på bekräftelse eller vederläggning genom slutförande av den nämnda metoden, följande föremål bevaras och förvaras på lämpligt sätt till dess att metoderna har slutförts:

1. Visos iespējamās organisma klātbūtnes gadījumos, kas identificēti ar I pielikumā aprakstītajām skrīninga testu metodēm, līdz iegūto rezultātu galīgai apstiprināšanai vai noraidīšanai jākonservē un attiecīgi jāsaglabā:

- Alla de knölar, och om möjligt plantor, från vilka prover har tagits.

- visi paraugiem ņemtie bumbuļi un, ja iespējams, visi augi, no kuriem ņemti paraugi,

- Allt kvarvarande extrakt och ytterligare förberett material för screeningtest(er), t.ex. immunofluorescensglas.

- visi ekstraktu atlikumi un skrīninga testiem papildus sagatavotie materiāli, piemēram, imunofluorescences priekšmetstikliņi,

- All relevant dokumentering.

Genom bevaring av knölarna kan vid behov sorttester göras.

- visa attiecīgā dokumentācija

2. Om förekomst av skadegöraren bekräftas, bör följande bevaras och förvaras på lämpligt sätt under åtminstone en månad efter anmälningsförfarandet enligt artikel 5.2:

līdz minēto procedūru pabeigšanai.

- Det material som specificeras i punkt 1.

Ja bumbuļus saglabā, vajadzības gadījumā ir iespējams veikt papildu pārbaudi.

- Ett prov av det infekterade äggplantematerialet inokulerat med knöl- eller plantextrakt.

2. Ja ir pozitīvi apstiprināta šā organisma klātbūtne, jākonservē un attiecīgi jāsaglabā:

- Den isolerade kulturen av skadegöraren.

- 1. punktā minētie materiāli,

--------------------------------------------------

BILAGA III

- inficētā baklažānu materiāla paraugs, kas inokulēts ar bumbuļu vai augu ekstraktu,

1. Följande skall beaktas vid bestämningen av hur omfattande den troliga smitta som avses i artikel 5.1 b är:

- Knölar och plantor som har odlats på en produktionsplats som förklaras smittad enligt artikel 5.1 a.

- no organisma izolētā kultūra,

- Den eller de produktionsplatser med någon anknytning till produktionen av de knölar eller plantor som har förklarats smittade i enlighet med artikel 5.1 a, inklusive anknytning via produktionsutrustning eller produktionsanordningar som delas direkt eller genom en gemensam entreprenör.

līdz pagājis vismaz viens mēnesis pēc paziņojuma, kas veikts saskaņā ar 5. panta 2. punktu.

- Knölar eller plantor som har producerats på en sådan plats (sådana platser) som avses i föregående strecksats, eller som har förvarats på en sådan plats (sådana platser) under den tid då de knölar eller plantor som har förklarats smittade i enlighet med artikel 5.1 a befann sig på den produktionsplats som avses i första strecksatsen.

--------------------------------------------------

- Anläggningar som hanterar potatis från produktionsplatserna i ovannämnda strecksatser.

III PIELIKUMS

- Alla maskiner, fordon, fartyg, lager, eller delar av dessa, och alla andra föremål, inklusive förpackningsmaterial, som kan ha kommit i kontakt med de knölar eller plantor som har förklarats angripna i enlighet med artikel 5.1 a.

1. Lai noteiktu iespējamās inficēšanās apjomu saskaņā ar 5. panta 1. punkta b) apakšpunktu, ņem vērā šādus faktorus:

- Alla knölar eller plantor som har lagrats i, eller kommit i kontakt med, någon av de platser eller något av föremål som anges i föregående strecksats innan dessa platser eller föremål hade rengjorts och desinficerats.

- bumbuļus vai augus, kas audzēti tādā ražošanas vietā, kas noteikta kā inficēta saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunktu,

- Till följd av den undersökning som avses i artikel 6, de knölar eller plantor som har ett syster- eller moderförhållande genom kloning till de knölar eller plantor som har förklarats angripna i enlighet med artikel 5.1 a och som, trots att de kan ha givit negativt svar när de testats för skadegöraren, sannolikt är angripna via ett kloningssamband. Sorttester kan göras för att styrka identiteten hos de knölar eller plantor som är smittade och som kommer ur kloner som är närbesläktade.

- ražošanas vietu(-as), kas kāda ražošanas procesa sakarā saistītas ar bumbuļiem vai augiem, kuri noteikti kā inficēti saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunktu, tostarp tās, kurās kopīgi izmanto ražošanas aprīkojumu un iekārtas tieši, vai ar kopīga apakšuzņēmēja starpniecību,

- Den eller de produktionsplatser för de knölar eller plantor som avses i föregående strecksats.

- bumbuļus vai augus, kas ražoti iepriekšējā ievilkumā minētajā(-ās) ražošanas vietā(-ās) vai kas atradās šādā(-ās) ražošanas vietā(-ās) tajā laika posmā, kad tie bumbuļi vai augi, kuri noteikti kā inficēti saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunktu, atradās pirmajā ievilkumā minētajā ražošanas vietā,

2. Följande skall beaktas vid bestämningen av den möjliga spridning som avses i artikel 5.1 c:

- zemesgabali un telpas, kurās veic darbības ar kartupeļiem no iepriekšējos ievilkumos minētajām ražošanas vietām,

- Närheten till andra produktionsplatser där det odlas potatis eller andra värdväxter.

- jebkuras iekārtas, transportlīdzekļus, traukus, glabātavas vai to vienības un jebkurus citus priekšmetus, tostarp arī iepakojuma materiālu, kas varēja nonākt saskarē ar bumbuļiem vai augiem, kuri noteikti kā inficēti saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunktu,

- Den gemensamma produktionen och användningen av partierna av utsädespotatis.

- visus bumbuļus vai augus, kas glabājušies vai bijuši saskarē ar jebkurām iepriekšējā ievilkumā minētajām telpām vai priekšmetiem pirms šādu telpu un priekšmetu tīrīšanas un dezinfekcijas,

3. Den anmälan som avses i artikel 5.2 första stycket skall uppfylla följande:

- saskaņā ar 6. pantu veiktās testēšanas rezultātā tos bumbuļus vai augus, kuriem ir vertikāla vai horizontāla klonu radniecība ar tiem bumbuļiem un augiem, kas ir noteikti kā inficēti saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunktu, un attiecībā uz kuriem, lai gan veiktā attiecīgā organisma testa rezultāts bijis negatīvs, ir iespējama inficēšanās klonu radniecības rezultātā, lai pārbaudītu inficēto un klonu radniecībā saistīto bumbuļu un augu identitāti, var veikt papildu testus,

- Den skall avges omedelbart efter det att förekomst av skadegöraren har bekräftats av laboratorietester, vilka utförts med tillämpning av de metoder som anges i bilaga I, och omfatta minst

- potatispartiets sortnamn,

- iepriekšējā ievilkumā minēto bumbuļu un augu audzēšanas vieta(-as).

- potatispartiets typ (matpotatis, utsädespotatis m.m.) och i förekommande fall utsädeskategori.

2. Lai noteiktu iespējamās infekcijas izplatīšanās apjomu saskaņā ar 5. panta 1. punkta c) apakšpunktu, ņem vērā šādus faktorus:

- Om det föreligger risk för smitta i potatis från eller i en annan medlemsstat (andra medlemsstater) skall den medlemsstat i vilken förekomst har bekräftats genast ge den berörda medlemsstaten eller de berörda medlemsstaterna de upplysningar som krävs för att iaktta artikel 5.3, såsom

- attālumu līdz citām ražošanas vietām, kurās audzē kartupeļus vai citus saimniekaugus,

- potatispartiets sortnamn,

- kopēju sēklas kartupeļu krājumu audzēšanu un izmantošanu.

- exportörens respektive mottagarens namn och adress,

3. Saskaņā ar 5. panta 2. punktu paredzētais paziņojums jāsniedz šādi:

- potatispartiets leveransdatum,

- nekavējoties pēc tam, kas organisma klātbūtne ir apstiprinājusies laboratorijas testu rezultātā, izmantojot metodes, kas minētas I pielikumā; tajā obligāti jānorāda:

- storleken på det potatisparti som levereras,

- kartupeļu partijas šķirnes nosaukums,

- om så är lämpligt kopia av växtpasset eller åtminstone växtpassnumret, och om så är lämpligt odlarens eller handlarens registreringsnummer och en kopia av leveransbeskedet.

- kartupeļu veids (pārtikas, sēklas, u. c.) un, ja nepieciešams, sēklas kartupeļu kategorija,

När denna information har tillhandahållits skall kommissionen genast underrättas om detta.

- ja pastāv inficēšanās risks attiecībā uz kartupeļiem, ko ieved no citas dalībvalsts vai dalībvalstīm, izved uz citu dalībvalsti vai dalībvalstīm, tā dalībvalsts, kurā ir apstiprināts konkrētais gadījums, nekavējoties sniedz attiecīgajai dalībvalstij vai dalībvalstīm šādu informāciju, kas vajadzīga, lai izpildītu 5. panta 3. punkta prasības, t. i.:

- Anmälan skall avges efter det att alla undersökningar har avslutats, och varje undersökning skall innehålla

- kartupeļu partijas šķirnes nosaukums,

- det datum då smittan bekräftades,

- nosūtītāja un saņēmēja vārds/nosaukums un adrese,

- en kort beskrivning av den undersökning som gjorts för att identifiera källa och möjlig spridning av smittan, samt på vilken nivå provtagningen har skett,

- kartupeļu partijas piegādes datums,

- information om smittans identifierade eller misstänkt källa (misstänkta källor),

- piegādātās kartupeļu partijas lielums,

- detaljerade uppgifter om den angivna smittans omfattning, inklusive antalet produktionsställen och antalet partier med uppgifter om sort och, i fall av utsädespotatis, kategori,

- vajadzības gadījumā jāpievieno augu pases kopija vai vismaz augu pases numurs, ja tas nepieciešams, vai ražotāja vai tirgotāja reģistrācijas numurs, ja tas nepieciešams, un piegādes apliecības kopija.

- detaljerade uppgifter om det område som har avgränsats, inklusive det antal produktionsplatser som inte har förklarats smittade men inkluderats i området.

Komisijai nekavējoties paziņo par šādas informācijas sniegšanu tad:

- annan information som bekräftar förekomsten (förekomsterna) av smitta och som kommissionen kan kräva.

- kad ir pabeigti visi izmeklējumi, un attiecībā uz katru gadījumu norāda:

--------------------------------------------------

- inficēšanās apstiprināšanas datumu,

BILAGA IV

- īsu aprakstu izmeklēšanai, kas veikta, lai identificētu inficēšanas avotu un iespējamo infekcijas izplatīšanos, norādot arī to, kādā apmērā veikta paraugu ņemšana,

1. De officiellt övervakade åtgärder som avses i artikel 7.1 skall vara någon av följande:

- informāciju par identificētajiem vai iespējamiem inficēšanās avotiem,

- Användning som djurfoder efter värmebehandling så att det inte finns någon risk för att skadegöraren har överlevt.

- noteiktās inficēšanās sīku aprakstu, tostarp ražošanas vietu skaitu un kartupeļu partiju skaitu ar šķirnes norādi, un sēklas kartupeļiem to kategoriju,

- Bortskaffande på en officiellt godkänd specialiserad upplagsplats för avfall där det inte finns någon identifierbar risk för att patogenen sprids till omgivningen, t.ex. genom läckage till jordbruksmark.

- norobežotās zonas sīku aprakstu, tostarp to ražošanas vietu skaitu, kuras nav atzītas par inficētām, bet ir iekļautas attiecīgajā zonā,

- Förbränning.

- pārējo informāciju par apstiprināto infekcijas uzliesmojumu, ko varētu pieprasīt Komisija.

- Användning för industriell bearbetning genom direkt och omedelbar leverans till en bearbetningsanläggning med officiellt godkända anordningar för avfallshantering för vilken det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas, och med ett system för rengöring och desinfektion av åtminstone avgående fordon.

--------------------------------------------------

- Andra åtgärder, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas. Dessa åtgärder skall anmälas till kommissionen och till de andra medlemsstaterna.

IV PIELIKUMS

Allt kvarvarande avfall som berörs av eller har uppkommit på grund av ovannämnda åtgärder skall bortskaffas genom officiellt godkända metoder i överensstämmelse med bilaga V till detta direktiv.

1. 7. panta 1. punktā paredzētie oficiāli kontrolētie pasākumi ir šādi:

2. För att under tillsyn av de berörda medlemsstaternas ansvariga officiella organ använda eller bortförskaffa de knölar eller plantor som har förklarats som troligen smittade enligt artikel 5.1 b och som avses i artikel 7.2, med lämplig kommunikation mellan ansvariga officiella organ för att alltid säkerställa sådan tillsyn och godkännande av ansvariga officiella organ i den medlemsstat där potatisen skall förpackas eller bearbetas med hänsyn till de anordningar för avfallshantering som avses i första och andra strecksatsen, är något av följande sätt lämpliga:

- izmantošana lopbarībā pēc termiskās apstrādes tā, lai novērstu risku, ka organisms varētu izdzīvot,

- Användning som matpotatis avsedd för konsumtion och packad på platser med lämpliga anordningar för avfallshantering, klar för direkt leverans och användning utan ompaketering. Potatisar avsedda för sättning får behandlas på samma plats endast om detta sker separat eller efter rengöring och desinfektion.

vai

- Användning som industripotatis, och avsedd för direkt och omedelbar leverans till en bearbetningsanläggning som har lämpliga anordningar för avfallshantering och ett system för rengöring och desinfektion av åtminstone avgående fordon.

- iznīcināšana oficiāli apstiprinātā īpašā atkritumu iznīcināšanas vietā, kur nepastāv nosakāms risks patogēna nokļūšanai vidē, piemēram, iesūcoties lauksaimniecības zemē,

- Annan användning eller annat bortförskaffande, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids och under förutsättning att nämnda ansvariga officiella organ lämnat sitt tillstånd.

vai

3. Lämpliga metoder för att rengöra och desinficera de föremål som avses i artikel 7.3 skall vara de för vilka det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas. De skall användas under övervakning av medlemsstaternas ansvariga officiella organ.

- sadedzināšana,

Top

BG CS DA DE EL EN ES ET FI FR HU IT LT LV NL PL PT RO SK SL SV	BG CS DA DE EL EN ES ET FI FR HU IT LT LV NL PL PT RO SK SL SV
sv	lv
Page 1 of 2 - > >> Full text

Bilingual display

sv

lv