COUNCIL DIRECTIVE 93/85/EEC of 4 October 1993 on the control of potato ring rot

Směrnice Rady 93/85/EHS

THE COUNCIL OF THE EUROPEAN COMMUNITIES,

ze dne 4. října 1993

Having regard to the Treaty establishing the European Economic Community, and in particular Article 43 thereof,

o ochraně proti bakteriální kroužkovitosti bramboru

Having regard to the proposal from the Commission(1) ,

RADA EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,

Having regard to the opinion of the European Parliament(2) ,

s ohledem na Smlouvu o založení Evropského hospodářského společenství, a zejména na článek 43 této smlouvy,

Having regard to the opinion of the Economic and Social Committee(3) ,

s ohledem na návrh Komise [1],

Whereas potato production occupies an important place in Community agriculture; whereas the potato yield is constantly threatened by harmful organisms;

s ohledem na stanovisko Evropského parlamentu [2],

Whereas, through the protection of potato cultivation against such harmful organisms, not only should productive capacity be maintained but agricultural productivity should also be increased;

s ohledem na stanovisko Hospodářského a sociálního výboru [3],

Whereas protective measures to prevent the introduction of harmful organisms into the territory of a Member State would have only a limited effect were such organisms not controlled simultaneously and methodically throughout the Community and not prevented from spreading;

vzhledem k tomu, že produkce brambor zaujímá významné místo v zemědělství Společenství; že výnos z této produkce je soustavně ohrožován škodlivými organismy;

Whereas one of the harmful organisms on potatoes is Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., the pathogenic agent of the potato ring rot disease; whereas this disease has occurred in some parts of the Community and some limited sources of infection still exist;

vzhledem k tomu, že ochranou pěstování brambor proti těmto škodlivým organismům by měla nejen být zachována jejich produkční kapacita, ale také zvýšena zemědělská produktivita;

Whereas there is a considerable risk to potato cultivation throughout the Community if effective measures are not taken to locate this disease and determine its distribution, to prevent it from occurring and spreading, and, if found, to prevent its spread and to control it with the aim of eradication;

vzhledem k tomu, že ochranná opatření proti zavlékání škodlivých organismů do jednotlivých členských států by měla pouzeomezený účinek, pokud by proti těmto organismům neexistovala souběžná a metodicky řízená ochrana v celém Společenství a nezamezovalo se jejich rozšiřování;

Whereas, in order to ensure this, certain measures must be taken within the Community; whereas Member States must, in addition, be able to take additional or stricter measures where necessary, provided that there is no hindrance to the movement of potatoes within the Community, except in so far as laid down in Council Directive 77/93/EEC of 21 December 1976 on protective measures against the introduction into the Member States of organisms harmful to plants or plant products(4) ; whereas such measures must be notified to the other Member States and to the Commission;

vzhledem k tomu, že jedním z nejnebezpečnějších škodlivých organismů pro brambory je Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., původce bakteriální kroužkovitosti bramboru; že se tato choroba vyskytla v určitých částech Společenství a dosud existují některé menší zdroje choroby;

Whereas Council Directive 80/665/EEC of 24 June 1980 on the control of potato ring rot(5) , laid down minimum measures to be taken by the Member States against potato ring rot;

vzhledem k tomu, že dokud nebudou přijata účinná opatření k ochraně proti této chorobě a k zamezení jejího šíření, je pěstování brambor v celém Společenství trvale ohroženo;

Whereas, since then, there have been significant developments in the understanding of potato ring rot disease and the detection of the potato ring rot pathogen;

vzhledem k tomu, že k dosažení tohoto cíle je nezbytné, aby Společenství přijalo některá opatření; že by kromě opatření uvedených ve směrnici Rady 77/93/EHS ze dne 21. prosince 1976 o ochranných opatřeních proti zavlékání organismů škodlivých rostlinám nebo rostlinným produktům do členských států [4] mělo být členským státům umožněno přijmout v případě potřeby doplňující nebo přísnější opatření, pokud jsou taková opatření nezbytná a nejsou překážkou obchodu s bramborami uvnitř Společenství; že tato opatření musí být oznámena ostatním členským státům a Komisi;

Whereas the application of the Community plant health regime to the Community as an area without internal frontiers has called for the re-examination and revision of some provisions of Directive 80/665/EEC;

vzhledem k tomu, že směrnice Rady 80/665/EHS ze dne 24. června 1980 o ochraně proti bakteriální kroužkovitosti bramboru [5] stanovila minimální opatření, která mají členské státy učinit proti bakteriální kroužkovitosti bramboru;

Whereas, as a result of such re-examination, the provisions of Directive 80/665/EEC have been found insufficient, and further specification of measures is necessary;

vzhledem k tomu, že od té doby byl v poznatcích o bakteriální kroužkovitosti bramboru a o zjišťování patogenů bakteriální kroužkovitosti bramboru učiněn výrazný pokrok;

Whereas, in that situation, Directive 80/665/EEC should be repealed and the necessary measures adopted;

vzhledem k tomu, že použití rostlinolékařského režimu Společenství pro Společenství jako prostor bez vnitřních hranic si vyžádalo přezkoumání a revizi některých ustanovení směrnice 80/665/EHS;

Whereas the measures have to take into account, first, that the disease can remain latend and unobserved both in the growing crop and in stored tubers, and so can be effectively prevented only by production and use of seed potatoes free from infection and, secondly, that systematic official surveys are necessary to locate it; whereas spread of the pathogen within the growing crop is not the most important factor, but whereas the pathogen can exist through the winter in self-sown (volunteer) potato plants and these are the major source of infection being carried from one season to the next; whereas the pathogen is spread mainly by the contamination of potatoes through contact with infected potatoes and through contact with planting, harvesting and handling equipment or transport and storage containers which have become contaminated with the organism by previous contact with infected potatoes; whereas such contaminated objects can remain infectious for some time after such contamination; whereas spread of the pathogen can be reduced or prevented by disinfection of such objects; whereas any such contamination of seed potatoes poses a major risk for the spread of the pathogen;

vzhledem k tomu, že v důsledku tohoto přezkoumání byla ustanovení směrnice 80/665/EHS shledána nedostatečnými a je nezbytné stanovená opatření dále upřesnit;

Whereas, for the determination of the details of such general measures, as well as for those stricter or additional measures taken by Member States to prevent the introduction of the pathogen into their territory, it is desirable for Member States to cooperate closely with the Commission within the Standing Committee of Plant Health (hereinafter referred to as 'the Committee'),

vzhledem k tomu, že by za této situace měla být zrušena směrnice 80/665/EHS a měla by být přijata nezbytná opatření;

HAS ADOPTED THIS DIRECTIVE:

vzhledem k tomu, že opatření musí přihlédnout ke skutečnosti, že choroba může zůstat skrytá a nepozorovaná jak v rostoucí plodině, tak i ve skladovaných hlízách, a může se jí účinně předcházet pouze pěstováním a používáním sadbových brambor, které jsou prosté infekce, a že pro určení ohnisek choroby jsou nezbytná pravidelná úřední šetření; že rozšíření patogenu v rostoucí plodině není nejdůležitějším faktorem, ale že patogen může přečkat zimu v bramborových rostlinách, které se vysemenily přirozeným způsobem (planě rostoucí rostliny), a ty jsou hlavním zdrojem choroby, která se přenáší z jednoho období do druhého; že se patogen většinou rozšiřuje při kontaktu brambor s napadenými bramborami a sázecím, sklízecím a manipulačním zařízením nebo dopravními a skladovacími kontejnery, které byly zamořeny při dřívějším kontaktu s napadenými bramborami; že tyto předměty mohou zůstat zamořenými po určitou dobu po tomto zamoření; že může být rozšíření patogenu sníženo nebo mu lze předejít dezinfekcí těchto předmětů; že každá takové zamoření sadbových brambor přináší velmi velké nebezpečí rozšíření patogenu;

vzhledem k tomu, že je žádoucí, aby členské státy úzce spolupracovaly s Komisí v rámci Stálého rostlinolékařského výboru (dále jen "výbor") při stanovení podrobností těchto obecných, jakož přísnějších nebo doplňujících opatření, učiněných členskými státy na ochranu proti zavlečení patogenu na jejich území,

Article 1

PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:

The Directive concerns the measures to be taken within the Member States against Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., the cause of potato ring rot (hereinafter referred to as 'the organism'), in order to:

Článek 1

(a) locate it and determine its distribution;

Směrnice se týká opatření, která mají být přijata členskými státy proti Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., vyvolávající bakteriální kroužkovitost bramboru (dále jen "organismus"), aby:

(b) prevent its occurrence and spread; and

a) se zjistilo ohnisko choroby a určilo její rozšíření;

(c) if found, to prevent its spread and to control it with the aim of eradication.

b) se předešlo výskytu choroby a jejímu rozšíření; a

c) se v případě výskytu předešlo rozšíření a prováděla se ochranná opatření za účelem její eradikace.

Article 2

Článek 2

1. Member States shall conduct systematic official surveys for the organism on tubers and, where appropriate, on plants of potato (Solanum tuberosum L.) originating in their territory, for the confirmation of absence of the organism.

1. Členské státy provádějí za účelem potvrzení nepřítomnosti organismu pravidelná úřední šetření organismu zaměřená na zjištění organismu na hlízách a v případě potřeby na rostlinách bramboru (Solanum tuberosum L.) pocházejících z jejich území.

For these surveys, in the case of tubers samples of both seed and other potatoes shall be taken, preferably from lots in store and subjected to official or officially supervised laboratory testing using the method set out in Annex I for the detection and diagnosis of the organism. In addition, where appropriate, official or officially supervised visual inspection by cutting of tubers on other samples may be done.

Pro tato šetření se v případě hlíz odebírají vzorky sadbových i ostatních brambor, především ze skladovaných zásilek, a podrobují se úředním nebo úředně kontrolovaným laboratorním testům pomocí metody na zjištění a určení organismu uvedené v příloze I. Kromě toho může být v případě potřeby u ostatních vzorků provedena úřední nebo úředně kontrolovaná vizuální kontrola rozříznutím hlíz.

In the case of plants, these surveys shall be carried out according to appropriate methods and the samples shall be subjected to appropriate official or officially supervised testing.

U rostlin se tato šetření provádějí podle odpovídajících metod a vzorky se podrobují příslušným úředním nebo úředně kontrolovaným testům.

The number, origin, stratification and timing of collection of samples shall be decided by the responsible official bodies within the meaning of Directive 77/93/EEC based on sound scientific and statistical principles and the biology of the organism, and taking into account the particular potato production systems of the Member States concerned. The details thereof shall be submitted annually to the other Member States and the Commission, with a view to ensuring comparable levels of assurance between Member States for confirmation of the absence of the organism.

O počtu, původu, složení a časovém rozvrhu při shromažďování vzorků rozhodnou příslušné úřední subjekty podle směrnice 77/93/EHS na základě uznávaných vědeckých a statistických zásad a biologie organismu a s přihlédnutím k zvláštním systémům produkce brambor příslušných členských států. Podrobnosti týkající se těchto šetření se předkládají ročně ostatním členským státům a Komisi, aby se zajistily srovnatelné úrovně záruk členských států pro potvrzení nepřítomnosti organismu.

2. The results of the official surveys provided for in paragraph 1 shall be notified at least once a year to the other Member States and to the Commission. The details of this notification shall be confidential. They may be submitted to the Committee in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC.

2. Výsledky úředních šetření stanovených v odstavci 1 se oznamují nejméně jednou ročně ostatním členským státům a Komisi. Podrobnosti těchto oznámení jsou důvěrné. Mohou být předloženy výboru postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS.

3. The following provisions may be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC;

3. Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS mohou být přijata:

- the details of surveys provided for in paragraph 1 above, to be carried out in accordance with sound scientific and statistical principles,

- pravidla pro šetření stanovená v odstavci 1, která se provádějí na základě uznávaných vědeckých a statistických zásad,

- the details of the notification provided for in paragraph 2 above.

- pravidla pro oznámení uvedená v odstavci 2.

4. The following provisions shall be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC:

4. Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS se přijmou tato ustanovení:

- the appropriate method for the surveys and the testing provided for in the third subparagraph of paragraph 1 above.

- vhodná metoda pro šetření a testy uvedené v odst. 1 třetím pododstavci.

Článek 3

Article 3

Členské státy zajistí, aby bylo jakékoli podezření z výskytu nebo potvrzená přítomnost organismu v rostlinách bramboru a hlízách nebo v hlízách sklízených, skladovaných nebo uváděných na trh na jejich území sděleny příslušným úředním subjektům těchto členských států.

Member States shall ensure that the suspected occurrence or confirmed presence of the organism, in potato plants and tubers or harvested, stored or marketed tubers in their territory shall be reported to their own responsible official bodies.

Článek 4

1. V případě podezření z výskytu zajistí příslušné úřední subjekty členského státu, ve kterém byly tyto případy ohlášeny, provedení úředních nebo úředně kontrolovaných laboratorních testů pomocí metody uvedené v příloze I a za podmínek uvedených v bodě 1 přílohy II, aby potvrdily nebo vyvrátily podezření z výskytu. Je-li potvrzena přítomnost organismu, použije se bod 2 přílohy II.

Article 4

2. Až do potvrzení nebo vyvrácení podezření z výskytu podle odstavce 1, v případech, kdy byly zjištěny:

1. In cases of suspected occurrence, the responsible official bodies of the Member State in which these cases have been reported shall ensure completion of official or officially supervised laboratory testing, using the method set out in Annex I, and in accordance with the conditions specified in point 1 of Annex II, in order to confirm or refute the suspected occurrence. In the former case, the requirements laid down in point 2 of Annex II shall apply.

i) diagnostické vizuální příznaky choroby; nebo

2. Pending the confirmation or refutation of the suspected occurrence under paragraph 1, in those cases of suspect occurrence where, either:

ii) pozitivní reakce na imunofluorescenční test podle přílohy I nebo jiný odpovídající test;

(i) suspect diagnostic visual symptoms of the disease have been seen; or,

příslušné úřední subjekty členských států:

(ii) a positive immunofluorescence test as specified in Annex I or other appropriate positive test has been identified,

a) zakážou pohyb všech partií nebo zásilek, ze kterých byly odebrány vzorky, s výjimkou partií nebo zásilek, které jsou pod jejich kontrolou, a u nichž bylo stanoveno, že neexistuje zjistitelné nebezpečí rozšíření organismu;

the responsible official bodies of the Member States shall:

b) učiní nezbytná opatření, aby zjistily původ podezřelého výskytu;

(a) prohibit the movement of all lots or consignments from which the samples have been taken, except under their control and provided that it has been established that there is no identifiable risk of the organism spreading;

c) zavedou vhodná doplňující bezpečnostní opatření založená na stupni odhadovaného nebezpečí, aby předešly jakémukoli rozšíření organismu. Mezi tato opatření může být zahrnuta úřední kontrola pohybu všech ostatních hlíz nebo rostlin v rámci prostor nebo mimo prostory spojené s podezřelým výskytem.

(b) take steps to trace the origin of the suspected occurrence;

3. Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS mohou být přijata tato ustanovení:

(c) introduce appropriate additional precautionary measures based on the level of estimated risk, in order to prevent any spread of the organism. These measures may include the official control of the movement of all other tubers or plants within or off premises associated with the suspected occurrence.

- ustanovení uvedená v odst. 2 písm. c).

3. The following provision may be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC:

4. Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS se přijímají tato ustanovení:

- the measures referred to in paragraph 2 (c) above.

- jiný odpovídající test stanovený v odst. 2 bodu ii).

4. The following provision shall be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC:

Článek 5

- the other appropriate test provided for in paragraph 2 (ii) above;

1. Pokud úřední nebo úředně kontrolovaný laboratorní test pomocí metody uvedené v příloze I potvrdí přítomnost organismu ve vzorku hlíz, rostlin nebo částí rostlin, příslušné úřední subjekty členského státu na základě uznávaných vědeckých zásad, biologie organismu a zvláštních systémů produkce, uvádění na trh nebo zpracování v daném členském státě:

a) označí hlízy nebo rostliny, zásilku a/nebo partii, a zařízení, vozidlo, plavidlo, sklad nebo jejich jednotky a veškeré jiné předměty včetně obalového materiálu, z něhož byl vzorek odebrán, a v případě potřeby místo(a) produkce a pozemky, na nichž se hlízy nebo rostliny sklízely, za zamořené;

Article 5

b) s přihlédnutím k bodu 1 přílohy III určí rozsah pravděpodobného zamoření, které vzniklo předsklizňovým nebo posklizňovým kontaktem s prvky označenými za zamořené nebo vztahem s nimi v rámci produkčního systému;

1. If official or officially supervised laboratory testing using the method set out in Annex I confirms the presence of the organism in a sample of tubers, plants, or parts of plants, the responsible official bodies of a Member State, having regard to sound scientific principles, the biology of the organism and the particular production, marketing and processing systems in that Member State shall:

c) vymezí oblast na základě označení zamoření podle písmene a), určí rozsah pravděpodobného zamoření podle písmene b) a možného rozšíření organismu s přihlédnutím k bodu 2 přílohy III.

(a) designate as contaminated the tubers or plants, consignment and/or lot, and the machinery, vehicle, vessel, store, or units thereof, and any other objects including packaging material, from which the sample was taken, and, where appropriate, the place(s) of production and field(s) from which the tubers or plants were harvested;

2. Členské státy neprodleně oznámí postupem podle bodu 3 přílohy III ostatním členským státům a Komisi jakékoli zamoření označené podle odst. 1 písm. a), jakož i podrobné informace o vymezení oblasti podle odst. 1 písm. c).

(b) determine, taking into account the provisions of point 1 of Annex III, the extent of probable contamination through pre- or post-harvest contact or through production link with the designated contamination;

Podrobnosti tohoto oznámení jsou důvěrné. Mohou být předloženy výboru postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS.

(c) demarcate a zone on the basis of the designation of contamination under (a), the determination of the extent of probable contamination under (b), and the possible spread of the organism, taking into account the provisions of point 2 of Annex III.

3. V důsledku oznámení podle odstavce 2 a podle prvků v něm uvedených označí ostatní členské státy, které jsou v oznámení uvedeny, přiměřeným způsobem zamoření podle odst. 1 písm. a), stanoví rozsah pravděpodobného zamoření podle odst. 1 písm. b) a vymezí oblast podle odst. 1 písm. c).

2. Member States shall immediately notify the other Member States and the Commission, in accordance with the provisions of point 3 of Annex III, of any contamination designated under paragraph 1 (a) and the details of the zone demarcation under paragraph 1 (c).

Článek 6

The details of this notification shall be confidential. They may be submitted to the Committee in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC.

Členské státy nařídí, aby se v případě označení hlíz nebo rostlin za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) provedlo v souladu s čl. 4 odst. 1 testování zásob brambor klonově příbuzných zamořeným bramborám. Testování se provede na takovém množství hlíz nebo rostlin, které je potřeba ke stanovení prvotního zdroje choroby a rozsahu pravděpodobného zamoření, a zejména podle stupně nebezpečí.

3. As a result of the notification under paragraph 2 and the elements mentioned therein, other Member States detailed in the notification shall, as appropriate, designate contamination, determine the extent of probable contamination and demarcate a zone, in accordance with paragraph 1 (a), (b) and (c) respectively.

V důsledku testování se v případě potřeby provede další označení zamoření podle čl. 5 odst. 1 písm. a), určení rozsahu pravděpodobného zamoření podle čl. 5 odst. 1 písm. b) a vymezení oblasti podle čl. 5 odst. 1 písm. c).

Článek 7

Article 6

1. Členské státy nařídí, že hlízy nebo rostliny označené za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) nesmí být sázeny a musí být pod kontrolou jejich příslušných úředních subjektů:

Member States shall prescribe that where tubers or plants have been designated to be contaminated under Article 5 (1) (a), testing in accordance with Article 4 (1) shall be carried out on potato stocks which are clonally related to those involved in the contamination. The testing shall be carried out on as many such tubers or plants as are needed to determine the probable primary source of infection and the extent of the probable contamination, preferably in order of degree of risk.

- zničeny nebo

As a result of the testing, further designation of contamination, determination of the extent of probable contamination and demarcation of a zone shall be conducted, as appropriate, under Articles 5 (1) (a), (b) and (c) respectively.

- odstraněny jiným způsobem v rámci opatření prováděných pod úřední kontrolou v souladu s bodem 1 přílohy IV, pokud bylo stanoveno, že neexistuje zjistitelné nebezpečí rozšíření organismu

2. Členské státy nařídí, že se hlízy nebo rostliny označené jako pravděpodobně zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. b) nesmí sázet a musí být pod kontrolou příslušných úředních subjektů, aniž jsou dotčeny výsledky testů uvedených v článku 6 pro klonově příbuzné hlízy nebo rostliny, použity nebo odstraněny vhodným způsobem uvedeným v bodě 2 přílohy IV tak, aby mohlo být stanoveno, že neexistuje zjistitelné nebezpečí rozšíření organismu.

Article 7

3. Členské státy nařídí, že každé zařízení, vozidlo, plavidlo, sklad nebo jejich jednotky a veškeré jiné předměty včetně obalového materiálu, které byly označeny za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) nebo označeny za pravděpodobně zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. b), se buď zničí, nebo vyčistí a dezinfikují příslušnými metodami uvedenými v bodu 3 přílohy IV. Po vydezinfikování se takové předměty již nepovažují za zamořené.

1. Member States shall prescribe that tubers or plants, designated to be contaminated under Article 5 (1) (a) may not be planted and that, under the control of their responsible official bodies, they shall be:

4. Aniž jsou dotčena ustanovení provedená podle odstavců 1, 2 a 3, členské státy nařídí, aby byla v oblasti vymezené podle čl. 5 odst. 1 písm. c) provedena různá opatření podle bodu 4 přílohy IV.

- destroyed, or

Článek 8

- otherwise disposed of, subject to officially supervised measure(s), in accordance with the provisions of point 1 of Annex IV, provided that it is established that there is no identifiable risk of the organism spreading.

1. Členské státy nařídí, že sadbové brambory musí splňovat požadavky směrnice 77/93/EHS a musí v přímé linii pocházet z materiálu získaného podle úředně schváleného programu, který byl při úředním nebo úředně kontrolovaném testu pomocí metody uvedené v příloze I shledán prostým organismu.

2. Member States shall prescribe that tubers or plants determined as probably contaminated under Article 5 (1) (b) may not be planted and, without prejudice to the outcome of the testing referred to in Article 6 for clonally related stocks shall, under the control of their responsible official bodies, be put to appropriate use or disposal as specified in point 2 of Annex IV, in such a way that it is established that there is no identifiable risk of the organism spreading.

Uvedené testování se provádí:

3. Member States shall prescribe that any machinery, vehicle, vessel, store, or units thereof, and any other objects including packaging material, designated as contaminated under Article 5 (1) (a) or determined as probably contaminated under Article 5 (1) (b), shall either be destroyed or cleansed and disinfected using appropriate methods as specified in point 3 of Annex IV. After disinfection, any such objects shall no longer be considered contaminated.

- v případech, kdy se zamoření týká produkce sadbových brambor na rostlinách původního klonového výběru,

4. Without prejudice to the measures implemented under paragraphs 1, 2 and 3, Member States shall prescribe that, in the zone demarcated under Article 5 (1) (c), a series of measures, as specified in point 4 of Annex IV, shall be implemented.

- v ostatních případech buď na rostlinách původního klonového výběru, nebo na reprezentativních vzorcích základní kategorie sadbových brambor nebo dřívějších stupňů množení.

2. Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS mohou být přijata tato ustanovení:

Article 8

- prováděcí pravidla k odst. 1 druhému pododstavci první odrážce,

1. Member States shall prescribe that seed potatoes shall meet the requirements of Directive 77/93/EEC and shall derive in direct line from material obtained under an officially approved programme which has been found free of the organism in official or officially supervised testing using the method set out in Annex I.

- pravidla týkající se reprezentativních vzorků stanovených v odst. 1 druhém pododstavci tohoto článku.

The aforesaid testing shall be carried out:

Článek 9

- in cases where the contamination affects seed potato production, on the plants of the initial clonal selection,

Členské státy zakážou držení organismu a nakládání s ním.

- in other cases, either on the plants of the initial clonal selection or on representative samples of the basic seed potatoes or earlier propagations.

Článek 10

2. The following provisions may be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC:

Aniž jsou dotčena ustanovení směrnice 77/93/EHS, členské státy jsou oprávněny povolit odchylky od opatření uvedených v článcích 6, 7 a 9 této směrnice k pokusným nebo vědeckým účelům a k šlechtitelské práci, pokud tyto odchylky nejsou na újmu ochrany proti organismu a nevyvolávají nebezpečí jeho rozšíření.

- the detailed rules of application of the first indent of the second subparagraph of paragraph 1 of this Article,

Článek 11

- the rules concerning the representative samples provided for in the second indent of the second subparagraph of paragraph 1 of this Article.

Členské státy mohou přijmout doplňující nebo přísnější pravidla k ochraně proti organismu nebo k zabránění jeho rozšíření, pokud jsou tato opatření v souladu se směrnicí 77/93/EHS.

Doplňující opatření uvedená v prvním pododstavci mohou zahrnovat povinnost sázet pouze sadbové brambory, které jsou certifikované nebo úředně prověřené a které splňují požadované rostlinolékařské normy. Tyto rostlinolékařské normy lze použít zejména v případě, kdy jsou zemědělci ve svých podnicích oprávněni k používání sadbových brambor získaných z vlastní sklizně, jakož i v ostatních případech, kdy se sázejí sadbové brambory vypěstované producentem.

Article 9

Podrobnosti o těchto opatřeních se oznamují ostatním členským státům a Komisi.

Member States shall ban the holding and handling of the organism.

Článek 12

Změny příloh této směrnice na základě vývoje vědeckých nebo technických znalostí se přijmou postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS.

Article 10

Článek 13

Without prejudice to the provisions of Directive 77/93/EEC, Member States may authorize derogations from the measures referred to in Articles 6, 7 and 9 of this Directive for experimental or scientific purposes, and for work on varietal selection, provided that such derogations do not prejudice the control of the organism and create no risk of spread of the organism.

1. Členské státy přijmou a zveřejní ustanovení nezbytná pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 15. listopadu 1993. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.

Tato opatření přijatá členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním zveřejnění. Způsob odkazu si stanoví členské státy.

Article 11

Členské státy použijí tato ustanovení ode dne 16. listopadu 1993.

Member States may adopt such additional or stricter measures as may be required to combat the organism or to prevent it from spreading, in so far as they are in compliance with the provisons of Directive 77/93/EEC.

2. Členské státy neprodleně sdělí Komisi znění všech ustanovení vnitrostátních právních předpisů, které přijmou v oblasti působnosti této směrnice. Komise o nich uvědomí ostatní členské státy.

The additional measures mentioned in the first subparagraph may include the prescription that only seed potatoes may be planted that are either officially certified or officially inspected to meet the required plant health standards. The latter may apply in particular in case farmers are authorized to use, on their own holding, seed potatoes which they have obtained from their own harvest and in other cases that own-produced seed potatoes are planted.

Článek 14

The details of these measures shall be notified to the other Member States and to the Commission.

Směrnice 80/665/EHS se zrušuje ode dne 16. listopadu 1993.

Článek 15

Article 12

Tato směrnice je určena členským státům.

Amendments to the Annexes to this Directive, to be made in the light of developments in scientific or technical knowledge, shall be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC.

V Lucemburku dne 4. října 1993.

Article 13

Za Radu

1. By 15 November 1993 Member States shall adopt and publish the provisions necessary to comply with this Directive. They shall immediately inform the Commission thereof.

předseda

When Member States adopt these provisions, they shall contain a reference to this Directive or shall be accompanied by such reference at the time of their official publication. The procedure for making such reference shall be adopted by Member States.

W. Claes

Member States shall apply these provisions from 16 November 1993.

[1] Úř. věst. C 93, 2.4.1993, s. 12.

2. Member States shall immediately communicate to the Commission all provisions of national law which they adopt in the field covered by this Directive. The Commission shall inform the other Member States thereof.

[2] Úř. věst. C 176, 28.6.1993, s. 210.

[3] Úř. věst. C 161, 14.6.1993, s. 18.

Article 14

[4] Úř. věst. L 26, 31.1.1977, s. 20. Směrnice naposledy pozměněná směrnicí Komise 92/103/EHS (Úř. věst. L 363, 11.12.1992, s. 1).

Directive 80/665/EEC is hereby repealed with effect from 16 November 1993.

[5] Úř. věst. L 180, 14. 7.1980, s. 30.

--------------------------------------------------

Article 15

PŘÍLOHA I

This Directive is addressed to the Member States.

METODA PRO ZJIŠTĚNÍ A URČENÍ BAKTERIÁLNÍ KROUŽKOVITOSTI BRAMBORU, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al. VE SVAZCÍCH BRAMBOROVÝCH HLÍZ

Done at Luxembourg, 4 October 1993.

1. Odstranění výkrojků z pupkové části hlízy

For the Council The President W. CLAES

1.1. Omyjte 200 hlíz pod tekoucí vodou a pomocí řádně vydezinfikovaného skalpelu nebo škrabky na brambory odstraňte epidermis okolo pupkového konce každé hlízy; dezinfekci lze provést tak, že se nástroj smočí v 70 % roztoku ethanolu a ožehne.

1.2. Pečlivě odstraňte nožem nebo škrabkou na brambory konické výkrojky pletiva z pupkové části konců brambor. Omezte na minimum nadbytečnou část pletiva nezahrnující cévní svazky. Po vykrojení by měly být výkrojky z pupkových konců zpracovány do 24 hodin (viz odstavec 3) nebo konzervovány při –20 °C po dobu nejdéle dvou týdnů.

(1) OJ No C 93, 2. 4. 1993, p. 12.

2. Vizuální vyšetření na přítomnost příznaků kroužkovitosti

(2) OJ No C 176, 28. 6. 1993, p. 210.

Po odebrání výkrojků z pupkových konců rozřízněte každou hlízu napříč a prohlédněte, zda vykazuje příznaky kroužkovitosti.

(3) OJ No C 161, 14. 6. 1993, p. 18.

Zmáčkněte hlízy a sledujte, zda z vodivých pletiv vystupuje macerovaná hmota.

(4) OJ No L 26, 31. 1. 1977, p. 20. Directive as last amended by Commission Directive 92/103/EEC (OJ No L 363, 11. 12. 1992, p. 1).

Nejranějšími příznaky jsou slabá sklovitost nebo průsvitnost pletiva bez měknutí v okolí cévního systému, zejména blízko pupku. Prstenec svazků cévních na pupkovém konci hlízy může mít nepatrně tmavší zbarvení než normálně. Prvním dobře identifikovaným příznakem je žlutavé zabarvení prstence cévních svazků a při jemném zmáčknutí hlízy vystupují z cév sloupky sýrové hmoty. Tento exsudát obsahuje milióny bakterií. V tomto stadiu mohou vodivá pletiva hnědnout. Zpočátku mohou být tyto příznaky omezeny na jednu část prstence, nemusí se vyskytovat jen blízko pupkové části a mohou se postupně šířit na celý prstenec. S postupem infekce dochází k destrukci vodivých pletiv: vnější korová část se v tomto místě může oddělit od vnitřní korové části. V pokročilých stadiích infekce se objevují na povrchu hlízy praskliny, často s červenohnědými okraji. Druhotná houbová nebo bakteriální infekce může příznaky maskovat a může být obtížné, ne-li nemožné, rozlišit pokročilé příznaky kroužkovitosti od jiných hnilob bramboru.

(5) OJ No L 180, 14. 7. 1980, p. 30.

3. Příprava vzorků pro Gramovo barvení, imunofluorescenci (IF) a test na lilku vejcoplodém

3.1. Homogenizujeme pupkové konce hlíz až do úplné macerace v kapalině netoxické pro Corynebacterium sepedonicum (např. 0,05 M fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku (PBS) pH 7,0) při teplotě nižší než 30 °C; lze doporučit přidání netoxického prostředku proti vločkování (deflokulant) a netoxický protipěnový prostředek (dodatky 1 a 2). Neměla by se připustit nadměrná macerace.

3.2. Bakterie z homogenátu extrahujte jedním z následujících postupů [1]:

ANNEX I

A. a) Odstřeďujte při nejvýše 180 g po dobu 10 minut.

METHOD FOR THE DETECTION AND DIAGNOSIS OF THE RING ROT BACTERIUM, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. IN BATCHES OF POTATO TUBERS 1. Removal of heel-end cores

b) Odstřeďujte supernatant při zrychlení nepřesahujícím 4000 g po dobu 10 min. Dekantujte a odstraňte supernatant.

1.1. Wash 200 tubers in running tap water and remove the epidermis around the heel end of each tuber using a regularly disinfected scalpel or potato peeler; disinfection may be achieved by dipping the peeler in 70 % ethanol and flaming.

B. a) Nechte macerát stát 30 min., aby se usadila drť pletiv. Dekantujte supernatant, aniž by se rozvířil sediment.

1.2. Carefully remove conical tissue cores from the heel ends with a knife or potato peeler. Keep the excess non-vascular tissue to a minimum. Once removed, heel ends should be processed within 24 hours (see paragraph 3) or conserved at -20°C for no longer than two weeks.

b) Supernatant přefiltrujte přes filtrační papír (Whatman No 1) umístěný v sintrovaném skleněném filtru (č. 2 = 40–100 μm) pomocí vodní vývěvy. Filtrát seberte do centrifugačních zkumavek. Filtr promyjte sterilním PBS až do maximálního objemu filtrátu 35 ml.

2. Visual examination for ring rot symptoms

c) Odstřeďujtefiltrát při nejméně 4000 g po dobu 20 minut.

After removal of heel ends, cut each tuber transversely and observe for the presence of ring rot symptoms.

3.3. Suspendujte peletu ve sterilním 0,1 M fosfátovém pufru pH 7,2 (Dodatek 2), abyste získali celkový objem přibližně 1 ml. Suspenzi rozdělte na dvě stejné části a jednu část uschovejte pro účely srovnávání (referenční vzorek) zmrazením při –20 °C [2] nebo lyofilizací. Druhou část suspenze rozdělte na dvě poloviny. Jednu použijte na IF test a barvení podle Grama, druhou pro test na lilku vejcoplodém.

Squeeze the tubers and look for expression of macerated tissues from the vascular tissue.

3.4. Je nezbytně nutné, aby se se všemi pozitivními kontrolami a vzorky C. sepedonicum zacházelo odděleně, aby se předešlo zamoření. To se týká i sklíček na IF testy a testů na lilku vejcoplodém.

The earliest symptoms are a slight glassiness or translucence of the tissue without softening round the vascular system, particularly near the heel end. The vascular ring at the heel end may be slightly darker in colour than normal. The first readily identifiable symptom is one whereby the vascular ring has a yellowish coloration and when the tuber is gently squeezed, pillars of cheese-like material emerge from the vessels. This exudation contains millions of bacteria. Browning of the vascular tissue may develop at this stage. At first, these symptoms may be restricted to one part of the ring, not necessarily close to the heel end and may gradually extend to the whole ring. As the infection progresses, destruction of the vascular tissue occurs; the outer cortex may become separated from the inner cortex. In advanced stages of infection, cracks appear on the surface of the tuber, which are often reddish-brown at their margins. Secondary fungal or bacterial invasion may mask the symptoms and it may be difficult, if not impossible, to distinguish advanced ring rot symptoms from other tuber rots.

4. Gramovo zbarvení

3. Preparation of samples for Gram staining, immunofluorescence staining (IF) and eggplant test

4.1. Připravte Gramovo barvení pro všechna ředění pelety (5.2.1) a pro veškeré rozříznuté hlízy (2), které vykazují sklovitost, hnitít nebo jiné podezřelé příznaky. Vzorky by měly být odebrány z okraje napadených pletiv.

3.1. Homogenize the heel ends until complete maceration has just been achieved in a diluent known to be non-toxic to Corynebacterium sepedonicum (for example, 0,05 M phosphate buffered saline (PBS) pH 7,0) at a temperature of less than 30°C; the addition of a non-toxic deflocculant is advisable and non-toxic antifoam agent may be needed (Appendices 1 and 2). Excessive maceration should be avoided.

4.2. Připravte Gramovo barvení pro známé kultury C. sepedonicum, a pokud je to možné pro pletivo infikované přirozenou cestou (5.1).

3.2. Extract bacteria from the homogenate by one of the methods as follows(1) :

4.3. Určete, které vzorky obsahují typické gramopozitivní koryneformní buňky. Buňky C. sepedonicum jsou obvykle 0,8 až 1,2 μm dlouhé a 0,4 až 0,6 μm široké.

A. (a) Centrifuge at not more than 180 g for 10 minutes.

Vhodná metoda barvení je uvedena v dodatku 3.

(b) Centrifuge supernatant at not less than 4 000 g for 10 minutes. Decant and discard the supernatant.

Preparáty z přirozených infekcí nebo z čerstvě izolovaných kultur často převládají kokovité tyčinky, které jsou poněkud menší než buňky ze starších agarových kultur. Buňky C. sepedonicum jsou na většině živých médií pleomorfními koryneformními tyčinkami a mohou vykazovat proměnlivou reakci podle Gramai. Buňky jsou jednotlivé, ve dvojicích s charakteristickými zahnutími do "V" nebo "Y" typickým pro dělení kroutivým ohybem a příležitostně v nepravidelných skupinách často označovaných jako palisády a čínská písmena.

B. (a) Allow the macerate to stand for 30 minutes for the tissue debris to settle. Decant the supernatant without disturbing the sediment.

5. Schéma pro IF test

(b) Filter the supernatant through filter paper (Whatman No 1) held in a sintered glass filter (No 2 = 40-100mm) using a water vacuum pump. Collect the filtrate in a centrifuge tube. Wash the filter with sterile PBS to a maximum filtrate volume of 35 ml.

5.1. Použijte antisérum proti známému kmenu C. sepedonicum kroužkovitosti - ATCC33113 (NCPPB 2137) nebo NCPPB 2140. Toto antisérum by mělo mít větší IF titr než 1: 600. Zařaďte jednu kontrolu PBS na testovací podložní sklíčko ke stanovení, zda nedojde k nespecifické kombinaci bakteriálních buněk s konjugátem fluorescenčního isothiokyanátu a antikráličího imunoglobulinu (FITC). Corynebacterium sepedonicum (ATCC 33113, NCPPB 2137, NCPPB 2140) by se měla použít jako homologická kontrola antigenů na jiném podložním sklíčku. Na stejném podložním sklíčku by se měla jako paralelní kontrola používat přirozeně infikovaná pletiva (uchovávaná lyofilizací nebo zmrazením při –20 °C) (obr. 2).

(c) Centrifuge filtrate at not less than 4 000 g for 20 minutes.

5.2. Postup

3.3. Suspend the pellet in sterile 0,01 M phosphate buffer pH 7,2 (Appendix 2) to give a total volume of approximately 1 ml. Divide in two equal parts and retain one part for reference purposes by freezing at -20 °C(2) or by lyophilization. Divide the other part into halves using one half for the IF test and Gram stain and the other for the eggplant test.

5.2.1. Připravte řadu tři desetinásobných ředění (101,102,103) výsledné pelety v destilované vodě (obr. 1).

3.4. It is imperative that all positive C. sepedonicum controls and samples are treated separately to avoid contamination. This applies to IF slides and to eggplant tests.

5.2.2. Do jamek vícejamkového sklíčka napipetujte z každého ředění pelety nebo suspenze C. sepedonicum (přibližně 106 buněk/ml) změřený standardní objem dostačující k naplnění jamky (přibližně 25 ml) (obr. 1)

4. Gram staining

+++++ TIFF +++++

4.1. Prepare Gram stains for all pellet dilutions (5.2.1) and for any cut tubers (2) which show glassiness, rotting or other suspect symptoms. Samples should be taken from the edge of diseased tissues.

+++++ TIFF +++++

4.2. Prepare Gram stains for known C. sepedonicum cultures and, if possible, for naturally infected tissue (5.1).

5.2.4. Zaplňte příslušné jamky antisérem C. sepedonicum v doporučených ředěních roztokem 0,01 M PBS pH 7,2 (Dodatek 2), jak je uvedeno na obrazku 1 (Použijte PBS pro kontrolu FITC). Pracovní ředění antiséra by mělo mít přibližně polovinu titru IF. Jestliže se má pracovat s jinými ředěními antiséra, měla by se připravit pro každé ředění, s nímž se má pracovat, samostatná sklíčka.

4.3. Determine which samples contain typical Gram positive coryneform cells. In general, C. sepedonicum cells are 0,8 to 1,2mm long and 0,4 to 0,60mm wide.

5.2.5. Inkubujte ve vlhké komůrce při pokojové teplotě po dobu 30 minut.

An appropriate staining procedure is given in Appendix 3.

5.2.6. Pečlivě opláchněte roztokem 0,01 M PBS pH 7,2. Promývejte po dobu pěti minut ve třech vždy vyměněných roztocích 0,01 M PBS pH 7,2.

Preparations from natural infections or recently isolated cultures often show a predominance of coccoid rods which are usually slightly smaller than cells from oder agar cultures. On most culture media, C. sepedonicum cells are pleomorphic coryneform rods and may give a variable Gram reaction. Cells are single, in pairs with characteristic 'elbows' typical of bending division, and occasionally in irregular groups often referred to as palisades and Chinese letters.

5.2.7. Pečlivě odstraňte přebytečnou vlhkost.

5. Scheme for IF-testing

5.2.8. Do každé jamky přidáme konjugát FITC ve zředění používaném ke stanovení titru a necháme inkubovat ve tmavé vlhké komůrce při pokojové teplotě po dobu 30 minut.

5.1. Use antiserum to a known strain of C. sepedonicum - ATCC 33113 (NCPPB 2137), or NCPPB 2140. This should have an IF titre of more than 1:600. Include one PBS control on the test slide to determine whether the fluorescein isothiocyanate anti-rabbit immunoglobulin conjugate (FITC) combines non-specifically with bacterial cells. Corynebacterium sepedonicum (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) should be used as homologous antigen controls on a separate slide. Naturally infected tissue (maintained by lyophilization or freezing at -20°C) should be used where possible as a similar control on the same slide (Figure 2).

5.2.9. Opláchněte a omývejte jako v předcházejícím případě.

5.2. Procedure

5.2.10. Do každé jamky přidejte přibližně 5 – 10 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7,6 s glycerinem (nebo podobnou látkou o pH neklesajícím pod 7,6) a přikryjeme krycím sklíčkem (Dodatek 2).

5.2.1. Prepare three serial ten fold dilutions (101, 102, 103) of the final pellet in distilled water (Figure 1).

5.2.11. Prohlédněte pod mikroskopem, vybaveným zdrojem epifluorescenčního světla a filtry vhodnými pro práci s FITC. Vhodné je zvětšení od 400 do 1000. Pečlivě prohlédneme jamky v přímkách jdoucích v pravých úhlech středem a po obvodu jamky.

5.2.2. Pipette a measured standard volume sufficient to cover the window (approximately 25 ml) of each pellet dilution or C. sepedonicum suspension (approximately 106 cells/ml) to windows of a multispot slide as shown in Figure 1.

Pozorujte fluoreskující buňky v pozitivních kontrolách a určete titr. Pozorujte fluoreskující buňky v jamce s kontrolou FITC/PBS a pokud se zde nevyskytují, přejděte k jamkám testovacích vzorků. V nejméně 10 mikroskopových polích určete průměrný počet morfologicky typických fluoreskujících buněk v jednom poli a vypočítejte jejich počet na 1 ml neředěné pelety (dodatek 4).

5.2.4. Cover appropriate windows which C. sepedonicum antiserum at the recommended dilutions, 0,01 M PBS pH 7,2 (Appendix 2), as shown in Figure 1. (Use PBS for the FITC control.) The working dilution of the antiserum should be approximately half that of the IF titre. If other antiserum dilutions are to be included, separate slides should be prepared for each dilution to be used.

Existuje několik problémů podstatných pro imunofluorescenční test.

5.2.5. Incubate in a humid chamber at ambient temperature for 30 minutes.

- V peletách bramboru se pravděpodobně vyskytnou doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s rozměry a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. V úvahu bereme pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií.

5.2.6. Rinse carefully with 0,01 M PBS pH 7,2. Wash for five minutes in three changes of 0,01 M PBS pH 7,2.

Vzhledem k možnosti křížových reakcí by měly být vzorky s pozitivním imunofluorescenčním testem opětovně testovány pomocí odlišného antiséra.

5.2.7. Carefully remove excess moisture.

- Technický limit zjištění touto metodou je mezi 103 a 104 buněk/ml neředěné pelety. Vzorky s počtem IF typických buněk na hranici detekčního limitu jsou obvykle pro C. m. ssp. sepedonicus negativní, ale mohou být postoupeny do testu na lilku vejcoplodém.

5.2.8. Cover each window with FITC conjugate at the same dilution used to determine the titre and incubate in a dark humid chamber at ambient temperature for 30 minutes.

Imunofluorescenční test se považuje za negativní u kteréhokoliv vzorku, kde nebyly nalezeny morfologicky typické fluoreskující buňky. Vzorky se považují za "nezamořené"Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

5.2.9. Rinse and wash as before.

Test na lilku není požadován.

5.2.10. Apply approximately 5 to 10 ml of 0,1 M phosphate buffered glycerine pH 7,6 (or a similar mountant with a pH not less than 7,6) to each window and cover with a coverglass (Appendix 2).

Imunofluorescenční test se považuje za pozitivní u kteréhokoliv vzorku, kdebyly nalezeny morfologicky typické fluoreskující buňky.

5.2.11. Examine with a microscope fitted with an epifluorescent light source and filters suitable for working with FITC. A magnification of 400 to 1 000 is suitable. Scan replicated windows across two diameters at right angles and around the window perimeters.

Vzorky, u kterých byl pozitivní imunofluorescenční test u obou užitých antisér, se považují za "pravděpodobně zamořené"Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Observe for fluorescing cells in the positive controls and determine the titre. Observe for fluorescing cells in the FITC/PBS control window and, if absent, proceed to the test windows. Determine in a minimum of 10 microscope fields the mean number of morphologically typical fluorescing cells per field and calculate the number per ml of undiluted pellet (Appendix 4).

Test na lilku je požadován pro všechny vzorky považované za pravděpodobně zamořené

There are several problems inherent to the immunofluorescence test.

6. Test na lilku vejcoplodém

- Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus are likely to occur in potato pellets. Consider only fluorescing cells with typical size and morphology.

Podrobnosti o pěstování jsou uvedeny v dodatku 5.

Because of the possibility of cross-reactions, samples with a positive immunoflorescence test should be retested using a different antiserum.

6.1. Peletu podle 3.3. rozdělíme mezi alespoň 25 rostlin lilku vejcoplodého ve fázi tří listů (dodatek 5) jednou z níže uvedených metod (6.2, 6.3 nebo 6.4).

- The technical limit of detection of this method is situated between 103 and 104 cells per ml of undiluted pellet. Samples with counts of IF typical cells at the detection limit are usually negative for C. m. ssp. sepedonicus but may be committed to eggplant testing.

6.2. Inokulace zářezemI

A negative immunofluorescence test is identified for any sample where morphologically typical fluorescing cells are not found. The samples shall be considered as 'not contaminated' with Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

6.2.1. Každý květináč horizontálně podepřeme (pro 10 cm květináč je vhodný blok pěnového polystyrénu s vyhloubenou částí o rozměrech 5 cm hloubky, 10 cm šířky a 15 cm délky, viz obr. 3). Pro každý testovaný vzorek by se měl mezi stonek a blok umístit proužek sterilní hliníkové fólie. Rostlinu je možno fixovat na místě gumovým páskem kolem bloku.

The eggplant test is not required.

6.2.2. Pomocí skalpelu proveďte mezi děložními lístky a prvním pravým listem podélný nebo mírně úhlopříčný řez dlouhý 0,5 až 1,0 cm a hluboký přibližně jako tři čtvrtiny průměru stonku.

A positive immunofluorescence test is identified for any sample where morphologically typical fluorescing cells are found.

6.2.3. Držte zářez otevřený pomocí špičky čepele skalpelu a naneste do něj inokulum štětečkem na oční linky nebo jemným malířským štětečkem namočeným do pelety. Rozdělte zbytek pelety mezi všechny testovací rostliny lilku.

Samples for which a positive immunofluorescence test have been identified with both antisera shall be considered as 'potentially contaminated' with Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

6.2.4. Překryjte řez sterilní vazelínou aplikovanou 2 ml injekční stříkačkou.

The eggplant test is required for all samples considered as potentially contaminated.

+++++ TIFF +++++

6. Eggplant test

6.3. Inokulace zářezem II

For cultural details, see Appendix 5.

6.3.1. Držte rostlinu dvěma prsty, na stonek napipetujte mezi děložními lístky a prvním pravým listem kapku (přibližně 5 až 10 μl) suspendované pelety.

6.1. Distribute the pellet from 3.3 between at least 25 eggplants at leaf stage 3 (Appendix 5) by one of the methods given below (6.2, 6.3 or 6.4).

6.3.2. Pomocí sterilního skalpelu udělejte sešikměný zářez (v úhlu přibližně 5o), dlouhý 1,0 cm a hluboký přibližně jako 2/3 tloušťky stonku, přičemž s řezem začneme v místě kapky suspendované pelety.

6.2. Slit inoculation I

6.3.3. Zakryjte řez sterilní vazelínou z injekční stříkačky.

6.2.1. Support each pot horizontally (a block of expanded polystyrene with a piece 5 cm deep × 10 cm wide × 15 cm long, removed from one surface (Figure 3) is adequate for a 10 cm pot). A strip of sterile aluminium foil should be placed between the stem and the block for each sample tested. The plant may be held in place by a rubber band around the block.

6.4. Inokulace injekční stříkačkou

6.2.2. Using a scalpel, make a longitudinal or slightly diagonal cut 0,5 to 1,0 cm long and approximately three quarters of the stem diameter deep, between the cotyledons and the first leaf.

6.4.1. Nezalévejte lilky den před inokulací, aby se snížilo vnitřní napětí buňky (turgor).

6.2.3. Hold the slit open with the scalpel blade point and paint the inoculum into it using an eyeliner or fine artist's brush charged with the pellet. Distribute the remainder of the pellet between the eggplants.

6.4.2. Stonky lilku vejcoplodého inokulujte těsně nad děložními lístky pomocí injekční stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23G). Peletu rozdělte mezi testovací rostliny lilku vejcoplodého.

6.2.4. Seal the cut with sterile vaseline from a 2 ml syringe barrel.

6.5. Inokulujte 25 rostlin stejnou inokulační metodou (6.2, 6.3 nebo 6.4) známou kulturou C. sepedonicuma a v případě potřeby i pletivem z přirozeně infikovaných hlíz bramboru (5.1).

6.3. Slit inoculation II

6.6. Inokulujte 25 rostlin sterilním 0,05 M PBS stejnou inokulační metodou (6.2, 6.3 nebo 6.4).

6.3.1. Holding the plant between two fingers, pipette a drop (approximately 5 to 10 ml) of the suspended pellet on the stem between the cotyledons and the first leaf.

6.7. Nechte inokulovat rostliny ve vhodných podmínkách (dodatek 5) po dobu 40 dní. Pravidelně po osmi dnech prověřujte přítomnost příznaků. Spočítejte rostliny vykazující příznaky. C. sepedonicum působí u lilku vejcoplodého vadnutí listů, které může začít jako okrajová nebo mezižilková ochablost (ztráta turgoru). Zvadlé pletivo může zprvu být tmavozelené nebo strakaté, ale než znekrotizuje, zesvětlí. Povadlá místa mezi žilnatinou mívají často mastně vodnatý vzhled. Nekrotická pletiva mívají často jasně žlutý okraj. Rostliny vždy neodumírají; čím déle trvá období do vyvinutí příznaků, tím je větší naděje na přežití. Rostliny mohou infekci odrůst. Náchylné mladé rostliny lilku vejcoplodého jsou mnohem citlivější vůči nízkým koncentracím C. sepedonicum než starší rostliny, proto je nezbytné používat rostliny ve fázi tří listů a nebo krátce před ní.

6.3.2. Using a sterile scalpel, make a diagonal (at an angle of approximately 5°) slit, 1,0 cm long and approximately 2/3 of the stem thickness deep, starting the cut from the pellet drop.

Vadnutí mohou také způsobovat populace jiných bakterií nebo hub přítomných v peletě z pletiv hlízy. Patří k nim Erwinia carotovora subsp. carotovora a E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, jakož i velké koncentrace saprofytických bakterií. Tyto případy vadnutí lze odlišit od případů způsobených kroužkovitostí, jelikož rychle vadnou celé listy nebo celé rostliny.

6.3.3. Seal the cut with sterile vaseline from a syringe barrel.

6.8. Připravte Gramovo barvení (4) pro všechny partie lilku vejcoplodého vykazující příznaky napadení. Použijte části zvadlých listových pletiv a pletivo ze stonků rostlin a izolujte je na vhodných živných médiích (7). Listy a stonky lilku vejcoplodého dezinfikujte povrchově otřením 70 % ethanolem.

6.4. Syringe inoculation

6.9. Za určitých okolností, zejména pokud nejsou růstové podmínky optimální, se může stát, že C. sepedonicum zůstává jako latentní infekce v rostlinách lilku vejcoplodého dokonce i po 40 denní inkubací. Takové infekce mohou mít případně za následek zakrnělost a ztrátu vitality inokulovaných rostlin. Pokud je IF test považován za pozitivní, může být považováno za nezbytné další testovat. Je proto důležité porovnávat rychlost růstu všech testovacích rostlin lilku vejcoplodého s kontrolami inokulovanými sterilním 0,05 M PBS a sledovat podmínky prostředí ve skleníku.

6.4.1. Do not water eggplants for one day prior to inoculation to reduce turgor pressure.

Pro další testování se stanoví tato doporučení:

6.4.2. Inoculate the eggplant stems just above the cotyledons using a syringe fitted with a hypodermic needle (not less than 23G). Distribute the pellet between the eggplants.

6.9.1. Odřízněte stonky nad místem inokulace a odstraňte listy.

6.5. Inoculate 25 plants with a known C. sepedonicum culture and, where possible, naturally infected tuber tissue (5.1) by the same inoculation method (6.2, 6.3 or 6.4).

6.9.2. Macerujte stonky v roztoku 0,05 M PBS s pH 7,0, jak je uvedeno v bodech 3.1 až 3.2.

6.6. Inoculate 25 plants with sterile 0,05 M PBS by the same inoculation method (6.2, 6.3 or 6.4).

6.9.3. Použijte polovinu pelety k provedení Gramova barvení (4) a testu IF (5).

6.7. Incubate the plants in appropriate conditions (Appendix 5) for 40 days. Examine regularly for symptoms after eight days. Count the number of plants showing symptoms. C. sepedonicum causes leaf wilting in eggplants which may commence as a marginal or interveinal flaccidity. Wilted tissue may initially appear dark green or mottled but turns paler before becoming necrotic. Interveinal wilts often have a greasy water-soaked appearance. Necrotic tissue often has a bright yellow margin. Plants are not necessarily killed; the longer the period before symptoms develop, the greater the chance of survival. Plants may outgrow the infection. Susceptible young eggplants are much more sensitive to low populations of C. sepedonicum than are older plants, hence the necessity to use plants at or just before leaf stage 3.

6.9.4. Použijte druhou polovinu pelety k provedení dalšího testu na lilku vejcoplodém (6), pokud je Gramovo barvení a/nebo IF test pozitivní. Jako kontroly použijte známou kulturu C. sepedonicum a sterilní 0,05 M PBS. Pokud v následující testu nejsou příznaky napadení pozorovány, považuje se vzorek za negativní.

Wilts may also be induced by populations of other bacteria or fungi present in the tuber tissue pellet. These include Erwinia carotovora, subsp. carotovora and E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, as well as large populations of saprophytic bacteria. Such wilts can be distinguished from those caused by C. sepedonicum since whole leaves or whole plants wilt rapidly.

7. Izolace C. sepedonicum

6.8. Prepare a Gram stain (4) for all batches of eggplants showing symptoms, using sections of wilted leaf tissue and stem tissue from plants and isolate on to suitable nutrient media (7). Surface disinfect the eggplant leaves and stems by wiping with 70 % ethanol.

Diagnóza může být potvrzena pouze tehdy, je-li C. sepedonicum izolována a takto identifikována (8). Ačkoliv je C. sepedonicum náročným organismem, je možno ji izolovat z pletiv projevujících příznaky napadení. Mohou ji však přerůst rychle rostoucí saprofytické bakterie, a proto se nedoporučují provádět izolaci přímo z pelety pletiva hlízy (3.3). Lilek vejcoplodý je výtečným selektivním obohacovacím živným médiem pro růst C. sepedonicum a zároveň je také vhodný pro použití k potvrzujícímu testu pomocí hostitelské rostliny.

6.9. Under certain circumstances, in particular where growing conditions are not optimal, it may be possible for C. sepedonicum to exist as a latent infection within eggplants even after incubation for 40 days. Such infections may possibly result in stunting and lack of vigour in the inoculated plants. If the IF test is considered positive, it may be considered necessary to test further. It is, therefore, essential to compare the growth rates of all eggplant test plants with the sterile 0,05 M PBS inoculated controls and to monitor the environmental conditions of the glasshouse.

Izolace by se měly provádět ze všech hlíz bramboru a rostlin lilku vejcoplodého vykazující příznaky napadení (4.6). Kde je to nezbytné, je třeba provést maceraci stonků lilku jako v bodech 3. a 6.9.

Recommendations for further testing are as follows:

7.1. Rozetřete suspenzi na jedno z následujících médií: (složení uvedena v dodatku 6):

6.9.1. excise the stems above the inoculation site and remove the leaves;

živný dextrózový agar (pouze pro subkultury),

6.9.2. macerate the stems in 0,05 M PBS pH 7,0, as in 3.1 to 3.2;

kvasničný pepton glukózový agar,

6.9.3. use half of the pellet to perform a Gram stain (4) and an IF test (5);

živný kvasničný dextrózový agar,

6.9.4. use the other half to perform a further eggplant test (6) if the Gram stain and/or IF tests are positive. Use a known C. sepedonicum culture and sterile 0,05M PBS controls. If symptoms are not observed in the subsequent test, the sample must be considered negative.

agar z kvasničného extraktu s minerálními solemi

7. Isolation of C. sepedonicum

Inkubujte po dobu maximálně 20 dní při teplotě 21 °C

Diagnosis can only be confirmed if C. sepedonicum is isolated and so identified (8). Although C. sepedonicum is a fastidious organism, it can be isolated from symptomatic tissue. However, it may be outgrown by rapidly growing saprophytic bacteria and, therefore, isolations directly from the tuber tissue pellet (3.3) are not recommended. Eggplants provide an excellent selective enrichment medium for the growth of C. sepedonicum and also provide an excellent confirmatory host test.

C. sepedonicum pomalu roste a obvykle vytváří za 10 dnů kolonie velikosti špendlíkové hlavičky, vyklenuté, smetanově zbarvené.

Isolations should be made from all symptomatic potato tubers and eggplants (4, 6). Maceration of eggplant stems when necessary should be carried out as in 3. and 6.9.

Pro zaručení čistoty kultury znovu rozetřete

7.1. Streak suspensions on to one of the following media: (formulae are given in Appendix 6):

U subkultur se zlepšuje rychlost růstu. Typické kolonie jsou smetanově bílé nebo barvy slonoviny, jsou okrouhlé, hladké, vyvýšené, konvexně vyklenuté, slizovitě tekuté, s rovnými okraji a obvykle mají v průměru 1–3 mm

nutrient dextrose agar (for subculture only),

Identifikace

yeast peptone glucose agar,

Ze zdravých i nemocných brambor a lilku je možné izolovat mnohé grampozitivní koryneformní bakterie se znaky kolonií podobnými jako u kroužkovitosti. V této souvislosti musí být kroužkovitost identifikována následujícími testy:

nutrient yeast dextrose agar,

IF test (5.1),

yeast extract mineral salts agar.

test na lilku vejcoplodém,

Incubate at 21°C for up to 20 days.

nutriční a fyziologické testy (dodatek 7),

C. sepedonicum is slow-growing, usually producing pin-point, cream, domed colonies within 10 days.

- oxidačněfermentační testy (O/F),

Re-streak to establish purity.

- oxidasový test,

Growth rates are improved with subculture. Typical colonies are creamy-white or ivory, rounded, smooth, raised, convex-domed, mucoid-fluidal, with entire edges and usually 1 to 3 mm in diameter.

- růst při 37 °C,

Identification

- tvorba ureasy,

Many Gram positive coryneform bacteria, with colonial characters similar to those of C. sepedonicum, may be isolated from healthy or diseased potatoes and eggplants. In this context C. sepedonicum must be identified by the following tests:

- hydrolýza eskulinu,

IF test (5.1),

- hydrolýza škrobu,

eggplant test,

- tolerance k 7 % roztoku NaCl,

nutrition and physiological tests (Appendix 7),

- indolový test,

- oxidation/fermentation test (O/F),

- katalasový test,

- oxidase test,

- tvorba H2S,

- growth at 37°C,

- využití citrátu,

- urease production,

- hydrolýza želatiny,

- aesculin hydrolysis,

- tvorba kyseliny z: glycerolu, laktosy, rhamnosy a salicinu,

- starch hydrolysis,

- Gramovo barvení.

- tolerance of 7 % sodium chloride solution,

Všechny testy by měly zahrnovat kontrolu se známým kmenem C. sepedonicum. Nutriční a fyziologické testy by měly být provedeny s inokulem ze subkultur na živým agaru. Morfologická srovnání by se měla provádět z kultur z živného dextrosového agaru.

- indole test,

Pro IF test by hustota populace buněk měla být upravena na 106 buněk/ml. IF titr by měl být podobný známé kultuře C. sepedonicum.

- catalase test,

Pro test na lilku vejcoplodém by měla být hustota populace buněk upravena na 107 buněk/ml. Testy na lilku vejcoplodém by měly zahrnovat 10 rostlin pro každý testovaný organismus, opět za použití kontrol tvořených známou kulturou C. sepedonicum a sterilní vodou. U čistých kultur by mělo během 20 dnů nastat typické vadnutí, avšak rostliny, které nevykazují žádné příznaky napadení po této době, je nutno inkubovat celkem 30 dní při teplotách příznivých pro růst lilku, ale nepřesahujících 30 oC (dodatek 5). Jestliže se po 30 dnech příznaky napadení nevyskytují, nemůže být kultura považována za patogenní formu Corynebacterium sepedonicum.

- H28 production,

Test | C. sepedonicum |

- citrate utilization,

O/F | inertní nebo slabě oxidační |

- gelatin hydrolysis

Oxidasa | – |

- acid from: glycerol, lactose, rhamnose and salicin,

Katalasa | + |

- Gram stain.

Redukce nitrátů | – |

All tests should include a known C. sepedonicum control. Nutritional and physiological tests should be made using inocula from nutrient agar subcultures. Morphological comparisons should be made from nutrient dextrose agar cultures.

Aktivitat ureasy | – |

For the IF test, cell populations should be adjusted to 106 cells/ml. The IF titre should be similar to that of the known C. sepedonicum culture.

Tvorba H2S | – |

For the eggplant test cell populations should be adjusted to c 107 cells/ml. Eggplant tests should be made using 10 plants for each of the test organisms, again using known C. sepedonicum culture and sterile water controls; with pure cultures typical wilting should be obtained within 20 days but plants not showing symptons after this time should be incubated for a total of 30 days at temperatures conducive to eggplant growth but not exceeding 30°C (Appendix 5). If after 30 days symptoms are not present, the culture cannot be confirmed as being a pathogenic form of Corynebacterium sepedonicum.

Tvorba indolu | – |

Test C. sepedonicum

Využívání citrátu | – |

O/F Inert or weakly oxidative

Hydrolýza škrobu | –nebo slabá |

Oxidase -

Růst při 37 °C | – |

Catalase +

Růst v 7 % NaCl | – |

Nitrate reduction -

Hydrolýza želatiny | – |

Urease activity -

Hydrolýza eskulinu | + |

H2S production -

Tvorba kyseliny z: | |

Indole production -

–glycerolu | – |

Citrate utilization -

–laktosy | –nebo slabá |

Starch hydrolysis - or weak

–rhamnosy | – |

Growth at 37° -

–salicinu | – |

Growth in 7 % NaCl -

[1] Alternativní metoda extrakce uvádí Dinesen, 1984.

Gelatin hydrolysis -

[2] Existuje důkaz (Janse a Vaerenberg, 1987), že zmražení může snížit životnost Corynebacterium sepedonicum. Tento problém lze vyřešit suspendováním pelety v 10 % roztoku glycerolu.

Aesculin hydrolysis +

--------------------------------------------------

Acid from:

PŘÍLOHA II

- Glycerol -

1. Při každém podezření z výskytu, pro který byla imunofluorescenčním testem uvedeným v příloze I zjištěna pozitivní reakce a dokončením této metody by mělo být podezření potvrzeno nebo vyvráceno, je třeba až do dokončení dané metody zadrženy a vhodným způsobem konzervovány:

- Lactose - or weak

- všechny hlízy nebo rostliny, které jsou součástí vzorku, a

- Rhamnose -

- jakýkoli zbývající výluh a dodatečně připravená imunofluorescenční sklíčka.

- Salicin -

2. V případě potvrzení organismu by měly být zadrženy a vhodným způsobem konzervovány:

Appendix 1 FORMULATION OF MACERATING FLUID RECOMMENDED BY LELLIOTT AND SELLAR, 1976

- materiál uvedený v odstavci 1 a

D C silicone antifoam MS A compound (Hopkins & Williams Ltd, Cat. No 9964-25, Chadwell Heath, Essex, England) 10 ml

- vzorek napadeného materiálu lilku vejcoplodého naočkovaného hlízou nebo rostlinným výluhem a

Lubrol W flakes (ICI Ltd) 0,5 g

- izolované kultury organismu,

Tetra-sodium pyrophosphate 1 g

nejméně do jednoho měsíce od oznamovacího postupu podle čl. 5 odst. 2.

0,05 M phosphate buffered saline pH 7,0 (Appendix 2) 1 litre

--------------------------------------------------

Appendix 2 BUFFERS

PŘÍLOHA III

0,05 M phosphate buffered saline pH 7,0

1. Pro určení rozsahu pravděpodobného zamoření podle čl. 5 odst. 1 písm. b) je třeba zohlednit tyto činitele:

This buffer can be used for tuber tissue maceration (2.1)

- hlízy nebo rostliny pěstované v místě produkce označeném za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a),

Na2HPO4 4,26 g

- místo(a) produkce nebo zařízení, které mají v rámci produkčního systému vztah k hlízám nebo rostlinám označeným za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a), včetně těch, které mají společné pěstitelské zařízení a vybavení přímo nebo prostřednictvím společného smluvního partnera,

KH2PO4 2,72 g

- hlízy nebo rostliny pěstované v místě(ech) produkce uvedeném(ých) v předchozí odrážce nebo nacházející se v takovém(ých) místě(ech) produkce během období, kdy se hlízy nebo rostliny označené za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) nacházely v takovém zařízení nebo místech produkce uvedených v první odrážce,

NaCl 8,0 g

- ústřední sklady skladující brambory z uvedených míst produkce,

Distilled water to 1 litre

- jakékoli zařízení, vozidlo, plavidlo, sklad nebo jejich jednotky a jakékoli jiné předměty včetně obalového materiálu, které mohly přijít do styku s hlízami nebo rostlinami označenými za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) během předcházejících 12 měsíců nebo jiného odpovídajícího období,

0,01 M phosphate buffered saline pH 7,2

- jakékoli hlízy nebo rostliny, které se skladují nebo jsou v kontaktu s jakýmikoli stavbami nebo předměty vyjmenovanými v předcházející odrážce před čištěním a dezinfekcí těchto předmětů nebo staveb, a

This buffer is used for diluting antisera and washing IF slides

- v důsledku testů uvedených v článku 6 hlízy nebo rostliny, které mají stejný klonový původ jako hlízy nebo rostliny označené za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) a u nichž testy označily zamoření za pravděpodobné.

Na2HPO4 12 H2O 2,7 g

2. Pro stanovení možného rozšíření podle čl. 5 odst. 1 písm. c) je třeba zohlednit tyto činitele:

NaH2PO4 2 H2O 0,4 g

- blízkost ostatních míst produkce, kde se pěstují brambory nebo jiné hostitelské rostliny,

NaCl 8,0 g

- společný původ zásob sadbových brambor.

Distilled water to 1 litre

3. Podrobnosti oznámení uvedeného v čl. 5 odst. 2 prvním pododstavci zahrnují:

0,1 M phosphate buffered glycerine pH 7,6

- osvědčení stanovená v článcích 7 nebo 8 směrnice 77/93/EHS, pas nebo podle potřeby evidenční číslo pro každou zásilku nebo partii brambor označenou za zamořenou,

This buffer is used as a mountant to enhance fluorescence in the IF test

- název odrůdy pro zásoby sadbových brambor a v případě potřeby ve všech ostatních případech,

Na2HPO4 12 H2O 3,2 g

- činitele označeného zamoření a vymezené oblasti,

NaH2PO4 2 H2O 0,15 g

- existence výluhu, připravených imunofluorescenčních sklíček, materiálu napadených lilků vejcoplodých a izolované kultury organismu z testu, při kterém bylo organismu potvrzen.

Glycerol 50 ml

--------------------------------------------------

Distilled water 100 ml

PŘÍLOHA IV

Appendix 3 GRAM STAIN PROCEDURE (HUCKER'S MODIFICATION) (DOETSCH, 1981)

1. Úředně kontrolovaná opatření uvedená v čl. 7 odst. 1 a týkající se zacházení s hlízami nebo rostlinami označenými za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a), jsou:

Crystal violet solution

- využívána při průmyslovém zpracování prostřednictvím přímé a okamžité dodávky na zpracovatelský závod s příslušným zařízením na zpracování odpadu, u kterého bylo stanoveno, že v něm neexistuje zjistitelné nebezpečí rozšíření organismu, a se systémem dezinfekce skladovacích prostor a odvozových vozidel, nebo

Dissolve 2 g crystal violet in 20 ml 95 % ethanol.

- jiná opatření, pokud bylo stanoveno, že neexistuje zjistitelné nebezpečí rozšíření organismu; tato opatření se oznamují Komisi a ostatním členským státům.

Dissolve 0,8 g ammonium oxalate in 80 ml distilled water.

2. Použití nebo příslušnými úředními subjekty členských států úředně kontrolované odstranění hlíz nebo rostlin označených za pravděpodobně zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. b) a uvedených v čl. 7 odst. 2 zahrnuje:

Mix the two solutions.

- jejich použití jako konzumních brambor určených ke spotřebě, balených pro přímou dodávku a použití, které nevyžadují změnu obalu, a určených pro takovou přímou dodávku a použití, nebo

Lugol's iodine

- jejich použití jako konzumních brambor určených k průmyslovému zpracování po přímé a okamžité dodávce zpracovatelskému závodu s vhodným zařízením na odstranění odpadu, nebo

Iodine 1 g

- jiné přiměřené využití nebo odstranění, pokud je stanoveno, že neexistuje zjistitelné nebezpečí rozšíření organismu.

Potassium iodide 2 g

3. Příslušnými metodami pro čištění a dezinfekci předmětů uvedených v čl. 7 odst. 3 se rozumějí takové metody, u kterých bylo stanoveno, že neexistuje zjistitelné nebezpečí rozšíření organismu, a tyto metody se použijí pod kontrolou příslušných úředních subjektů členských států.

Distilled water 300 ml.

4. Opatření, která mají členské státy provést uvnitř vymezené oblasti podle čl. 5 odst. 1 písm. c) a uvedené v čl. 7 odst. 4, zahrnují:

Grind the solids together in a pestle and mortar. Add to the water and stir to dissolve in a closed container.

4.1. v místech produkce označených za zamořená podle čl. 5 odst. 1 písm. a):

Safranin counterstain solution

a) v poli označeném za zamořené podle čl. 5 odst. 1 písm. a):

Stock solution:

i) - během nejméně tří pěstitelských let následujících po roce označení zamoření,

Safranin O 2,5 g

- se přijmou opatření na odstranění planě rostoucích rostlin bramboru a ostatních planě rostoucích hostitelských rostlin organismu, a

95 % ethanol 100 ml.

- se nesázejí žádné bramborové hlízy, rostliny ani pravá semena či jiné planě rostoucí hostitelské rostliny organismu, případně plodiny, pro které existuje zjištěné nebezpečí přežití nebo rozšíření organismu, dokud není po dobu nejméně dvou po sobě následujících pěstitelských let stanoveno, že je pozemek prostý planě rostoucích rostlin bramboru,

Mix and store.

- v prvním sklizňovém období brambor následujícím po období upřesněném v předchozí odrážce se sázejí pouze certifikované sadbové brambory pro pěstování jako konzumní brambory a provede se úřední šetření podle čl. 2 odst. 1,

Dilute: 1:10 to obtain a working solution.

- v sklizňovém období brambor následujícím po období uvedeném v předchozí odrážce a následujícím po příslušném rotačním cyklu se certifikované sadbové brambory použijí buď na sadbu, nebo jako konzumní brambory a provede se úřední šetření podle čl. 2 odst. 1; nebo

Staining procedure

ii) - během čtyř pěstitelských let následujících po roce označení zamoření,

1. Prepare smears, air dry and heat fix.

- se přijmou opatření na odstranění planě rostoucích rostlin bramboru a ostatních planě rostoucích hostitelských rostlin organismu, a

2. Flood slide with crystal violet solution for one minute.

- pozemek se ponechá a udržuje ladem nebo jako stálá pastvina s častým nízkým sečením nebo intenzivní pastvou,

3. Wash briefly with tap water.

- v prvním sklizňovém období brambor následujícím po období uvedeném v předchozí odrážce se certifikované brambory použijí buď na sadbu, nebo pro pěstování jako konzumní brambory a provede se úřední šetření podle čl. 2 odst. 1;

4. Flood with Lugol's iodine for one minute.

b) na ostatních pozemcích:

5. Wash with tap water and blot dry.

- v pěstitelském roce následujícím po označení zamoření:

6. Decolourize with 95 % ethanol, added dropwise, until no further colour is removed or immerse with gentle agitation for 30 seconds.

- se žádné bramborové hlízy, rostliny ani pravá semena nebo jiné planě rostoucí hostitelské rostliny nesázejí a podle potřeby se provedou opatření na odstranění planě rostoucích rostlin bramboru, nebo

7. Wash in tap water and blot dry.

- se certifikované sadbové brambory mohou sázet pouze jako konzumní za podmínky, že jsou příslušné úřední subjekty nabyly jistoty, že nebezpečí spojené s planě rostoucími rostlinami bramboru a ostatními planě rostoucími hostitelskými rostlinami organismu bylo odstraněno,

8. Flood with safranin solution for 10 seconds.

- po dobu nejméně dvou pěstitelských let následujících po roce uvedeném v předchozí odrážce se sázejí pouze certifikované sadbové brambory na sadbu nebo jako konzumní brambory,

9. Wash with tap water and blot dry.

- v každém pěstitelském roce uvedeném v předchozí odrážce se provedou opatření na odstranění planě rostoucích rostlin bramboru a planě rostoucích hostitelských rostlin organismu a provede se úřední šetření podle čl. 2 odst. 1,

Gram positive bacteria stain violet-blue; Gram negative bacteria stain pink-red.

- pokud se certifikované sadbové brambory sázejí jako konzumní brambory v pěstitelském roce následujícím po označení zamoření, rostoucí plodina se v přiměřených lhůtách kontroluje a planě rostoucí rostliny se testují na přítomnost organismu;

Appendix 4 DETERMINATION OF POPULATION OF IF-POSITIVE CELLS

c) neprodleně po označení zamoření podle čl. 5 odst. 1 písm. a) a v každém z následujících pěstitelských roků až do prvního povoleného sklizňového období brambor a včetně tohoto období na pozemku(cích) označeném(ých) za zamořený(é), jak je uvedeno pod písmenem a), se veškeré stroje a skladovací prostory v místě produkce vyčistí a dezinfikují podle potřeby a pomocí příslušných metod podle bodu 3;

Surface area (S) of window of multispot slide

d) v systémech produkce, kde je možné úplně nahradit pěstební substrát,

p (1)

- se nesázejí žádné hlízy, rostliny ani pravá semena, dokud nebyla produkce podrobena úředně sledovaným opatřením na odstranění organismu a nebyly odstraněny všechny brambory nebo jiný lilkovitý materiál včetně přinejmenším celkové výměny pěstebního substrátu a vyčištění a dezinfekce produkční jednotky a veškerého zařízení a dokud následně nebyl příslušnými úředními subjekty udělen souhlas k pěstování brambor, a

Where D = diameter of window.

- se brambory pěstují z certifikovaných sadbových brambor nebo z minihlíz či mikrorostlin získaných z testovaných zdrojů.

Surface area(s) of objective field

4.2. Aniž je dotčen bod 4.1, členské státy uvnitř vymezené oblasti:

p (2)

a) neprodleně po označení zamoření a po dobu nejméně tří pěstitelských období:

where d = diameter of field.

- zajistí vlastními příslušnými úředními subjekty kontrolu zařízení, ve kterých se pěstují nebo skladují bramborové hlízy nebo se s těmito hlízami nakládá, jakož i prostor, které pronajímají mechanizaci používanou k produkci brambor,

Calculate d either by direct measurement or from the following formulae:

- vyžadují vyčištění a dezinfekci zařízení a skladů v těchto prostorách podle potřeby a pomocí příslušných metod podle bodu 3,

p (3)

- vyžadují, aby k výsadbě všech porostů bramboru uvnitř této oblasti byla použita jen certifikovaná sadba,

where i = field coefficient (depends upon ocular type and varies from 8 to 24),

- vyžadují ve všech prostorách uvnitř oblasti oddělené nakládání se sklizenými zásobami sadby od nakládání s konzumními bramborami,

K = tube coefficient (1 or 1,25),

- provádí úřední šetření podle čl. 2 odst. 1;

G = magnification of 100×, 40× etc) objective,

b) vytvoří v případě potřeby program na náhradu všech zásob sadbových brambor po přiměřenou dobu.

from (2) d =

Opatření provedená podle bodu 4.2 se spolu s registračními čísly producentů, společných skladů a středisek odeslání uvnitř vymezené oblasti oznamují každý rok ostatním členským státům a Komisi.

pfrom (3) ppCount the number of typical fluorescent cells per field (c).

--------------------------------------------------

Calculate the number of typical fluorescent cells per window (C).

Calculate the number of typical fluorescent cells per ml pellet (N)

where y = volume of pellet on window,

where F = pellet dilution factor.

Appendix 5 EGGPLANT CULTURE

Sow seeds of eggplant (Solanum melongena cv. Black Beauty) in pasteurized seed compost. Transplant seedlings with fully expanded cotyledons (10 to 14 days) into pasteurized potting compost.

Use eggplants at leaf stage 3 when two, but not more than three, leaves are fully uncurled.

Eggplants should be grown in a glasshouse with the following environmental conditions:

day length: 14 hours or natural day length if greater;

temperature: day: 21 to 24°C,

night: 15°C.

NB: C. sepedonicum will not grow at temperatures >30°C. If night temperatures do not fall to 15°C, chromophore damage (silvery necrosis) may occur.

Root damage caused by sciarid larvae can be overcome by the application of an appropriate insecticide.

Eggplant cv. Black Beauty may be obtained from:

1. AB Hammenhoegs Froe,

270 50 Hammenhoeg,

Sweden;

2. HURST Seeds Ltd,

Avenue Road,

Witham,

Essex CM8 2DX,

England;

3. ASGRO Italia Sp A,

Corso Lodi, 23,

Milan;

4. KUEPPER

Mitteldeutsche Samen GmbH,

Hessenring 22,

D-37269 Eschwege.

Appendix 6 MEDIA FOR GROWTH AND ISOLATION OF C. SEPEDONICUM

Nutrient agar (NA)

Difco bacto nutrient agar in distilled water at manufacturer's rate. Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

Nutrient dextrose agar (NDA)

Difco bacto nutrient agar containing 1 % D(+) glucose (monohydrate). Sterilize by autoclaving at 115 °C for 20 minutes.

Yeast peptone glucose agar (YPGA)

Difco bacto yeast extract (No 0127) 5 g

Difco bacto peptone (No 0118) 5 g

D(+)-glucose (monohydrate) 10 g

Difco bacto purified agar (No 0560) 15 g

Distilled water 1 litre

Sterilize 0,5 litre volumes of medium by autoclaving at 115 °C for 20 minutes.

Yeast extract mineral salts medium (YGM)

Difco bacto yeast extract 2,0 g

D(+)-glucose (monohydrate) 2,5 g

K2HPO4 0,25 g

KH2PO4 0,25 g

MgSO4 . 7H2O 0,1 g

MnSO4 . H2O 0,015 g

NaCl 0,05 g

FeSO4 . 7H2O 0,005 g

Difco bacto purified agar 18 g

Distilled water 1 litre

Sterilize 0,5 litre volumes of medium by autoclaving at 115 °C for 20 minutes.

Appendix 7 NUTRITIONAL AND PHYSIOLOGICAL TESTS FOR THE IDENTIFICATION OF C. SEPEDONICUM

All media should be incubated at 21 °C and examinated after six days. If no growth has occurred, incubate for up to 20 days.

- Oxidative and fermentative test (Hugh & Leifson), 1953) - O/F-test.

Basal medium:

KCl 0,2 g

MgSO4 . 7H2O 0,2 g

NH4H2PO4 1,0 g

Difco bacto peptone 1,0 g

Difco bacto purified agar 3,0 g

D(+)-glucose (monohydrate) 10,0 g

Bromothymol blue 0,03 g

Distilled water 1 litre

Mix and adjust to pH 7,0 to 7,2 with 1N KOH.

Dispense in Pyrex culture tubes 16 mm × 100 mm (12 ml capacity) in 5 ml and 10 ml volumes.

Sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes.

Stab inoculate 5 ml and 10 ml tubes for each culture. Aseptically add 1 to 2 ml sterile liquid paraffin to the 10 ml tube. Incubate.

/* Tables: see OJ */

(Kovacs, 1956)

Kovacs'oxidase reagent:

1 % aqueous solution of tetramethyl paraphenylenediamine dihydrochloride (BDH No 30386) in distilled water.

This reagent should be freshly made up in 1 ml volumes or can be stored in a brown glass bottle at 5 °C for 1 to 4 weeks.

Place a drop of reagent on filter paper in a clean Petri dish. Immediately rub some of the test culture from nutrient agar using a platinum loop.

Positive reaction: development of purple coloration within 10 seconds. Cultures with times of 10 to 30 seconds are weakly positive.

NB: It is essential to use a platinum loop and NA cultures, since traces of iron or high sugar content in the growth medium may give false positive results.

- Acid production from lactose, rhamnose, salicin, glycerol

Prepare Hugh & Leifson's O/F medium without the glucose. Distribute into 5 ml volumes in tubes. Sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes. To the molten base at 45 °C, aseptically add 0,5 ml of filter sterilized 10 % aqueous solutions of either glycerol, lactose, rhamnose or salicin. Mix carefully.

Positive reaction: colour change from blue-green to yellow indicates production of acid.

- Catalase test

Place a drop of hydrogen peroxide (30 volume) onto a clean slide, and emulsify with a loopful of culture using a platinum loop.

Positive reaction: production of oxygen bubbles in the drop indicates the presence of catalase.

- Nitrate reductase activity and denitrification (Bradbury, 1970)

Culture medium:

KNO3 (nitrite free) 1 g

Difco bacto yeast extract 1 g

K2HPO4 5 g

Distilled water 1 litre

Dispense into 10 ml volumes in 20 ml bottles. Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

Reagent A:

H2SO4 8g

5N acetic acid 1 litre

Reagent B:

naphthylamine 5 g

5N acetic acid 1 litre

Inoculate the nitrate medium in duplicate. Test after 10 and 20 days, by adding one drop of Lugol's iodine, 0,5 ml reagent A and 0,5 ml reagent B. If medium does not turn reddish, add approximately 50 mg zinc powder. Observe the colour reaction.

Positive reaction: Colour reaction

Stage 1 Stage 2

No reduction of nitrate colourless red

Reduction of nitrate as far as nitrite

(nitrate reductase only) red -

Reduction of nitrate beyond nitrite

(denitrification - nitrate and nitrite reductase) colourless colourless

- Urease production (Lelliott, 1966)

Basal medium:

Oxoid urea agar base (CM53) 2,4 g

Distilled water 95 ml

Sterilize by autoclaving at 115 °C for 20 minutes. Cool the molten base to 50 °C and aseptically add 5 ml of filter-sterilized 40 % aqueous urea solution (Oxoid SR20). Mix well.

Distribute into 6 ml volumes in sterile tubes (16 × 100 mm) and allow to set as slopes with a good butt.

Positive reaction: the yellow-orange medium develops a cherry red or magenta pink coloration if urease activity has occurred.

Utilization of citrate (Christensen) (Skerman, 1967)

Citrate agar base (Merck 2503) 23 g

Distilled water 1 litre

Mix and dissolve by heating. Dispense into 6 ml volumes as for urea medium. Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes and allow to set as slopes.

Positive reaction: citrate utilization is indicated by a change in the colour of the medium from orange to red.

- Hydrogen sulphide production (Ramamurthi, 1959)

Medium:

Difco bacto tryptone (No 0123) 10 g

K2HPO4 1 g

NaCl 5 g

Distilled water 1 litre.

Dissolve and dispense into 6 ml volumes in 16 × 100 mm tubes. Sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes.

Inoculate and aseptically suspend a lead acetate paper (Merck 9511) from the lip if the tube. Hold in place with the cap. Incubate for up to 20 days.

Positive reaction: H2S production from tryptone is indicated by the development of a black-brown coloration of the test paper.

- Indole production (Ramamurthi, 1959)

Medium:

As for H2S test.

Remove the lead acetate paper and add 1 to 2 ml of diethyl ether and shake gently. Allow the layers to separate (five minutes). Add 0,5 ml Kovacs' reagent (Merck 9293) carefully down the inside of the sloped tube.

Positive reaction: the presence of indole is indicated by the development of a red colour in the yellow layer between the ether and aqueous fractions.

- Growth ar 37 °C (Ramamurthi, 1959)

Medium:

Difco bacto nutrient broth (No 0003) 8 g

Distilled water 1 litre

Mix, dissolve and distribute into 6 ml volumes in tubes.

Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

Inoculate and incubate at 37 °C.

Positive reaction: look for growth.

- Growth in 7 % sodium chloride (Ramamurthi, 1959)

Medium:

Difco bacto nutrient broth 8g

NaCl 70 g

Distilled water 1 litre

Mix, dissolve and distribute into 6 ml volumes in tubes.

Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

Positive reaction: look for growth.

- Gelatin hydrolysis (Lelliott, Billing & Hayward, 1966)

Medium:

Difco bacto gelatine (No 0143) 120 g

Distilled water 1 litre

Mix, dissolve by heating and distribute into 6 ml volumes in tubes.

Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

Positive reaction: liquefaction of gelating even when held at 5 °C for 30 minutes.

- Starch hydrolysis

Medium:

Difco bacto nutrient agar (molten) 1 litre

Difco bacto soluble starch (No 0178) 2 g

Mix, sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes.

Pour plates. Spot inoculate the plates.

After good growth has occurred (10 to 20 days), remove part of the growth and flood with Lugol's iodine.

Positive reaction: starch hydrolysis is indicated by clear zones under or around the bacterial growth; the remainder of the medium stains purple.

- Aesculin hydrolase activity (Sneath & Collins, 1974)

Medium:

Difco bacto peptone 10 g

Aesculin 1 g

Ferric citrate (Merck 3862) 0,05 g

Sodium citrate 1 g

Distilled water 1 litre

Mix to dissolve and distribute into 6 ml volumes in tubes. Sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes.

The medium is clear but has a bluish fluorescence.

Positive reaction: aesculin hydrolysis is indicated by the development of a brown colour together with a disappearance of fluorescence. This can be checked using an ultraviolet lamp.

REFERENCES

Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218.

Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147-152.

Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21-23.

Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-26.

Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., No 17, 1987, pp. 1-10.

Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.

Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-118.

Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.

Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101-106.

Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.

Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527.

(1) An alternative method for extraction is given by Dinesen, 1984.

(2) There is evidence (Janse and Van Vaerenberg, 1987) that freezing may reduce viability of Corynebacterium sepedonicum. Suspension of the pellet in 10 % glycerol may overcome this problem.

ANNEX II

1. For each suspected occurrence for which a positive immunofluorescence test has been identified according to the method set out in Annex I, and confirmation or refutation by completion of the said method is awaited, there should be the retention and appropriate conservation of:

- all tubers or plants sampled, wherever possible, and

- any remaining extract and additional prepared immunofluorescence slides,

until the completion of the said method.

2. In the case of positive confirmation of the organism, there should be retention and appropriate conservation of:

- the material specified in paragraph 1, and

- a sample of the infected eggplant material inoculated with the tuber or plant extract, and

- the isolated culture of the organism,

until at least one month after the notification procedure under Article 5 (2).

ANNEX III

1. The elements to be considered in the determination of the extent of probable contamination under Article 5 (1) (b), shall include:

- tubers or plants grown at a place of production designated as contaminated under Article 5 (1) (a),

- place(s) of production or premises with some production link to the tubers or plants, designated as contaminated under Article 5 (1) (a), including those sharing production equipment and facilities directly or through a common contractor,

- tubers or plants produced in the place(s) of production referred to in the previous indent, or present in such place(s) of production during the period when the tubers or plants designated as contaminated under Article 5 (1) (a) were present on the premises or places of production referred to in the first indent,

- central stores handling potatoes from the above places of production,

- any machinery, vehicle, vessel, store, or units thereof, and any other objects including packaging material, that may have come into contact with the tubers or plants designated as contaminated under Article 5 (1) (a), during the previous 12 months or wherever appropriate,

- any tubers or plants stored in, or in contact with, any of the structures or objects listed in the previous indent, prior to the cleansing and disinfection of such structures and objects, and

- shall include, as a result of the testing under Article 6, tubers or plants with the same clonal origin as tubers or plants designated to be contaminated under Article 5 (1) (a) and for which investigations indicate contamination is probable.

2. The elements to be considered in the determination of the possible spread under Article 5 (1) (c) shall include:

- the proximity of other places of production growing potatoes or other host plants,

- the commonality of seed potato stocks.

3. The details of the notification referred to in the first subparagraph of Article 5 (2) shall include:

- for any potato consignment or lot designated as contaminated, the certificates prescribed in Articles 7 or 8 of Directive 77/93/EEC, the passport or registration number, as appropriate,

- the variety name for seed potato stocks, and where possible in all other cases,

- a description of the elements of the designated contamination and zone demarcation,

- the availability of extract, prepared immunofluorescent slides, infected eggplant material and an isolated culture of the organism from the test in which positive confirmation of the organism has been made.

ANNEX IV

1. The officially supervised measures referred to in Article 7 (1) for the disposal of tubers or plants designated to be contaminated under Article 5 (1) (a) shall be:

- use for industrial processing through direct and immediate delivery to a processing plant with appropriate waste disposal facilities for which it has been established that there is no identifiable risk of the organism spreading, and with a system of disinfection of storage areas and departing vehicles, or

- other measures, provided that it has been established that there is no identifiable risk of the organism spreading; such measures to be notified to the Commission and to the other Member States.

2. The appropriate use or disposal of tubers or plants determined as probably contaminated under Article 5 (1) (b) and referred to in Article 7 (2), under the control of the responsible official bodies of the Member States, shall be:

- use as ware potatoes intended for consumption, packed ready for direct delivery and use without repacking, and intended for such direct delivery and use, or

- use as ware potatoes intended for industrial processing, and intended for direct and immediate delivery to a processing plant with appropriate waste disposal and disinfection facilities, or

- some other use or disposal, provided that it is established that there is no identifiable risk of the organism spreading.

3. The appropriate methods for cleansing and disinfecting of the objects referred to in Article 7 (3) shall be those for which it has been established that there is no identifiable risk of the organism spreading and shall be employed under the supervision of the responsible official bodies of the Member States.

4. The series of measures to be implemented by Member States within the demarcated zone established under Article 5 (1) (c) and referred to in Article 7 (4) shall include:

4.1. in places of production designated as contaminated under Article 5 (1) (a):

(a) in a field designated to be contaminated under Article 5 (1) (a), either

(i)- during at least the three growing years following the year of the designated contamination,

- measures shall be taken to eliminate volunteer potato plants and other naturally found host plants of the organism, and

- no potato tubers, plants or true seeds, or other naturally found host plants of the organism, or crops for which there is an identified risk of the organism surviving or spreading, shall be planted until the field is found free from volunteer potato plants for at least two consecutive growing years,

- in the first potato cropping season following the period specified in the preceding indent, officially certified seed potatoes shall be planted for ware production only and an official survey, as detailed in Article 2 (1), shall be conducted;

- in the potato cropping season succeeding that referred to in the previous indent and following an appropriate rotation cycle, officially certified seed potatoes shall be planted for either seed or ware production and an official survey as detailed in

Article 2

(1), shall be conducted; or

(ii) - during the four growing years following that of the designated contamination,

- measures shall be taken to eliminate volunteer potato plants and other naturally found host plants of the organism, and

- the field shall be laid to, and maintained either, in bare fallow or in permanent pasture with frequent close cutting or intensive grazing,

- in the first potato cropping season following the period specified in the preceding indent, officially certified seed potatoes shall be planted for either seed or ware production and an official survey, as detailed in Article 2 (1), shall be conducted;

(b) in other fields:

- in the growing year following the designated contamination:

- either no potato tubers, plants or true seeds or other naturally found host plants of the organism shall be planted, and measures shall be taken to eliminate volunteer potato plants, as appropriate, or

- officially certified seed potatoes may be planted for ware production only, on the condition that the responsible official bodies are satisfied that the risk of volunteer potato plants and other naturally found host plants of the organism have been eliminated,

- for, at least the two growing years following that specified in the preceding indent, only officially certified seed potatoes shall be planted, for either seed or ware production,

- in each of the growing years referred to in the previous indents measures shall be taken to eliminate volunteer potato plants and naturally found host plants of the organism, and an official survey as detailed in Article 2 (1), shall be conducted,

- where officially certified seed potatoes are planted for ware production in the growing year following the designated contamination, the growing crop shall be inspected at appropriate times and volunteer potato plants shall be tested for the organism;

(c) immediately following the designation of contamination under Article 5 (1) (a) and in each of the subsequent growing years up to and including the first permissible potato cropping season on the field(s) designated as contaminated, as detailed in paragraph (a), all machinery and storage facilities on the place of production and involved in potato production shall be cleansed and disinfected as appropriate and using appropriate methods, as specified in 3;

(d) in those production systems where complete replacement of the growing medium is possible,

- no tubers, plants or true seeds shall be planted unless the production unit has been subjected to officially supervised measures to eliminate the organism and remove any potato or other solanaceous material, including, at least, a complete change in growing medium and cleansing and disinfection of the production unit, and all equipment, and, subsequently has been granted approval for potato production by the responsible official bodies, and

- potato production shall be from officially certified seed potatoes, or from mini-tubers or micro-plants derived from tested sources;

4.2. within the demarcated zone, without prejudice to the measures detailed under 4.1, the Member States shall:

(a) immediately, and for at least three growing seasons, after the designated contamination:

- ensure supervision by their responsible official bodies of premises growing, storing or handling potato tubers, together with premises which operate potato machinery under contract,

- require cleansing and disinfection of machinery and stores on such premises, as appropriate, and using appropriate methods, as specified under 3,

- require the planting of certified seed only for all potato crops within that zone,

- require the separate handling of harvested seed stocks to those of ware on all premises within the zone,

- conduct an official survey as detailed in Article 2 (1);

(b) establish a programme, where appropriate, for the replacement of all seed potato stocks over an appropriate period of time.

The measures implemented under 4.2, along with the registration numbers of producers, collective warehouses and dispatching centres within the demarcated zone, shall be notified annually to the other Member States and to the Commission.