COUNCIL DIRECTIVE 93/85/EEC of 4 October 1993 on the control of potato ring rot

19931004

THE COUNCIL OF THE EUROPEAN COMMUNITIES,

Директива 93/85/ЕИО на Съвета

Having regard to the Treaty establishing the European Economic Community, and in particular Article 43 thereof,

от 4 октомври 1993 година

Having regard to the proposal from the Commission(1) ,

относно борбата с пръстеновидното гниене по картофите

Having regard to the opinion of the European Parliament(2) ,

СЪВЕТЪТ НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,

Having regard to the opinion of the Economic and Social Committee(3) ,

като взе предвид Договора за създаване на Европейската икономическа общност и по-специално член 43 от него,

Whereas potato production occupies an important place in Community agriculture; whereas the potato yield is constantly threatened by harmful organisms;

като взе предвид предложението на Комисията [1],

Whereas, through the protection of potato cultivation against such harmful organisms, not only should productive capacity be maintained but agricultural productivity should also be increased;

като взе предвид становището на Европейския парламент [2],

Whereas protective measures to prevent the introduction of harmful organisms into the territory of a Member State would have only a limited effect were such organisms not controlled simultaneously and methodically throughout the Community and not prevented from spreading;

като взе предвид становището на Икономическия и социален комитет [3];

Whereas one of the harmful organisms on potatoes is Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., the pathogenic agent of the potato ring rot disease; whereas this disease has occurred in some parts of the Community and some limited sources of infection still exist;

като има предвид, че производството на картофи заема важно място в селското стопанство на Общността; като има предвид, че добивът на картофи е постоянно застрашен от вредни организми;

Whereas there is a considerable risk to potato cultivation throughout the Community if effective measures are not taken to locate this disease and determine its distribution, to prevent it from occurring and spreading, and, if found, to prevent its spread and to control it with the aim of eradication;

като има предвид, че чрез защитата на отглеждането на картофи от такива вредни организми не само ще се поддържа добивът, но също ще се увеличи производителността на селското стопанство;

Whereas, in order to ensure this, certain measures must be taken within the Community; whereas Member States must, in addition, be able to take additional or stricter measures where necessary, provided that there is no hindrance to the movement of potatoes within the Community, except in so far as laid down in Council Directive 77/93/EEC of 21 December 1976 on protective measures against the introduction into the Member States of organisms harmful to plants or plant products(4) ; whereas such measures must be notified to the other Member States and to the Commission;

като има предвид, че защитните мерки за предотвратяване внасянето на вредни организми на територията на държавите-членки биха имали само ограничен ефект, ако срещу тях не се води едновременна и методична борба в цялата Общност и не се предотвратява разпространението им;

Whereas Council Directive 80/665/EEC of 24 June 1980 on the control of potato ring rot(5) , laid down minimum measures to be taken by the Member States against potato ring rot;

като има предвид, че един от вредните организми по картофите е Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., патогенният агент на пръстеновидното гниене; като има предвид, че болестта се е появила в някои части на Общността и че все още съществуват ограничени източници на заразяване;

Whereas, since then, there have been significant developments in the understanding of potato ring rot disease and the detection of the potato ring rot pathogen;

като има предвид, че съществува значителен риск от отглеждането на картофи в цялата Общност, ако не се предприемат ефективни мерки за локализиране на болестта и определяне разпространението ѝ, с цел да се предотврати появата и пренасянето ѝ, а в случай, че бъде открита, да се предотврати разпространението ѝ и да се води борба за изкореняването ѝ;

Whereas the application of the Community plant health regime to the Community as an area without internal frontiers has called for the re-examination and revision of some provisions of Directive 80/665/EEC;

като има предвид, че за да се постигне това, следва да се вземат определени мерки в Общността; като има предвид, че, освен това, държавите-членки трябва да могат да вземат допълнителни или по-строги мерки при необходимост, при условие че няма пречки за движението на картофите в на Общността, с изключение на посоченото в Директива 77/93/ЕИО на Съвета от 21 декември 1976 г. за защитните мерки срещу внасяне в Общността на организми, вредни за растенията или продуктите от растителен произход [4]; като има предвид, че тези мерки следва да се съобщават на останалите държави-членки и Комисията;

Whereas, as a result of such re-examination, the provisions of Directive 80/665/EEC have been found insufficient, and further specification of measures is necessary;

като има предвид, че Директива 80/665/ЕИО на Съвета от 24 юни 1980 г. за борба срещу пръстеновидното гниене по картофите [5] предвижда приемането от държавите-членки на минимални мерки срещу пръстеновидното гниене;

Whereas, in that situation, Directive 80/665/EEC should be repealed and the necessary measures adopted;

като има предвид, че оттогава значително са се развили познанията за болестта пръстеновидно гниене и за откриване на патогена на тази болест;

Whereas the measures have to take into account, first, that the disease can remain latend and unobserved both in the growing crop and in stored tubers, and so can be effectively prevented only by production and use of seed potatoes free from infection and, secondly, that systematic official surveys are necessary to locate it; whereas spread of the pathogen within the growing crop is not the most important factor, but whereas the pathogen can exist through the winter in self-sown (volunteer) potato plants and these are the major source of infection being carried from one season to the next; whereas the pathogen is spread mainly by the contamination of potatoes through contact with infected potatoes and through contact with planting, harvesting and handling equipment or transport and storage containers which have become contaminated with the organism by previous contact with infected potatoes; whereas such contaminated objects can remain infectious for some time after such contamination; whereas spread of the pathogen can be reduced or prevented by disinfection of such objects; whereas any such contamination of seed potatoes poses a major risk for the spread of the pathogen;

като има предвид, че прилагането на режима на Общността за здравето на растенията спрямо Общността като пространство без вътрешни граници налага преразглеждането и ревизията на някои разпоредби на Директива 80/665/ЕИО на Съвета;

Whereas, for the determination of the details of such general measures, as well as for those stricter or additional measures taken by Member States to prevent the introduction of the pathogen into their territory, it is desirable for Member States to cooperate closely with the Commission within the Standing Committee of Plant Health (hereinafter referred to as 'the Committee'),

като има предвид, че в резултат на такова преразглеждане разпоредбите на Директива 80/665/ЕИО на Съвета се считат за недостатъчни и че е необходимо по-подробно уточняване на мерките;

HAS ADOPTED THIS DIRECTIVE:

като има предвид, че при това положение Директива 80/665/ЕИО на Съвета следва да бъде отменена и да се предприемат необходимите мерки;

като има предвид, че тези мерки следва да вземат под внимание, на първо място, че болестта може да остане скрита и незабелязана както в клубените по време на вегетация, така и в съхраняваните на склад клубени, и че тя може да бъде ефективно предотвратена само чрез производство и използване на незаразени картофи за семе и, на второ място, че са необходими системни официални проучвания за локализирането ѝ; като има предвид, че разпространението на патогена в клубени по време на вегетация не е най-важният фактор, но като има предвид, че патогенът може да просъществува през зимата в картофени самосевки (саморасляци) и че те са основният източник на зараза, която се разпространява от един сезон в следващия; като има предвид, че патогенът се разпространява главно чрез заразяване на картофи посредством контакт със заразени картофи и чрез контакт с техника за засаждане, манипулация и прибиране на реколтата и с контейнери, използвани за транспортиране и съхраняване, които са били заразени с вредителя при предишен контакт със заразени картофи; като има предвид, че такива заразени предмети могат да бъдат причинители на зараза известно време след настъпване на такова заразяване; като има предвид, че разпространението на патогена може да се предотврати или спре чрез дезинфекция на такива предмети; като има предвид, че заразяването на картофи за семе представлява основен риск от разпространяване на патогена;

Article 1

като има предвид, че за определянето на подробностите на такива общи мерки, както и на по-строги или допълнителни мерки, взети от държавите-членки за предотвратяване внасянето на патогена на тяхна територия, е желателно държавите-членки да бъдат в тясно сътрудничество с Комисията в рамките на Постоянния фитосанитарен комитет (наричан по-нататък "Комитета"),

The Directive concerns the measures to be taken within the Member States against Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., the cause of potato ring rot (hereinafter referred to as 'the organism'), in order to:

ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:

(a) locate it and determine its distribution;

Член 1

(b) prevent its occurrence and spread; and

Настоящата директива се отнася до мерките, които държавите-членки следва да вземат срещу Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., причинител на пръстеновидното гниене по картофите (по-долу наричан "вредител"), с цел:

(c) if found, to prevent its spread and to control it with the aim of eradication.

а) да локализират и определят разпространението на болестта;

б) да предотвратят появата и разпространението ѝ; и

Article 2

в) да предотвратят разпространението ѝ и да водят борба с нея с цел изкореняването ѝ, в случай че бъде открита.

1. Member States shall conduct systematic official surveys for the organism on tubers and, where appropriate, on plants of potato (Solanum tuberosum L.) originating in their territory, for the confirmation of absence of the organism.

Член 2

For these surveys, in the case of tubers samples of both seed and other potatoes shall be taken, preferably from lots in store and subjected to official or officially supervised laboratory testing using the method set out in Annex I for the detection and diagnosis of the organism. In addition, where appropriate, official or officially supervised visual inspection by cutting of tubers on other samples may be done.

1. Държавите-членки провеждат системни официални проучвания за наличие на вредителя по картофените клубени и, при необходимост, по картофените растения (Solanum tuberosum L.), произхождащи от тяхната територия, за да потвърдят отсъствието на вредителя.

In the case of plants, these surveys shall be carried out according to appropriate methods and the samples shall be subjected to appropriate official or officially supervised testing.

За целите на такива проучвания, в случая на клубени, се вземат проби както от картофите за семе, така и от други картофи, за предпочитане от партиди на склад, и се подлагат на официално лабораторно изпитване или официално контролирано лабораторно изпитване, като се прилага методът, посочен в приложение I, за откриване и диагностициране на вредителя. Освен това, при необходимост, може да се извършва официална визуална проверка или официално контролирана проверка на други проби чрез нарязване на клубени.

The number, origin, stratification and timing of collection of samples shall be decided by the responsible official bodies within the meaning of Directive 77/93/EEC based on sound scientific and statistical principles and the biology of the organism, and taking into account the particular potato production systems of the Member States concerned. The details thereof shall be submitted annually to the other Member States and the Commission, with a view to ensuring comparable levels of assurance between Member States for confirmation of the absence of the organism.

В случая на растения проучванията се извършват чрез подходящи методи, а пробите се подлагат на официално изпитване или официално контролирано изпитване.

2. The results of the official surveys provided for in paragraph 1 shall be notified at least once a year to the other Member States and to the Commission. The details of this notification shall be confidential. They may be submitted to the Committee in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC.

Броят, произходът, стратификацията и графикът на събиране на пробите се решават от компетентните официални органи по смисъла на Директива 77/93/ЕИО, въз основа на обосновани научни и статистически принципи и на биологията на вредителя, като се вземат под внимание конкретните системи за производство на картофи в съответните държави-членки. Подробностите от тези изследвания се представят ежегодно на останалите държави-членки и на Комисията, за да се осигури сравнима степен на гаранция между държавите-членки за потвърждаване отсъствието на вредителя.

3. The following provisions may be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC;

2. Резултатите от официалните изследвания, предвидени в параграф 1, се съобщават на останалите държави-членки и на Комисията най-малко веднъж годишно. Подробностите по това уведомяване са поверителни. Те могат да се представят на Комитета в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО.

- the details of surveys provided for in paragraph 1 above, to be carried out in accordance with sound scientific and statistical principles,

3. В съответствие с процедурата, посочена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО, могат да се приемат следните разпоредби:

- the details of the notification provided for in paragraph 2 above.

- подробностите на изследванията, предвидени в параграф 1 по-горе, които да бъдат проведени в съответствие с обосновани научни и статистически принципи,

4. The following provisions shall be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC:

- подробностите по уведомяването, предвидени в параграф 2 по-горе.

- the appropriate method for the surveys and the testing provided for in the third subparagraph of paragraph 1 above.

4. В съответствие с процедурата, посочена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО, се приемат следните разпоредби:

- за подходящия метод за извършване на проучванията и изпитвания, предвидени в третата алинея от параграф 1 по-горе.

Article 3

Член 3

Member States shall ensure that the suspected occurrence or confirmed presence of the organism, in potato plants and tubers or harvested, stored or marketed tubers in their territory shall be reported to their own responsible official bodies.

Държавите-членки гарантират, че при всяко съмнение за поява или потвърдено наличие на вредителя в картофените растения в процес на вегетация или в прибраните, съхраняваните на склад или продавани на тяхна територия клубени се докладва на техните компетентни официални органи.

Член 4

Article 4

1. В случаи на съмнение за поява компетентните официални органи на държавите-членки, в които са докладвани такива случаи, осигуряват извършването на официални или официално наблюдавани лабораторни изпитвания, като прилагат метода, описан в приложение I, и в съответствие с условията, посочени в точка 1 от приложение II, с оглед потвърждаване или опровергаване на съмненията за поява на болестта. В горните случаи се прилагат изискванията, определени в точка 2 от приложение II.

1. In cases of suspected occurrence, the responsible official bodies of the Member State in which these cases have been reported shall ensure completion of official or officially supervised laboratory testing, using the method set out in Annex I, and in accordance with the conditions specified in point 1 of Annex II, in order to confirm or refute the suspected occurrence. In the former case, the requirements laid down in point 2 of Annex II shall apply.

2. До потвърждаване или опровергаване на съмненията за поява по параграф 1, в случаите на съмнения за поява, когато:

2. Pending the confirmation or refutation of the suspected occurrence under paragraph 1, in those cases of suspect occurrence where, either:

i) са установени визуални диагностични симптоми, които пораждат съмнение за наличието на болестта; или

(i) suspect diagnostic visual symptoms of the disease have been seen; or,

ii) е установена положителна реакция при имунофлуоресцентно изпитване, както е посочено в приложение I, или при друго подходящо изпитване,

(ii) a positive immunofluorescence test as specified in Annex I or other appropriate positive test has been identified,

компетентните органи на държавите-членки:

the responsible official bodies of the Member States shall:

а) забранят движението на всички партиди или пратки, от които са взети проби, с изключение под техен контрол и при условие че е установено, че няма определен риск от разпространение на вредителя;

(a) prohibit the movement of all lots or consignments from which the samples have been taken, except under their control and provided that it has been established that there is no identifiable risk of the organism spreading;

б) предприемат стъпки за откриване на източника на поява, за която има съмнение;

(b) take steps to trace the origin of the suspected occurrence;

в) да въведат подходящи допълнителни предпазни мерки, основаващи се на нивото на оценения риска, с оглед да се предотврати разпространението на вредителя. Тези мерки могат да включват официален контрол на движението на всички други клубени или растения в или извън помещенията, свързани с появата на болестта, за която има съмнения.

(c) introduce appropriate additional precautionary measures based on the level of estimated risk, in order to prevent any spread of the organism. These measures may include the official control of the movement of all other tubers or plants within or off premises associated with the suspected occurrence.

3. В съответствие с процедурата, предвидена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО, могат да се приемат следните мерки:

3. The following provision may be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC:

- мерките, посочени в параграф 2, буква в) по-горе.

- the measures referred to in paragraph 2 (c) above.

4. В съответствие с процедурата, предвидена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО, се приемат следните мерки:

4. The following provision shall be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC:

- други подходящи изпитвания, предвидени в параграф 2, ii) по-горе;

- the other appropriate test provided for in paragraph 2 (ii) above;

Член 5

1. Ако при официално изпитване или официално контролирано лабораторно изпитване, при което се използва методът, описан в приложение I, се потвърди наличието на вредителя в проба от клубени, растения или части от растения, компетентните официални органи на държавата-членка, като взема под внимание обосновани научни принципи, биологията на вредителя и конкретните системи за производството, пускане на пазара и преработка в съответната държава-членка:

Article 5

а) определят като заразени клубените или растенията, пратката и/или партидата, машините, транспортните средства, съдовете, складовете или техните части, и всякакви други предмети, включително опаковъчен материал, от които е била взета пробата и, при необходимост, мястото/местата на производство и полето/полята, от които са прибрани клубените или растенията;

1. If official or officially supervised laboratory testing using the method set out in Annex I confirms the presence of the organism in a sample of tubers, plants, or parts of plants, the responsible official bodies of a Member State, having regard to sound scientific principles, the biology of the organism and the particular production, marketing and processing systems in that Member State shall:

б) като вземат под внимание разпоредбите на точка 1 от приложение III, определят степента на вероятното заразяване чрез контакт преди или след прибиране на реколтата, или чрез производствената връзка с посоченото заразяване;

(a) designate as contaminated the tubers or plants, consignment and/or lot, and the machinery, vehicle, vessel, store, or units thereof, and any other objects including packaging material, from which the sample was taken, and, where appropriate, the place(s) of production and field(s) from which the tubers or plants were harvested;

в) определят границите на зона въз основа на посоченото в буква а) заразяване, степента на вероятното заразяване по буква б) и вероятното разпространяване на вредителя, като вземат под внимание разпоредбите на точка 2 от приложение III.

(b) determine, taking into account the provisions of point 1 of Annex III, the extent of probable contamination through pre- or post-harvest contact or through production link with the designated contamination;

2. Държавите-членки незабавно уведомяват останалите държави-членки и Комисията в съответствие с разпоредбите на точка 3 от приложение III за всяко заразяване, определено по параграф 1, буква а), и за подробности по определяне на зоната по параграф 1, буква в).

(c) demarcate a zone on the basis of the designation of contamination under (a), the determination of the extent of probable contamination under (b), and the possible spread of the organism, taking into account the provisions of point 2 of Annex III.

Подробностите по това уведомяване са поверителни. Те се представят на Комитета в съответствие с процедурата, предвидена в член 16а от Директива 77/93ЕИО.

2. Member States shall immediately notify the other Member States and the Commission, in accordance with the provisions of point 3 of Annex III, of any contamination designated under paragraph 1 (a) and the details of the zone demarcation under paragraph 1 (c).

3. В резултат на уведомяването по параграф 2 и елементите посочени в него, останалите държави-членки, изброени в уведомлението, посочват, при необходимост, наличието на заразяване, определят степента на вероятното заразяване и зоната, в съответствие с параграф 1, букви а), б) и в).

The details of this notification shall be confidential. They may be submitted to the Committee in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC.

Член 6

3. As a result of the notification under paragraph 2 and the elements mentioned therein, other Member States detailed in the notification shall, as appropriate, designate contamination, determine the extent of probable contamination and demarcate a zone, in accordance with paragraph 1 (a), (b) and (c) respectively.

В случай че клубените или растенията са били обявени за заразени съгласно член 5, параграф 1, буква а), държавите-членки предписват да се проведе изпитване, в съответствие с член 4, параграф 1, на наличностите от картофи, свързани клоново с картофите, обявени за заразени. Изследват се толкова клубени или растения, колкото е необходимо, за определяне на вероятния първичен източник на заразяване и степента на вероятно замърсяване, за предпочитане по степен на риска.

В резултат на изпитванията при необходимост се извършва допълнително определяне на заразяването, на степента на вероятното замърсяване и на зоната, съгласно член 5, параграф 1, букви а), б) и в).

Article 6

Член 7

Member States shall prescribe that where tubers or plants have been designated to be contaminated under Article 5 (1) (a), testing in accordance with Article 4 (1) shall be carried out on potato stocks which are clonally related to those involved in the contamination. The testing shall be carried out on as many such tubers or plants as are needed to determine the probable primary source of infection and the extent of the probable contamination, preferably in order of degree of risk.

1. Държавите-членки предписват, че клубени или растения, обявени за заразени по член 5, параграф 1, буква а), не могат да бъдат засаждани, и че под контрола на компетентните официални органи те следва да бъдат:

As a result of the testing, further designation of contamination, determination of the extent of probable contamination and demarcation of a zone shall be conducted, as appropriate, under Articles 5 (1) (a), (b) and (c) respectively.

- унищожени или

- по някакъв друг начин премахнати, при спазване на официално контролираните мерки, в съответствие с разпоредбите на точка 1 от приложение IV, при условие че е установено, че няма определен риск от разпространяване на вредителя.

Article 7

2. Държавите-членки предписват, че клубени или растения, обявени за вероятно заразени по член 5, параграф 1, буква в), не могат да бъдат засаждани и че без да се засягат резултатите от посоченото в член 6 изпитване за клоново свързани запаси, следва да бъдат пуснати за подходяща употреба или премахване под контрола на съответните компетентни официални органи, както се посочва в точка 2 от приложение IV, по такъв начин, че да се гарантира отсъствието на определен риск от т разпространяване на вредителя.

1. Member States shall prescribe that tubers or plants, designated to be contaminated under Article 5 (1) (a) may not be planted and that, under the control of their responsible official bodies, they shall be:

3. Държавите-членки предписват всяко оборудване, транспортно средство, съд, склад или техни части и всякакви други предмети, включително опаковъчният материал, обявени за заразени по член 5, параграф 1, буква а) или обявени за вероятно заразени по член 5, параграф 1, буква б), да бъдат унищожени или почистени и дезинфектирани чрез прилагане на подходящи методи, както се посочва в точка 3 от Приложение IV. След дезинфектирането всички тези обекти не се считат повече за заразени.

- destroyed, or

4. Без да се засягат мерките, приложени по параграф 1, 2 и 3, държавите-членки предписват, че в определената по член 5, параграф 1, буква в) зона се прилагат серия от мерки, както се посочва в точка 4 от приложение IV.

- otherwise disposed of, subject to officially supervised measure(s), in accordance with the provisions of point 1 of Annex IV, provided that it is established that there is no identifiable risk of the organism spreading.

Член 8

2. Member States shall prescribe that tubers or plants determined as probably contaminated under Article 5 (1) (b) may not be planted and, without prejudice to the outcome of the testing referred to in Article 6 for clonally related stocks shall, under the control of their responsible official bodies, be put to appropriate use or disposal as specified in point 2 of Annex IV, in such a way that it is established that there is no identifiable risk of the organism spreading.

1. Държавите-членки постановяват, че картофите за семе трябва да отговарят на изискванията на Директива 77/93ЕИО и да произхождат по права линия от материал, получен по официално одобрена програма, за който е установено, че няма вредител чрез официално изпитване или официално контролирано изпитване, като се използват методите, описани в приложение I.

3. Member States shall prescribe that any machinery, vehicle, vessel, store, or units thereof, and any other objects including packaging material, designated as contaminated under Article 5 (1) (a) or determined as probably contaminated under Article 5 (1) (b), shall either be destroyed or cleansed and disinfected using appropriate methods as specified in point 3 of Annex IV. After disinfection, any such objects shall no longer be considered contaminated.

Горепосоченото изпитване се извършва:

4. Without prejudice to the measures implemented under paragraphs 1, 2 and 3, Member States shall prescribe that, in the zone demarcated under Article 5 (1) (c), a series of measures, as specified in point 4 of Annex IV, shall be implemented.

- в случаи, когато заразяването засяга производството на картофи за семе, на растения от началната клонова селекция

- в други случаи, на растения от началната клонова селекция или на представителни проби от базови картофи за семе, или от предишно размножаване.

Article 8

2. Могат да бъдат приети следните разпоредби в съответствие с процедурата, предвидена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

1. Member States shall prescribe that seed potatoes shall meet the requirements of Directive 77/93/EEC and shall derive in direct line from material obtained under an officially approved programme which has been found free of the organism in official or officially supervised testing using the method set out in Annex I.

- подробни правила за прилагане на първото тире на втората алинея на параграф 1 на настоящия член,

The aforesaid testing shall be carried out:

- правилата, отнасящи се до представителните проби, предвидени във второто тире на втората алинея на параграф 1 на настоящия член.

- in cases where the contamination affects seed potato production, on the plants of the initial clonal selection,

Член 9

- in other cases, either on the plants of the initial clonal selection or on representative samples of the basic seed potatoes or earlier propagations.

Държавите-членки забраняват притежаването на вредителя и манипулации с него.

2. The following provisions may be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC:

Член 10

- the detailed rules of application of the first indent of the second subparagraph of paragraph 1 of this Article,

Без да се засягат разпоредбите на Директива 77/93/ЕИО, държавите-членки могат да разрешат изключения от мерките, посочени в членове 6, 7 и 9 от настоящата директива, за експериментални или научни цели и за работа по сортова селекция, при условие че тези изключения не вредят на мерките за борба с вредителя и не създават риск от разпространяването му.

- the rules concerning the representative samples provided for in the second indent of the second subparagraph of paragraph 1 of this Article.

Член 11

Държавите-членки могат да приемат допълнителни или по-строги мерки, каквито може да са необходими за борба с вредителя или за предотвратяване на разпространяването му, доколкото те са в съответствие с разпоредбите на Директива 77/93/ЕИО.

Article 9

Допълнителните мерки, посочени в първата алинея, трябва да включват предписанието, че могат да се засаждат само картофи за семе, които са официално сертифицирани или официално проверени, с цел да отговарят на необходимите фитосанитарни норми. Последното може да се прилага по-специално в случаи, когато на земеделските производители се разрешава да използват в собственото си стопанство картофи за семе, получени от собствената им реколта и в други случаи на засаждане на картофи за семе, произведени от земеделския стопанин.

Member States shall ban the holding and handling of the organism.

Подробностите по тези мерки се съобщават на останалите държави-членки и на Комисията.

Член 12

Article 10

Измененията на приложенията към настоящата директива, които следва да се внесат в светлината на развитието на научнотехническите знания, се приемат в съответствие с процедурата, предвидена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО.

Without prejudice to the provisions of Directive 77/93/EEC, Member States may authorize derogations from the measures referred to in Articles 6, 7 and 9 of this Directive for experimental or scientific purposes, and for work on varietal selection, provided that such derogations do not prejudice the control of the organism and create no risk of spread of the organism.

Член 13

1. Държавите-членки приемат и публикуват преди 15 ноември 1993 г. разпоредбите, необходими за да се съобразят с настоящата директива. Те незабавно информират Комисията за това.

Article 11

Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позоваване се определят от държавите-членки.

Member States may adopt such additional or stricter measures as may be required to combat the organism or to prevent it from spreading, in so far as they are in compliance with the provisons of Directive 77/93/EEC.

Държавите-членки прилагат тези разпоредби от 16 ноември 1993 г.

The additional measures mentioned in the first subparagraph may include the prescription that only seed potatoes may be planted that are either officially certified or officially inspected to meet the required plant health standards. The latter may apply in particular in case farmers are authorized to use, on their own holding, seed potatoes which they have obtained from their own harvest and in other cases that own-produced seed potatoes are planted.

2. Държавите-членки съобщават незабавно на Комисията всички разпоредби от националното законодателство, които те приемат в областта, уредена с настоящата директива. Комисията информира останалите държави-членки за тези разпоредби.

The details of these measures shall be notified to the other Member States and to the Commission.

Член 14

Директива 80/665/ЕИО се отменя считано от 16 ноември 1993 г.

Article 12

Член 15

Amendments to the Annexes to this Directive, to be made in the light of developments in scientific or technical knowledge, shall be adopted in accordance with the procedure laid down in Article 16a of Directive 77/93/EEC.

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.

Article 13

Съставено в Люксембург на 4 октомври 1993 година.

1. By 15 November 1993 Member States shall adopt and publish the provisions necessary to comply with this Directive. They shall immediately inform the Commission thereof.

За Съвета

When Member States adopt these provisions, they shall contain a reference to this Directive or shall be accompanied by such reference at the time of their official publication. The procedure for making such reference shall be adopted by Member States.

Председател

Member States shall apply these provisions from 16 November 1993.

W. Claes

2. Member States shall immediately communicate to the Commission all provisions of national law which they adopt in the field covered by this Directive. The Commission shall inform the other Member States thereof.

[1] ОВ С 93, 2.4.1993 г., стр. 12.

[2] ОВ С 176, 28.6.1993 г., стр. 210.

Article 14

[3] ОВ С 161, 14.6.1993 г., стр. 18.

Directive 80/665/EEC is hereby repealed with effect from 16 November 1993.

[4] ОВ L 26, 31.1.1977 г., стр. 20. Последно изменена с Директива 92/103/ЕИО на Комисията (ОВ L 363, 11.12.1992 г., стр. 1).

[5] ОВ L 180, 14.7.1980 г., стр. 30.

Article 15

--------------------------------------------------

This Directive is addressed to the Member States.

19931004

Done at Luxembourg, 4 October 1993.

ПРИЛОЖЕНИЕ I

For the Council The President W. CLAES

МЕТОД ЗА ОТКРИВАНЕ И ДИАГНОСТИКА НА ПРЪСТЕНОВИДНО ГНИЕНЕ ПО КАРТОФИТЕ, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. В ПАРТИДИ КАРТОФЕНИ КЛУБЕНИ

1. Вземане на проба от сърцевината от долния край

(1) OJ No C 93, 2. 4. 1993, p. 12.

1.1. Измиват се 200 клубена на течаща вода и се отстранява епидермиса около долната част на всеки клубен, като се използва обикновено дезинфектиран скалпел или картофобелачка; дезинфекция може да се постигне чрез потапяне на белачката в 70 % етилов спирт и обгаряне.

(2) OJ No C 176, 28. 6. 1993, p. 210.

1.2. Внимателно се отстранява коничната тъкан на сърцевината от долния край с нож или картофобелачка. Взема се колкото се може по-малко количество неваскуларна тъкан. Отстранените долни краища се обработват в продължение на 24 часа (виж параграф 3) или се съхраняват за не повече от две седмици при температура – 20 °С.

(3) OJ No C 161, 14. 6. 1993, p. 18.

2. Визуален преглед за симптоми на пръстеновидно гниене

(4) OJ No L 26, 31. 1. 1977, p. 20. Directive as last amended by Commission Directive 92/103/EEC (OJ No L 363, 11. 12. 1992, p. 1).

След отстраняване на долните краища се срязва напречно всеки клубен и се наблюдава за симптоми на пръстеновидно гниене.

(5) OJ No L 180, 14. 7. 1980, p. 30.

Изстискват се клубените и се проверява дали има мацерирани части от васкуларната тъкан.

Най-ранните симптоми са лек стъклен или полупрозрачен вид на тъканта без омекване около васкуларната система, и по-специално при долния край. Васкуларният пръстен в долния край може да бъде малко по-тъмен на цвят от нормално. Първият лесно установим симптом е наличието на жълтеникаво оцветяване на васкуларния пръстен, а когато се стисне клубена, от съдовете излизат стълбчета от приличен на сирене материал. Този ексудат съдържа милиони бактерии. На този етап може да се появи кафеникаво оцветяване на васкуларната тъкан. Първоначално симптомите може да са ограничени в една част на пръстена, не непременно близо до долния край, и може постепенно оцветяването да се разширят до целия пръстен. С напредването на инфекцията се разрушава васкуларната тъкан. Външната кора може да се отдели от вътрешната. В напредналите стадии на инфекция по повърхността на клубена се появяват цепнатини, които често са червеникаво-кафяви по края. Вторична гъбична или бактериална инвазия може да прикрие симптомите и тогава ще бъде трудно, ако не и невъзможно, да се различат симптомите на напреднал стадий на пръстеновидно гниене от други видове гниене на картофените клубени.

3. Подготовка на проби за оцветяване по метода на Грам, изпитване за имунофлуоресцентно оцветяване (IF) и изпитване на сини домати

ANNEX I

3.1. Хомогенизират се долните краища до пълна мацерация в разредител, за който е известно, че не е токсичен за Corynebacterium sepedonicum (например 0,05 М фосфатно-буферен солен разтвор (ФБР) с рН 7,0) при температура, по-ниска от 30 °С. Препоръчва се добавяне на нетоксичен дефлокулиращ агент, а може да се добави и нетоксичен антипенител (приложения 1 и 2). Трябва да се избягва прекомерна мацерация.

METHOD FOR THE DETECTION AND DIAGNOSIS OF THE RING ROT BACTERIUM, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. IN BATCHES OF POTATO TUBERS 1. Removal of heel-end cores

3.2. Извличат се бактериите от хомогенизираната течност чрез един от следните методи [1]:

1.1. Wash 200 tubers in running tap water and remove the epidermis around the heel end of each tuber using a regularly disinfected scalpel or potato peeler; disinfection may be achieved by dipping the peeler in 70 % ethanol and flaming.

А. а) Центрофугират се не повече от 180 г в продължение на 10 минути.

1.2. Carefully remove conical tissue cores from the heel ends with a knife or potato peeler. Keep the excess non-vascular tissue to a minimum. Once removed, heel ends should be processed within 24 hours (see paragraph 3) or conserved at -20°C for no longer than two weeks.

б) Центрофугират се не по-малко от 4000 г супернатант в продължение на 10 минути. Преточва се и се отстранява супернатанта.

2. Visual examination for ring rot symptoms

Б. а) Оставя се размекнатото вещество 30 минути, за да се утаят парченцата от тъканта. Преточва се супернатанта, без да се разбърква утайката.

After removal of heel ends, cut each tuber transversely and observe for the presence of ring rot symptoms.

б) Филтрира се супернатантът през филтърна хартия (Уотмън № 1), поставена в синтерован стъклен филтър (№ 2 = 40-100мм), като се използва водна вакуумна помпа. Събира се филтратът в тръба за центрофугиране. Измива се филтърът със стерилен ФБР до получаване на максимално количество на филтрата 35 мл.

Squeeze the tubers and look for expression of macerated tissues from the vascular tissue.

в) Центрофугира се не по-малко от 4000 г филтрат в продължение на 20 минути.

The earliest symptoms are a slight glassiness or translucence of the tissue without softening round the vascular system, particularly near the heel end. The vascular ring at the heel end may be slightly darker in colour than normal. The first readily identifiable symptom is one whereby the vascular ring has a yellowish coloration and when the tuber is gently squeezed, pillars of cheese-like material emerge from the vessels. This exudation contains millions of bacteria. Browning of the vascular tissue may develop at this stage. At first, these symptoms may be restricted to one part of the ring, not necessarily close to the heel end and may gradually extend to the whole ring. As the infection progresses, destruction of the vascular tissue occurs; the outer cortex may become separated from the inner cortex. In advanced stages of infection, cracks appear on the surface of the tuber, which are often reddish-brown at their margins. Secondary fungal or bacterial invasion may mask the symptoms and it may be difficult, if not impossible, to distinguish advanced ring rot symptoms from other tuber rots.

3.3. Оставя се утайката (концентриран екстракт) в стерилен 0,01 М фосфатен буферен разтвор с рН 7,2 (допълнение 2), за да се постигне общ обем от приблизително 1 мл. Разделя се на две равни части и се запазва едната част за сравнение, като се замразява при –20 °С [2] или чрез лиофилизация. Разделя се другата част на две половини и се използва едната половина за изпитване на реакция на имунофлуоресценция и за Грам оцветяване, а другата за изпитване на син домат.

3. Preparation of samples for Gram staining, immunofluorescence staining (IF) and eggplant test

3.4. Абсолютно задължително да се третират поотделно всички положителни контролни образци и проби на C. sepedonicum, за да се избегне заразяване. Това се отнася както за имунофлуоресцентното изпитване, така и за изпитването на син домат.

3.1. Homogenize the heel ends until complete maceration has just been achieved in a diluent known to be non-toxic to Corynebacterium sepedonicum (for example, 0,05 M phosphate buffered saline (PBS) pH 7,0) at a temperature of less than 30°C; the addition of a non-toxic deflocculant is advisable and non-toxic antifoam agent may be needed (Appendices 1 and 2). Excessive maceration should be avoided.

4. Реакция на Грам

3.2. Extract bacteria from the homogenate by one of the methods as follows(1) :

4.1. Приготвят се оцветители на Грам за всички разтвори на концентрирания екстрат (точка 5.2.1) и за всички отрязани клубени (точка 2), при които се наблюдава прозрачност, загниване или други подозрителни симптоми. Пробите се взимат от края на болните тъкани.

A. (a) Centrifuge at not more than 180 g for 10 minutes.

4.2. Приготвя се Грам оцветители за познати култури C. sepedonicum и, ако е възможно, за естествено заразена тъкан (точка 5.1).

(b) Centrifuge supernatant at not less than 4 000 g for 10 minutes. Decant and discard the supernatant.

4.3. Определя се кои проби съдържат типични Грам положителни клетки на Corynebacterium. Най-общо клетките на C. sepedonicum са с дължина 0,8—1,2 mm и с широчина 0,4—0,60 mm.

B. (a) Allow the macerate to stand for 30 minutes for the tissue debris to settle. Decant the supernatant without disturbing the sediment.

Подходящ начин за оцветяване на Грам е посочен в допълнение 3.

(b) Filter the supernatant through filter paper (Whatman No 1) held in a sintered glass filter (No 2 = 40-100mm) using a water vacuum pump. Collect the filtrate in a centrifuge tube. Wash the filter with sterile PBS to a maximum filtrate volume of 35 ml.

В препаратите от естествени инфекции или от наскоро изолирани култури често преобладават кокоидни пръчици, които обикновено са малко по-малки от клетките на по-стари култури върху агар-агар. В повечето среди на култура клетките на C. sepedonicum са плеоморфни пръчици от вида бактерии coryneform и могат да дадат променлива Грам реакция. Клетките са единични, по двойки, с характерни "извивки", типични за огънато делене, а понякога са в несиметрични групи, често наричани палисади и китайски букви.

(c) Centrifuge filtrate at not less than 4 000 g for 20 minutes.

5. Имунофлуоресцентни изпитвания

3.3. Suspend the pellet in sterile 0,01 M phosphate buffer pH 7,2 (Appendix 2) to give a total volume of approximately 1 ml. Divide in two equal parts and retain one part for reference purposes by freezing at -20 °C(2) or by lyophilization. Divide the other part into halves using one half for the IF test and Gram stain and the other for the eggplant test.

5.1. Използва се антисерум за познат щам на C. sepedonicum - ATCC 33113 (NCPPB 2137) или NCPPB 2140. Той трябва да има титър на имунофлуоресценция по-голям от 1:600. Включва се една контролна проба на ФБР върху предметното стъкло, за да се определи дали антитялото флуоресцеин изотиоцианат заешки имуноглобулинов конюгат (ФИИК) се съчетава неспецифично с бактериалните клетки. Corynebacterium sepedonicum (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) следва да се използва като контролни проби на хомоложен антиген върху отделно предметно стъкло. При възможност тъкан, заразена по естествен път (поддържана чрез лиофилизация или замразяване при – 20 °С), трябва да се използва като подобна контрола на същото предметно стъкло (Фигура 2).

3.4. It is imperative that all positive C. sepedonicum controls and samples are treated separately to avoid contamination. This applies to IF slides and to eggplant tests.

5.2. Процедура

4. Gram staining

5.2.1. Приготвят се три поредни десеторни разреждания (101, 102, 103) на окончателния концентрират екстрат в дестилирана вода (Фигура 1).

4.1. Prepare Gram stains for all pellet dilutions (5.2.1) and for any cut tubers (2) which show glassiness, rotting or other suspect symptoms. Samples should be taken from the edge of diseased tissues.

5.2.2 Поставя се с пипета измерен стандартен обем, достатъчен да покрие гнездото (приблизително 25 ml), от всеки разтвор на концентрирания екстрат или суспензия на C. sepedonicum (приблизително 106 клетки/µl) в гнездата на многоклетъчно предметно стъкло, както е показано на фигура 1.

4.2. Prepare Gram stains for known C. sepedonicum cultures and, if possible, for naturally infected tissue (5.1).

+++++ TIFF +++++

4.3. Determine which samples contain typical Gram positive coryneform cells. In general, C. sepedonicum cells are 0,8 to 1,2mm long and 0,4 to 0,60mm wide.

+++++ TIFF +++++

An appropriate staining procedure is given in Appendix 3.

5.2.3. Оставя се да изсъхне при температура приблизително 37 °С и се фиксира с 95 % етанол или на пламък.

Preparations from natural infections or recently isolated cultures often show a predominance of coccoid rods which are usually slightly smaller than cells from oder agar cultures. On most culture media, C. sepedonicum cells are pleomorphic coryneform rods and may give a variable Gram reaction. Cells are single, in pairs with characteristic 'elbows' typical of bending division, and occasionally in irregular groups often referred to as palisades and Chinese letters.

5.2.4. Покриват се съответните гнезда с антисерум на C. sepedonicum при препоръчаните разреждания, 0,01 М ФБР с рН 7,2, (допълнение 2), както е показано на фигура 1. (Използва се ФБР за контролата ФИИК). Работният разтвор на антисерума трябва да бъде приблизително наполовина от този на титъра на имунофлуоресценцията. Ако бъдат включени други антисерумни разтвори, ще трябва да се приготвят отделни предметни стъкла за всеки разтвор, който ще се използва.

5. Scheme for IF-testing

5.2.5. Инкубира се във влажна камера при температура на околната среда в продължение на 30 минути.

5.1. Use antiserum to a known strain of C. sepedonicum - ATCC 33113 (NCPPB 2137), or NCPPB 2140. This should have an IF titre of more than 1:600. Include one PBS control on the test slide to determine whether the fluorescein isothiocyanate anti-rabbit immunoglobulin conjugate (FITC) combines non-specifically with bacterial cells. Corynebacterium sepedonicum (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) should be used as homologous antigen controls on a separate slide. Naturally infected tissue (maintained by lyophilization or freezing at -20°C) should be used where possible as a similar control on the same slide (Figure 2).

5.2.6. Изплаква се внимателно с 0,01 М ФБР с рН 7,2. Мие се в продължение на пет минути във фосфатно-буферен разтвор 0,01 М с рН 7,2, като се сменя разтворът три пъти.

5.2. Procedure

5.2.7. Отстранява се внимателно излишната влага.

5.2.1. Prepare three serial ten fold dilutions (101, 102, 103) of the final pellet in distilled water (Figure 1).

5.2.8. Покрива се всяко гнездо с конюгат ФИИК при същото разреждане, използвано за определяне на титъра, и се инкубира в тъмна влажна камера при температура на околната среда в продължение на 30 минути.

5.2.2. Pipette a measured standard volume sufficient to cover the window (approximately 25 ml) of each pellet dilution or C. sepedonicum suspension (approximately 106 cells/ml) to windows of a multispot slide as shown in Figure 1.

5.2.9. Изплаква се и се измива като преди.

5.2.4. Cover appropriate windows which C. sepedonicum antiserum at the recommended dilutions, 0,01 M PBS pH 7,2 (Appendix 2), as shown in Figure 1. (Use PBS for the FITC control.) The working dilution of the antiserum should be approximately half that of the IF titre. If other antiserum dilutions are to be included, separate slides should be prepared for each dilution to be used.

5.2.10. Използва се приблизително 5 до 10 мл 0,1 М фосфатен буферен разтвор на глицерин с рН 7,6 (или подобен препарат с рН не по-малко от 7,6) за всяко гнездо и се покрива с предпазно стъкло (допълнение 2).

5.2.5. Incubate in a humid chamber at ambient temperature for 30 minutes.

5.2.11. Изследва се под микроскоп, снабден с епифлуоресцентен светлинен източник и с филтри, подходящи за работа с ФИИК. Подходящо е увеличение от 400 до 1000 пъти. Сканират се получените еднакви гнезда през средата на два диаметъра под прави ъгли и около периметрите на гнездото.

5.2.6. Rinse carefully with 0,01 M PBS pH 7,2. Wash for five minutes in three changes of 0,01 M PBS pH 7,2.

Следят се флуоресциращи клетки в положителните контроли и се определят титъра. Следят се флуоресциращи клетки в контролното гнездото на ФИИК/ФБР и ако няма такива, се преминава към тестовите гнезда. Определят се в минимум 10 микроскопски полета средният брой на флуоресциращи клетки с типична морфология на поле и се изчислява техният брой на мл от неразтворения концентриран екстрат (допълнение 4).

5.2.7. Carefully remove excess moisture.

Съществуват няколко проблема, присъщи на имунофлуоресцентното изпитване:

5.2.8. Cover each window with FITC conjugate at the same dilution used to determine the titre and incubate in a dark humid chamber at ambient temperature for 30 minutes.

- В картофените концентрирани екстракти съществува вероятност да се появят фонови популации на флуоресциращи клетки с нетипична морфология и противоположно реагиращи сапрофитни бактерии, с големина и морфология подобни на Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Вземат се под внимание само флуоресциращите клетки с типична големина и морфология.

5.2.9. Rinse and wash as before.

Поради възможността от противоположни реакции, проби с положителна реакция при имунофлуоресцентно изпитване трябва да се тестват отново, но с различен антисерум.

5.2.10. Apply approximately 5 to 10 ml of 0,1 M phosphate buffered glycerine pH 7,6 (or a similar mountant with a pH not less than 7,6) to each window and cover with a coverglass (Appendix 2).

- Техническата граница на откриване при този метод е между 103 и 104 клетки на мл неразреден концентриран екстрат. Проби за които броят на типичните флуоресциращи клетки е на границата на откриване обикновено са отрицателни за C. m. ssp. sepedonicus, но могат да бъдат подложени на изпитване на син домат.

5.2.11. Examine with a microscope fitted with an epifluorescent light source and filters suitable for working with FITC. A magnification of 400 to 1 000 is suitable. Scan replicated windows across two diameters at right angles and around the window perimeters.

За всички проби, в които не са открити флуоресциращи клетки с типична морфология, се определя проба за реакция при имунофлуоресцентно изпитване. Пробите следва да се считат за "незаразени" с Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Observe for fluorescing cells in the positive controls and determine the titre. Observe for fluorescing cells in the FITC/PBS control window and, if absent, proceed to the test windows. Determine in a minimum of 10 microscope fields the mean number of morphologically typical fluorescing cells per field and calculate the number per ml of undiluted pellet (Appendix 4).

Изпитването на син домат не е задължителю.

There are several problems inherent to the immunofluorescence test.

За всички проби, в които се установява наличие на флуоресциращи клетки с типична морфология, се определя проба за положителна реакция при имунофлуоресцентно изпитване.

- Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus are likely to occur in potato pellets. Consider only fluorescing cells with typical size and morphology.

Проби, за които е била определена проба за положителна реакция на имунофлуоресцентно изпитване с двата антисерума, се считат за "потенциално заразени" с Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Because of the possibility of cross-reactions, samples with a positive immunoflorescence test should be retested using a different antiserum.

Изпитване на син домат се изисква за всички проби, считани за потенциално заразени.

- The technical limit of detection of this method is situated between 103 and 104 cells per ml of undiluted pellet. Samples with counts of IF typical cells at the detection limit are usually negative for C. m. ssp. sepedonicus but may be committed to eggplant testing.

6. Изпитване на син домат

A negative immunofluorescence test is identified for any sample where morphologically typical fluorescing cells are not found. The samples shall be considered as 'not contaminated' with Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

За подробности за културите виж допълнение 5.

The eggplant test is not required.

6.1. Разпределя се концентрираният екстрат от точка 3.3. между най-малко 25 сини домата във фаза на разлистване 3 (допълнение 5), като се прилага един от посочените по-долу методи (точка 6.2, 6.3 или 6.4).

A positive immunofluorescence test is identified for any sample where morphologically typical fluorescing cells are found.

6.2. Инокулация чрез разрез I

Samples for which a positive immunofluorescence test have been identified with both antisera shall be considered as 'potentially contaminated' with Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

6.2.1. Поставя се всяка саксия в хоризонтално положение (за 10 сантиметрова саксия е подходящ блок от пенополистирол, от който е смахнато от едната повърхност парче с дълбочина 5 см, широчина 10 см и дължина 15 см (Фигура 3). За всяка тествана проба се поставя лента от стерилно алуминиево фолио между стъблото и пенополистиролния блок. Растението може да бъде поддържано с ластик около блока.

The eggplant test is required for all samples considered as potentially contaminated.

6.2.2. Прави се със скалпел надлъжен или леко диагонален разрез с дължина от 0,5 до 1,0 см и с дълбочина приблизително три четвърти от диаметъра на стъблото между, семеделния лист и първия лист.

6. Eggplant test

6.2.3. Задържа се разреза отворен с острието на скалпела и се оцветява инокулата вътре с помощта на очна линия или фина четка за рисуванепотопена в концентрирания екстракт.. Разпределя се останалата част от концентрирания екстракт между другите сини домати.

For cultural details, see Appendix 5.

6.2.4. Затваря се разрезът със стерилен вазелин, като се използва спринцовка с вместимост 2 мм.

6.1. Distribute the pellet from 3.3 between at least 25 eggplants at leaf stage 3 (Appendix 5) by one of the methods given below (6.2, 6.3 or 6.4).

+++++ TIFF +++++

6.2. Slit inoculation I

6.3. Инокулация чрез разрез II

6.2.1. Support each pot horizontally (a block of expanded polystyrene with a piece 5 cm deep × 10 cm wide × 15 cm long, removed from one surface (Figure 3) is adequate for a 10 cm pot). A strip of sterile aluminium foil should be placed between the stem and the block for each sample tested. The plant may be held in place by a rubber band around the block.

6.3.1. Държи се растението между два пръста и се капват (приблизително от 5 до 10 мл) от суспендирания концентриран екстракт върху стъблото, между семеделния лист и първия лист.

6.2.2. Using a scalpel, make a longitudinal or slightly diagonal cut 0,5 to 1,0 cm long and approximately three quarters of the stem diameter deep, between the cotyledons and the first leaf.

6.3.2. Прави се със стерилен скалпел диагонален разрез (под ъгъл приблизително 5о) с дължина 1,0 см и с дълбочина около 2/3 от дебелината на стъблото, като разрезът се започва капката от концентрирания екстракт.

6.2.3. Hold the slit open with the scalpel blade point and paint the inoculum into it using an eyeliner or fine artist's brush charged with the pellet. Distribute the remainder of the pellet between the eggplants.

6.3.3. Запечатва се разрезът със стерилен вазелин, като се използва спринцовка.

6.2.4. Seal the cut with sterile vaseline from a 2 ml syringe barrel.

6.4. Инокулация със спринцовка

6.3. Slit inoculation II

6.4.1. Не се поливат сините домати един ден преди вкарването на материала, за да се намали тургурното налягане.

6.3.1. Holding the plant between two fingers, pipette a drop (approximately 5 to 10 ml) of the suspended pellet on the stem between the cotyledons and the first leaf.

6.4.2. Прави се инокулация на стъблото на синия домат, точно над семеделния лист, използвайки спринцовка с игла за подкожна инжекция (не по-малко от 23 G). Разпределя се концентрираният екстракт между сините домати.

6.3.2. Using a sterile scalpel, make a diagonal (at an angle of approximately 5°) slit, 1,0 cm long and approximately 2/3 of the stem thickness deep, starting the cut from the pellet drop.

6.5. Инокулират се 25 растения с известна култура на C. sepedonicum и при възможност, заразена по естествен път тъкан от клубен (точка 5.1.), като се прилага същият метод на инокулация (точка 6.2, 6.3 или 6.4).

6.3.3. Seal the cut with sterile vaseline from a syringe barrel.

6.6. Инокулират се 25 растения със стерилен 0,05 М ФБР по същия метод на инокулация (точка 6.2, 6.3 или 6.4).

6.4. Syringe inoculation

6.7. Инкубират се растенията при подходящи условия (допълнение 5) в продължение на 40 дни. Проверяват се редовно за симптоми след осем дни. Преброяват се растенията с проявени симптоми. C. sepedonicum причинява увяхване на листата при сините домати, което може да започне като отпуснатост на краищата на листата или между жилките. Повяхналата тъкан може първоначално да бъде тъмнозелена или на петна, но преди да загние избледнява. При увяхване между жилките, повърхността често изглежда мазна и много водна. Мъртвата тъкан е често ярко жълта по края. Растенията не умират непременно. Колкото по-дълъг е периодът преди да се развият симптомите, толкова по-голям е шансът за оцеляване. Растенията могат да превъзмогнат инфекцията. Податливите млади сини домати са много по-чувствителни към ниски популации на C. sepedonicum, отколкото по-старите растения, и оттам следва необходимостта да се използват растения в третата фаза на разлистване или точно преди нея.

6.4.1. Do not water eggplants for one day prior to inoculation to reduce turgor pressure.

Повяхване може да се предизвика и от популации на други бактерии или гъбички, намиращи се в концентрирания екстракт от тъкан на картофен клубен. В тях са включени Erwinia carotovora, subsp. carotovora и E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, както и големи популации на сапрофитни бактерии. Такъв вид повяхване може да бъде разграничено от повяхването, причинено от C. sepedonicum, тъй като при него цели листа или цели растения бързо увяхват.

6.4.2. Inoculate the eggplant stems just above the cotyledons using a syringe fitted with a hypodermic needle (not less than 23G). Distribute the pellet between the eggplants.

6.8. Приготвя се Грам оцветител (точка 4) за всички партиди сини домати с проявени симптоми, като се използват части от тъкан на увехнал лист и тъкан от стъбло от растения, и се изолират в подходящи хранителни среди (точка 7). Дезинфекцира се повърхността на листата и стъблата на сините домати чрез изтриване със 70 % етанол.

6.5. Inoculate 25 plants with a known C. sepedonicum culture and, where possible, naturally infected tuber tissue (5.1) by the same inoculation method (6.2, 6.3 or 6.4).

6.9. При определени условия, и по-специално когато условията за растеж не са оптимални, съществува възможност C. sepedonicum да присъства като латентна инфекция в сините домати дори след 40 дневна инкубация. Такива инфекции могат да доведат до спиране на растежа и липса на жизненост в инокулираните растения. Ако имунофлуоресцентното изпитване се приеме за положително, може да се счете за необходимо да се продължи с тестването. Поради това, от съществено значение е да се сравнят темповете на растеж на всички тествани сини домати с помощта на инокулирани контролни проби на стерилен 0,05 М ФБР и да се наблюдава екологичната обстановка в оранжерията.

6.6. Inoculate 25 plants with sterile 0,05 M PBS by the same inoculation method (6.2, 6.3 or 6.4).

Правят се следните препоръки за допълнително изпитване:

6.7. Incubate the plants in appropriate conditions (Appendix 5) for 40 days. Examine regularly for symptoms after eight days. Count the number of plants showing symptoms. C. sepedonicum causes leaf wilting in eggplants which may commence as a marginal or interveinal flaccidity. Wilted tissue may initially appear dark green or mottled but turns paler before becoming necrotic. Interveinal wilts often have a greasy water-soaked appearance. Necrotic tissue often has a bright yellow margin. Plants are not necessarily killed; the longer the period before symptoms develop, the greater the chance of survival. Plants may outgrow the infection. Susceptible young eggplants are much more sensitive to low populations of C. sepedonicum than are older plants, hence the necessity to use plants at or just before leaf stage 3.

6.9.1. изрязват се стъблата над мястото на инокулацията и се махат листата;

Wilts may also be induced by populations of other bacteria or fungi present in the tuber tissue pellet. These include Erwinia carotovora, subsp. carotovora and E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, as well as large populations of saprophytic bacteria. Such wilts can be distinguished from those caused by C. sepedonicum since whole leaves or whole plants wilt rapidly.

6.9.2. накисват се стъблата в 0,05 М ФБР с рН 7,0, както е посочено в точка 3.1 и точка 3.2;

6.8. Prepare a Gram stain (4) for all batches of eggplants showing symptoms, using sections of wilted leaf tissue and stem tissue from plants and isolate on to suitable nutrient media (7). Surface disinfect the eggplant leaves and stems by wiping with 70 % ethanol.

6.9.3. използва се половината от концентрирания екстракт, за да се извърши Грам оцветяване (точка 4) и имунофлуоресцентното изпитване (точка 5);

6.9. Under certain circumstances, in particular where growing conditions are not optimal, it may be possible for C. sepedonicum to exist as a latent infection within eggplants even after incubation for 40 days. Such infections may possibly result in stunting and lack of vigour in the inoculated plants. If the IF test is considered positive, it may be considered necessary to test further. It is, therefore, essential to compare the growth rates of all eggplant test plants with the sterile 0,05 M PBS inoculated controls and to monitor the environmental conditions of the glasshouse.

6.9.4. използва се другата половина, за да се проведе допълнителео изпитване на син домат (точка 6), ако са положителни резултатите от изпитването на Грам оцветяване и имунофлуоресцентното изпитване. Използва се известна култура на C. sepedonicum и стерилни контроли с 0,05 М ФБР. Ако в последващото изпитване не се наблюдават симптоми, пробата следва да се счита за отрицателна.

Recommendations for further testing are as follows:

7. Изолиране на C. sepedonicum

6.9.1. excise the stems above the inoculation site and remove the leaves;

Диагнозата може да се потвърди само ако C. sepedonicum бъде изолирана и идентифицирана (точка 8). Въпреки че C. sepedonicum е труден за изолиране вредител, това може да се направи от симптоматична тъкан. Въпреки това бързо растящи сапрофитни бактерии могат да я надживеят, поради което не се препоръчва директно изолиране от концентрирания екстракт от тъкан на клубен (точка 3.3.). Сините домати предоставят отлична селективно обогатителна среда за растежа на C. sepedonicum, както и възможности за отличен тест за потвърждаване на гостоприемник.

6.9.2. macerate the stems in 0,05 M PBS pH 7,0, as in 3.1 to 3.2;

Изолиране следва да се направи от всички симптоматични картофени клубени и сини домати (точка 4 и точка 6). При необходимост трябва да се извърши мацерация на стъблата на сини домати, както е посочено в точка 3. и точка 6.9.

6.9.3. use half of the pellet to perform a Gram stain (4) and an IF test (5);

7.1. Прочиства се с нова посявка на ивици със суспензии една от следните среди: (формулите са дадени в допълнение точка 6):

6.9.4. use the other half to perform a further eggplant test (6) if the Gram stain and/or IF tests are positive. Use a known C. sepedonicum culture and sterile 0,05M PBS controls. If symptoms are not observed in the subsequent test, the sample must be considered negative.

хранителен агар с декстроза (само за субкултура),

7. Isolation of C. sepedonicum

дрождов-пептонов агар с глюкоза,

Diagnosis can only be confirmed if C. sepedonicum is isolated and so identified (8). Although C. sepedonicum is a fastidious organism, it can be isolated from symptomatic tissue. However, it may be outgrown by rapidly growing saprophytic bacteria and, therefore, isolations directly from the tuber tissue pellet (3.3) are not recommended. Eggplants provide an excellent selective enrichment medium for the growth of C. sepedonicum and also provide an excellent confirmatory host test.

хранителен дрождов агар с декстроза,

Isolations should be made from all symptomatic potato tubers and eggplants (4, 6). Maceration of eggplant stems when necessary should be carried out as in 3. and 6.9.

агар с екстракт от дрожди и минерални соли.

7.1. Streak suspensions on to one of the following media: (formulae are given in Appendix 6):

Инкубира се до 20 дни при температура 21 °C.

nutrient dextrose agar (for subculture only),

C. sepedonicum расте бавно и обикновено за 10 дни произвежда съвсем малки, кремави, куполовидни колонии.

yeast peptone glucose agar,

Прави отново посявка на ивици, за да се постигнат чисти култури.

nutrient yeast dextrose agar,

Темповете на растеж се подобряват при субкултурата. Типичните колонии са кремаво-бели или с цвят на слонова кост, заоблени, гладки, надигнати, издути и куполовидни, слизесто-течни, с цели краища, и са обикновено от 1 до 3 мм в диаметър.

yeast extract mineral salts agar.

Идентифициране

Incubate at 21°C for up to 20 days.

Много Грам положителни бактерии coryneform, с характеристики на колониите подобни на тези на C. sepedonicum, могат да бъдат изолирани от здрави или заболели картофи и сини домати. В тази връзка, C. sepedonicum следва да се идентифицира чрез едно от посочените по-долу изпитвания:

C. sepedonicum is slow-growing, usually producing pin-point, cream, domed colonies within 10 days.

имунофлуоресцентното изпитване (точка 5.1),

Re-streak to establish purity.

изпитване на син домат,

Growth rates are improved with subculture. Typical colonies are creamy-white or ivory, rounded, smooth, raised, convex-domed, mucoid-fluidal, with entire edges and usually 1 to 3 mm in diameter.

хранителни и физиологични изпитвания (допълнение 7),

Identification

- изпитване на окисляване/ферментация (O/F),

Many Gram positive coryneform bacteria, with colonial characters similar to those of C. sepedonicum, may be isolated from healthy or diseased potatoes and eggplants. In this context C. sepedonicum must be identified by the following tests:

- изпитване за оксидаза,

IF test (5.1),

- растеж при 37 °C,

eggplant test,

- произвеждане на уреаза,

nutrition and physiological tests (Appendix 7),

- ескулинова хидролиза,

- oxidation/fermentation test (O/F),

- скорбялна хидролиза,

- oxidase test,

- толеранс от 7 % разтвор на натриев хлорид,

- growth at 37°C,

- изпитване на индол

- urease production,

- изпитване за каталаза

- aesculin hydrolysis,

- произвеждане на Н28,

- starch hydrolysis,

- използване на цитрат

- tolerance of 7 % sodium chloride solution,

- желатинова хидролиза

- indole test,

- кисела реакция от: глицерин, лактоза, рамноза и салицин,

- catalase test,

- Грам оцветяване.

- H28 production,

Всички проби следва да включват известна контрола на C. sepedonicum. Хранителните и физиологичните изпитвания трябва да се правят с инокулати от субкултури на хранителен агар. Трябва да се правят морфологични сравнения на култури на агар с хранителна декстроза.

- citrate utilization,

За имунофлуоресцентното изпитване, клетъчните популации трябва да се поставят до 106 клетки/мл. Титърът на имунофлуоресценцията трябва да прилича на титъра на познатата култура на C. sepedonicum.

- gelatin hydrolysis

За изпитването на синия домат клетъчни популациити трябва да се поставят до 107 клетки/мл. Изпитванията със син домат се правят с 10 растения за всеки от тестваните вредители, и отново се използва позната култура на C. sepedonicum и стерилни водни контроли. При чисти култури за 20 дни трябва да се получи типично увяхване, а растенията, които след този период не проявяват симптоми, трябва да се инкубират в продължение на 30 дни при температури, благоприятни за растежа на синия домат, но не по-високи от 30 °С (допълнение 5). Ако след 30 дни симптомите не се проявят, не може да се потвърди, че културата е патогенна форма на Corynebacterium sepedonicum.

- acid from: glycerol, lactose, rhamnose and salicin,

Проба | C. sepedonicum |

- Gram stain.

O/F | Инертна или леко окислителна |

All tests should include a known C. sepedonicum control. Nutritional and physiological tests should be made using inocula from nutrient agar subcultures. Morphological comparisons should be made from nutrient dextrose agar cultures.

Оксидаза | – |

For the IF test, cell populations should be adjusted to 106 cells/ml. The IF titre should be similar to that of the known C. sepedonicum culture.

Каталаза | + |

For the eggplant test cell populations should be adjusted to c 107 cells/ml. Eggplant tests should be made using 10 plants for each of the test organisms, again using known C. sepedonicum culture and sterile water controls; with pure cultures typical wilting should be obtained within 20 days but plants not showing symptons after this time should be incubated for a total of 30 days at temperatures conducive to eggplant growth but not exceeding 30°C (Appendix 5). If after 30 days symptoms are not present, the culture cannot be confirmed as being a pathogenic form of Corynebacterium sepedonicum.

Намаляване на нитратите | – |

Test C. sepedonicum

Активност на уреаза | – |

O/F Inert or weakly oxidative

Произвеждане на Н2S | – |

Oxidase -

Произвеждане на индол | – |

Catalase +

Използване на цитрат | – |

Nitrate reduction -

Скорбялна хидролиза | или слаба |

Urease activity -

Растеж при 37 °С | – |

H2S production -

Растеж в 7 % разтвор на натриев хлорид | – |

Indole production -

Желатинова хидролиза | – |

Citrate utilization -

Ескулинова хидролиза | + |

Starch hydrolysis - or weak

Проба за кисела реакция от | |

Growth at 37° -

—Глицерол | – |

Growth in 7 % NaCl -

—Лактоза | или слаба |

Gelatin hydrolysis -

—Рамноза | – |

Aesculin hydrolysis +

—Салицин | – |

Acid from:

[1] Алтернативен метод за извличане е даден от Динсен, 1984 г.

- Glycerol -

[2] Доказано е (Янсен и Ван Веренберг, 1987 г.), че замразяването може да намали жизнеспособността на Corynebacterium sepedonicum.

- Lactose - or weak

--------------------------------------------------

- Rhamnose -

19931004

- Salicin -

Допълнение 1

Appendix 1 FORMULATION OF MACERATING FLUID RECOMMENDED BY LELLIOTT AND SELLAR, 1976

ФОРМУЛАЦИЯ НА МАЦЕРИРАЩАТА ТЕЧНОСТ, ПРЕПОРЪЧВАНА ОТ ЛЕЛИОТ И СЕЛАР, 1976 Г.

D C silicone antifoam MS A compound (Hopkins & Williams Ltd, Cat. No 9964-25, Chadwell Heath, Essex, England) 10 ml

D C силиконова антипенова смес MS A (Hopkins & Williams Ltd, Cat. № 9964-25, Chadwell Heath, Essex, England) | 10 мл |

Lubrol W flakes (ICI Ltd) 0,5 g

Люспици луброл W (ICI Ltd) | 0,5 г |

Tetra-sodium pyrophosphate 1 g

Тетра-натриев пирофосфат | 1 г |

0,05 M phosphate buffered saline pH 7,0 (Appendix 2) 1 litre

0,05 М фосфатно-буферен солен разтвор с рН 7,0 (допълнение 2) | 1 л |

Appendix 2 BUFFERS

--------------------------------------------------

0,05 M phosphate buffered saline pH 7,0

19931004

This buffer can be used for tuber tissue maceration (2.1)

Допълнение 2

Na2HPO4 4,26 g

БУФЕРНИ РАЗТВОРИ

KH2PO4 2,72 g

Фосфатно-буферен солен разтвор 0,05 М с рН 7,0

NaCl 8,0 g

Този буферен разтвор се използва за мацерация на тъкан от клубени (2.1.)

Distilled water to 1 litre

Na2HPO4 | 4,26 г |

0,01 M phosphate buffered saline pH 7,2

KH2PO4 | 2,72 г |

This buffer is used for diluting antisera and washing IF slides

NaCl | 8,0 г |

Na2HPO4 12 H2O 2,7 g

Дестилирана вода | 1 литър |

NaH2PO4 2 H2O 0,4 g

Фосфатно-буферен солен разтвор 0,01 M с pH 7,2

NaCl 8,0 g

Този буферен разтвор се използва за разреждащи антисеруми и за измиване на предметни стъкла при проби за имунофлуоресцентното изпитване

Distilled water to 1 litre

Na2HPO4 12 H2O | 2,7 г |

0,1 M phosphate buffered glycerine pH 7,6

NaH2PO4 2 H2O | 0,4 г |

This buffer is used as a mountant to enhance fluorescence in the IF test

NaCl | 8,0 г |

Na2HPO4 12 H2O 3,2 g

Дестилирана вода до 1 л | 1 литър |

NaH2PO4 2 H2O 0,15 g

Фосфатно-буферен глицеринов разтвор М с рН 7,6

Glycerol 50 ml

Този буферен разтвор се използва като препарат за засилване на флуоресценцията при имунофлуоресцентното изпитване

Distilled water 100 ml

Na2HPO4 12 H2O | 3,2 г |

Appendix 3 GRAM STAIN PROCEDURE (HUCKER'S MODIFICATION) (DOETSCH, 1981)

NaH2PO4 2 H2O | 0,15 г |

Crystal violet solution

Глицерин | 50 мл |

Dissolve 2 g crystal violet in 20 ml 95 % ethanol.

Дестилирана вода | 100 мл |

Dissolve 0,8 g ammonium oxalate in 80 ml distilled water.

--------------------------------------------------

Mix the two solutions.

19931004

Lugol's iodine

Допълнение 3

Iodine 1 g

НАЧИН НА ОЦВЕТЯВАНЕ ПО МЕТОДА НА ГРАМ (МОДИФИКАЦИЯ НА HUCKER) (DOETSCH, 1981)

Potassium iodide 2 g

Кристален виолетов разтвор

Distilled water 300 ml.

Разтварят се 2 г виолетов кристал в 20 мл 95 % етанол.

Grind the solids together in a pestle and mortar. Add to the water and stir to dissolve in a closed container.

Разтварят се 0,8 г амониев оксалат в 80 мл дестилирана вода.

Safranin counterstain solution

Смесват се двата разтвора.

Stock solution:

Йод на Лугол

Safranin O 2,5 g

Йод | 1 г |

95 % ethanol 100 ml.

Калиев йодид | 2 г |

Mix and store.

Дестилирана вода | 300 мл |

Dilute: 1:10 to obtain a working solution.

Стриват се всички твърди частици заедно в хаван с чукало. Добавя се получената смес към водата и се разбърква, докато се разтвори, в затворен съд.

Staining procedure

Сафранов разтвор за оцветяване

1. Prepare smears, air dry and heat fix.

Основен разтвор:

2. Flood slide with crystal violet solution for one minute.

Сафран | 2,5 г |

3. Wash briefly with tap water.

95 % етанол | 100 мл. |

4. Flood with Lugol's iodine for one minute.

Разбърква се и се съхранява.

5. Wash with tap water and blot dry.

Разрежда се в съотношение 1:10, за да се получи работен разтвор.

6. Decolourize with 95 % ethanol, added dropwise, until no further colour is removed or immerse with gentle agitation for 30 seconds.

Процедура на оцветяване

7. Wash in tap water and blot dry.

1. Приготвят се намазките, изсушават се на въздуха и се установява точно топлината.

8. Flood with safranin solution for 10 seconds.

2. Потапя се предметното стъкло в кристално-виолетов разтвор в продължение на една минута.

9. Wash with tap water and blot dry.

3. Измива се за кратко на течаща вода

Gram positive bacteria stain violet-blue; Gram negative bacteria stain pink-red.

4. Потапя се в йод на Лугол в продължение на една минута.

Appendix 4 DETERMINATION OF POPULATION OF IF-POSITIVE CELLS

5. Измива се на течаща вода и изсушете с попивателна хартия.

Surface area (S) of window of multispot slide

6. Обезцветява се с 95 % етанол, който се добавя на капки, докато обезцветяването не престане, или го потопете, като се разклаща леко в продължение на 30 секунди.

p (1)

7. Измива се на течаща вода и се изсушава с попивателна хартия.

Where D = diameter of window.

8. Потапя се в сафранов разтвор в продължение на 10 секунди.

Surface area(s) of objective field

9. Измива се на течаща вода и се подсушава с попивателна хартия.

p (2)

Грам положителните бактерии се оцветяват във виолетовосиньо. Грам отрицателните бактерии се оцветяват в розово-червено.

where d = diameter of field.

--------------------------------------------------

Calculate d either by direct measurement or from the following formulae:

19931004

p (3)

Допълнение 4

where i = field coefficient (depends upon ocular type and varies from 8 to 24),

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПОПУЛАЦИЯ ОТ ПОЛОЖИТЕЛНИ КЛЕТКИ С ИМУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОТО ИЗПИТВАНЕ

K = tube coefficient (1 or 1,25),

Повърхността (S) на гнездото на многоклетъчно предметно стъкло

G = magnification of 100×, 40× etc) objective,

= πD24 | (1) |

from (2) d =

къдетоDдиаметъра на гнездото. | |

pfrom (3) ppCount the number of typical fluorescent cells per field (c).

Повърхност(и) на полето на обектива | |

Calculate the number of typical fluorescent cells per window (C).

= πd24 | (2) |

къдетоdдиаметъра на полето. | |

Calculate the number of typical fluorescent cells per ml pellet (N)

Изчислява се d чрез пряко измерване, или по следната формула: | |

s = πi2G2K2 × 4 | (3) |

where y = volume of pellet on window,

къдетоiкоефициент на полето (зависи от вида на обектива и варира между 8 и 24),Kкоефициент на тубуса (1 или 1,25),Gувеличение (100 ×, 40 × и т.н.) на обектива | |

where F = pellet dilution factor.

+++++ TIFF +++++

Appendix 5 EGGPLANT CULTURE

4sот (2) d =π | |

Sow seeds of eggplant (Solanum melongena cv. Black Beauty) in pasteurized seed compost. Transplant seedlings with fully expanded cotyledons (10 to 14 days) into pasteurized potting compost.

+++++ TIFF +++++

Use eggplants at leaf stage 3 when two, but not more than three, leaves are fully uncurled.

πi24 xG2K2i× 4от (3) d ==GKπ | (4) |

Eggplants should be grown in a glasshouse with the following environmental conditions:

Преброява се броят на типичните флуоресцентни клетки на поле (с).

day length: 14 hours or natural day length if greater;

Изчислява се броят на типичните флуоресцентни клетки на гнездо (С).

temperature: day: 21 to 24°C,

C =

night: 15°C.

S

NB: C. sepedonicum will not grow at temperatures >30°C. If night temperatures do not fall to 15°C, chromophore damage (silvery necrosis) may occur.

s

Root damage caused by sciarid larvae can be overcome by the application of an appropriate insecticide.

Изчислява се броят на типичните флуоресцентни клетки на мл концентриран екстракт (N)

Eggplant cv. Black Beauty may be obtained from:

N =

1. AB Hammenhoegs Froe,

1000

270 50 Hammenhoeg,

y

Sweden;

× F

2. HURST Seeds Ltd,

където

Avenue Road,

y = обем на концентрирания екстракт в гнездо,

Witham,

където

Essex CM8 2DX,

F = коефициент на разреждане на концентрирания екстракт.

England;

--------------------------------------------------

3. ASGRO Italia Sp A,

19931004

Corso Lodi, 23,

Допълнение 5

Milan;

КУЛТУРА ОТ СИН ДОМАТ

4. KUEPPER

Посяват се семена от син домат (Solanum melongena cv. Black Beauty Черна красота) в пастьоризиран компост за семена. Разсаждат се младите растения с напълно развити семеделни листа (10—14 дни) в пастьоризиран компост за саксиен разсад.

Mitteldeutsche Samen GmbH,

Използват се сини домати в трета вегетационна фаза, но с не повече от три напълно разтворени листа.

Hessenring 22,

Сините домати трябва да се отглеждат в оранжерия при следните условия на околната среда:

D-37269 Eschwege.

продължителност на деня: | 14 часа или естествената продължителност на деня, ако е по-дълъг; |

Appendix 6 MEDIA FOR GROWTH AND ISOLATION OF C. SEPEDONICUM

температура: | дневна | 21—24 °С |

Nutrient agar (NA)

нощна: | 15 °С |

Difco bacto nutrient agar in distilled water at manufacturer's rate. Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

NB: C. sepedonicum не вирее при температури, по-високи от 30 °С. Ако нощните температури не паднат до 15 °С, може да настъпи хромофорно увреждане (сребриста некроза).

Nutrient dextrose agar (NDA)

Прилагането на подходящ инсектицид позволява да се предотврати увреждане на корена, причинено от ларви.

Difco bacto nutrient agar containing 1 % D(+) glucose (monohydrate). Sterilize by autoclaving at 115 °C for 20 minutes.

Син домат от сорта Black Beauty може да се получи от:

Yeast peptone glucose agar (YPGA)

1. AB Hammenhoegs Frö

Difco bacto yeast extract (No 0127) 5 g

,270 50 Hammenhög,

Difco bacto peptone (No 0118) 5 g

Sweden;

D(+)-glucose (monohydrate) 10 g

2. HURST Seeds Ltd

Difco bacto purified agar (No 0560) 15 g

, Avenue Road, Witham,EssexCM8 2DX,

Distilled water 1 litre

England;

Sterilize 0,5 litre volumes of medium by autoclaving at 115 °C for 20 minutes.

3. ASGRO Italia Sp A

Yeast extract mineral salts medium (YGM)

, Corso Lodi, 23, Milan,

Difco bacto yeast extract 2,0 g

Italy;

D(+)-glucose (monohydrate) 2,5 g

4. KÜPPER

K2HPO4 0,25 g

Mitteldeutsche Samen GmbH

KH2PO4 0,25 g

; Hessenring 22;

MgSO4 . 7H2O 0,1 g

D-37269 Eschwege

MnSO4 . H2O 0,015 g

Germany.

NaCl 0,05 g

--------------------------------------------------

FeSO4 . 7H2O 0,005 g

19931004

Difco bacto purified agar 18 g

Допълнение 6

Distilled water 1 litre

СРЕДИ ЗА РАСТЕЖ И ИЗОЛИРАНЕ НА C. SEPEDONICUM

Sterilize 0,5 litre volumes of medium by autoclaving at 115 °C for 20 minutes.

Хранителен агар (ХA)

Appendix 7 NUTRITIONAL AND PHYSIOLOGICAL TESTS FOR THE IDENTIFICATION OF C. SEPEDONICUM

Хранителен агар difco bacto в дестилирана вода при концентрация, посочена от производителя. Стерилизира се чрез обработване в автоклав при 121 °С в продължение на 15 минути.

All media should be incubated at 21 °C and examinated after six days. If no growth has occurred, incubate for up to 20 days.

Хранителен агар с декстроза (ХАД)

- Oxidative and fermentative test (Hugh & Leifson), 1953) - O/F-test.

Хранителен агар difco bacto, съдържащ 1 % D(+) глюкоза (монохидрат). Стерилизира се чрез автоклав при температура 115 °С в продължение на 20 минути.

Basal medium:

Дрождов пептон-глюкозен агар (ДПГА)

KCl 0,2 g

Екстракт от дрожди difco bacto (№ 0127) | 5 г |

MgSO4 . 7H2O 0,2 g

Пептон difco bacto (№ 0118) | 5 г |

NH4H2PO4 1,0 g

D(+)-глюкоза (монохидрат) | 10 г |

Difco bacto peptone 1,0 g

Пречистен агар difco bacto (№ 0560) | 15 г |

Difco bacto purified agar 3,0 g

Дестилирана вода | 1 литър |

D(+)-glucose (monohydrate) 10,0 g

Стерилизира се 0,5 литра обеми от среда чрез автоклав при 115 °С в продължение на 20 минути.

Bromothymol blue 0,03 g

Среда с екстракт от дрожди и минерални соли (СДМ)

Distilled water 1 litre

Екстракт от дрожди bacto difco | 2,0 г |

Mix and adjust to pH 7,0 to 7,2 with 1N KOH.

D(+)-глюкоза (монохидрат) | 2,5 г |

Dispense in Pyrex culture tubes 16 mm × 100 mm (12 ml capacity) in 5 ml and 10 ml volumes.

K2HPO4 | 0,25 г |

Sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes.

KH2PO4 | 0,25 г |

Stab inoculate 5 ml and 10 ml tubes for each culture. Aseptically add 1 to 2 ml sterile liquid paraffin to the 10 ml tube. Incubate.

MgSO4 · 7H2O | 0,1 г |

MnSO4 · H2O | 0,015 г |

/* Tables: see OJ */

NaCl | 0,05 г. |

FeSO4 · 7H2O | 0,005 г |

(Kovacs, 1956)

Очистен агар bacto difco | 18 г |

Kovacs'oxidase reagent:

Дестилирана вода | 1 литър |

1 % aqueous solution of tetramethyl paraphenylenediamine dihydrochloride (BDH No 30386) in distilled water.

Стерилизира се 0,5 литра обеми от средата чрез автоклав при 115 °С в продължение на 20 минути.

This reagent should be freshly made up in 1 ml volumes or can be stored in a brown glass bottle at 5 °C for 1 to 4 weeks.

--------------------------------------------------

Place a drop of reagent on filter paper in a clean Petri dish. Immediately rub some of the test culture from nutrient agar using a platinum loop.

19931004

Positive reaction: development of purple coloration within 10 seconds. Cultures with times of 10 to 30 seconds are weakly positive.

Допълнение 7

NB: It is essential to use a platinum loop and NA cultures, since traces of iron or high sugar content in the growth medium may give false positive results.

ХРАНИТЕЛНИ И ФИЗИОЛОГИЧНИ ИЗПИТВАНИЯ ЗА ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА C. SEPEDONICUM

- Acid production from lactose, rhamnose, salicin, glycerol

Всички среди трябва да се инкубират при 21 °С и да се изследват след 6 дни. Ако няма растеж, се инкубират до 20 дни.

Prepare Hugh & Leifson's O/F medium without the glucose. Distribute into 5 ml volumes in tubes. Sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes. To the molten base at 45 °C, aseptically add 0,5 ml of filter sterilized 10 % aqueous solutions of either glycerol, lactose, rhamnose or salicin. Mix carefully.

- Окислително и ферментационно изпитване (Hugh и Leifson), 1953) - O/F проба.

Positive reaction: colour change from blue-green to yellow indicates production of acid.

Среда на култура:

- Catalase test

KCl | 0,2 г |

Place a drop of hydrogen peroxide (30 volume) onto a clean slide, and emulsify with a loopful of culture using a platinum loop.

MgSO4. 7H2O | 0,2 г |

Positive reaction: production of oxygen bubbles in the drop indicates the presence of catalase.

NH4H2PO4 | 1,0 г |

- Nitrate reductase activity and denitrification (Bradbury, 1970)

пептон bacto difco | 1,0 г |

Culture medium:

Очистен агар bacto difco | 3,0 г |

KNO3 (nitrite free) 1 g

D(+)-глюкоза (монохидрат) | 10,0 г |

Difco bacto yeast extract 1 g

Бромотимол син | 0,03 г |

K2HPO4 5 g

Дестилирана вода | 1 литър |

Distilled water 1 litre

Смесва се и се регулира рН на 7,0 до 7,2 с 1N KOH.

Dispense into 10 ml volumes in 20 ml bottles. Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

Разпределя се в пирекс епруветки за култури 16 мм х 100 мм (капацитет 12 мл) в обеми 5 мл и 10 мл.

Reagent A:

Стерилизира се чрез автоклав при 115 °С в продължение на 10 минути.

H2SO4 8g

Инокулира се всяка култура като се дълбока инжекция в 5 мл и 10 мл в епруветки. Добавя се асептично 1 до 2 мл стерилен течен парафин в епруветка от 10 мл. Инкубира се.

5N acetic acid 1 litre

Положителна реакция

Reagent B:

Епруветка | Оцветяване | Тълкуване |

naphthylamine 5 g

Затворена | Жълто | | Ферментационна |

5N acetic acid 1 litre

Отворена | Жълто | |

Inoculate the nitrate medium in duplicate. Test after 10 and 20 days, by adding one drop of Lugol's iodine, 0,5 ml reagent A and 0,5 ml reagent B. If medium does not turn reddish, add approximately 50 mg zinc powder. Observe the colour reaction.

Затворена | Жълто | | Окислителна |

Positive reaction: Colour reaction

Отворена | Синьозелено | |

Stage 1 Stage 2

Затворена | Зеленикаво | | Окислителна или инертна |

No reduction of nitrate colourless red

Отворена | Синьозелено | |

Reduction of nitrate as far as nitrite

- Изпитване за оксидаза (проба на Ковакс, 1956 г.)

(nitrate reductase only) red -

Реактив за оксидаза на Ковакс:

Reduction of nitrate beyond nitrite

1 % воден разтвор на тетраметил парафенилендиамин дихидрохлорид (BDH № 30386) в дестилирана вода.

(denitrification - nitrate and nitrite reductase) colourless colourless

Този реактив трябва да е прясно приготвен в обеми от 1 мл или може да се съхранява в кафява стъклена бутилка при 5 °С в продължение на 1 до 4 седмици.

- Urease production (Lelliott, 1966)

Капва се капка от реактива върху филтърна хартия в чиста чашка Петри. Незабавно натрийте малко от тестваната култура от хранителния агар, като се използва платинена гребалка.

Basal medium:

Положителна реакция: за 10 секунди се появява пурпурно оцветяване. Културите, при които тази реакция се появява след 10 до 30 секунди, са слабо положителни.

Oxoid urea agar base (CM53) 2,4 g

NB: Важно е да се използва платинена гребалка и култури ХA, тъй като следи от желязо или високо съдържание на захар в растежната среда могат да дадат фалшиви положителни резултати.

Distilled water 95 ml

- Произвеждане на киселина от лактоза, рамноза, салицин, глицерин.

Sterilize by autoclaving at 115 °C for 20 minutes. Cool the molten base to 50 °C and aseptically add 5 ml of filter-sterilized 40 % aqueous urea solution (Oxoid SR20). Mix well.

Приготвя се окислително-ферментационната среда на Hugh и Leifson, без глюкозата. Разпределя се на обеми от по 5 мл в епруветки. Стерилизира се чрез автоклав при 115 °С в продължение на 10 минути. Към разтопената при 45 °С основа се прибавя асептично 0,5 мл от 10 % воден разтвор на глицерин, лактоза, рамноза, или на салицин, стерилизиран през филтър. Разбърква се внимателно.

Distribute into 6 ml volumes in sterile tubes (16 × 100 mm) and allow to set as slopes with a good butt.

Положителна реакция: промяната на цвета от синьозелен в жълт е индикация за произвеждане на киселина.

Positive reaction: the yellow-orange medium develops a cherry red or magenta pink coloration if urease activity has occurred.

- Изпитване за каталаза

Utilization of citrate (Christensen) (Skerman, 1967)

Капва се капка от водороден прекис (обем 30) върху чисто предметно стъкло и се емулгира с пълна платинена гребалка от културата.

Citrate agar base (Merck 2503) 23 g

Положителна реакция: произведените кислородни мехурчета в капката показват наличие на каталаза.

Distilled water 1 litre

- Нитроредуктазна активност и денитрификация (Брадбъри, 1970)

Mix and dissolve by heating. Dispense into 6 ml volumes as for urea medium. Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes and allow to set as slopes.

Среда на култура:

Positive reaction: citrate utilization is indicated by a change in the colour of the medium from orange to red.

KNO3 (без нитрит) | 1 г |

- Hydrogen sulphide production (Ramamurthi, 1959)

Екстракт от дрожди difco bacto | 1 г |

Medium:

K2HPO4 | 5 г |

Difco bacto tryptone (No 0123) 10 g

Дестилирана вода | 1 литър |

K2HPO4 1 g

Разпределя се на обеми по 10 мл в 20 милилитрови шишенца. Стерилизира се чрез автоклав при 121 °С в продължение на 15 минути.

NaCl 5 g

Реактив А:

Distilled water 1 litre.

H2SO4 | 8 г |

Dissolve and dispense into 6 ml volumes in 16 × 100 mm tubes. Sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes.

Оцетна киселина 5N | 1 литър |

Inoculate and aseptically suspend a lead acetate paper (Merck 9511) from the lip if the tube. Hold in place with the cap. Incubate for up to 20 days.

Реактив В:

Positive reaction: H2S production from tryptone is indicated by the development of a black-brown coloration of the test paper.

Нафтиламин | 5 г |

- Indole production (Ramamurthi, 1959)

Оцетна киселина 5N | 1 литър |

Medium:

Инокулира се нитратната среда двойно. Тества се след 10 и 20 дни, чрез добавяне на една капка йод на Лугол, 0,5 мл реактив А и 0,5 мл реактив В. Ако средата не стане червеникава, се добавя приблизително 50 мг цинкова прах. Следи се цветовата реакция.

As for H2S test.

Положителна реакция | Цветова реакция |

Remove the lead acetate paper and add 1 to 2 ml of diethyl ether and shake gently. Allow the layers to separate (five minutes). Add 0,5 ml Kovacs' reagent (Merck 9293) carefully down the inside of the sloped tube.

Фаза 1 | Фаза 2 |

Positive reaction: the presence of indole is indicated by the development of a red colour in the yellow layer between the ether and aqueous fractions.

Няма редукция на нитрата | Безцветно | Червено |

- Growth ar 37 °C (Ramamurthi, 1959)

Редукция на нитрата до нитрит (само нитрат редуктаза) | Червено | - |

Medium:

Редукция на нитрата до повече от нитрит (денитрификация – нитрат и нтрит редуктаза) | Безцветно | Безцветно |

Difco bacto nutrient broth (No 0003) 8 g

- Произвеждане на уреаза (Lelliott, 1966)

Distilled water 1 litre

Среда на култура:

Mix, dissolve and distribute into 6 ml volumes in tubes.

Основа с агар с оксоид на урея (CM53) | 2,4 г |

Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

Дестилирана вода | 95 мл |

Inoculate and incubate at 37 °C.

Стерилизира се чрез автоклав при 115 °С в продължение на 20 минути. Охлажда се разтопената основа до 50 °С и се добавя асептично 5 мл от стерилизирания с филтър 40 % воден разтвор на урея (оксоид SR20). Смесва се добре.

Positive reaction: look for growth.

Разпределя се в обеми по 6 мл в стерилни епруветки (16 × 100 мм) и се оставя да се втвърди в наклонени епруветки.

- Growth in 7 % sodium chloride (Ramamurthi, 1959)

Положителна реакция: в случай на активност на уреаза, жълто-оранжевата среда развива черешово червено или пурпурно оцветяване.

Medium:

Използване на цитрат (Christensen) (Skerman, 1967)

Difco bacto nutrient broth 8g

Основа с цитратен агар (Merck 2503) | 23 г |

NaCl 70 g

Дистилирана вода | 1 литър |

Distilled water 1 litre

Разбърква се и се разтваря чрез загряване. Разпределя се в обеми по 6 мл както за среда с урея. Стерилизира се чрез автоклав при 121 °С в продължение на 15 минути и се оставя да се втвърди в наклонени епруветки.

Mix, dissolve and distribute into 6 ml volumes in tubes.

Положителна реакция: използването на цитрат се вижда от промяна в цвета на средата от оранжев в червен.

Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

- Произвеждане на сероводород (Рамамурти, 1959)

Positive reaction: look for growth.

Среда:

- Gelatin hydrolysis (Lelliott, Billing & Hayward, 1966)

Триптон difco bacto (№ 0123) | 10 г |

Medium:

K2HPO4 | 1 г |

Difco bacto gelatine (No 0143) 120 g

NaCl | 5 г |

Distilled water 1 litre

Дестилирана вода | 1 литър. |

Mix, dissolve by heating and distribute into 6 ml volumes in tubes.

Разтворя се и се разпределя в обеми по 6 мл в епруветки 16 х 100 мм. Стерилизира се чрез автоклав при 115 °С в продължение на 10 минути.

Sterilize by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.

Инокулира се и се закача асептично оловна ацетатна хартия от края на епруветката. Задържа се на място със запушалката. Инкубира се до 20 дни.

Positive reaction: liquefaction of gelating even when held at 5 °C for 30 minutes.

Положителна реакция: произвеждането на H2S от триптона се вижда от появяването на черно-кафяво оцветяване на индикаторната хартия.

- Starch hydrolysis

- Произвеждане на индол (Рамамурти, 1959)

Medium:

Среда:

Difco bacto nutrient agar (molten) 1 litre

Същата като тази за теста за H2S:

Difco bacto soluble starch (No 0178) 2 g

Отстранява се оловно ацетатната хартия и се добавя 1 до 2 мл диетилов етер, и леко се разклаща. Оставя се (пет минути) пластовете да се разделят. Добавя се внимателно 0,5 мл реактив на Ковакс (Merck 9293) във вътрешността на наклонената епруветка.

Mix, sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes.

Положителна реакция: наличието на индол се вижда от появата на червен цвят в жълтия слой между етера и водните фракции.

Pour plates. Spot inoculate the plates.

- Растеж при 37 °С (Рамамурти, 1959)

After good growth has occurred (10 to 20 days), remove part of the growth and flood with Lugol's iodine.

Среда:

Positive reaction: starch hydrolysis is indicated by clear zones under or around the bacterial growth; the remainder of the medium stains purple.

хранителен бульон difco bacto (№ 0003) | 8 г |

- Aesculin hydrolase activity (Sneath & Collins, 1974)

Дестилирана вода | 1 литър |

Medium:

Смесва се, разтваря се и се разпределя в обеми по 6 мл в епруветките.

Difco bacto peptone 10 g

Стерилизира се чрез автоклав при 121 °С в продължение на 15 минути.

Aesculin 1 g

Инокулира се и се инкубира при 37 °С.

Ferric citrate (Merck 3862) 0,05 g

Положителна реакция: следете за растеж.

Sodium citrate 1 g

- Растеж в 7 % разтвор на натриев хлорид (Рамамурти, 1959)

Distilled water 1 litre

Среда:

Mix to dissolve and distribute into 6 ml volumes in tubes. Sterilize by autoclaving at 115 °C for 10 minutes.

хранителен бульон difco bacto | 8 г |

The medium is clear but has a bluish fluorescence.

NaCl | 70 г |

Positive reaction: aesculin hydrolysis is indicated by the development of a brown colour together with a disappearance of fluorescence. This can be checked using an ultraviolet lamp.

Дестилирана вода | 1 литър |

REFERENCES

Смесва се, разтваря се и се разпределя в обеми по 6 мл в епруветки.

Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218.

Стерилизира се чрез обработване в автоклав при 121 °С в продължение на 15 минути.

Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147-152.

Положителна реакция: следи се за растеж.

Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21-23.

- Желатинова хидролиза (Лелиот, Билинг и Хейуърд, 1966)

Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-26.

Среда:

Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., No 17, 1987, pp. 1-10.

Желатин difco bacto (№ 0143) | 120 г |

Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.

Дестилирана вода | 1 литър |

Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-118.

Смесва се, разтваря се чрез нагряване и се разпределя в обеми по 6 мл в епруветки.

Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.

Стерилизира се чрез автоклав при 121 °С в продължение на 15 минути.

Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101-106.

Положителна реакция: втечняване на желатина, дори когато се държи при 5 °С в продължение на 30 минути.

Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

- Скорбялна хидролиза

Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.

Среда:

Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527.

Хранителен агар difco bacto (разтопен) | 1 литър |

Разтворима скорбяла Difco bacto (№ 0178) | 2 г |

Смесва се, стерилизира се в автоклав при 115 °С в продължение на 10 минути.

Сипва се върху пластинките. Инокулира се точково пластинките.

След настъпване на добър растеж (10 до 20 дни), се премахва част от бактериалната култура и се залива с йод на Лугол.

(1) An alternative method for extraction is given by Dinesen, 1984.

Положителна реакция: наличието на скорбялна хидролиза се вижда от ясните зони под и около бактериалната култура. Останалата част от средата е на пурпурни петна.

(2) There is evidence (Janse and Van Vaerenberg, 1987) that freezing may reduce viability of Corynebacterium sepedonicum. Suspension of the pellet in 10 % glycerol may overcome this problem.

- Ескулин хидролазна активност (Снийт и Колинс, 1974)

Среда:

Пептон difco bacto | 10 г |

ANNEX II

Ескулин | 1 г |

1. For each suspected occurrence for which a positive immunofluorescence test has been identified according to the method set out in Annex I, and confirmation or refutation by completion of the said method is awaited, there should be the retention and appropriate conservation of:

Ферицитрат (Merck 3862) | 0,05 г |

- all tubers or plants sampled, wherever possible, and

Натриев цитрат | 1 г |

- any remaining extract and additional prepared immunofluorescence slides,

Дестилирана вода | 1 литър |

until the completion of the said method.

Разбърква се, за да се разтвори и се разпределя в обеми от 6 мл в епруветки. Стерилизира се чрез автоклав при 115 °С в продължение на 10 минути.

2. In the case of positive confirmation of the organism, there should be retention and appropriate conservation of:

Средата е бистра, но има синкава флуоресценция.

- the material specified in paragraph 1, and

Положителна реакция: хидролизата на ескулин се вижда от появата на кафяв цвят, заедно с изчезване на флуоресценцията. Това може да се провери с ултравиолетова лампа.

- a sample of the infected eggplant material inoculated with the tuber or plant extract, and

СПРАВОЧНА ЛИТЕРАТУРА

- the isolated culture of the organism,

Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. (Изолиране и предварително изследване на бактерии от растения.) Rev. Pl. Path. 49, 213—218.

until at least one month after the notification procedure under Article 5 (2).

Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. (Извличане и диагноза на Corynebacterium sepedonicum от заболели картофени клубени) EPPO Bull. 14 (2), 147—152.

Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, (Определящи методи на светлинна микроскопия. В: Наръчник с методи за обща бактериология) American Society for Microbiology, Washington, 21—23.

ANNEX III

Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. (Таксономично значение на ферментационната срещу окислителната обмяна на въглехидрати чрез различни грам-отрицателни бактерии J. Bact.), 66, 24—26

1. The elements to be considered in the determination of the extent of probable contamination under Article 5 (1) (b), shall include:

Janse, J. D. and J. Van Vaerenbergh. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. (Тълкуване на метода на ЕО за откриване на латентна зараза с пръстеновидна бактериоза (Corynebacterium sepedonicum) по картофите) EPPO Bull., № 17, 1987, pp. 1—10.

- tubers or plants grown at a place of production designated as contaminated under Article 5 (1) (a),

Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. (Установяване на Pseudomonas pyocyanea чрез реакция на оксидаза) Nature, Lond., 178, 703.

- place(s) of production or premises with some production link to the tubers or plants, designated as contaminated under Article 5 (1) (a), including those sharing production equipment and facilities directly or through a common contractor,

Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. (Патогенни бактерии coryneform по растенията) J. appl. Bact., 29, 114—118.

- tubers or plants produced in the place(s) of production referred to in the previous indent, or present in such place(s) of production during the period when the tubers or plants designated as contaminated under Article 5 (1) (a) were present on the premises or places of production referred to in the first indent,

Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact. (Определяща схема за растителните патогенни псевдомонади), 29, 470—489.

- central stores handling potatoes from the above places of production,

Lelliott, R. A. and P. W., Sellar, 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks (Определяне на латентна пръстеновидно гниене(Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) в запаси от картофи) EPPO Bull., 6 (2), 101—106.

- any machinery, vehicle, vessel, store, or units thereof, and any other objects including packaging material, that may have come into contact with the tubers or plants designated as contaminated under Article 5 (1) (a), during the previous 12 months or wherever appropriate,

Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. (Сравнителни изследвания на някои грам-положителни фитопатогенни бактерии и връзката им с коринебактериите) Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

- any tubers or plants stored in, or in contact with, any of the structures or objects listed in the previous indent, prior to the cleansing and disinfection of such structures and objects, and

Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. (Ръководство за определяне на видовете бактерии) 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.

- shall include, as a result of the testing under Article 6, tubers or plants with the same clonal origin as tubers or plants designated to be contaminated under Article 5 (1) (a) and for which investigations indicate contamination is probable.

Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. (Изследване за възпроизводимост на тестове между лабораториите: доклад на работна група по псевдомоните) Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481—527.

2. The elements to be considered in the determination of the possible spread under Article 5 (1) (c) shall include:

--------------------------------------------------

- the proximity of other places of production growing potatoes or other host plants,

19931004

- the commonality of seed potato stocks.

ПРИЛОЖЕНИЕ II

3. The details of the notification referred to in the first subparagraph of Article 5 (2) shall include:

1. За всяка поява, за която има съмнения и е констатирана положителна реакцияпри имунофлуоресцентното изпитване по метода, описан в приложение I, и за която се очаква потвърждаване или опровергаване чрез прилагане на посочения метод, следва да се запазят и съхранят по подходящ начин:

- for any potato consignment or lot designated as contaminated, the certificates prescribed in Articles 7 or 8 of Directive 77/93/EEC, the passport or registration number, as appropriate,

- всички клубени или растения, от които е взета проба, ако е възможно, и

- the variety name for seed potato stocks, and where possible in all other cases,

- всеки останал екстракт или допълнително приготвени предметни стъкла за имунофлуоресцентното изпитване,

- a description of the elements of the designated contamination and zone demarcation,

до завършване на изпитването по посочения метод.

- the availability of extract, prepared immunofluorescent slides, infected eggplant material and an isolated culture of the organism from the test in which positive confirmation of the organism has been made.

2. В случай че се потвърди наличието на вредител, следва да се запази и съхрани по подходящ начин:

- материалът, посочен в параграф 1, и

ANNEX IV

- проба от заразения материал от син домат, инокулиран с екстракт от клубени или растения, и

1. The officially supervised measures referred to in Article 7 (1) for the disposal of tubers or plants designated to be contaminated under Article 5 (1) (a) shall be:

- изолираната култура на вредителя,

- use for industrial processing through direct and immediate delivery to a processing plant with appropriate waste disposal facilities for which it has been established that there is no identifiable risk of the organism spreading, and with a system of disinfection of storage areas and departing vehicles, or

най-малко до един месец след процедурата по уведомяване по член 5, параграф 2.

- other measures, provided that it has been established that there is no identifiable risk of the organism spreading; such measures to be notified to the Commission and to the other Member States.

--------------------------------------------------

2. The appropriate use or disposal of tubers or plants determined as probably contaminated under Article 5 (1) (b) and referred to in Article 7 (2), under the control of the responsible official bodies of the Member States, shall be:

19931004

- use as ware potatoes intended for consumption, packed ready for direct delivery and use without repacking, and intended for such direct delivery and use, or

ПРИЛОЖЕНИЕ III

- use as ware potatoes intended for industrial processing, and intended for direct and immediate delivery to a processing plant with appropriate waste disposal and disinfection facilities, or

1. Елементите, които следва да се вземат под внимание при определяне на степента на вероятно заразяване по член 5, параграф 1, буква б), включват:

- some other use or disposal, provided that it is established that there is no identifiable risk of the organism spreading.

- клубени или растения, отгледани на място на производство, обявено за заразно по член 5, параграф 1, буква а),

3. The appropriate methods for cleansing and disinfecting of the objects referred to in Article 7 (3) shall be those for which it has been established that there is no identifiable risk of the organism spreading and shall be employed under the supervision of the responsible official bodies of the Member States.

- място/места на производство или помещения, които са в някаква производствена връзка с клубените или растенията, обявени за заразени по член 5, параграф 1, буква а), включително места, на които се ползва общо производствено оборудване и съоръжения, директно или чрез общ доставчик,

4. The series of measures to be implemented by Member States within the demarcated zone established under Article 5 (1) (c) and referred to in Article 7 (4) shall include:

- клубени или растения, произведени на мястото/местата на производство посочени в предишното тире, или които се намират на такова/и място/места а на производство по време, когато клубените или растенията, обявени за заразени по член 5, параграф 1, буква а), са били в помещенията или на местата на производство, посочени в първото тире,

4.1. in places of production designated as contaminated under Article 5 (1) (a):

- централни складове, в които се товарят и разтоварват картофи от горепосочените места на производство,

(a) in a field designated to be contaminated under Article 5 (1) (a), either

- всички машини, транспортни средства, съдове, складове или техни части, и всякакви предмети, включително опаковъчен материал, които вероятно са били в контакт с клубените или растенията, обявени за заразени по член 5, параграф 1, буква а) през предходните 12 месеца, или на каквито и да е други места,

(i)- during at least the three growing years following the year of the designated contamination,

- всички клубени или растения, намиращи се на склад в, или са били в контакт с някой от елементите или предметите, изброени в предходното тире, преди прочистването и обеззаразяването им, и

- measures shall be taken to eliminate volunteer potato plants and other naturally found host plants of the organism, and

- включва, в резултат от извършените изпитвания по член 6, клубени или растения със същия клонален произход като клубените или растенията, обявени за заразени по член 5, параграф 1, буква а), и за които направените проучвания показват вероятно заразяване.

- no potato tubers, plants or true seeds, or other naturally found host plants of the organism, or crops for which there is an identified risk of the organism surviving or spreading, shall be planted until the field is found free from volunteer potato plants for at least two consecutive growing years,

2. Елементите, които следва да се вземат под внимание при определяне на вероятното разпространяване на заразата по член 5, параграф 1, буква в), включват:

- in the first potato cropping season following the period specified in the preceding indent, officially certified seed potatoes shall be planted for ware production only and an official survey, as detailed in Article 2 (1), shall be conducted;

- близостта на други места на производствено, където се отглеждат картофи или други гостоприемници,

- in the potato cropping season succeeding that referred to in the previous indent and following an appropriate rotation cycle, officially certified seed potatoes shall be planted for either seed or ware production and an official survey as detailed in

- общият произход на наличностите от картофи за семе.

Article 2

3. Подробностите по уведомяването, посочено в първата алинея на член 5, параграф 2, включват:

(1), shall be conducted; or

- за всяка пратка или партида картофи, обявени за заразени, сертификатите, определени в членове 7 или 8 от Директива 77/93/ЕИО, паспортът или регистрационният номер, според случая,

(ii) - during the four growing years following that of the designated contamination,

- за наличностите от картофи за семе, името на сорта, и, при възможност, във всички останали случаи,

- measures shall be taken to eliminate volunteer potato plants and other naturally found host plants of the organism, and

- описание на елементите на обявената зараза и границите на зоната,

- the field shall be laid to, and maintained either, in bare fallow or in permanent pasture with frequent close cutting or intensive grazing,

- наличието на екстракт, приготвени предметни стъкла с оглед на имунофлуоресцентното изпитване, материал от заразени сини домати и изолирана култура на вредителя от изпитването, чрез която се потвърждава наличието на вредителя.

- in the first potato cropping season following the period specified in the preceding indent, officially certified seed potatoes shall be planted for either seed or ware production and an official survey, as detailed in Article 2 (1), shall be conducted;

--------------------------------------------------

(b) in other fields:

19931004

- in the growing year following the designated contamination:

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

- either no potato tubers, plants or true seeds or other naturally found host plants of the organism shall be planted, and measures shall be taken to eliminate volunteer potato plants, as appropriate, or

1. Посочените в член 7, параграф 1 официално контролирани мерки за унищожаване на клубени или растения, обявени за заразени по член 5, параграф 1, буква а), са:

- officially certified seed potatoes may be planted for ware production only, on the condition that the responsible official bodies are satisfied that the risk of volunteer potato plants and other naturally found host plants of the organism have been eliminated,

- употреба с цел промишлено преработване чрез пряка и незабавна доставка до преработващото предприятие със съответни съоръжения за депониране на отпадъци, за които е установено, че не представляват риск от разпространяване на вредителя, и със система за обеззаразяване на складовите площи и превозните средства, напускащи предприятието, или

- for, at least the two growing years following that specified in the preceding indent, only officially certified seed potatoes shall be planted, for either seed or ware production,

- други мерки, при условие че не е установен определен риск от разпространяване на вредителя. за тези мерки трябва да се съобщават на Комисията и останалите държави-членки.

- in each of the growing years referred to in the previous indents measures shall be taken to eliminate volunteer potato plants and naturally found host plants of the organism, and an official survey as detailed in Article 2 (1), shall be conducted,

2. Подходящата употреба или унищожаване на клубените или растенията, обявени за вероятно заразени по член 5, параграф 1, буква б) и посочени в член 7, параграф 2, извършвано под контрола на отговорните официални органи, съдържа:

- where officially certified seed potatoes are planted for ware production in the growing year following the designated contamination, the growing crop shall be inspected at appropriate times and volunteer potato plants shall be tested for the organism;

- употребата има като картофи за съхранение на склад, предназначени за консумация, в пакетирани за директна доставка и употреба без повторно пакетиране, и предназначени за такава пряка доставка и употреба, или

(c) immediately following the designation of contamination under Article 5 (1) (a) and in each of the subsequent growing years up to and including the first permissible potato cropping season on the field(s) designated as contaminated, as detailed in paragraph (a), all machinery and storage facilities on the place of production and involved in potato production shall be cleansed and disinfected as appropriate and using appropriate methods, as specified in 3;

- употребата като картофи за съхранение на склад, предназначени за промишлено преработване и предназначени за незабавна доставка до преработващото предприятие, снабдено със съответни съоръжения за депониране на отпадъци и дезинфекция, или

(d) in those production systems where complete replacement of the growing medium is possible,

- някакъв друг вид употреба или унищожаване, за които е установено, че не съществува определен риск от разпространяване на вредителя.

- no tubers, plants or true seeds shall be planted unless the production unit has been subjected to officially supervised measures to eliminate the organism and remove any potato or other solanaceous material, including, at least, a complete change in growing medium and cleansing and disinfection of the production unit, and all equipment, and, subsequently has been granted approval for potato production by the responsible official bodies, and

3. Подходящите методи за почистване и дезинфекция на предметите, посочени в член 7, параграф 3, са онези, за които е установено, че не крият определен риск от разпространяване на вредителя и че се прилагат под надзора на отговорните официални органи на държавите-членки.

- potato production shall be from officially certified seed potatoes, or from mini-tubers or micro-plants derived from tested sources;

4. Сериите мерки, които държавите-членки следва да приложат в границите на зоната, установена по член 5, параграф 1, буква в) и посочена в член 7, параграф 4, включват:

4.2. within the demarcated zone, without prejudice to the measures detailed under 4.1, the Member States shall:

4.1. на места на производство, обявени за заразени по член 5, параграф 1, буква а):

(a) immediately, and for at least three growing seasons, after the designated contamination:

а) в поле, обявено за заразено по член 5, параграф 1, буква а), или

- ensure supervision by their responsible official bodies of premises growing, storing or handling potato tubers, together with premises which operate potato machinery under contract,

i) - най-малко през трите вегетационни години след годината на обявеното заразяване,

- require cleansing and disinfection of machinery and stores on such premises, as appropriate, and using appropriate methods, as specified under 3,

- вземат се мерки за унищожаване на картофените самосевки и други естествени гостоприемници на вредителя, и

- require the planting of certified seed only for all potato crops within that zone,

- картофени клубени, растения или истински семена, или други естествени гостоприемници на вредителя, или култури, при които е установен определен риск от оцеляване или разпространяване на вредителя, не могат да се засаждат, докато не се установи, че в полето няма картофени самосевки в продължение най-малко на две последователни вегетационни години,

- require the separate handling of harvested seed stocks to those of ware on all premises within the zone,

- през първия сезон на отглеждане на картофите след периода, посочен в предходния параграф, официално сертифицираните картофи за семе се засаждат само с оглед на производство на картофи за съхранение, и се извършват официални проучвания, както подробно е описано в член 2, параграф 1;

- conduct an official survey as detailed in Article 2 (1);

- през сезона на отглеждане на картофите, следващ този в предходното тире и след подходящ цикъл на сеитбооборота, официално сертифицираните семе картофи за се засаждат за производство на семе, или на картофи за съхранение на склад, и се извършват официални проучвания, както подробно е описано в член 2, параграф 1; или

(b) establish a programme, where appropriate, for the replacement of all seed potato stocks over an appropriate period of time.

ii) - през четирите вегетационни години след тази, в която е обявена заразата,

The measures implemented under 4.2, along with the registration numbers of producers, collective warehouses and dispatching centres within the demarcated zone, shall be notified annually to the other Member States and to the Commission.

- се вземат мерки за унищожаване на картофени самосевки и други естествени гостоприемници на вредителя, и

- полето се превръща в чиста угар и се поддържа като такава, или в постоянно пасище с честа ниска коситба или интензивна паша,

- през първия сезон на отглеждане на картофите след периода, посочен в предходното тире, официално сертифицираните семена за картофи се засаждат за производството на семе, или на картофи за съхранение на склад и се извършват официални наблюдения, както е описано подробно в член 2, параграф 1;

б) в други полета:

- през вегетационната година след обявеното заразяване:

- или не се засаждат картофени клубени, растения или истински семена, или естествени гостоприемници на вредителяи се вземат подходящи мерки за унищожаване на картофени самосевки, при необходимост, или

- официално сертифицираните семена за картофи могат да се засаждат само за производство на картофи за съхранение на склад, при условие че официалните отговорни органи се уверят, че е премахнат рискът, който представляват картофените самосевки и други естествени гостоприемници на вредителя,

- в продължение най-малко на две вегетационни години след тази, посочена в предходното тире, се засаждат само официално сертифицирани семена за картофи или за производство на семе, или на картофи за съхранение на склад,

- през всяка от вегетационните години, посочени в предходните тирета, се взимат мерки за унищожаване на картофени самосевки и естествени гостоприемници на вредителя и се извършват официални проучвания, както е описано подробно в член 2, параграф 1,

- когато официално сертифицирани семена за картофи се засаждат за производство на картофи за съхранение на склад през годината след тази на обявеното заразяване, растящата култура се инспектира периодично и картофените самосевки се тестват за наличие на вредителя;

в) незабавно след обявяване на заразяването по член 5, параграф 1, буква а) и през всяка последваща вегетационна година, до и включително първия разрешен сезон за отглеждане на картофи на полето (полята), обявени за заразени, както е описано подробно в буква а), всички машини и складови съоръжения на мястото на производството и участващи в производството на картофи се почистват и дезинфекцират, при необходимост, чрез прилагане на подходящи методи, както е посочено в точка 3;

г) в производствени системи, където е възможна пълна подмяна на средата за отглеждане на растенията,

- не се засаждат клубени, растения или истински семена, освен ако производствената единица не е била подложена на официално контролирани мерки за унищожаване на вредителя и премахване на всички картофи или друг съдържащ соланин материал, включително, и най-малко, пълна смяна на средата за отглеждане на растенията и почистване и дезинфекция на производствената единица, както и цялото оборудване, и ако отговорните официални органи не са дали впоследствие официално одобрение за производство на картофи, и

- картофи следва да се произвеждат от официално сертифицирани семена за картофи или от миниклубени или микрорастения получени от тествани източници;

4.2. в границите на определената зона, без да се засягат мерките, описани подробно в точка 4.1, държавите- членки:

а) незабавно и в продължение най-малко на три вегетационни сезона след обявяване на заразата:

- осигуряват контрол от страна на техните официални органи на обектите за отглеждане, съхраняване и товарене и разтоварване на картофени клубени, както и на помещенията на предприятията, които работят по договор с техника, използвана за отглеждане на картофи,

- изискват, когато е необходимо, почистване и дезинфекция на машините и складовете на тези обекти, като прилагат подходящи методи, посочени в точка 3,

- изискват засаждане само на сертифицирани семена за всички картофени култури на територията на тази зона,

- изискват семенните запаси от прибраната реколта да се обработват отделно от онези за продоволствие по територията на цялата зона,

- провеждат официални проучвания, както е описано подробно в член 2, параграф 1;

б) при необходимост, разработват програма за подмяна на всички наличности от картофи за семе за подходящ период от време.

Комисията и останалите държави-членки следва да бъдат информирани всяка година за мерките, прилагани по точка 4.2, заедно с регистрационните номера на производителите, общите складове и центрове за експедиция на територията на определената зона.

--------------------------------------------------