o izvajanju Direktive Sveta 2006/88/ES glede ukrepov za nadzor povečanega pogina ostrig vrste Crassostrea gigas v povezavi z odkrivanjem ostreidnega herpesvirusa 1 μvar (OsHV-1 μvar)

ob upoštevanju Direktive Sveta 2006/88/ES z dne 24. oktobra 2006 o zahtevah za zdravstveno varstvo živali in proizvodov iz ribogojstva ter o preprečevanju in nadzoru nekaterih bolezni pri vodnih živalih (1) ter zlasti člena 41(3) in člena 61(3) Direktive,

V tej uredbi OsHV-1 μvar pomeni genotip virusa ostreidnega herpesvirusa-1 (OsHV-1), ki je določen na podlagi delnega zaporedja podatkov, ki kaže sistematični izbris 12 baznih parov v odprtem bralnem okviru ORF 4 genoma v primerjavi z OsHV-1 (GenBank # AY509253).

1. Ko se odkrije povečani pogin pri ostrigah vrste Crassostrea gigas („ostrige Crassostrea gigas“), pristojni organ opravi:

2. Ko rezultati preskušanja iz odstavka 1(b) pokažejo navzočnost OsHV-1 μvar, pristojni organ vzpostavi zaprti sistem. Ta zaprti sistem se opredeli na podlagi analize vsakega primera posebej ob upoštevanju dejavnikov, ki vplivajo na nevarnost širjenja bolezni iz dela C Priloge I.

3. Države članice takoj obvestijo Komisijo in druge države članice o prvem zaprtem sistemu, vzpostavljenem na njihovem ozemlju leta 2010.

Zahteve za dajanje na trg ostrig Crassostrea gigas iz zaprtega sistema iz člena 2

1. Ostrige Crassostrea gigas, ki izvirajo iz zaprtega sistema, ki je bil vzpostavljen v skladu s členom 2(2), se ne smejo premikati z navedenega območja.

2. Z odstopanjem od odstavka 1 se pošiljke ostrig Crassostrea gigas smejo premikati iz zaprtega sistema, kadar:

3. Pošiljkam iz odstavka 2(a) in (b), ki so namenjene za območja gojenja ali za ponovno nasaditev, je treba priložiti veterinarsko spričevalo, izpolnjeno po vzorcu iz Priloge II k tej uredbi in pojasnjevalnih opombah iz Priloge V k Uredbi (ES) št. 1251/2008.

Pristojni organ lahko odpravi nadzorne ukrepe pri zaprtih sistemih, vzpostavljenih v skladu s členom 2(2), in omejitve pri dajanju na trg iz člena 3, potem ko je opravil dva zaporedna pregleda s 15-dnevnim presledkom, ki kažeta, da je povečani pogin prenehal.

Zahteve za dajanje na trg ostrig Crassostrea gigas iz kompartmenta, v katerem so se prej izvajali nadzorni ukrepi zaradi povečanega pogina ostrig Crassostrea gigas v zvezi z OsHV-1 μvar

1. Ostrige Crassostrea gigas, ki se dajejo na trg in izvirajo iz kompartmenta, v katerem so se prej izvajali zadrževalni ukrepi leta 2009 ali leta 2010 zaradi povečanega pogina ostrig Crassostrea gigas v zvezi z OsHV-1 μvar:

2. Program za zgodnje odkrivanje OsHV-1 μvar iz odstavka 1(a)(i) izpolnjuje naslednje zahteve:

3. Odstavek 1 se uporablja en teden po dnevu srečanja Stalnega odbora za prehranjevalno verigo in zdravje živali, na katerem je bil priglašen program iz odstavka 1(a)(i).

2. Informacije iz odstavka 1 se posodabljajo in so dostopne na informacijskih spletnih straneh, vzpostavljenih v skladu s členom 10 Odločbe 2009/177/ES.

Najpozneje do 1. oktobra 2010 države članice predložijo Komisiji poročilo o programih, priglašenih v skladu s členom 5(2).

Poročilo je v skladu z vzorčnim obrazcem iz Priloge VI k Odločbi 2009/177/ES.

PRILOGA I

DEL A

Vzorčenje

1. Vzorčenje za namene člena 2

Vzorci iz člena 2 sestojijo iz najmanj 12 osebkov ostrig Crassotrea gigas. Pri izboru navedenih živali je treba vzorčiti slabotne, zevajoče ali pred kratkim poginule (nerazpadle) osebke, nabrane v kompartmentu, v katerem je bil opažen pogin.

2. Vzorčenje za namene člena 3(2)(b) ter člena 5(1)(b) in 5(2)

(a)

Vzorčenje iz člena 3(2)(b) sestoji:

(i)	pri ličinkah: iz petih zbirov na pošiljko po najmanj 50 mg celih živali, nabranih med 4 in 8 dnevi po oploditvi, vključno z lupino;

(ii)	pri mladicah, manjših od 6 mm: iz 30 zbirov na pošiljko po 300 mg celih živali, vključno z lupino;

(iii)

pri ostrigah, večjih od 6 mm: iz 150 osebkov na pošiljko.

Pri izboru navedenih živali je treba v vzorcu sorazmerno upoštevati vse dele pošiljke. Če so navzoče slabotne, zevajoče ali pred kratkim poginule (nerazpadle) živali, se najprej izberejo take živali.

(b)

Vzorčenje iz člena 5(2) sestoji iz najmanj 150 osebkov ostrige Crassotrea gigas na točko odvzema vzorcev. Vzorčijo se vse ribogojnice ali območja gojenja mehkužcev v državah članicah ali kompartmentih, ki jih zajema program.

Vzorčenje iz člena 5(1)(b) sestoji iz najmanj 150 osebkov ostrige Crassotrea gigas na kompartment.

Pri izboru navedenih živali je treba upoštevati naslednja merila:

—	če so navzoče slabotne, zevajoče ali pred kratkim poginule (nerazpadle) živali, se najprej izberejo take živali. Če takih živali ni, izbrane živali vključujejo zdrave mehkužce, mlajše od 12 mesecev;

—	pri vzorčenju v ribogojnicah, v katerih se za proizvodnjo uporablja več kot en vodni vir, je treba živali, ki predstavljajo vse vodne vire, vključiti za vzorčenje tako, da so vsi deli ribogojnice sorazmerno upoštevani v vzorcu;

—

pri vzorčenju na območjih gojenja mehkužcev je treba živali iz zadostnega števila (najmanj treh) točk odvzema vključiti v vzorec tako, da so vsi deli območja gojenja mehkužcev sorazmerno upoštevani v vzorcu, vključno z naravnimi školjčišči na območju gojenja mehkužcev. Glavni dejavniki, ki jih je treba upoštevati za izbor teh točk odvzema, so: predhodno odkritje OsHV-1 μvar na območju, gostota živali, vodni tokovi, batimetrija in upravljavskih praks.

(c)

Vzorčenje iz člena 5(2) je treba opravi v obdobju leta, za katerega je znano, da je razširjenost OsHV-1 μvar v državi članici ali kompartmentu največja. Ko tak podatek ni na voljo, se vzorčenje opravi tik po obdobju, ko temperatura vode preseže 16 °C, ali v obdobju leta, ko temperatura običajno doseže letni višek.

(d)	Vzorčenje iz člena 5(1)(b) se najraje opravi v obdobju leta iz točke (c). Če se vzorci nabirajo zunaj navedenega obdobja leta, je treba vzorčene ostrige pred preskušanjem vzdrževati pod pogoji, enakovrednim pogojem iz točke (c), in sicer za čas, ki je primeren za odkritje OsHV-1 μ var.

DEL B

Diagnostične metode za odkrivanje OsHV-1 μ var

1. Področje uporabe

Ta postopek razlaga standardno diagnostično metodo, ki se uporablja za odkrivanje OsHV-1 μ var in identifikacijo z verižno reakcijo s polimerazo (v nadaljnjem besedilu: PCR). Metoda omogoča razločevanje OsHV-1 od OsHV-1 μ var.

Po potrebi lahko laboratoriji spremenijo metode iz te priloge za optimizacijo pogojev za reakcijo ter prilagajanje laboratorijski opremi in razmeram, če je mogoče dokazati enako občutljivost in specifičnost.

2. Opredelitev pojmov

OsHV-1 μ var je opredeljen v členu 1 te uredbe.

3. Oprema in razmere okolja

Diagnostični preskus, ki se uporablja za odkrivanje OsHV-1 μ var in identifikacijo s PCR, zahteva, da so oprema in razmere okolja, ki se klasično uporabljajo za teste PCR, naslednje:

—	zaprt pokrov, opremljen s sistemom za UV sevanje za preprečitev morebitne kontaminacije pri pripravi mešanice za PCR,

—	dve popolni seriji pipet (2 μl; 20 μl; 200 μl in 1 000 μl), prva za ekstrakcijo DNK, druga za pripravo mešanice za PCR,

—	tri različne pipete: ena pipeta (2 μl) za pipetiranje vzorcev v mešanico za PCR, ena pipeta (20 μl) za vzorčenje EB in druga pipeta (20 μl) za nanašanje produktov PCR v agarozne gele,

—	pipetne konice s filtrom (2 μl; 20 μl; 200 μl in 1 000 μl) za ekstrakcijo DNK, pripravo mešanice za PCR in pipetiranje vzorcev,

—	pipetne konice (20 μl) za zbiranje EB in nanašanje pomnoževalnih produktov v agarozni gel,

—	ciklični termostat za izvajanje pomnoževanja,

—	vodoravni elektroforezni sistem za elektroforezo produktov PCR,

—	UV transiluminator za opazovanje produktov PCR po agarozni gelski elektroforezi,

—	sistem za slikanje gelov.

Izvajalec mora nositi zaščitno haljo in rokavice pri vseh različnih korakih, ki so opisani v nadaljevanju. Po možnosti je treba zamenjati zaščitno haljo in rokavice po vsakem večjem koraku: ekstrakciji DNK, pripravi mešanice za PCR, pipetiranju vzorcev, pomnoževanju in nanašanju v gel.

Priporoča se, da se ti različni koraki opravijo v različnih prostorih. Natančneje, pomnoževanje in nanašanje v gel/elektroforeza morata potekati v prostoru, ki je ločen od ekstrakcije DNK, priprave mešanice za PCR in dodajanja DNK.

4. Postopek

4.1 Priprava vzorca

Žive ali pred kratkim poginule (nerazpadle) ostrige, ki jih je mogoče prej zamrzniti, se pripravijo za ekstrakcijo DNK.

Vzorci se glede na velikost pripravijo različno:

(a)	za ličinke: se zbiri po 50 mg celih živali (vključno z lupino), ki se jim doda 200 μl destilirane vode, strejo in 1 minuto centrifugirajo pri 1 000 g;

(b)	za mladice, manjše od 6 mm: se zbiri po 300 mg celih živali (vključno z lupino), ki se jim doda 1 200 μl destilirane vode, strejo in 1 minuto centrifugirajo pri 1 000 g;

(c)	za mladice, velike med 6 in 15 mm: se vsa mehka tkiva vsake živali strejo posamezno;

(d)	za živali, večje od 15 mm: se izolirajo deli škrg in plašča.

Ekstrakcija DNK se opravi z uporabo QIAamp® DNA Mini Kita (QIAGEN) in upoštevanjem navodil iz postopka za preskušanje tkiva.

Nadaljnja priprava vzorca poteka v naslednjem vrstem redu:

1.	Položimo 100 μl supernatanta za vzorce iz točk (a) in (b) ali 10 do 50 mg tkiv za vzorce iz točk (c) in (d) v 1,5-mililitrsko epruvetko za mikrocentrifugiranje ter dodamo 180 μl pufra ATL.

2.	Dodamo 20 μl proteinaze K, zmešamo z vrtinčenjem in inkubiramo pri 56 °C, dokler tkivo ni popolnoma lizirano (čez noč). Občasno vrtinčimo med inkubacijo, da se vzorec razprši. Na kratko centrifugiramo 1,5-mililitrsko epruvetko za mikrocentrifugiranje, da odstranimo kapljice s pokrovčka.

3.	Vzorcu dodamo 200 μl pufra AL, mešamo 15 sekund s pulznim vrtinčenjem in 10 minut inkubiramo pri 70 °C. Na kratko centrifugiramo 1,5-mililitrsko epruvetko za mikrocentrifugiranje, da odstranimo kapljice s pokrovčka.

4.	Vzorcu dodamo 200 μl etanola (96–100 %) in mešamo 15 sekund s pulznim vrtinčenjem. Na kratko centrifugiramo 1,5-mililitrsko epruvetko za mikrocentrifugiranje, da odstranimo kapljice s pokrovčka.

Previdno prelijemo mešanico iz koraka 4 v kolono QIAamp Spin Column (v 2-mililitrsko zbiralno epruvetko), ne da bi zmočili rob. Zapremo pokrovček in centrifugiramo 1 minuto pri 10 000 obratih na minuto. Položimo kolono QIAamp Spin Column v čisto 2-mililitrsko zbiralno epruvetko (priloženo v kitu) in zavržemo epruvetko, ki vsebuje filtrat.

Previdno odpremo kolono QIAamp Spin Column in dodamo 500 μl pufra AW1, ne da bi zmočili rob. Zapremo pokrovček in centrifugiramo 1 minuto pri 10 000 obratih na minuto. Položimo kolono QIAamp Spin Column v čisto 2-mililitrsko zbiralno epruvetko (priloženo v kitu) in zavržemo zbiralno epruvetko, ki vsebuje filtrat.

7.	Previdno odpremo kolono QIAamp Spin Column in dodamo 500 μl pufra AW2, ne da bi zmočili rob. Zapremo pokrovček in centrifugiramo 3 minute pri polni hitrosti (14 000 obratov na minuto).

8.	(Neobvezno) položimo kolono QIAamp Spin Column v novo 2-mililitrsko zbiralno epruvetko (ki ni priložena v kitu) in zavržemo zbiralno epruvetko, ki vsebuje filtrat. Centrifugiramo 1 minuto pri polni hitrosti (14 000 obratov na minuto).

Položimo kolono QIAamp Spin Column v čisto 1,5-mililitrsko epruvetko za mikrocentrifugiranje (ki ni priložena v kitu) in zavržemo zbiralno epruvetko, ki vsebuje filtrat. Previdno odpremo kolono QIAamp Spin Column in dodamo 100 μl destilirane vode. Inkubiramo 5 minut na sobni temperaturi in centrifugiramo 1 minuto pri 10 000 obratih na minuto.

10.	Pregledamo kakovost in učinkovitost ekstrakcije (na primer z merjenjem vsebnosti raztopljenega kisika (260 nm) pod spektrofotometrom ali po agarozni gelski elektroforezi).

11.	Pripravimo razredčino vzorcev, da je končna koncentracija DNK 50–100 ng/μl.

12.	Raztopine DNK se hranijo pri 4 °C do opravljene analize PCR.

Za ekstrakcijo DNK se lahko uporabljajo drugi komercialni kiti, če je dokazano, da dajo podobne rezultate.

4.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR)

4.2.1 Reagenti

—	10 X pufer (priložen s Taq DNA polimerazo)

—	MgCl2 (priložen z DNA polimerazo) (25 mM)

—	Taq DNA polimeraza (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl

—	dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20 mM), pred uporabo je treba 10-kratno razredčiti (pri 2 mM)

—	d H2O (destilirana H2O brez DNK in RNK)

4.2.2 Temeljni premazi

Uporabiti je treba naslednje temeljne premaze (1):

CF (10 μM),

CR (10 μM).

4.2.3 Mešanica za PCR

Mešanica za PCR za vsako epruvetko je:

	Prostornina epruvete	Končna koncentracija
pufer (10 X)	5 μl	1X
MgCl2 (25 mM)	5 μl	2,5 mM
dNTP (2 mM)	5 μl	0,2 mM
CF (10 μM)	1 μl	0,2 μM
CR (10 μM)	1 μl	0,2 μM
Taq polimeraza (5 U/μl)	0,5 μl	2,5 U
dH2O	31,5 μl

—	49 μl te mešanice za PCR se da v vsako epruvetko za PCR,

—	1 μl ekstrahirane DNK (50–100 ng/μl) se doda v vsako epruvetko.

4.2.4 Kontrole

Uporabljata se dve vrsti kontrole:

—	negativne kontrole sestojijo iz dH2O (1 μl na 49 μl mešanice za PCR). Namenjene so odkrivanju morebitne reaktivne kontaminacije ali delovnega okolja. Po eno negativno kontrolo je treba vključiti vsakih 10 vzorcev ali po vsaki seriji vzorcev,

—	pozitivne kontrole sestojijo iz plazmidne DNK, ki vsebuje ciljno regijo CF-CR genoma OsHV-1. Namenjene so preverjanju učinkovitosti reakcije PCR. Po eno pozitivno kontrolo je treba vključiti v vsako analizo PCR. Pozitivne kontrole je mogoče dobiti pri referenčnem laboratoriju Skupnosti.

4.2.5. Pomnoževanje

Cikli pomnoževanja potekajo v cikličnem termostatu:

—	začetna denaturacija: 2 minuti pri 94 °C,

—	pomnoževanje: 35 ciklov (1 minuto pri 94 °C, 1 minuto pri 50 °C in 1 minuto pri 72 °C),

—	končno podaljševanje: 5 minut pri 72 °C.

4.3 Elektroforeza

4.3.1 Reagenti

—

50 X TAE (lahko se kupi že pripravljen za uporabo):

—	Tris base (40 mM) 242 g,

—	ledena ocetna kislina (40 mM) 57,1 ml,

—	Na2EDTA.2H2O (1 mM) 18,61 g,

—	dH2O za 1 liter.

—	Popravimo na pH 8.

—	Agarozni gel 2,5 % v 1X TAE: etidijev bromid (0,5 μg/ml), ki se doda po ohladitvi gela.

—

Modro barvilo za nanašanje:

—	bromfenol modro 0,25 %,

—	ksilen cianol FF 0,25 %,

—	saharoza 40 %.

—	Hranimo pri 4 °C.

—	Uporabimo 6 krat razredčeno (2 μl modrega puferja za nanašanje na 10 μl produktov PCR).

—	Označevalec molekularne mase: SmartLadder SF (Eurogentec): označevalec molekularne mase, ki je že pripravljen za uporabo in vključuje 9 enakomerno razporejenih prog od 100 do 1 000 bp.

4.3.2 Priprava agaroznega gela

1.	Stehtamo 2,5 g agaroze, dodamo 100 ml 1X TAE in grejemo, dokler se mešanica ne stopi.

2.	Po ohladitvi raztopine dodamo etidijev bromid (5 μl za 100 ml agaroznega gela) in prelijemo raztopino v posebni kalup, opremljen z glavnički (za oblikovanje vdolbin).

3.	Ko se gel polimerizira, se glavnički odstranijo in postavijo v vodoraven elektroforezni sistem, ki vsebuje dovolj 1X TAE za prekritje agaroznega gela.

4.	10 μl produktov PCR zmešamo z 2 μl modrega barvila (6X) in prelijemo v vdolbine.

5.	Ena vdolbina je namenjena označevalcu molekularne mase (5 μl).

6.	Držimo pod napetostjo 50 do 150 voltov od 30 minut do 1 ure, odvisno od velikosti in gostote gela.

7.	Opazujemo gel pod UV.

4.4 Interpretacija

Navzočnost OsHV-1 μvar v vzorcu se pokaže s pojavom proge ustrezne velikosti (157 bp namesto 173 bp za OsHV-1) na 2,5-odstotnem agaroznem gelu ob vseh negativnih kontrolah, ki so negativne, in vseh pozitivnih kotrolah, ki so pozitivne.

DEL C

Opredelitev zaprtega sistema

Pri opredelitvi zaprtega sistema v skladu s členom 2(2) je treba upoštevati naslednje dejavnike, ki vplivajo na nevarnost širjenja bolezni:

(a)	število, stopnja in porazdelitev mehkužcev v okuženi ribogojnici ali na območju gojenja mehkužcev;

(b)	razdalja in gostota sosednjih ribogojnic ali območij gojenja mehkužcev;

(c)	bližina obratov za predelavo, ribogojnice ali območja gojenja mehkužcev v stiku;

(d)	vrste, ki so navzoče v ribogojnici ali na območju gojenja mehkužcev;

(e)	načini gojenja, ki se uporabljajo pri prizadetih in sosednjih ribogojnicah ali območjih gojenja mehkužcev, ter

(f)	hidrodinamične razmere in drugi ugotovljeni dejavniki epizootiološkega pomena.

(1) Te temeljne premaze ali njihove opise je mogoče dobiti pri referenčnem laboratoriju Skupnosti za bolezni mehkužcev (LGP-Ifremer, av de Mus de Loup, 17390 La Tremblade, Francija).