Direttiva tal-Kummissjoni 2006/63/KE ta’ l- 14 ta’ lulju 2006 li temenda lill-Annessi II sa VII tad-Direttiva tal-Kunsill 98/57/KE dwar il-kontroll ta’ Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Official Journal L 206 , 27/07/2006 P. 0036 - 0106

Direttiva tal-Kummissjoni 2006/63/KE

ta’ l- 14 ta’ lulju 2006

li temenda lill-Annessi II sa VII tad-Direttiva tal-Kunsill 98/57/KE dwar il-kontroll ta’ Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ

Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea,

Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 98/57/KE ta’ l- 20 ta’ Lulju 1998 [1] dwar il-kontroll ta’ Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., partikolarment Artikolu 11 tagħha,

Billi:

(1) Wieħed mill-organiżmi li huma ta’ periklu għall-patata u t-tadam huwa Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., il-kawża patoġenika tal-marda tat-taħsir kannella fil-patata u tad-dbiel batterjoloġiku fil-patata u fit-tadam ("l-organiżmu");

(2) L-organiżmu għadu jinstab f’ċerti partijiet tal-Komunità;

(3) Id-Direttiva 98/57/KE stipolat miżuri dettaljati li għandhom jittieħdu fl-Istati Membri kontra l-organiżmu sabiex jiġi lokalizzat u tinstab id-distibuzzjoni tiegħu ssir prevenzjoni ta’ l-okkorrenza u t-tixrid tiegħu; u jekk dan jinstab, issir prevenzjoni tat-tixrid u jsir kontroll bil-għan ta’ l-eradikazzjoni tiegħu;

(4) Minn dak iż-żmien, kien hemm bosta żviluppi sinjifikattivi fil-konoxxenza tal-bijoloġija, fl-iskoperta u l-identifikazzjoni ta’ l-organiżmu; aktar minn hekk esperjenzi prattiċi miksuba mill-kontroll ta’ l-organiżmu jitolbu reviżjoni ta’ bosta dispożizzjonijiet tekniċi relatati mal-miżuri ta’ kontroll;

(5) Riżultat ta’ tali żvilupp, tinħass il-ħtieġa ta’ reviżjoni u aġġornar tal-miżuri inklużi f’ċerti Annessi tad-Direttiva 98/57/KE;

(6) Rigward proċeduri ta’ għarfien u identifikazzjoni, il-metodu ta’ ibridizzazzjoni florexxenti in-situ (FISH), metodu ta’ għarfien modern, huwa inkorporat. Titjib fil-metodu ta’ identifikazzjoni permezz ta’ aggregazzjoni ma’ l-enzimi polimeraże (PCR), kif ukoll titjib ta’ varji elementi tekniċi tal-proċeduri ta’ identifikazzjoni u għarfien, u metodi ta’ għarfien u identifikazzjoni ta’ organiżmi fi pjanti ta’ provenjenza ħlief il-patata, u fl-ilma u ħamrija, ġew inklużi wkoll;

(7) Fir-rigward ta’ l-elementi tekniċi tal-miżuri ta’ kontroll, saru dispożizzjonijiet aħjar għall-: mod ta’ konservazzjoni ta’ kampjuni eżaminati sabiex ikun aċċertat li wieħed jista’ jmur lura għall-organiżmu provenjenti, elementi meħtieġa sabiex wieħed jasal għall-istat ta’ kontaminazzjoni, dettalji tan-notifijkazzjoni tal-preżenza kkonfermata ta’ l-organiżmu u tal-firxa kkontaminata, miżuri implimentati f’postijiet ta’ produzzjoni mmarkati kkontaminati u li jaqgħu taħt medda ta’ territorji mmarkati. Kif ukoll, ċertu dispożizzjonijiet għat-tadam ġew imfassla sabiex jittieħdu aktar in konsiderazzjoni r-relevanza ta’ din il-pjanta bħala l-mezz ta’ għejxien għall-organiżmu;

(8) Il-miżuri pprovduti f’din id-Deċiżjoni huma konformi ma’ l-oppinjoni tal-Kumitat Permanenti fuq is-Saħħa tal-Pjanta.

ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA:

Artikolu 1

Anness II sa VII tad-Direttiva 98/57/KE huma minn issa sostitwiti bit-test korrispondenti f’Anness ta’ din id-Direttiva.

Artikolu 2

1. L-Istati Membri għandhom jadottaw u jippubblikaw, sal- 31 ta’ Marzu 2007 l-iktar, il-liġijiet, ir-regolamenti, u d-dispożizzjonijiet amministrattivi neċessarji sabiex jiġu f’konformità ma’ din id-Direttiva. Huma għandhom, mingħajr ebda telf ta’ żmien, jikkomunikaw lill-Kummissjoni t-test ta’ dawk id-dispożizzjonijiet u tabella li turi l-korrelazzjoni ta’ bejn dawk id-dispożizzjonijiet u din id-Direttiva.

Huma għandhom japplikaw tali dispożizzjonijiet mill- 1 ta’ April 2007.

Meta Stati Membri jadottaw dawn id-dispożizzjonijiet, huma għandhom jinkludu referenza għal din id-Direttiva jew ikun hemm akkompanjament bit-tali referenza fl-okkażjoni tal-pubblikazjoni uffiċjali tagħhom. L-Istati Membri għandhom jistabbilixxu kif għandha ssir referenza bħal din.

2. Stati Membri għandhom jikkomunikaw mill-ewwel lill-Kummissjoni t-test tad-dispożizzjonijiet ewlenin tal-liġi nazzjonali li huma jaddottaw fil-qasam kopert b’din id-Direttiva.

Artikolu 3

Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fit-tielet jum wara l-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea.

Artikolu 4

Din id-Direttiva hija ndirizzata lill-Istati Membri.

Magħmula fi Brussell, nhar l- 14 ta’ Lulju 2006.

Għall-Kummissjoni

Markos Kyprianou

Membru tal-Kummissjoni

[1] ĠU L 235, tat-21.8.1998, p. 1.

--------------------------------------------------

ANNESS

ANNESS II

SKEMA TA’ TESTIJIET GĦAD-DIJANJOSI U IDENTIFIKAZZJONI TA’ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

SKOP TA’ L-ISKEMA TA’ TESTIJIET

L-iskema ppreżentata tfassal il-proċeduri varjati involuti għall-:

(i) Dijanjosi tat-taħsir kannella fil-patata u dbiel batterjoloġiku fit-tuberi tal-patata, fit-tadam u ċerti pjanti ta’ provenjenza oħra;

(ii) Għarfien ta’ Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi tal-patata, patata, tadam u pjanti ospitanti oħrajn fl-ilma u fil-ħamrija;

(iii) Identifikazzjoni ta’ Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

WERREJ

| | Paġna |

| Prinċipji Ġenerali | 40 |

TAQSIMA I | Applikar ta’ l-iskema ta’ testijiet | 40 |

| 1. | Skema ta’ għarfien għad-dijanjosi tat-taħsir kannella u dbiel batterjoloġiku (R. solanacearum) fit-tuberi tal-patata, tadam jew pjanti oħra ta’ provenjenza li għandhom sintomi ta’ taħsir kannella jew dbiel batterjoloġiku | 40 |

| 2. | Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata li ma jurux sintomi | 43 |

| 3. | Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, pjanti tat-tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li ma jurux sintomi | 46 |

TAQSIMA II | Metodi fil-fond għall-għarfien ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li jippreżentaw is-sintomi kollha ta’ taħsir kannella u dbiel batterjoloġiku | 48 |

| 1. | Sintomi | 48 |

| 2. | Testijiet ta’ eżaminazzjoni qosra | 48 |

| 3. | Proċeduri ta’ iżolazzjoni | 49 |

| 4. | Testijiet ta’ identifikazzjoni għal R. solanacearum | 49 |

TAQSIMA III | 1. | Metodi dettaljati għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata li ma jurux sintomi | 49 |

| | 1.1. | Preparazzjoni tal-kampjun | 49 |

| | 1.2. | Testijiet | 51 |

| 2. | Metodi dettaljati għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li ma jurux sintomi | 51 |

| | 2.1. | Preparazzjoni tal-kampjun | 51 |

| | 2.2. | Testijiet | 52 |

TAQSIMA IV | 1. | Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fl-ilma | 53 |

| 2. | Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fl-ilma | 55 |

| | 2.1. | Preparazzjoni tal-kampjun | 55 |

| | 2.2. | Testijiet | 55 |

TAQSIMA V | 1. | Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fil-ħamrija | 56 |

| 2. | Skema għall-għarfien u identiofikazzjoni ta’ R. solanacearum fil-ħamrija | 58 |

| | 2.1. | Preparazzjoni tal-kampjuni | 58 |

| | 2.2. | Testijiet | 58 |

TAQSIMA VI: | Protokoll ottimizzat għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum | 58 |

| A) | Testijiet ta’ dijanjosi u għarfien | 58 |

| | 1. | testijiet ta’ separar u analiż taz-zkuk | 58 |

| | 2. | Tfittxija ta’ qmuħ zgħar ta’ poly-β-hydroxybutyrate | 58 |

| | 3. | Testijiet ta’ tagħqid seroloġiku (Agglutination) | 59 |

| | 4. | Iżolazzjoni selettiva | 60 |

| | | 4.1. | Pjastra selettiva | 60 |

| | | 4.2. | Proċedura ta’ trobbija f’ambjent favorevoli | 60 |

| | 5. | Test ta’ l-immunofluworexxenza (Test IF) | 61 |

| | 6. | Test tal-Polymerase chain reaction (Test PCR) | 64 |

| | | 6.1. | Metodi ta’ purifikazzjoni tad-DNA | 65 |

| | | | (a) | Metodi skond Pastrik (2000) | 65 |

| | | | (b) | Metodi oħra | 65 |

| | | 6.2. | PCR | 66 |

| | | 6.3. | Analiżi tal-prodott PCR | 66 |

| | 7. | Test ta' l-ibridizzazzjoni fluwore67enti in situ (Test FISH) | 67 |

| | 8. | Assay li huwa enzyme linked immuno sorbent (Tests ELISA) | 69 |

| | | (a) | Indirett ELISA | 69 |

| | | (b) | DASI ELISA (Double Antibody Sandwich Indirect) | 70 |

| | 9. | Test Bioassay | 71 |

| B) | Testijiet ta’ identifikazzjoni | 72 |

| | 1. | Testijiet ta’ nutriment u identifikazzjoni permezz ta’ enzimi | 72 |

| | 2. | Test IF | 72 |

| | 3. | Test ELISA | 73 |

| | 4. | Test PCR | 73 |

| | 5. | Test FISH | 73 |

| | 6. | Identifikazzjoni skond it-tip ta’ aċidi grassi (FAP) | 73 |

| | 7. | Metodi ta’ karatterizzazzjoni tal-varjetà | 73 |

| | | 7.1. | Determinazzjoni Biovar | 73 |

| | | 7.2. | Teħid tal-marki tas-swaba Genomic | 74 |

| | | 7.3. | Metodi PCR | 74 |

| C) | Test ta’ Konferma | 74 |

| | Appendiċi 3 | (A) | Materjal ta’ kontroll standardizzat kummerċjalment disponibbli | 79 |

| | | (B) | Prepazzjoni ta’ kontrolli | 80 |

| | Referenzi | | 94 |

PRINĊIPJI ĠENERALI

Protokolli ottimizzati għall-metodi kollha, sustanzi reaġġenti validati u dettalji għall-preparazzjoni tat-test u materjali li jservu ta’ kontroll jew tqabbil huma mfassla fl-Appendiċi. Lista tal-laboratorji li ġew inklużi fl-ottimizzazzjoni u validazzjoni tal-protokolli huma pprovduti f’Appendiċi 1.

La l-protokolli ser jinvolvu għarfien ta’ organiżmu fi kwarantena u ser jinkludu użu ta’ gruppi mrobbijja vijabilment ta’ R. solanacearum bħala materjal ta’ tqabbil, ser ikun hemm bżonn li jsiru ċerti proċeduri taħt kundizzjonijiet ta’ kwarantena siewja bi faċilitajiet adegwati ta’ skart u taħt kundizzjonijiet ta’ liċenzji approprjat kif imħarrġa mill-awtoritajiet uffiċjali tal-kwarantina tal-pjanti.

Parametri ta’ testijiet iridu jiżguraw livelli ta’ għarfien ta’ R. solanacearum li jkunu ripproduċibbli u konsistenti sal-limiti ta’ tali metodi magħżula.

Preparazzjoni ta’ kontrolli pożittivi preċiżi hija ta’ importanza primarja.

Testjar skond il-limiti meħtieġa tinkludi wkoll issettjar korrett, manutenzjoni u kalibrar tat-tagħmir, użu u preżervazzjoni bil-prudenza ta’ sustanzi reaġġenti u kull miżuri meħtieġa sabiex jiġu evitati kontaminazzjonijiet bejn kampjuni, eż. Separar ta’ kontrolli pożittivi minn kampjuni li qegħdin jiġu ttestjati. Miżuri ta’ kontroll fuq kwalità jridu jiġu implimentati sabiex jiġu evitati żbalji amministrattivi u żbalji oħra speċjalment fl-immarkar u dokumentazzjoni.

Okkorrenza sospetta kif imfassla f’Artikolu 4 (2) fid-Direttiva 98/57/KE tirriżulta riżulatat pożittiv fit-testijiet ta’ dijanjosi jew skrining fuq kampjun kif speċifikat fl-illustrazzjoni hawn isfel. Test ta’ skrining li jirriżulta pożittiv l-ewwel darba (test IF, PCR/FISH, iżolazzjoni selettiva) jrid jiġi kkonfermat permezz tat-tieni test ta’ skrining li huwa bbażat fuq prinċipju ieħor bijoloġiku.

Jekk l-ewwel test ta’ skrining huwa pożittiv, kontaminazzjoni bil-R. solancearum hija sosopettat għalhekk test ieħor ta’ skrining irid isir. Jekk it-tieni test ta’ skrining huwa pożittiv, is-sospett huwa kkonfermat (preżenza kkonfermata) u t-testijiet skond l-iskema jridu jitkomplew. Jekk it-tieni test ta’ skrining huwa negattiv, il-kampjun jiġi meqjus bħala mhux kontaminat bil-R. solanacearum.

Preżenza kkonfermata kif imfassal f’artikolu 5 (1) fid-direrttiva 98/57/KE tirriżulta iżolazzjoni u identifikazzjoni ta’ grupp safi ta’ R. solanacearum bil-konferma ta’ patoġeniċità.

TAQSIMA I

APPLIKAR TA’ L-ISKEMA TA’ TESTIJIET

1. Skema ta’ għarfien għad-dijanjosi tat-taħsir kannella u dbiel batterjoloġiku (R. solanacearum) fit-tuberi tal-patata, tadam jew pjanti oħra ta’ provenjenza li għandhom sintomi ta’ taħsir kannella jew dbiel batterjoloġiku

Il-proċedura ta’ testjar hija mfassla għall-pjanti tal-patata u pjanti li jippreżentaw sintomi ċari jew sospetti ta’ taħsir kannella jew dbiel vaskulari. Din tinkludi skrining rapidu, iżolazzjoni tal-mikrobu patoġeniku mit-tessut vaskulari infettat fuq sustanza fejn huma biss jistgħu jikbru (selettiva) u, fil-każ ta’ riżultat pożittiv, identifikazzjoni tal-grupp ta’ organiżmi in kwestjoni bħala Ralstonia solanacearum.

+++++ TIFF +++++

2. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ pjanti ta’ patata li ma jurux sintomi

Prinċipju:

Il-proċedura tat-testjar hija intiża sabiex issir l-iskoperta ta’ infezzjoni moħbija fit-tuberi tal-patata. Riżultat pożittiv minn mill-inqas żewġ testijiet ta’ skrining3, ibbażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti, għandhom isiru bl-iżolazzjoni ta’ l-organiżmi patoġeniċi; u dan għandu jiġi segwit, fil-każ ta’ iżolazzjoni ta’ kolonji tipiċi, mill-konferma ta’ kolonja safja ta’ R. Solanacearum. Riżultat pożittiv minn test ta’ skrining wieħed biss mhux biżżejjed sabiex il-kampjun jitqies bħala suspett.

Testijiet ta’ skrining u iżolazzjoni jridu jagħtu għarfien ta’ 103 sa 104 ċellula/ml ta’ residwu risospiż (resuspended pellet) inkluża bħala kontroll pożittiv f’kull serje ta’ testijiet.

+++++ TIFF +++++

3. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li ma jurux sintomi

+++++ TIFF +++++

TAQSIMA II

METODI FIL-FOND GĦALL-GĦARFIEN TA’ RALSTONIA SOLANACEARUM F’KAMPJUNI TA’ TUBERI TA’ PATATA, TADAM U PJANTI OĦRA TA’ PROVENJENZA LI JIPPREŻENTAW IS-SINTOMI KOLLHA TA’ TAĦSIR KANNELLA U TA’ DBIEL BATTERJOLOĠIKU

1. Sintomi (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.)

1.1. Is-Sintomi fil-patata

Il-pjanta tal-patata. L-ewwel stadju ta’ infezzjoni fl-għelieqi hija innotata minħabba d-dbiel tal-weraq fin-naħa ta’ fuq tal-pjanta f’temperaturi għoljin matul il-ġurnata bl-irkuprar matul il-lejl. Fl-ewwel fażijiet ta’ dbiel il-weraq jibqgħu ħodor, iżda ’l quddiem nekrożi safra u kannella tiżviluppa. Issir ukoll epinastija. Jidbielu xtieli separati jew il-pjanta kollha tasal fi stat irreversibli li tirriżulta fil-kollass u l-mewt tal-pjanta. It-tessut vaskulari minn zkuk maqtugħin transversalment minn pjanti li dbielu, għandu apparenza kannella u jkollhom nixxa ta’ sustanza densa kawża tal-batterji jew wieħed jista’ jara dan billi jagħfashom. Meta zokk maqtugħ jitqiegħed pożizzjoni wieqfa fl-ilma, traċċi ta’ lgħab jinxterdu mill-organi vaskulari.

It-tuberu tal-patata. It-tuberi tal-patata għandhom jinqatgħu trasversalment qrib l-għarqub (il-parti ta’ l-istolon) jew lonġitudinalment il-fuq mill-parti ta’ l-istolon. L-ewwel stadji ta’ infezzjoni huma rikonoxxuti minn ċarar isfar fil-kannela tleqq tal-kulur taċ-ċirku vaskulari li minnu jnixxi krema batterika spontanjament wara ftit minuti. Il-quddiem dan it telf ta’ kulur vaskulari jsir iktar ċar u distint lewn kannella u nekrożi tista’ tinfirex fit-tessut taz-zokk madwar it-tessut vaskulari. Fi stadju avvanzat, l-infezzjoni tinfirex min-naħa ta’ isfel u l-imsiemer minn fejn inixxi il-lgħab ta’ batterji li jista’ jikkawża aderenza ta’frak ta’ ħamrija. Pjagi lewn aħmar lewn fuq il-kannella jistgħu jidhru fuq il-ġilda ta’ barra minħabba tkissir ta’ tessut vaskulari internament. Oħrajn infezzjonijiet sekondarji ta’ moffa u tħassir batterjoloġiku huma komuni fl-istadji avvanzati tal-marda.

1.2. sintomi fit-tadam

Il-pjanta tat-tadam. L-ewwel sintomu viżibbli hija l-apparenza mitluqa tal-weraq iż-żgħar. F’ambjent favorevoli għall-organiżmu patoġeniku (temperatura tal-ħamrija 25 °C; umdità saturizzata), epinastija u dbiel fuq parti waħda jew fuq il-pjanta kollha fi żmien ftit ġranet li jwassal għall-kollass tal-pjanta. Fi kundizzjonijiet inqas favorevoli (temeperatura tal-ħamrija inqas minn 21 °C), isi inqas tidbil, iżda numru kbir ta’ għeruq sekondarji jistgħu joħorġu miz-zokk. Huwa possibli li wieħed jinnota strixxi imxarrba ta’ għeruq min-naħa ta’ isfel taz-zokk li hija evidenza ta’ nekrożi fis-sistemna vaskulari. Meta z-zokk jinqatgħa dritt, tessut kannella ċar jidher toħroġ nixxa ta’ batterji safranija minnhom.

1.3. sintomi fuq pjanti oħra li huma soġġetti

Pjanti Solanum dulcamara and S. nigrum. Taħt kundizzjonijiet naturali, sintomi ta’ tidbil huma rarament osservati f’dawn il-pjanti ta’ ħaxix ħażin sakemm it-temperatura tal-ħamrija ma taqbiżx il-25 °C jew livelli ta’ inoklu huma għolja ħafna (eż. għal S. nigrum li jikber qrib ħafna ta’ pajnti tal-patata jew tat-tadam infettati. Meta jsir it-tidbil, is-sintomi huma kif imfassla għat-tadam. Pjanti ta’ S. dulcamara li ma jidbielux li jikbru bl-għeruq u zkuk ġewwa l-ilma jistgħu jippreżentaw iċċarar vaskulari intern lewn kannella ċar meta wieħed josserva z-zokk f’sezzjoni trażversali jew partijiet taz-zkuk taħt l-ilma. Nixxa ta’ batterji minn tessuti vaskulari maqtugħa jew għamla ta’ lgħab tinfirex fi ħjut żgħar miz-zokk meta jitqiegħed fl-ilma pożizzjoni wieqfa, huma osservati ukoll fl-assenza ta’ sintomi ta’ tidbil.

2. Testijiet ta’ eżaminazzjoni qosra

Testijiet ta’ dijanjosi rapida jiffaċilitaw dijanjosi preżunta iżda mhumiex essenzjali. Uża wieħed jew iktar minn dawn it-testijiet validati:

2.1. testijiet ta’ separar u analiż taz-zkuk

(Ara Taqsima VI.A.1.)

2.2. Tfittxija ta’ qmuħ zgħar ta’ poly-β-hydroxybutyrate

Qmuħ karatteristiċi ta’ PHB fiċ-ċelluli ta’ R. solanacearum jistgħu jingħarfu billi jittebbgħu kampjuni, li jiġu iffissati bis-sħana, tan-nixxa batterika minn tessut infettat fuq hġieġa taħt mikroskopju permezz tal-kuluri Nile Blu A jew Sudan Black (Ara Taqsima VI.A.2.).

2.3. Testijiet ta’ tagħqid seroloġiku (Agglutination)

(Ara Taqsima VI.A.3.))

2.4. Testijiet oħra

Testijiet oħrajn approprjati ta’ skrining rapidu inkluż testijiet ta’ IF (ara Taqsima VI.A.5.), it-test FISH (ara Taqsima VI.A.7.), testijiet ELISA (ara Taqsima VI.A.8.) u testijiet PCR (ara Taqsima VI.A.6).

3. Proċeduri ta’ iżolazzjoni

(a) Neħħi in-nixxa jew tessut iċċarat mid-dawra vaskulari fit-tuberu tal-patata jew mill-istrixxi vaskulari fiz-zkuk ta’ patata, tadam jew pjanti li jservu li fuqhom igħixu dawn l-organiżmi li qegħdin jidbielu. Ħoll f’volum żgħir ta’ ilma distilliżat u sterilizzat jew 50mM ta’ sustanza ta’ fosfat li żżomm il-kundizzjonijiet stabbli (buffer) (Appendiċi 4) u ħalli għall-5-10 minuti.

(b) Ipprepara serje ta’ taħlitiet dilwiti li jkunu għaxar darbiet iktar minn xulxin.

(c) Ittrasferixxi 50-100 µl tas-sospensjoni u d-dilwizzjonijiet fuq medju ta’ nutriment ġenerali (NA, YPGA or SPA; ara l-Appendiċi 2) u/jew fuq il-medju tat-terazolju selettiv Kelman (Appendiċi 2) u/jew medju selettiv validat (eż SMSA; ara Appendiċi 2). Ifrex jew agħmel strixxa permezz ta’ teknika ta’ kisja dilwita approprjata. Jekk huwa ta’ utilità, ipprepara kampjuni miksija separati ta’ taħlita dilwita ta’ R. solanacearum biovar 2 bħala kontroll biex wieħed iqisu bħala riżultat pożittiv.

(d) Żomm il-kisjiet taħt inkubazzjoni għal 2 – 6 ijiem fi 28 °C.

- Fuq il-materjal ta’ nutrijent ġenerali, iżolati aggressivi ta’ R. solanacearum jifformaw kolonji tal-lewn abjad kulur il-krema apparenza perla u kompożizzjoni fluwida b’dawriet karatteristiċi fin-nofs. Varjazzjonijiet oħra mhux aggressivi ta’ R. solanacearum jifformaw kolonji tondi mhux konsistenza fluwida, butiriċi li għandhom lewn kompletament abjad kulur il-krema.

- Fuq it-tetrażoljum ta’ Kelman u SMSA, iċ-ċirkji huma ħomor, kulur id-demm. Varjazzjonijiet oħra mhux aggressivi ta’ R. solanacearum jifformaw kolonji tondi mhux konsistenza fluwida, butrici li għandhom lewn kompletament aħmar skur.

4. Testijiet ta’ identifikazzjoni għal R. solanacearum

Testijiet sabiex jiġu kkonfermati l-identità ta’ preżunti iżolati ta’ R. solanacearum huma mfassla f’Taqsima VI.B.

TAQSIMA III

1. Metodi dettaljati għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ Ralstonia solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata li ma jippreżentawx sintomi

1.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Nota:

- Id-daqs standàrd tal-kampjun huwa ta’ 200 tuberu per test. Aktar ġbir ta’ kampjuni intesiv jitlob iktar testijiet fuq kampjuni ta’ dan id-daqs. Numri akbar ta’ tuberi fil-kamjun iwasslu għal tfixkil jew interpretazzjoni diffiċli tar riżultati. Iżda, proċeduri jistgħu jiġu applikati konvenjentament fuq kampjuni b’inqas minn 200 tuberu fejn hemm inqas numru ta’ tuberi disponibbli għall-użu.

- Validazzjoni għall-metodi ta’ l-iskoperta kif imfassla hawn isfel hija bbażata fuq kampjuni ta’ 200 tuberu.

- L-estratt mill-patata mfassal hawn isfel jista’ jintuża wkoll biex wieħed jivverifika l-preżenza tal batterju Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus li huwa kawża ta’ tħassir fil-patata.

Pre trattament mhux obbligatorju fuq il-kampjun qabel ma jiġi ppreparat:

(a) Inkubazzjoni tal-kampjuni f’temperatura ta’ 25-30 °C, għal żmien ta’ ġimgħatejn qabel ma jsir it-testjar, sabiex jitjiebu l-kundizjonijiet għat-tkattir tal-popolazzjoni ta’ R. solanacearum.

(b) Aħsel it-tuberi. Agħmel użu minn disinfettanti approprjati (komposti tal-kloru fejn ser isir it-test tal-PCR sabiex jinqered id-DNA eventwali ta’ organiżmu patoġeniku) u deterġenti bejn kull kampjun. Nixxef it-tuberi fl-arja. Din il-proċedura ta’ ħasil hija ta’ użu partikulari (iżda mhux obbligatorja) għall-kampjuni li jippreżentaw eċċess ta’ ħamrija u jekk test PCR jew iżolazzjoni diretta jridu jsiru.

1.1.1. Neħħi permezz ta’ xafra disinfettata jew sikkina tal-ħaxix il-qoxra fin-naħa ta’ l-għarqub (stolon) ta’ kull tuberu sabiex it-tessut vaskulari jiġi jidher. Aqta’ b’attenzjoni biċċa qalba tat-tessut vaskulari fin-naħa ta’ l-għarqub u żomm l-iktar ammont ta’ tessut mhux vaskulari kemm jista’ jkun. (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota: Ifred mill-oħrajn it-tuberi (mħassra: erfa' (Petra Muller) it-tuberi li għandhom xi sintomi ta’ taħsir kannella sospetti u ttestja separatament.

Jekk matul it-tneħħija ta’ l-għarqub jiġu osservati sintomi sospetti tat-taħsir kannella spezzjoni viżwali tat-tuberu għandha ssir u t-tuberu għandu jinqata’ min-naħa ta’ l-għarqub. Kull tuberu maqtugħ li għandu sintomi sospetti għandu jinħażen għall-jumejn temperatura ambjentali sabiex tista’ sir is-suberizzazzjoni u aħżen f’refriġerazzjoni fi (at 4 - 10 °C) f’kundizzjonijiet ta’ kwarantena xierqa. It-tuberi kollha inklużi dawk li għandhom sintomi sospetti jridu jinżammu skond m’hu imfassal f’Anness III.

1.1.2. Iġbor il-qlub meħudin minn-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu f’reċipjent mhux użati li jintrema’ (disposable) wara li jintuża u li jista’ jingħalaq u/jew jiġu ssiġillati (jekk reċipjenti jintużaw iktar minn darba jridu jitnaddaf sew u jiġi disinfettat permezz ta’ komposti bbażati fuq il-kloru). Jekk jista’ jkun, qlub tan-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu jridu jiġu pproċessati mill-ewwel. Jekk dan ma jistax ikun, erfagħhom fil-kontenitur, mingħajr ma jiżdiedu sostanzi li jżommu l-kundizzjonijiet stabbli (buffer), ambjent refriġerat għal żmien ta’ mhux iktar minn 72 siegħa jew għal żmien ta’ mhux iktar minn 24 siegħa f’temperatura ambjentali.

Ipproċessa l-qlub tan-naħa ta’ l-għarqub tat-tuberu permezz ta’ wieħed minn dawn il-proċeduri li ġejjin:

(a) Poġġi l-qlub f’ammont (approssimativament 40ml) suffiċjenti ta’ kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli (Appendiċi 4) u ħawwad permezz ta’ apparat rotatorju (50-100rpm) għal erbgħa sigħat f’temperatura inqas minn 24 °C jew miżmuma għal 16 –24 siegħa refriġerati.

jew

(b) Omoġenizza l-qlub b’ammont suffiċjenti (approssimativament 40ml) ta’ kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli waqt l-estrazzjoni (extraction buffer) (Appendiċi 4), f’apparat li jintuża għat-taħlit (eż Waring jew Ultra Thurax) jew billi jitgħaffġu f’borża għall-immaċerazzjoni li tintrema wara l-użu tagħha (eż Stomacher or Bioreba polyethene ta’ kalibru qawwi, 150 mm × 250 mm; sterilizzat bir-radjazzjoni) permezz ta’ mazza tal-lasktu jew apparat għat-taħna xieraq (eż Homex).

Nota: Ir-riskju ta’ kontaminazzjoni huwa għoli meta l-kampjuni huma omogeniżżati permezz ta’ apparat għat-taħlit. Ħu prekawzjonijiet sabiex jiġu evitati generazzjoni ta’ taħlita ta’ particelli fl-arja waqt il-proċess ta’ estrazzjoni. Kun ċert li jintużaw xwabel ta’ l-apparat li jomoġenizza sterilizzati għal kull kampjun. Jekk it-test tal-PCR għandu jkun evitat, aħseb sabiex tevita li jkun hemm kontaminazzjoni ta’ DNA minn kampjuni oħra fil-kontenituri jew apparat li jintuża biex issir it-taħna. It-taħna f’boroż li jistgħu jintremew u l-użu ta’ tubi li jintremew wara l-użu huma kollha rrakkomandati fejn jintuża l-PCR.

1.1.3. Ferra l-likwidu li jibqa’ wara. Jekk jidher eċċessivament imniġġes, iċċarah jew permezz ta’ ċentrifugazzjoni lenta (mhux iktar minn 180 g għal għaxar minuti f’temperatura ta’ 4-10 °C) jew permezz ta’ filtrazzjoni fi vakwu (40-100 µm), il-filtri jinħaslu dejjem b’iktar (10 ml) kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli. (buffer)

1.1.4. Ikkonċentra l-parti batterika permezz ta’ ċentrifugazzjoni bi veloċità 7000g għal ħmistax il-minuta (jew 10000 għal 10 minuti) f’temperatura ta’ bejn 4-10 °C u armi l-likwidu residwu mingħajr ma tħarbat ir-residwu (pellet).

1.1.5. Qiegħed ir-residwu fi 1.5ml ta’ kimika apposta li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli (buffer) (Appendiċi 4). Uża 500 µl biex tittestja għal R. solanacearum, 500 µl għal Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus u 500 µl għal raġunijiet ta’ referenza.. Żid gliċerol sterilizzat sal-konċentrazzjoni finali ta’ 10-25 % (v/v) mal 500 µl ta’ l-alikwot ta’ referenza u lill-alikwot li jifdal tat-test, ħawwad u erfa’ fi –16 to –24 °C (ġimgħat) jew fi –68 sa –86 °C (xhur). Ippreżerva l-alikwoti tat-test taħt temperatura ta’ 4-10 °C waqt it-testing.

Mhux affidabli li jsir iffriżar jew jinħallu ripetutament.

Jekk hemm il-ħtieġa ta’ trasport għall-estratt, kun cert li jsir f’kontenitur li jżomm il-kesħa fi żmien ta’ 24 sa 48 siegħa.

1.1.6. Huwa imperattiv li kull kontroll pożittiv u kampjuni għall-R. solanacearum jiġu meqjusa separatament sabiex jiġi evitat il-kontaminazzjoni. Dan japplika fi pjastri ta’ l-IF u għat-testijiet kollha.

1.2. Testijiet

Ara l-illustrazzjoni u deskrizzjoni tat-testijiet u protokolli ottimizzati fl-appendiċi relevanti:

Iżolazzjoni selettiva (ara Taqsima VI.A.4.)

Test IF (ara Taqsima VI.A.5.)

Testijiet PCR (ara Taqsima VI.A.6)

Test FISH (ara Taqsima VI.A.7)

Testijiet ELISA (ara Taqsima VI.A.8)

Il-Bioassay (Ara Taqsima VI.A.9.)

2. Metodi dettaljati għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum f’kampjuni ta’ tuberi ta’ patata, tadam u pjanti oħra ta’ provenjenza li ma jurux sintomi

2.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Nota: Għall-kampjuni ta’ popolazzjonijiet ta’ R. solanacearum huwa indikat li wieħed jittestja kampjuni komposti. Il-proċedura tista’ tiġi applikata faċilment għal kampjuni komposti minn ammont ta’ 200 parti ta’ zokk. Fejn isiru studji dawn iriddu jsiru fuq kampjun repreżentattiv statistikalment tal-popolazzjoni ta’ pjanti li qed tkun investigata.

2.1.1. Iġbor 1-2 cm biċċiet taz-zkuk f’kontenitur sterilliżżat skond dawn il-proċeduri ta’ ġbir ta’ kampjuni li ġejjin:

Pjanti tat-tadam żgħar: B’sikkina nadifa u disinfettata, aqta’ biċċa fiha ċentimetru wieħed mill-bażi ta’ kull zokk, ftit iktar il-fuq mil-livell tal-ħamrija.

Pjanti tat-tadam ta’ l-għelieqi jew tas-serrer: B’sikkina nadifa u disinfettata, aqta’ il-fergħa l-iktar baxxa minn kull pjanta billi taqta’ ftit iktar il-fuq mill-ġonta ta’ bejn iz-zokk priċipali. Aqta’ biċċa ta’ ċentimetru wieħed minn-naħa ta’ isfel minn kull fergħa.

Pjanti ospitanti oħrajn: B’sikkina nadifa u disinfettata jew b’imqass taż-żabra, aqta’ bicca fiha ċentimetru wieħed mill-bażi ta’ kull zokk, ftit iktar il-fuq mil-livell tal-ħamrija. Fil-każ ta’ S. dulcamara jew pjanti oħra ta’ provenjenza li jikbru fl-ilma, neħħi biċċiet ta’1-2 cm miz-zkuk ta’ taħt l-ilma jew mill-fergħa orizzontali b’għeruq akkwatiċi.

Meta jsir ġbir ta’ kampjuni minn post partikolari huwa indikabbli li jsir testjar fuq kampjun statistikament repreżentattiv għal mhux inqas minn 10 pjanti għal kull punt ta’ kampjunar ta’ kull ħaxixa li hija potenzjalment ta’ provenjenza. L-investigazzjoni ta’ l-organiżmu patoġeniku jkun iktar lajn tmiem ir-rebbiegħa, fis-sajf u fil-ħarifa, għalkemm infezzjonijiet naturali jistgħu jinstabu tul is-sena kollha fis-Solanum dulcamara perenni li tikber fil-korsijiet ta’ l-ilma. Pjanti li fuqhom jistgħu jikbru huma pjanti ta’ patata voluntiera Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium u membri oħra tal-familja Solanaceae. Pjanti oħra li jistgħu jservu ta’ mezz għall-għixien huma Portulaca oleracea. Ċertu speċi ta’ ħxejjex Ewropew li jistgħu potenzjalment iżommu popolazzjonijiet ta’ R. solanacearum biovar 2/Razza 3 f’għeruq u/jew riżosferi f’kundizzjonijiet ambjentali speċifiċi jinkludu Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra u Urtica dioica.

Nota: Eżaminazzjoni viżwali għal sintomi interni (tiġrif vaskulari jew nixxa batterika) tista’ ssir f’dan l-istadju. Ifred segmenti taz-zokk bis-sintomi u ttestja separatament (Ara Taqsima II).

2.1.2. Iddisinfetta s-segmenti taz-zkuk permezz ta’ l-etanol 70 % u mill-ewwel nixxef permezz ta’ karta assorbenti Imbagħad ipproċessa s-segmenti taz-zkuk permezz ta’ waħda mill-proċeduri li ġejjin:

(a) Poġġi s-segmenti f’ammont (approssimativament 40ml) suffiċjenti ta’ kimika li żżomm il-kundizzjonijiet kimiċi stabbli waqt l-estrazzjoni (extraction buffer) (Appendiċi 4) u ħawwad permezz ta’ apparat rotatorju (50-100rpm) għal erba’ sigħat f’temperatura inqas minn 24 °C jew 16 –24 siegħa f’refriġerazzjoni. jew

(b) Ipproċessa mill-ewwel, billi ttaħħan is-segmenti f’borża tat-titħin ħoxna (eż Stomacher jew Bioreba) bi volum approprjat ta’ buffer għall-estrazzjoni (appendiċi 4) permezz ta’ mazza tal-lasktu jew tagħmir apposta (eż Homex). Jekk dan mhux disponibbli, erfa’ is-segmenti taz-zkuk għal-mhux iktar minn 72 siegħa jew għal mhux iktar minn 24 siegħa f’temperatura ambjentali.

2.1.3. Ferra l-likwidu li jifdal wara li jkun qagħad għal 15 il-minuta.

2.1.4. Iktar kjarifikazzjoni dwar l-estrazzjoni u konċentrazzjoni tal-parti batterika mhumiex dejjem neċessarji iżda jistgħu jsiru billi ssir filtrazzjoni u/jew ċentrifugazzjoni kif imfassal f’Taqsima III.1.3 – 1.1.5.

2.1.5. Aqsam fi tnejn il-kampjun pur jew ikkonċentrat f’żewġ partijiet indaqs. Poġġi nofs f’4-10 C waqt it-test u erfa’ il-parti l-oħra b’10-25 % (v/v) gliċerol sterilizzat fi –16 to –24 °C (ġimgħat) jew fi –68 to –86 C (ġimgħat) jekk ikun hemm mil-ħtieġa ta’ iktar testijiet.

2.2. Testijiet

Ara l-illustrazzjoni u deskrizzjoni tat-testijiet u protokolli ottimizzati fl-appendiċi relevanti:

Iżolazzjoni selettiva (ara Taqsima VI.A.4.)

Test IF (ara Taqsima VI.A.5)

Testijiet PCR (ara Taqsima VI.A.6)

Test FISH (ara Taqsima VI.A.7)

Testijiet ELISA (ara Taqsima VI.A.8)

Il-Bioassay (Ara Taqsima VI.A.9.)

TAQSIMA IV

1. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fl-ilma

+++++ TIFF +++++

2. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fl-ilma.

Prinċipju:

L-iskema validata ta’ għarfien, imfassla f’din it-taqsima, hija applikabli għall-għarfien ta’ organiżmu patoġeniku f’kampjuni ta’ ilma tal-wiċċ u jista’ jkun applikat ukoll għat-testing ta’ kampjuni ta’ materjal ipproċessat mill-patata jew derivati mid-dranaġġ. Iżda, huwa importanti li jingħaraf li s-sensitività tal-metodu ta’ għarfien ivarja skond il-materjal li qiegħed isir fuqu t-test. Is-sensitività tat-test ta’ iżolazzjoni huwa affetwat minn popolazzjonijiet ta’ batterji saprofitiċi kompetituri li ssoltu huwa ogħla f’materjal meħud minn proċessar ta’ patata u minn effluwent ta’ dranaġġ milli minn sors ta’ ilma tal-wiċċ. Fejn l-iskema mfassla hija mistennija li wieħed ikun jista’ jagħraf sa ftit daqs 103 cellula per litru minn ilma tal-wiċċ, is-sensittività minn materjal meħud minn proċessar ta’ patata jew effluwent ta’ dranaġġ huwa probabli li tkun iktar baxxa. Għal din ir-raġuni huwa indikat li jiġu ttestjati sostanzi effluwenti wara kull proċedura ta’ purifikazzjoni (eż sedimentazzjoni jew filtrazjoni) li jservu sabiex jitnaqsu l-popolazzjonijiet ta’ batterji saprofitiċi. Il-limitazzjonijiet fis-sensitività ta’ l-iskema ta’ testijiet trid tiġi kkunsidrata meta l-akkuratezza ta’ riżultati negattivi miksuba tkun assessjata. Minkejja li din l-iskema ġiet użata b’suċċess f’xogħol ta’ investigazzjoni biex tiġi vverifikata l-preżenza jew le ta’ l-organiżmu patoġeniku f’ilma tal-wiċċ, il-limitazzjonijiet tagħha jridu jiġu kkonsidrati meta użati f’investigazzjonijiet simili ta’ materjal minn proċessar ta’ patata jew effluwent ta’ dranaġġ.

2.1. Preparazzjoni tal-kampjun

Nota:

- Għarfien ta’ R. solanacearum f’ilma tal-wiċċ hija l-iktar akkurata fl-aħħar tar-rebbiegħa, Fis-sajf u fil-ħarifa meta t-temperatura ta’ l-ilma taqbeż il-15 oC.

- Proċeduri ta’ ġbir ta’ kampjuni rrepetuti fiż-żminijiet imsemmija f’postijiet assenjati jżidu l-akkuratezza tal-metodu ta’ għarfien billi jitnaqqsu elementi ta’ varjazzjoni klimatiċi.

- Wieħed għandu jikkonsidra l-effetti ta’ xita qawwija jew tal-Ġeografija tal-kors ta’ l-ilma sabiex jiġu evitati effetti dilwenti estensivi li jistgħu jaħbu l-preżenza patoġenika.

- Għandhom jittieħdu kampjuni mill-wiċċ ħdejn il-pjanti ta’ provenjenza jekk dawn huma preżenti.

2.1.1. F’postijiet ta’ kampjunar magħżula, iġbor kampjuni ta’ ilma billi jintlew tubi li jistgħu jintremaw wara u li huma sterilizzati minn fond ta’ iktar minn 30 ċm u mhux iktar il-barra minn 2 m mit-tarf. Sabiex jiġu pproċessati l-effluwenti ta’ dranaġġ, iġbor il-kampjuni mill-punt ta’ skariku ta’ l-effluwent. Qisien tal-kampjuni ta’ mhux iktar minn 500ml għal kull post ta’ kampjunar huma indikati. Jekk wieħed jippreferi kampjuni iżgħar, huwa rrakkmandat li jittieħdu kampjuni għal mill inqas tliet okkażjonijiet għal kull punt ta’ kampjunar, fejn kull kampjun jikkonsisti minn żewġ sub kampjuni replikati ta’ mill-inqas 30 ml. Għal xogħol ta’ stħarriġ intensiv, agħżel mill inqas tliet punti ta’ kampjunar għal kull kilometru ta’ kors ta’ l-ilma u aċċerta li l-fergħat li jiżbokkaw fil-kors huma kkampjunati wkoll.

2.1.2. Trasport ta’ kampjuni jrid isir taħt kundizzjonijiet mudlama (4-10 °C) u ttestja qabel ma’ jgħaddu 24 siegħa.

2.1.3. Jekk hu meħtieġ, il-parti batterika tista’ tiġi kkonċentrata permezz ta’ wieħed minn dawn il-metodi li ġejjin:

(a) Iċċentrifuga 30-50 ml sub-kampjuni veloċità ta’ 10000 g għal 10 minuti (7,000 g għal 15 il-minuta) preferibbilment f’4-10 °C, armi l-likwidu li jibqa’ u żid 1ml tal-kimika li żżomm kundizzjonijiet stabbli (buffer) mar-residwu (Appendiċi 4).

(b) Iffiltra permezz ta’ passatur (membrane filter)magħmul minn pori ta’ daqs minimu ta’ 0.45 µm jippreċedi l-ħasil tal-filtru fi 5-10ml kimika stabiliżżanti (pellet buffer) u jinżamm il-materjal maħsul. Dan il-metodu huwa indikat għal volum ikbar ta’ ilma li fih ammonti iżgħar ta’ organiżmi saprofitiċi.

Metodu ta’ kkonċentrament mhux indikat għal kampjuni ta’ materjal meħud minn proċessar ta’ patata jew effluwenti ta’ dranaġġ għaliex popolazzjonijiet ippropagati ta’ batteri saprofitiċi huma ta’ tfixkil totali għall-għarfien ta’ Ralstonia solanacearum.

2.2. Testijiet

Ara l-illustrazzjoni u deskrizzjoni tat-testijiet u protokolli ottimizzati fl-appendiċi rilevanti:

TAQSIMA V

1. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fil-ħamrija

+++++ TIFF +++++

2. Skema għall-għarfien u identifikazzjoni ta’ R. solanacearum fil-ħamrija

Prinċipji

L-iskema validata ta’ għarfien, imfassla f’din it-taqsima, hija applikabli għat-tagħrif ta’ organiżmi patoġeniċi minn kampjuni ta’ ħamrija iżda tista’ tintuża wkoll għat-testjar ta’ skart solidu minn proċessar ta’ patata jew minn effluwent imtajjen ta’ dranaġġ. Iżda jrid jiġi kkonsidrat li tali metodi huma ta’ akkuratezza insuffiċjenti għal fini ta’ garanzija għall-għarfien ta’ popolazzjonijiet baxxi jew/u popolazzjonijiet imfirxa ta’ Ralstonia solanacearum li jistgħu jinstabu f’kampjuni infestati b’mod naturali fi kampjuni ta’ dawn is-sustrati.

Il-limitazzjonijiet fl-akkuratezza ta’ din l-iskema ta’ testijiet iridu jittieħdu in konsiderazzjoni meta l-akkeratezza ta’ tali testijiet negattivi jinkisbu kif ukoll meta użati f’investigazzjonijiet li l-għan tagħhom huwa li jistabilixxu l-preżenza jew nuqqas ta’ l-organiżmu patoġeniku fi ħamriji jew effluwenti mtajna. L-aktar test akkurat għall-preżenza ta’ l-organiżmu patoġeniku fi ħamrija ta’ l-għelieqi huwa li jitħawlu pjanti suxxettibli u jsir monitoraġġ għall-preżenza ta’ infezzjoni, iżda b’dan il-metodu wkoll livelli baxxi ta’ kontaminazzjoni mhumiex perċepibbli.

2.1. Preparazzjoni tal-kampjun

2.1.1. Ġbir ta’ kampjuni ta’ ħamrija ta’ l-għelieqi għandu jsegwi prinċipji ta’ kampjunar li japplika għall-organiżmi nematodi. Iġbor 0.5-1 kg ta’ ħamrija għal kull kampjun minn 60 firxa ta’ art per 0.3 ettaru minn fond ta’ 10-20 ċm (jew permezz ta’ kwadru ta’ 7 × 7 metru) Jekk huwa ssospettat il-preżenza ta’ l-organiżmu patoġeniku, żid in-numru ta’ żoni ta’ ġbir sa 120 per 0.3 ettaru. Żomm il-kampjuni f’temperatura ta’ 12-15 °C qabel it-testjar. Iġbor kampjuni meħudin minn materjal ta’ pproċessar ta’ patata u minn effluwenti mtajna ta’ dranaġġ billi tiġbor kilogram wieħed minn firxiet ta’ art li huma rappreżentattivi għall-volum totali ta’ effluwent li qiegħed jiġi ttestjat. Ħallat kull kampjun sew qabel it-testijiet.

2.1.2. Ħawwad sub-kampjuni ta’ 10–25 gm ta’ ħamrija jew effluwent permezz ta’ apparat rotatorju (250 rpm) fi 60-150 ml sustanza li żżomm kundizzjonijiet kimiċi stabbli għall-estrazzjoni (buffer) (Appendiċi 4) għal żmien sa sagħtejn. Jekk meħtieġ iż-żieda ta’ 0.02 % Tween-20 sterilizzat u 10-20 g ta’ żrar sterilizzat jistgħu jgħinu fid-dispersjoni.

2.1.3. Żomm it-taħlita ta’ likwidu u solidi f’4 °C waqt it-test.

2.2. Testijiet

Ara l-illustrazzjoni u deskrizzjoni tat-testijiet u protokolli ottimizzati fl-appendiċi relevanti:

TAQSIMA VI

PROTOKOLL OTTIMIZZAT GĦALL-GĦARFIEN U IDENTIFIKAZZJONI TA’ R. SOLANACEARUM

A. TESTIJIET TA’ DIJANJOSI U GĦARFIEN

1. testijiet ta’ separar u analiż taz-zkuk

Il-preżenza ta’ R. solanacearum fi zkuk ta’ patata li qed tidbiel, tadam jew pjanti oħra jistgħu jiġu indikati permezz ta’ testijiet preżuntivi li ġejjin: Aqta’ z-zokk ftit ’il fuq mil-livell tal-ħamrija. Daħħal il-faxxa maqtugħa fi tubu ta’ ilma nadif. Osserva għall-preżenza ta’ hruġ ta’ sostanza batterika fi ħjut provenjenti mit-tessuti vaskulari wara ftit minuti.

2. Tfittxija ta’ qmuħ zgħar ta’ poly-β-hydroxybutyrate

1. Ċappas kampjun żgħir ta’ nixxa batterika minn tessut infettat jew minn kolonja ta’ l-organiżmu mrobbija in vitro għall 48 siegħa fuq sostanza tat-trobbija YPGA jew SPA (Appendiċi 2) fuq pjastra tal-mikroskopju.

2. Ipprepara kampjuni ta’ biovar 2 varjazzjoni ta’ R. solanacearum bħala control pożittiv u jekk ikkusidrat ta’ użu, kontroll negattiv ta’ speċi ta’ organiżmu li huwa ċert li jagħti riżultat negattiv.

3. Ħalli joqgħod ftit għall-arja, nixxef u webbes il-kampjun permezz ta’ sħana ta’ fjamma.

4. Tebba’ il-prepart bi Nile Blue jew Sudan Black u osserva mikroskopikament kif imfassal:

Test ta’ Nile Blue:

(a) Xarrab kull pjastra bi soluzzjoni ta’ 1 % ta’ Ikħal Nile A u inkuba kollox għal għaxar minuti f’55 °C.

(b) Neħħi l-materjal koloranti żejjed. Aħsel bi ftit ilma tal-vit. Neħħi ilma żejjed permezz ta’ karti assorbenti.

(d) Aħsel bi ftit ilma tal-vit. Neħħi ilma żejjed permezz ta’ karti assorbenti.

(e) Erġa xarrab ftit b’qatra ilma u għatti bi pjastra zgħira rqieqa.

(f) Eżamina t-tidlika li ġiet imtebbgħa taħt mikroskopju epifluworexxenti ta’ 450 nm taħt immersjoni fiż-żejt, bi manjifikazzjoni ta’ 600-1000 permezz ta’ oġġettiv f’immersjoni taż-żejt u l-ilma.

(g) Osserva wkoll taħt emissjoni ta’ dawl normali sabiex taċċerta li l-qmuħ huma intraċellulari u l-għamla taċ-ċelluli hija tipikament ta’ R. solanacearum.

Test bis-Sudan Black:

(a) Xarrab kull pjastra (slide) bi soluzzjoni ta’ 0.3 % ta’ Sudan Iswed B fi soluzjoini ta’ 70 % etanol u inkuba għal 10 minuti minuti fi temperatura ambjent.

(b) Neħħi l-materjal koloranti żejjed.

(c) Bill il-pjastri brevement f’soluzzjoni ta’ xylol u nixxef fuq karta ossorbenti. Attenzjoni: Il-Xylol huwa ta’ periklu, prekawzjonijiet meħtieġa jridu jittieħdu u aħdem fi vetrina li hi mgħammra b’ventilatur għall-estrazzjoni.

(d) Xarrab il-pjastri permezz ta’ % (w/v) safranin akweuu, u ħalli għal għaxar minuti fi temperatura ambjentali. Attenzjoni: Is-safranin huwa ta’ periklu, prekawzjonijiet meħtieġa jridu jittieħdu u aħdem fi vetrina li hi mgħammra b’ventilatur għall-estrazzjoni.

(e) Aħsel taħt ilma tal-vit nieżel bil-mod, nixxef b’karti assorbenti u poġġi pjastra żgħira fuqha.

(f) Eżamina l-kampjuni kkolorati permezz ta’ mikroskopju normali tad-dawl bi emissjoni ta’ dawl taħt immersjoni fiż-żejt b’qawwa ta’ magnifikazzjoni ta’ 1000 permezz ta’ oġġettiv apposta.

(g) Fittex it-tbajja blu jew suwed ta’ qmuħ ta’ PHB f’ċelluli ta’ R. solanacearum bil-qxur taċ-ċelluli lewn roża.

3. Testijiet ta’ tagħqid seroloġiku (Agglutination)

Tagħqid ta’ ċelluli ta’ R. solanacearum fi nixxa batterika jew estratti minn tessuti sintomatiċi jiġi osservat permezz ta’ antikorpi validati (ara Appendiċi 3) mmarkat bil-markaturi, kkuluriti approprjatament bħal ċelluli ta’ Staphylococcus aureus ħomor jew partiċelli tal-lattiċi. Jekk qed jintużaw settijiet li jistgħu jinkisbu kommerċjalment, segwi l-istruzzjonijiet tal-manufattur. Jekk le, segwi dawn il-proċeduri:

(a) Ħallat qattra tas sospensjoni ta’ antikorpi mmarkati u nixxa batterika (approssivativament 5 µl kull wieħed) fuq il-wiċċ ta’ pjastri b’ħafna ħofriet.

(b) Ipprepara kontrolli negattivi u pożittivi bi sospensjoni ta’ R. solanacearum biovar 2 u varjetà eterologa.

4. Iżolazzjoni selettiva

4.1. Pjastra selettiva

Nota: Qabel ma jintuża dan il-metodu għall-ewwel darba, agħmel testijiet preliminarji sabiex tassigura għarfien ripproduċibbli ta’ 103 sa 104 ta’ unitajiet li jifformaw kolonji ta’ R. solanacearum għal kull ml miżjud ma’ l-estratti mill-kampjuni li ttestjaw negattivi qabel.

Uża medji selettivi validati approprjatament bħalma huma SMSA (kif immodifikat minn Elphinstone et al., 1996;. ara Appendiċi 2).

Attenzjoni trid tingħata sabiex ikun hemm differenzjazzjoni bejn R. solanacearum u batterji oħra kapaċi jIFformaw kolonji fuq tali sostanza għat-trobbija. Il-kolonji jistgħu saħansitra jkollhom morfoloġija atipika jekk il-pjastri huma Iffollati bil kolonji ta’ R. solanacearum jew jekk batterji antagonistiċi huma preżenti wkoll. Fejn hemm sospett ta’ kompetizzjoni jew antagopniżmu, il-kampjun irid jiġi eżaminat permezz ta’ test ieħor

L-ogħla akkuratezza ta’ dan il-metodu jista’ jinkiseb meta l-kampjuni użati huma friski. Dan il-metodu jista’ jiġi applikat ukoll fuq estratti li ġew miżmuma taħt il-gliċerol fi –68 sa –86 °C.

Bħala kontrolli pożittivi, ipprepara dilwizzjonijiet deċimali minn sospensjoni ta’ 106 għal kull varjetà bijovar 2 aggressiva ta’ R. solanacearum (e.ż. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857. Sabiex tevita kwalunkwe tip ta’ kontaminazzjoni, ipprepara kontrolli pożittivi separatament mill-kampjuni li jridu jiġu ttestjati.

Għal kull numru ta’ medju selettiv ippreparat ġdid il-konvenjenza tiegħu għat-tkabbir tal-patoġenu għandu jiġi ttestjat qabel ma jintuża sabiex jiġu ttestjati kampjuni ta’ rutina.

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

4.1.1. Agħmel teknika ta’ kisi b’dilwizzjoni approprjata sabiex wieħed jaċċerta li kull kolonja saprofitika li tista’ tikber huma maħsulin il-barra. Ifrex 50 -100 µl għal kull pjastra ta’ estratt mill-kampjun minn kull dilwizjoni.

4.1.2. Inkuba l-pjastri fi 28 °C. Aqra r-riżultat tal-pjastra wara 48 siegħa u għal kuljum wara għal sitt ijiem. Kolonji tipiċi ta’ R. solanacearum fuq materja SMSA huma bojod ċari konsistenza tal-ħalib, ċatti, irregolari u fluwidi u wara 3 ijiem inkubazzjoni juru kolorazzjoni roża sa aħmar kulur id-demm b’linji jew crieki interni. (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

Nota: Kolonji atipiċi ta’ R. solanacearum jistgħu jifformaw fuq tali sostanza. Dawn jistgħu jkunu żgħar, tondi, kompletament ħomor u kostitwenza mhux fluwida jew parzjalment fluwida u għalhekk diffiċli sabiex wieħed jagħmel distinzjoni minn kolonji saprofitiċi ta’ batterji.

4.1.3. Oħroġ kolonji safja ta’ R. solanacearum wara tqegħid jew kisja b’metodi ta’ dilwizzjoni fuq sostanza ta’ trobbija (medju) ġenerali, sabiex jinkisbu kolonji iżolati. (ara Appendiċi 2).

4.1.4. Erfa’ il-kolonji għal żmien qasir f’ilma sterilizzat (pH 6-8, ħieles mill-kloru) fid-dlam, jew għal żmien twil f’sostanza protettiva għaċ-ċelluli fi –68 to –86 °C jew lijofiliżżat..

4.1.5. Identifika kolonji preżunti (ara Taqsima VI.B.) u agħmel test ta’ patoġeniċità.

Interpretazjoni tar-riżultati miksuba mill-kisja selettiva

It-test ta’ kisja selettiva joħroġ negattiv jekk ebda kolonja batterika tkun viżibli wara 6 ijiem jew jekk ebda kolonja preżunta, tipika tal-R. solanacearum tinstab, dejjem jekk ebda tfixkil huwa ssospettat minħabba kompetizzjoni jew antagoniżmu minn batterji oħra u li kolonji tipiċi ta’ R. solanacearum jinstabu fil-kontrolli pożittivi.

Il-metodu ta’ kisi selettiv joħroġ pożittiv jekk kolonji preżunti ta’ R. solanacearum huma ssospettati.

4.2. Proċedura ta’ trobbija f’ambjent favorevoli

Uża sostanza għat-trobbija favorevoli li kun ivvalidata bħal brodu mmodifikat ta’ Wilbrink (Ara Appendiċi 2).

Din il-proċedura tista’ tintuża sabiex jiżdiedu selettivament il-popolazzjonijiet ta’ R. solanacearum minn estratti ta’ kampjuni u tiżdied l-akkuratezza tal-metodu. Il-proċedura tiddilwixxi inħibituri tar-reazzjoni PCR (1:100). Għandu jittieħed in konsiderazzjoni li trobbija f’ambjent favorevoli ta’ R. solanacearum jista’ ma jirnexxix minħabba kompetizzjoni jew antagoniżmu minn organiżmi saprofitiċi li huma ta’ spiss benefiċjarji tal-kundizzjonijiet. Għal din ir-raġuni, iżolazzjoni ta’ R. solanacearum minn sostanzi li jinkoraġġixxu t-tkattir tal-kolonji jistgħu jkunu diffiċli. Ulterjurment, filwaqt li popolazzjonijiet ta’ organiżmi saprofitiċi relatati seroloġikament jistgħu jiżdiedu, l-użu ta’ antikorpi monklonali, speċifiċi ħlief antikorpi poliklonali huwa indikat meta ser isir it-test ELISA.

4.2.1. Għat-teknika ta’ PCR f’sustanzi ta’ faċilitazzjoni għat-trobija, trasferiment ta’ kamjun mill-estratt ta’ 100 µl fi 10 ml ta’ brodu ta’ sustanzi siewja għat-trobbija (Appendiċi 2) alikwotata minn qabel f’tubi jew reċipjenti li huma safja mid-DNA. Fit-teknika ELISA jistgħu jintużaw ammonti ogħla ta’ estratt mill-kampjun mqabbel mal-brodu(eż 100 µl fi 1.0 ml ta’ brodu).

4.2.2. Inkuba għal 72 siegħa f’temperatura ta’ 27 sa 30 °C f’sistema ta’ trobbija statika jew dinamika movimentata u bl-għotjien mhux issikkati sabiex issir arjazzjoni.

4.2.3. Ħawwad sew qabel ma jintuża fit-testijiet ELISA jew PCR.

4.2.4. Agħti l-istess trattament fil-brodu ssostanzjat bħal fil-kampjun(i) fit-testijiet hawn fuq.

Nota: Jekk tfixkil fit-trobbija ta’ R. solanacearum permezz ta’ brodu ssostanzjat jiġi antiċipat, minħabba popolazzjonijiet għolja ta’ ċerti batterji saprofitiċi, ssostanzjar ta’ kampjun ta’ l-estratti qabel ma ssir iċ-ċentrifugazzjoni jew stadji oħra ta’ konċentrament jistgħu jagħtu riżultati aħjar.

5. Testijiet IF

Prinċipju:

L-użu tat-test IF bħala test prinċipali ta’ skrining huwa rrakmandat minħabba l-fatt li huwa ta’ min joqgħod fuqu sabiex jinkisbu l-livelli meħtieġa.

Meta jintuża t-test ta’ l-IF bħala metodu ta’ skrining prinċipali, u r-riżultat joħroġ pożittiv, l-iżolazzjoni, PCR jew FISH jridu jitwettqu bħala test ta’ skrining oħrajn. Meta t-test ta’ l-IF jintuża bħala t-tieni test ta’ skrining u r-riżultat ta’ l-IF joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri hija meħtieġa sabiex tkun kompluta l-analiżi.

Nota: Uża sors ta’ antikorpi validati ta’ R. solanacearum (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Huwa rrikmandat li d-dożar (titre) jiġi kkalkulat għal kull lott ta’ antikorpi. Id-dożar jissejjaħ bħala l-ogħla fattur ta’ dilwizzjoni fejn issir ir-reazzjoni ottimali meta tiġi ttestjata t-taħlita solida u likwida li fiha 105 sa 106 ċelluli per ml ta’ varjetà omologa ta’ R. solanacearum meta jintuża konjugat approprjat ta’ "fluorescein isothiocyanate" (FITC) skond ma’ jirrikmanda l-manufattur. L-antisjeri validati poliklonali kollha kellhom titru IF ta’ mill-inqas 1:2000. Waqt it-test, l-antikorpi jridu jintużaw dilwiti f’dilwizzjoni(jiet) li toqrob(joqorbu) jew li taqbel (jaqblu) eżattament mat-titru.

It-test irid isir fuq estratti minn kampjuni friski. Jekk tinħass il-ħtieġa, jista’ jsir fuq kampjuni jew estratti miżmuma fi –68 sa -86 °C taħt il-gliċerol. Il-gliċerol jista’ jitneħħa mill-kampjun permezz ta’ l-addizzjoni ta’ ml wieħed ta’ sustanza li żżomm il-kundizzjonijiet stabbli (Appendiċi 4), jsir mill-ġdid proċess ta’ ċentrifugazzjoni għal 15-il minuta veloċità 7000 g u jerġgħu jiħaltu fi volume indaqs ta’ buffer. Dan huwa sikwit meħtieġ, speċjalmet jekk il-kampjuni jiġu ffissati mal-pjastra permezz tas-sħana meta jinżammu fuq fjamma.

Ipprepara pjastri ta’kontrolli pożittivi separati tal-varjetà omologa jew xi varjetà oħra bħala referenza ta’ R. solanacearum, imħallta f’estratt tal-patata, kif speċifikat f’Appendiċi 3 B u mhux obligatorjament fi buffer.

Tessut infettat naturalment (miżmum billi jkun lijofiliżżat jew iffriżat temperatura ta’ –16 to –24 °C) jrid jintuża fejn hu possibli bħala kontroll simili fuq l-istess pjastra.

Bħala kontrolli negattivi, alikwoti ta’ kampjuni ta’ l-estratt li qabel ħarġu bħala testijiet negattivi għal R. solanacearum jistgħu jintużaw.

Materjali ta’ kontroll standardizzati pożittivi u negattivi li jistgħu jintużaw ma’ dan it-test huma mfassla fi Appendiċi 3.

Uża pjastri tal-mikroskopju li fihom ħafna ħofor preferibbilment għaxar aperturi ta’ dijametru ta’ sitt millimetri.

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

5.1. Ipprepara l-pjastri tat-test permezz ta’ wieħed minn dawn il-proċeduri li ġejjin:

(i) Għar-residwi (pellet) li għandhom relattivament kontenut żgħir ta’ sedimentazzjoni ta’ lamtu:

Qattar volum meqjus stàndard ta’ dilwizzjoni (15 µl huwa xieraq għal 6mm dijametru ta’ apertura – kabbar il-volum skond il-proporzjoni għal aperturi ikbar) ta’ 1/100 tar-residwu ta’ patata mħallat mill-ġdid, fl-ewwel apertura. Qattar volum simili ta’ residwu mhux dilwit (1/1) fuq l-aperturi li jifdal fuq il-filliera. It-tieni filliera tista’ tintuża bħala duplikata jew għall-użu ta’ kampjun ieħor kif ippreżentat fl-Illustrazzjoni 1.

(ii) Għar-residwu ieħor:

Ipprepara dilwizzjonijiet deċimali (1/10, 1/100) tar-residwu risospiża fil-buffer apposta. Qattar volum stàndard (15 µl huwa xieraq għal 6mm dijametru ta’ apertura – kabbar il-volum skond il-proporzjoni għal apertura ikbar) tar-residwu ta’ patata mħallat (imħallat mill-ġdid) mill-ġdid (suspended/resuspended pellet) u kull dilwizzjoni fi filliera ta’ aperturi. It-tieni filliera tista’ tintuża bħala duplikata jew għall-użu ta’ kampjun ieħor kif ippreżentat fl-Illustrazzjoni 2.

5.2. Nixxef il-qatriet f’temperatura ambjentali jew billi jissaħħan sa temperaturi ta’ 40 sa 45 °C. Iffissa ċ-ċelluli batteriċi mal-pjastra jew billi ssaħħan (15 il-minuta f’temperatura ta’ 60 °C), billi jinżammu fuq fjamma, permezz ta’ l-etanol 95 % jew skond istruzzjonijiet specifici mill-fornitur ta’ l-antikorpi.

Jekk tinħass il-ħtieġa, pjastri ffissati jistgħu jintrefgħu f’kontenitur apposta għat-tnixxif (dessicated box) għal żmien qasir kemm hemm bżonn (l-iktar żmien ta’ tlett xhur) qabel ma jsir ittestjar oħrajn.

5.3. Proċedura IF

(i) Skond il-preparazzjoni ta’ pjastra tat-test fi 5.1 (i):

Ipprepara set ta’ dilwizzjonijiet doppji. L-ewwel ħofra jrid ikollha 1/2 id-dożar (T/2), l-oħrajn 1/4 tad-dożar (T/4), 1/2 tad-dożar (T/2), id-dożar (T) u d-doppju tad-dożar (2T).

(ii) Skond il-preparazzjoni ta’ pjastra tat-test fi 5.1 (i):

Ipprepara d-dilwizzjonijiet sabiex jinħadem it-test (WD) ta’ l-antikorpi fil-buffer ta’ l-IF. Id-dilwizzjoni li tintuża fit-tħarriġ tat-test taffetwa l-ispeċifiċità.

Figura 1 Preparazzjoni tal-pjastra tat-test skond 5.1(i) u 5.3(i)

| Dilwizzjoni ta’ residwi ri sospiżi |

1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Dilwizzjoni ta’ residwi ri sospiżi |

(T = dożar) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Dilwizzjonijiet doppji ta’ antisjeru/antikorpi |

+++++ TIFF +++++

1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

+++++ TIFF +++++

6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Figura 2 Preparazzjoni tal-pjastra tat-test skond 5.1(ii) u 5.3(ii)

| Dilwizzjoniji użati ta’ antisjeru/antikorpi |

1/1 | 1/10 | 1/100 | vojt | vojt |  | Dilwizzjoni deċimali ta’ residwu ri sospiża |

+++++ TIFF +++++

1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

+++++ TIFF +++++

6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

5.3.1. Irranġa l-pjastri fuq karta assorbenti niedja. Għatti kull apertura ta’ test komopletament permezz ta’ dilwizzjoni(jiet) ta’ antikorpi. Il-volum ta’ antikorpi fuq kull apertura jrid ikun mill-inqas il-volum ta’ l-estratt applikat.

Il-proċedura li ġejja trid issir fl-assenza ta’ istruzzjonijiet speċifiċi mill-fornituri ta’ l-antikorpi.

5.3.2. Inkuba l-pjastri fuq karta umda taħt kopertura ta’ 30 minuta f’temperatura ambjentali (18 – 25 °C).

5.3.3. Neħħi l-qatriet minn kull pjastra u laħlaħ bil-galbu f’buffer IF. Aħsel billi tagħddas għal 5 minuti fi buffer-Tween IF (Appendiċi 4) u wara f’buffer IF. Evita li tagħmel kontaminazzjoni permezz ta’ arjusol jew qatriet żgħar. Neħħi bil-mod umdità eċċessiva permezz ta’ karti assorbenti.

5.3.4. Irranġa l-pjastri fuq karta niedja. Agħtti l-apertura tat-test bid-dilwit ta’ konjugat ta’ FITC użat fid-sejba tad-dożar. Il-volum tal-konjugat applikat fuq din l-apertura trid tkun identika għall-volum ta’ antikorpi użati.

5.3.5. Inkuba l-pjastri fuq karta umda taħt kopertura ta’ 30 minuta f’temperatura ambjentali (18 – 25 °C).

5.3.6. Neħħi il-qtar ta’ konjugat minn fuq il-pjastra billi ssir aġitazzjoni tal-pjastra. Laħlah u aħsel bħal qabel (5.3.3).

Neħħi bil-mod kull umidità eċċessiva.

5.3.7. Qattar 5-10 µl ta’ 0.1M gliċerol ibbufferjat bil-fosfat (Appendiċi 4) jew sostanza montanti li ma tiċċarax, li tinbiegħ kummerċjalment, fuq kull apertura applika pjastra żgħira sabiex tgħatti.

5.4. Interpretazzjoni tat-test IF:

5.4.1 Eżamina l-pjastri taħt mikroskopju epifluworexxenti permezz ta’ filtri xierqa għall-eċitament ta’ l-FITC, taħt immersjoni fiż-żejt jew ilma manjifikazzjoni ta’ 500-1000. Osserva l-apertura billi tħares ma’ żewġ dijametri li huma perpendikulari ma’ xulxin u mad-dawra perimetrika. Għal kampjuni li juru nuqqas jew ftit ċelluli osserva għall-inqas 40 aspett mikroskopiku.

Ivverifika l-pjastra ta’ kontroll pożittiva l-ewwel. Ic-ċelluli jridu jkunu fluworexxenti u imtebbgħin komopletament fid-dożar ta’ antikorpi immarkat jew fid-dilwizzjoni li tintuża għat-taħriġ tat-test. It-test IF (Ara Taqsima VI.A.5.) irid isir mill-ġdid jekk issir abberrazzjoni tat-tebgħa.

5.4.2. Osserva għall-preżenza ta’ ċelluli jleqqu li għandhom morfoloġija karatteristika ta’ R. solanacearum fl-apertura ta’ testjar fuq il-pjastri. (ara portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L-intesità fluworexxenti trid tkun ekwivalenti għal dik tal-varjetà ta’ kontroll pożittiva fl-istess dilwizzjoni. Ċelluli li huma mtebbgħin inkompletament jew bi fluworexxenza dgħajfa ma jridux jiġu meqjusa.

Jekk hemm suspett ta’ kontaminazzjoni it-test irid jerġa’ jsir. Dan jista’ jseħħ meta l-pjastri kollha minn lott juru ċelluli pożittivi minħabba kontaminazzjoni tal-buffer jew jekk ċelluli pożittivi jinstabu (il-barra mill-apertura) fuq il-kisja tal-pjastra.

5.4.3. Hemm bosta problemi relatati mat-test ta’ l-immunofluworexxenza. Popolazzjonijiet oħra ta’ ċelluli fluworexxenti b’morfoloġija atipika u batterji saprofitiċi reaġġenti bi morfoloġija u dimensjoni simili għal R. solanacearum jistgħu jinstabu fil-qalba tan-naħa tal-għarqub u fi residwi meħudin minn segmenti taz-zkuk.

5.4.4. Ikkonsidra biss ċelluli fluworexxenti b’dimensjonijiet u morfoloġija tipika miksuba fid-dożar jew dilwizzjoni magħżula għat-test ta’ antikorpi kif imfassal fi 5.3.

5.4.5. Interpretazzjoni tat-test ta’ l-IF:

(i) Jekk jinstabu ċelluli fluworexxenti bi morfoloġija karatteristika, ħu stima tan-numru ta’ ċelluli tipiċi per firxa mikroskopika u kkalkula n-numru ta’ ċelluli tipiċi per ml ta’ residwu imħallat mill-ġdid (Appendiċi 5).

It-test IF joħroġ pożittiv għal kampjuni b’mhux inqas minn 5x 103 ċelluli tipiċi per ml ta’ residwu risospiż. Il-kampjun huwa kkonsidrat potenzjalment ikkontaminat u testing ieħor irid isir.

(ii) Ir-riżultat IF joħroġ negattiv għall-kampjuni b’inqas minn 5x 103: għal kull ml ta’ residwu risospiż u l-kampjun huwa meqjus bħala negattiv. Testing ieħor mhux meħtieġ.

6. Test PCR

Prinċipji

Meta jsir it-test tal-PCR bħala t-test ta’ skrining prinċipali u joħroġ pożittiv, l-iżolament jew l-IF jrid isir bħala t-tieni test ta’ skrining obligatorju. Meta l-PCR jintuża bħala t-tieni test ta’ skrining u r-riżultat joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri huma meħtieġa sabiex tkun kompluta d-dijanjosi.

Użu komplet ta’ dan il-metodu bħala test ta’ skrining prinċipali huwa rrikmandat meta esperjenza speċjalizzata ġiet miksuba.

Nota: Testijiet preliminarji b’dan il-metodu jridu jaslu għall-sejba ta’ 103 sa 104 ċelluli ta’ R. solanacearum per ml miżjud ma’ estratti ta’ kampjuni li qabel ħarġu negattivi. Testijiet ta’ ottimizzazzjoni jistgħu jinħtieġu sabiex livelli massimi ta’ sensittività jinkisbu u speċifiċità f’kull laboratorju.

Agħmel użu ta’ reaġġenti PCR u protokolli (ara Appendiċi 6). Jekk possibli agħżel metodi li fihom kontroll intern.

Ħu prekawzjonijiet approprjati sabiex tevita kontaminazzjoni ta’ kampjuni ma’ DNA li qed ikun investigat. It-test tal-PCR irid isir minn esperti tekniċi, f’laboratorji dedikati speċifikament għall-bijoloġija molekolari, ħalli wieħed inaqqas kemm jista’ jkun il-possibiltà ta’ kontaminazzjoni ma’ DNA li qed ikun investigat.

Kontrolli negattivi (għall-proċeduri ta’ estrazzjoni ta’ DNA u PCR) għandhom dejjem jiġu meqjusa bħala l-kampjun finali fil-proċedura, sabiex jaċċertaw il-preżenza ta’ DNA minn sors ieħor.

Il-kontrolli negattivi li ġejjin iridu jiġu inklużi fit-test tal-PCR:

- Estratt mill-kampjun li preċedentament ħarġu negattivi għal R. solanacearum,

- Kontrolli għall-buffer użati għall-estrazzjoni tal-batterju u tad-DNA mill-kampjun,

- Taħlita mir-reazzjoni PCR.

Il-kontolli pożittivi li ġejjin għandhom jiġu inklużi:

- Alikwoti ta’ residwi risospiżi li magħhom ġie miżjud il-R. solanacearum (għall-preparazzjoni ara Appendiċi 3 B).

- Sospensjoni ta’ 106 ċellula għal kull ml ta’ R. solanacearum fl-ilma minn iżolat ta’ varjetà aggressiva (eż NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ara Appendiċi 3 B).

- Jekk hu possibli uża wkoll DNA estratt minn kampjuni tal-kontrolli pożittivi fit-test tal-PCR.

Sabiex tiġi evitata l-posssibiltà ta’ kontaminazzjoni pprepara kontrolli pożittivi f’ambjent separat mill-kampjuni li ħa jkunu ttestjati.

Estratti mill-kampjuni jridu jkunu kemm jista’ jkun safja minn ħamrija. Għalhekk jista’ jkun aħjar li wieħed jipprepara estratti minn patata maħsula jekk ser jintużaw protokolli ta’ PCR.

Materjali ta’ kontroll standardizzati pożittivi u negattivi li jistgħu jintużaw ma’ dan it-test huma mfassla fl-Appendiċi 3.

6.1. Metodi ta’ purifikazzjoni tad-DNA

Uża kampjuni ta’ kontroll pożittivi u negattivi kif imfassal hawn fuq (ara Appendiċi 3)

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

Hemm bosta metodi li jistgħu jintużaw għall-purifikazzjoni ta’ DNA li qed jiġi ttestjat għalih minn sustrati tal-kampjun, b’hekk jitneħħew fatturi li jfixklu l-proċess PCR u reazzjonijiet enzimatiċi oħra u tiżdied il-konċentrazzjoni ta’ DNA li qed tiġi ttestjatha fil-kampjun ta’ l-estratt. Il-metodu li ġej ġie ottimizzat għall-użu ma’ metodi PCR validati mfassla f’Appendiċi 6.

(a) Metodi skond Pastrik (2000)

1) Qattar 220 µl ta’ buffer li jintuża għall-iproċessar f’unitajiet żgħar (lysis buffer) (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0]) fi tubu Eppendorf ta’ 1.5 ml.

2) Żid 100 µl ta’ l-estratt tal-kampjun u qiegħed fuq blokka sħuna jew banjo sħun ta’ 95 °C għal 10 min.

3) Qiegħed it-tubu fis-silġ għal 5 min.

4) Żid 80 µl soluzzjoni ta’ stokk ta’ liżożimi (50 mg Liżożimi per ml fi 10 mM Tris HCl, pH 8.0) u inkuba fi 37 °C għal 30 min.

5) Żid 220 µl ta’ soluzzjoni A ta’ Easy DNA® (Invitrogen), ħallat sew permezz ta’ vortiċi u inkuba fi 65 °C għal 30 min.

6) Żid 100 µl ta’ Easy DNA® solution B (Invitrogen), ħallat permezz ta’ vortiċi bis-saħħa sakemm il-precipitate jimxi liberament fit-tubu u l-kampjun hu magħqud b’mod uniformi.

7) Żid 500 µl ta’ kloroform u vortex sakemm il-viskożità tonqos u t-taħlita hi omoġenja.

8) Għaddi minn ċentrifugazzjoni ta’ 15000 g għal 20 min fi 4 °C sabiex jisseparaw il-fażijiet separate minn stat ta’ interfażi.

9) Ittrasferixxi l-fażi ta’ fuq ġo tubu Eppendorf ġdid.

10) Żid ml wieħed ta’ etanol 100 % (–20 °C) ħallat b’vortiċi għal ftit u inkuba fuq silġ għal 10 minuti.

11) Iċċentrifuga b’15000g għal 20 minuta fi 4 °C u neħħi l-etanol mir-residwu.

12) Żid 500 µl 80 % ethanol (–20 °C) u ħallat billi taqleb it-tubu.

13) Iċċentrifuga b’15000g għal 10 minuta fi 4 °C u neħħi l-etanol mir-residwu.

14) Ħalli r-residwu jinxef fl-arja jew f’DNA speed vac.

15) Erġa’ ħallat ir-residwu f’100 µl UPW sterili u ħalli f’temperatura tal-kamra għal mill-anqas 20 minuta.

16) Aħżen f’temperatura ta’ –20 °C sakemm ikun hemm bżonn għal PCR.

17) Dawwar l-isfel il-precipitate abjad permezz taċ-ċentrifugazzjoni u uża 5 µl tas-supernatant li fih id-DNA għal PCR.

(b) Metodi oħra

Metodi oħra ta’ estrazzjoni, eż Qiagen DNeasy Plant Kit, jistgħu jintużaw jekk jiġu pprovati li huma ugwalment effettivi fil-purifikazzjoni tad-DNA minn kampjuni ta’ kontrolli li fihom 103 sa 104 ċellula ta’organiżmu patoġeniku per ml.

6.2. PCR

6.2.1. Ipprepara mudelli ta’ testjar u kontroll għall-PCR skond il-protokolli validati (Ara Taqsima VI.A.6.). Ipprepara deċimal ta’ sostanza dilwita ta’ estratt ta’ kampjun tad-DNA (1:10 f’UPW).

6.2.2. Ipprepara t-taħlita ta’ reazzjoni PCR approprjata f’ambjent ħieles minn kontaminazzjoni skond protokolli ppublikati. (Appendiċi 6). Fejn hu possibli, huwa indikat li jintuża protokoll PCR multiplex li jinkorpora wkoll kontroll PCR intern.

6.2.3. Żid 2-5 µl ta’ DNA extratt per 25 µl ta’ reazzjoni ta’ PCR f’tubi sterilizzati apposta skond protokolli PCR (ara Appendiċi 6)

6.2.4. Inkorpora kampjun ta’ kontroll negattiv li fih taħlita ta’ reazzjoni tal-PCR biss u żid l-istess sors ta’ UPW kif kien użat fit-taħlita tal-PCR minnflok il-kampjun.

6.2.5. Poġġi t-tubi fl-istess ċiklatur termali li intuża fl-ittestjar preliminari u ħaddem il-programm PCR ottimizzat kif xieraq (Appendiċi 6).

6.3. Analiżi tal-prodott PCR

6.3.1. Ifred l-amplikoni permezz ta’ l-elektrofloreżi agarose gel. Ħaddem mill-anqas 12 µl tat-taħlita ta’ reazzjoni tad-DNA amplIFikata minn kull kampjun imħallat b’3 µl loading buffer (Appendiċi 6) f’2.0 % (w/v) agarose gels f’tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (Appendiċi 6) f’5-8 V għal kull ċm. Uża marker tad-DNA xieraq, eż. "100 bp ladder".

6.3.2. Ikxef faxxi ta’ DNA billi ttebba’ fi etilju bromide (0.5 mg per L) għal 30-60 minuta bil-prekawzjonijiet adegwati għal-manipulazzjoni ta’ dan l-aġent mutanti.

6.3.3. Osserva l-ġel imtebba’ taħt UV banda qasira transillminazzjoni (λ = 302 nm) għal prodotti PCr amplifikati tad-daqs mistenni (Appendiċi 6) u iddokumenta kollox.

6.3.4. Għas-sejbiet/każijiet kollha ġodda ivverifika l-awtentiċità ta’ l-amplikon PCR billi twettaq analiżi tar-restrizzjoni ta’ l-enzimi fuq kampjun tad-DNA amplifikat li fadal billi tinkuba fl-aħjar temperatura u ħin b’enzima u buffer xierqa (ara l-Appendiċi 6). Ifred il-frammenti diġeriti mill-elettroforeżi bil-ġel agarożu kif sar qabel u osserva d-disinn karatteristiku ta’ restrizzjoni tal-frammenti taħt il-UV transilluminazzjoni wara li jiġi mtebba’ bl-etidjum bromide u qabbel ma’kontrolli pożittivi diġeriti u mhux.

Interpretazzjoni tar-riżultat tat-test ta’ l-PCR:

It-test tal-PCR huwa negattiv jekk l-amplikon PCR speċifiku ta’ R. solanacearum -tad-daqs mistenni mhux osservat fil-kampjun in kwistjoni iżda jinstab għall-kontrolli pożittivi kollha (fil-każ ta’ multiplex PCR bi primers ta’ kontroll interni speċifiċ għall-pjanti: prodott PCR ieħor ta’ dimensjoni mistennija għandu jiġi amplifikat bil-kampjun in kwestjoni).

It-test PCR joħroġ pożittiv jekk l-ampiklon speċifiku PCR ta’ R. solanacearum tad-daqs mistenni u d-disinn ta’ restrizzjoni (meta meħtieġ) huwa misjub, proviż li ma jiġix amplifikat minn kampjuni ta’ kontroll negattivi. Konferma soda ta’ riżultat pożittiv jista’ jinkiseb ukoll billi it-test jerġa’ jsir b’sett ieħor ta’ primers PCR (Appendiċi 6).

Nota: Tfixkil ta’ PCR jista’ jkun sospettat jekk l-ampiklon mistenni jinkiseb mill-kontroll pożittiv li fih R. solanacearum fl-ilma iżda riżultati negattivi jinkisbu minn kontrolli pożittivi ta’ R. solanacearum minn estratt ta’ patata. F’protokolli tal-PCR multiplex b’kontrolli tal-PCR interni, inibizzjoni tar-reazzjoni hi indikata meta l-ebda miż-żewġ amplikons huma miksuba.

Il-kontaminazzjoni tista’ tiġi suspettata jekk l-amplikon mistennija hu miksub minn waħda jew aktar tal-kontrolli negattivi.

7. Test FISH

Prinċipju:

Meta jsir it-test tal-PCR bħala t-test ta’ skrining principali u joħrog pożittiv, Iżolazzjoni jew test IF jrid isir bħala t-tieni test ta’ skrining obligatorju. Meta t-test ta’ l-FISH jintuża bħala t-tieni test ta’ skrining u r-riżultat joħroġ pożittiv, testijiet oħrajn skond l-iskema tal-proċeduri huma meħtieġa sabiex tkun kompluta d-dijanjosi.

Nota: Uża sondi validati R. solanacearum oligo speċifiċi. (ara Appendiċi 7). Testijiet preliminarji b’dan il-metodu jridu jaslu għall-sejba ta’ 103 sa -104 ċelluli ta’ R. solanacearum per ml miżjud ma’ estratti ta’ kampjuni li qabel ħarġu negattivi.

Il-proċedura li ġejja trid issir fuq estratt mill-kampjun frisk iżda jista’ jsir ukoll b’suċċess fuq estratt ta’ kampjun li kien ġie miżmum fil-gliċerol fi –16 sa –24 jew –68 sa –86 °C.

Bħala kontrolli negattivi, alikwoti ta’ kampjuni ta’ l-estratt li qabel ħarġu bħala testijiet negattivi għal R. solanacearum jistgħu jintużaw.

Bħala kontroll pożittiv ipprepara sospensjonijiet li fihom 105 sa 106 ċellula per ml ta’ R. solanacearum biovar 2 (eż varjetà NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ara Appendiċi 3) fi 0.01M ta’ buffer fosfat (PB) minn kolonja ta’ 3-5 ijiem). Ipprepara pjastri ta’ kontrolli pożittivi separati tal-varjetà omologa jew xi varjetà oħra bħala referenza ta’ R. solanacearum, imħallta f’estratt tal-patata, kif speċifikat f’Appendiċi 3 B u mhux obligatorjament fi buffer.

L-użu ta’ oligo sondi ewbatterjali immarkati FITC joffri kontroll għall-preżemza ta’ ibridizzazzjoni, la tali proċess itebba’ l-ewbatteri kollha li huma preżenti fil-kampjun.

Materjali ta’ kontroll standardiżżati pożittivi u negattivi li jistgħu jintużaw ma’ dan it-test huma mfassla fi Appendiċi 3 A).

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

7.1. Fissaġġ ta’ l-estratt tal-patata

Il-protokoll li ġej huwa bbażat fuq Wullings et al. (1998):

7.1.1. Ipprepara taħlil fissanti (ara Appendiċi 7).

7.1.2. Qattar 100 µl ta’ kull estratt tal-kampjun fi tubu Eppendorf u ċċentrifuga għal 7 minuti, velocità 7000 g.

7.1.3. Neħħi l-likwidu supernatanti residwu u ħoll ir-residwu fi 200 µl ta’ materjal fissativ ippreparat <24 siegħa minn qabel. Ħallat permezz ta’ vortiċi għal siegħa f’refriġerazzjoni.

7.1.4. Iċċentrifuga għal 7 minuti fi 7000 g, neħħi l-likwidu residwu, supernatanti u erġa’ ħoll parzjalment ir-residwu fi 75 µl 0.01M PB (ara Appendiċi 7).

7.1.5. Qattar tikek tat-taħlita riżultanti li ġiet iffissata fuq pjastra multitest nadifa kif imfassal fi dijagrama 7.1. Qiegħed żewġ kampjuni differenti fuq kull pjastra, li mhumhiex dilwiti u uża 10 µl sabiex tagħmel dilwizzjoni ta’ 1:100 (fi 0.01 M PB). mit-taħlil li jifdal tal-kampjun (49 µl) tista’ tinżamm fi –20 °C wara ż-żieda ta’ volum wieħed ta’ 96 % etanol. Jekk l-assay FISH jinħtieġ jerġa’ jsir, neħħi l-etanol permezz ta’ ċentrifugazzjoni u żid volum ugwali ta’ 0.01 PB (ħallat f’apparat ta’ vortiċi).

Dijagramma 7.1 Organizzazzjoni tal-pjastra għall-FISH

+++++ TIFF +++++

| | | | |

+++++ TIFF +++++

| | | | |

Pjastra 1 | | Pjastra 2 |

7.1.6. Nixxef il-pjastri fl-arja (jew fuq apparat apposta li jnixxef fi 37 °C) u ffissa fuq in-nar.

F’dan l-istadju l-proċedura tista’ tiġi sospiża u l-ibridizzazzjoni titkompla l-ġurnata ta’ wara. Il-pjastri jridu jinżammu ħielsa mit-trab u f’temperatura ambjentali.

7.2. Ibridizzazzjoni

7.2.1. Iġbed l-ilma minn ġewwa ċ-ċelluli fi serje ta’ etanol fi gradi ta’ 50 %, 80 % u 96 % għal minuta kull wieħed. Nixxef il-pjastri fl-arja fuq holder apposta.

7.2.2. Ipprepara kompartiment ta’ inkubazzjoni niedi billi tiksi l-qiegħ ta’ kaxxa ssigillata b’karti assorbenti jew karta ta’ filtrazzjoni mgħaddsa fi 1x hybmix (Appendiċi 7). Inkuba l-kaxxa minn qabel f’forn ta’ l-ibridizzazzjoni temperatura ta’ 45 °C għal mhux inqas minn 10 minuti.

7.2.3. Applika 10 μl ta’ soluzzjoni ta’ ibridizzazzjoni (Appendiċi 7) fi 8 aperturi (aperturi 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 u 10; ara Dij 7.1) ta’ kull pjastra u ħalli żewġ aperturi tan-nofs vojta (3 u 8).

7.2.4. Poġġi l-għatu tal ħġieġa (24 × 24 mm) fuq l-ewwel u l-aħħar erba’ aperturi mingħajr ma tinqabad l-arja. Qiegħed il-pjastri fil-kompartiment niedi u msaħħan u ibridiżża għal ħames sigħat fil-forn temperatura ta’ 45 °C, fid-dlam.

7.2.5. Ipprepara 3 tazzi ta’ litru wieħed ta’ Milli Q ilma (grad molekolari), 1 l ta’ 1x hybmix (334 ml 3x hybmix u 666 ml Milli Q water) u 1 l ta’ 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix u 958. ml Milli Q water). Pre-inkuba kull wieħed fi banju temperatura ta’ 45 °C.

7.2.6. Neħħi l-coverslips mill-pjastri u qiegħed il-pjastri fuq holder tal-pjastri apposta.

7.2.7. Laħlaħ is-sonda żejjed permezz ta’ inkubazzjoni għal 15 il-minuta fit-tazza bi 1x hybmix temperatura ta’ 45 °C.

7.2.8. Poġġi l-holder tal-pjastri fi 1/8 hybmix taħlil u inkuba għal 15 il-minuta oħra.

7.2.9. Bill il-pjastri brevement fi Milli Q soluzzjoni u qiegħdhom fuq biċċa karta assorbenti. Neħħi l’ umdità żejda billi tgħatti l-wiċċ b’biċċa karta assorbenti. Qattar 5-10 μl ta’ taħlil montanti li ma tiċċarax (eż Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA jew ekwivalenti) fuq kull apertura u qiegħed coverslip kbir qies (24 × 60 mm) fuq il-pjastra kollha.

7.3. Interpretazzjoni tat-Test FISH

7.3.1. Osserva l-pjastri mill-ewwel permezz ta’ mikroskopju mgħammar b’mikroskopija epifluworexxenti, qawwa ta’ 630 jew 1000 × immersjoni taħt iż-żejt. B’filtru addattat għal fluorescein isothiocyanate (FITC) ċelluli ewbatteriċi, (inkluż ċelluli gram negattivi) fil-kampjun huma mtebbgħin lewn aħdar fluworexxenti. Taħt filtru għal tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate, Cy3-ċelluli imtebbgħin ta’ R. solanacearum jidhru ħomor fluworexxenti. Qabbel il-morfoloġija taċ-ċelluli ma’ dik tal-kontrolli pożittivi. Iċ-ċelluli jridu jidhru fluworexxenti jgħajjat u kompletament imtebbgħin. (Taqsima VI.A.7.)It-test FISH jrid jerġa’ jsir jekk it-tebgħa hija aberrata. Osserva l-apertura billi tħares ma’ żewġ dijametri li huma perpendikulari ma’ xulxin u mad-dawra perimetrika. Għal kampjuni li juru nuqqas jew ftit ċelluli osserva għall-inqas 40 aspett mikroskopiku.

7.3.2. Osserva għall-preżenza ta’ ċelluli jleqqu li għandhom morfologija karatteristika ta’ R. solanacearum fl-apertura ta’ testjar fuq il-pjastri. (ara portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.). L-intensità fluworexxenti trid tkun daqs jew aħjar minn dik tal-varjetà fil-kontroll pożittiv. Ċelluli li huma mtebbgħin inkompletament jew bi fluworexxenza dgħajfa ma jridux jiġu meqjusa.

7.3.3. Jekk hemm suspett ta’ kontaminazzjoni t-test irid jerġa’ jsir. Dan jista’ jseħħ meta l-pjastri kollha minn lott juru ċelluli pożittivi minħabba kontaminazzjoni tal-buffer jew jekk ċelluli pożittivi jinstabu (il-barra mill-apertura) fuq il-kisja tal-pjastra.

7.3.4. Hemm bosta problemi relatati ma’ l-ispeċifiċità tat-test ta’ l-FISH. Popolazzjonijiet oħra ta’ ċelluli fluworexxenti b’morfoloġija atipika u batterji saprofitiċi reaġġenti bi morfoloġija u dimensjoni simili għal R. solanacearum jistgħu jinstabu fil-qalba tan-naħa ta’ l-għarqub u fi residwi meħudin minn segmenti taz-zkuk.

7.3.5. Ikkonsidra biss ċelluli fluworexxenti ta’ qisien u morfoloġija tipika.

7.3.6. Interpretazzjoni tar-riżultat tat-test ta’ l-FISH:

(i) Riżultati validi tat-test tal-FISH jinkisbu jekk ċelluli jleqqu ħodor fluworexxenti ta’ qisien u morfoloġija tipika ta’ R. solanacearum huma osservati permezz tal-filtru FITC u ċelluli ħomor fluworexxenti bil-filtru rhodamine f’kull kontroll pożittivu mhux f’ebda kontroll negattiv. Jekk jinstabu ċelluli fluworexxenti bi morfoloġija karatteristika, ħu stima tan-numru ta’ ċelluli tipiċi per firxa mikroskopika u kkalkula n-numru ta’ ċelluli tipiċi per ml ta’ residwu imħallat mill-ġdid (Appendiċi 4). Kampjuni li fihom mill-inqas 5x 103 ċellula tipika per ml ta’ residwu imħallat mill-ġdid huma kkonsidrati potenzjalment ikkontaminati. Tetsijiet oħrajn mhux meħtieġa. Kampjuni li fihom inqas minn 5x 103 ċellula tipika per ml ta’ residwu imħallat mill-ġdid huma kkonsidrati negattivi..

(ii) It-test FISH huwa negattiv jekk ċelluli jleqqu ħomor fluworexxenti b’qisien u morfoloġija tipika ta’ R. solanacearum ma jidhrux bil-filtru rhodamine, dejjem jekk ċelluli jleqqu ħomor fluworexxenti tipiċi huma osservati fil-kontrolli pożittivi meta jintuża l-filtru rhodamine.

8. Testijiet ELISA

Prinċipju:

ELISA jista’ jintuża bħala test ottimali meta miżjud ma’ IF, PCR jew FISH minħabba sensitività relattivament baxxa ta’ dan it-test. Meta jintuża DAS ELISA kundizzjonijiet ta’ sostanzjament u antikorpi monoklonali huma obbligatorji. (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Trobbija tal-kampjuni f’kundizzjonijiet ta’ sostanzjament huma meħtieġa sabiex is-sensitività tat-test jiżdied, iżda jista’ ma jirnexxix minħabba kompetizzjoni minn organiżmi oħra fil-kampjun.

Nota: Uża sors ta’ antikorpi validati ta’ R. solanacearum (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.). Huwa rrikmandat li d-dożar jiġi kkalkulat għal kull lott ta’ antikorpi. Id-dożar jissejjah bħala l-ogħla fattur ta’ dilwizzjoni fejn issir ir-reazzjoni ottimali meta jiġi ttestjat it-tahlita solida u likwida li fiha 105 sa 106 ċelluli per ml ta’ varjetà omologa ta’ R. solanacearum meta jintuża konjugat approprjat ta’ antikorpi sekondarji skond ma jirrikmanda l-manufattur. Waqt it-test, l-antikorpi jridu jintużaw dilwiti f’dilwizzjoni li toqrob jew li taqbel eżattament mal-formolazzjoni kummerċjali.

Sib id-dożar ta’ antikorpi f’sospensjoni ta’ 105 sa 106 ċellula per ml tal-varjetà omolga tar-R. solanacearum.

Inkludi kampjun ta’ l-estratt li qabel ħareġ negattiv għal R. solanacearum u sospensjoni ta’ batterji li ma jirreaġġux ma’ xulxin fi soluzzjoni ta’ phosphate buffered saline bħala kontroll negattiv.

Bħala kontrolli pożittivi uża alikwoti ta’ l-estratt tal-kampjun, li qabel ittestja negattiv, li jitħallat ma’ 103 sa 104 ċellula għal kull ml ta’ R. solanacearum bijovar 2 (eż varjazzjoni NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ara Appendiċi 2 A u B). Għat-tqabbil tar-riżultati fuq kull pjastra uża sospensjoni standard ta’ 105 sa 106 ċellula għal kull ml fi PBS ta’ R. solanacearum Aċċerta kontrolli pożittivi jinżammu separatai fuq pjastra mikrotitru mill-kampjun (i) li qed jiġi(u) ttestjat(i).

Materjali ta’ kontroll standardizzati pożittivi u negattivi disponibbli għall-użu ma’ dan it-test huma elenkati fl-Appendiċi 3 A.

Materjal ta’ kontroll tat-test f’mod identiku bħall-kampjun(i).

Żewġ protokolli ELISA ġew validati.

(a) ELISA indirett (Robinson Smith et al., 1995)

1) Uża 100-200 µl alikwoti ta’ estratt tal-kampjun. (Tisħin f’temperatura ta’ 100 °C għal erba’ minuti banjumarija jew f’heating block jista’ f’xi każi jnaqqas ir-riżultati non-speċifiċi).

2) Żid volum indaqs ta’ double strength coating buffer (Appendiċi 4) u ħallat permezz ta’ vortiċi.

3) Applika 100 µl alikwoti lil kull wieħed minn mill-anqas 2 ħofor ta’ pjastra ta’ mikrotritazzjoni (eż Nunc-Polysorp jew l-ekwivalenti) u poġġi f’inkubatur għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C jew matul il-lejl f’temperatura ta’ 4 °C.

4) Oħroġ f’daqqa l-estratti mill-ħofor. Aħsel il-ħofor tliet darbiet bil-PBS-Tween (Appendiċi 4), billi tħalli l-aħħar sustanza tal-ħasil fil-ħofor għal mill-anqas 5 minuti.

5) Ipprepara s-sustanza dilwita ta’ antikorpi xierqa kontra r-R. solanacearum f’blocking buffer (Appendiċi 4). Għall-antikorpi kummerċjali validati, uża s-sustanza dilwita rrikmandata (normalment ikkonċentrata darbtejn aktar mid-dożar).

6) Żid 100 µl lil kull ħofra u poġġi f’inkubatur għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C.

7) Oħroġ f’daqqa t-taħlil ta’ l-antikorp mill-ħofor u aħsel bħal qabel (4.).

8) Ipprepara s-sustanza dilwita xierqa ta’ konjugati fosfati sekondarji ta’ antikorpi alkalini fil-blocking buffer. Żid 100 µl lil kull ħofra u poġġi f’inkubatur għal siegħa f’temperatura ta’ 37 °C.

9) Oħroġ f’daqqa l-antikorp konjugat mill-ħofor u aħsel bħal qabel (4.).

10) Żid 100 µl taħlil sustrat alkalin fosfat (Appendiċi 4) lil kull ħofra. Poġġi f’inkubatur fid-dlam f’temperatura ambjentali u aqra l-assorbenza f’405 nm f’intervalli regolari fi żmien 90 minuta.

(b) DASI ELISA

1) Ipprepara t-taħlila dilwita ta’ anti-R. solanacearum polyclonal immunoglobulins xierqa f’coating buffer pH 9.6 (Appendiċi 4). Żid 200 µl lil kull ħofra. Poġġi f’inkubatur f’temperatura ta’ 37 °C għal 4-5 sigħat jew f’temperatura ta’ 4 °C għal 16-il siegħa.

2) Aħsel il-ħofor tliet darbiet bil-PBS-Tween (Appendiċi 4).

Żid 190 µl ta’ l-estratt tal-kampjun lil mill-anqas 2 ħofor. Żid ukoll kontrolli pożittivi u negattivi f’żewġ ħofriet għal kull pjastra. Poġġi f’inkubatur għal 16-il siegħa f’temperatura ta’ 4 °C.

3) Aħsel il-ħofor tliet darbiet bil-PBS-Tween (Appendiċi 4).

4) Ipprepara sustanza dilwita xierqa ta’ antikorpi monoklonali R. solanacearum-speċifiċi fil-PBS (appendiċi 4) li fih ukoll 0.5 % ta’ albumina sjeru bovin (BSA) u żid 190 µl lil kull ħofra. Poġġi f’inkubatur f’temperatura ta’ 37 °C għal sagħtejn.

5) Aħsel il-ħofor tliet darbiet bil-PBS-Tween (Appendiċi 4).

6) Ipprepara sustwanza dilwita xierqa ta’ anti-mouse immunoglobulins magħquda ma’ fosfati alkaliniċi fil-PBS. Żid 190 µl lil kull ħofra. Poġġi f’inkubatur f’temperatura ta’ 37 şC għal sagħtejn.

7) Aħsel il-ħofor tliet darbiet bil-PBS-Tween (Appendiċi 4).

8) Ipprepara taħlil ta’ sustrat fosfat alkaliniku li fiha 1 mg p-nitrophenyl phosphate għal kull ml ta’ sustrate buffer (Appendiċi 4). Żid 200 µl lil kull ħofra. Poġġi f’inkubatur fid-dlam f’temperatura ambjentali u aqra l-assorbenza f’405 nm f’intervalli regolari fi żmien 90 minuta.

Interpretazzjoni tar-riżultati tat-test ELISA:

It-test ELISA hu negattiv jekk il-qari tad-densità ottika medja (OD) minn kampjuni tal-ħofor duplikati huwa < 2 × OD ta’ dak fil-ħofra ta’ kontroll ta’ l-estratt ta’ kampjun negattiv, bil-kundizzjoni li l-OD għall-kontrolli pożittivi huma kollha aktar minn 1.0 (wara 90 minuta ta’ inkubazzjoni bis-sustrat) u huma akbar minn darbtejn l-OD miksub għall-estratti ta’ kampjun negattiv.

It-test ELISA huwa pożittiv jekk il-qari ta’ l-OD medju mill-kampjuni duplikati tal-ħofor hu > 2 × OD fil-ħofra ta’ l-estratt tal-kampjun negattiv bil-kundizzjoni li l-qari OD fil-ħofor ta’ kontroll negattiv kollha huma < 2 × OD ta’ dawk fil-ħofor ta’ kontroll pożittiv.

Qari ta’ l-ELISA negattiv fil-ħofor ta’ kontroll pożittiv jindikaw li t-test ma ġiex magħmul korrettament jew li dan ġie inibid. Qari ta’ l-ELISA pożittivi fil-ħofor ta’ kontroll negattiv jindikaw li seħħet kontaminazzjoni bejniethom jew li seħħet għaqda ta’ l-antikorpi mhux speċifika.

9. Test Bioassay

Nota: Ittestjar preliminari permezz ta’ dan il-metodu għandu jippermetti detezzjoni riproduċibbli ta’ 103 sa 104 ta’ unitajiet ta’ formazzjoni ta’ kolonji ta’ R. solanacearum għal kull ml miżjud lill-estratti ta’ kampjuni li qabel ittestjaw negattiv (preparazzjoni ara l-Appendiċi 3).

L-ogħla sensittività ta’ osservazzjoni tista’ tkun mistennija meta tuża estratti ta’ kampjuni ppreparati friski u kundizzjonijiet ta’ żvilupp ottimali. Iżda, il-metodu jista’ jiġi applikat b’suċċess lill-estratti li ġew miżmuma fil-gliċerol f’temperatura ta’ bejn –68 sa –86 °C.

Il-protokoll li ġej hu bbażat fuq Janse (1988):

9.1. Uża 10 pjanti ta’ l-ittestjar minn kultivazzjoni ta’ tadam suxxettibbli (eż Moneymaker jew cultivar b’suxxettibilità ekwivalenti kif determinat mil-laboratorju ta’ l-ittestjar) fit-tielet stadju true leaf għal kull kampjun. Għal dettalji tat-tkabbir, ara l-Appendiċi 8. Bħala alternattiva, uża brunġiel (eż cultivar Black Beauty jew cultivars li fihom suxxettibilità ekwivalenti), uża biss pjanti fil-leaf stage 2-3 sa l-espansjoni sħiħa tat-tielet stadju true leaf. Ġie muri li s-sintomi kienu anqas severi u li dawn jiżviluppaw aktar bil-mod fil-pjanta tal-brunġiel. Fejn hu possibbli, huwa għalhekk irrikmandat li jintużaw nebbieta tat-tadam.

9.2. Iddistribwixxi 100 µl ta’ estratt tal-kampjun bejn il-pjanti ta’ l-ittestjar.

9.2.1. Tilqim bis-siringa

Laqqam iż-żkuk tal-pjanta eżatt fuq il-kotiledoni bl-użu ta’ siringa mgħammra b’labra ipodermika (mhux anqas minn 23G). Iddistribwixxi l-kampjun bejn il-pjanti ta’ l-ittestjar

9.2.2. Tilqim permezz ta’ tiċrita żgħira

Billi żżomm il-pjanta bejn żewġt iswaba, qattar qatra (bejn wieħed u ieħor 5-10 µl) tar-residwu sospiż (suspended pellet) fuq iz-zokk bejn il-kotiledoni u l-ewwel werqa.

Permezz ta’ skalpell sterilizzat, għamel tiċrita żgħira dijagonali, ta’ madwar 1.0ċm għat-tul u ta’ bejn wieħed u ieħor 2/3 tal-fond tal-ħxuna taż-żokk, billi tibda l-qatgħa minfejn toħroġ l-ewwel qatra.

Issiġilla l-qatgħa b’vażelina sterili minn siringa.

9.3. Permezz ta’ l-istess teknika, laqqam 5 nebbieta b’taħlita ta’ l-ilma ta’ 105 sa 106 ċelluli għal kull ml preparat minn kultivazzjoni ta’ 48 siegħa ta’varjazzjoni aggressiva biovar 2 ta’ R. solanacearum bħala kontroll pożittiv u b’pellet buffer (Appendiċi 4) bħala kontroll negattiv. Issepara l-pjanti ta’ kontroll negattiv u pożittiv mill-pjanti l-oħra sabiex jiġi evitat kontaminazzjoni bejniethom.

9.4. Kabbar il-pjanti ta’ l-ittestjar f’faċilitajiet ta’ kwarantina sa 4 ġimgħat f’temperatura ta’ 25-30 °C u f’umdità relattiva għolja b’saqi addattat sabiex jiġi evitat li jinfaqgħu jew li jitbielu min-nuqqas ta’ ilma. Sabiex tevita l-kontaminazzjoni, poġġi l-pjanti ta’ kontroll pożittiv u dawk negattiv f’inkubatur fuq bankijiet isseparati b’mod ċar ġewwa serra jew kamra tat-tkabbir jew, fejn l-ispazju huwa limitat, assigura li jkun hemm separazzjoni stretta bejn it-trattamenti. Jekk pjanti għall-kampjuni differenti għandhom jiġu poġġuti f’inkubatur viċin xulxin, sseparahom permezz ta’ skrinijiet adattati. Meta tkun qed tiffertilizza, tispezzjona u manipulazzjonijiet oħra, ogħqod attent ħafna sabiex tevita l-kontaminjazzjoni bejniethom. Hu essenzjali li s-serer u l-kmamar tat-tkabbir jinżammu nieqsa minn kull insetti għaliex dawn jistgħu jittrasmettu l-batterju minn kampjun għal kampjun.

Osserva għal sintomi ta’ titbil, epinastija, klorożi u/jew twaqqif ta’ l-iżvilupp.

9.5. Iżola minn pjanti infettati (Sezzjoni II.3.) u identifika kultivazzjonijiet purifikati ta’ R. solanacearum preżunt (Sezzjoni VI.B.).

9.6. Jekk ma jiġux osservati sintomi wara 3 ġimgħat, eżegwixxi IF/PCR/Iżolazzjoni fuq kamjun kompost ta’ sezzjonijiet taz-zokk ta’ 1 ċm ta’ kull pjanta ta’ l-ittestjar meħud aktar ‘il fuq mis-sit tat-tilqima. Jekk it-test jirriżulta pożittiv, eżegwixxi metodu ta’ kisja b’dilwizzjoni.

9.7. Identifika kwalunkwe kultivazzjonijiet purifikati ta’ R. solanacearum preżunti (Sezzjoni VI.B.).

Interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bioassay

Riżultati tat-test Bioassay validi huma miksuba meta pjanti tal-kontroll pozittiv juru sintomi tipiċi, il-batterju jista’ jiġi iżolat mill-ġdid minn dawn il-pjanti u l-ebda sintomi ma jinsabu fil-kontrolli negattivi.

It-test Bioassay huwa negattiv jekk il-pjanti ta’ l-ittestjar m’humiex infettati minn R. solanacearum, u sakemm R. solanacearum huwa osservat f’kontrolli pożittivi.

It-test Bioassay huwa pożittiv jekk il-pjanti ta’ l-ittestjar huma infettati minn R. solanacearum.

B. TESTIJIET TA’ IDENTIFIKAZZJONI

Identifika kultivazzjonijiet puri ta’ kostitwenti iżolati ta’ R. solanacearum preżunti billi tuża għalmenu tnejn mit-testijiet li ġejjin bażati fuq prinċipji bijoloġiċi differenti.

Inkludi varjazzjonijiet ta’ referenza magħrufa fejn hu xieraq għal kull test imwettaq (ara l-Appendiċi 3).

1. Testijiet ta’ identifikazzjoni nutrizzjonali u enzimatiku

Iddetermina l-proprjetajiet fenotipiċi li ġejjin, li huma preżenti b’mod universali jew assenti fl-R. solanacearum, skond il-metodi ta’ Lelliott u Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001)

Test | Riżultat mistenni |

Produzzjoni tal-pigment fluworexxenti | – |

InkluzzjonijietPoly-βhydroxybutyrate | + |

Test ta’ Ossidazzjoni/Fermentazzjoni (O/F) | O+/F– |

Attività ta’ Katalażi | + |

Test ta’ Ossidazzjoni ta’ Kovac | + |

Riduzzjoni tan-nitrat | + |

Utilizzazzjoni taċ-ċitrat | + |

Tkabbir f’temperatura ta’ 40.000000 °C | – |

Tkabbir f’1 % NaCl | + |

Tkabbir f’2.000000 % NaCl | – |

Attività ta’ di-idrolażi arġinina | – |

Likwifikazzjoni tal-ġelatina | – |

Idrolisi tal-lamtu | – |

Idrolisi aesculin | – |

Produzzjoni tal-levan | – |

2. Test IF

2.1. Ipprepara taħlita ta’ ċelluli ta’ madwar 106 għal kull ml f’IF buffer (Appendiċi 4).

2.2. Ipprepara sustanza dilwita għal darbtejn ta’ antisjeru xieraq (ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Applika l-proċedura IF (Sezzjoni VI.A.5.).

2.4. Test IF pożittiv jinkiseb jekk id-dożar IF tal-kultivazzjoni huwa ekwivalenti għal dak tal-kontroll pożittiv.

3. Test ELISA

Nota: Jekk qed teżegwixxi 2 testijiet ta’ identifikazzjoni biss, tużax test seroloġiku addizzjonali għal dan il-metodu.

3.1. Ipprepara taħlita ta’ ċelluli ta’ madwar 108 għal kull ml f’1X PBS (Appendiċi 4).

3.2. Eżegwixxi proċedura ELISA xierqa b’antikorp ta’ monoklonu speċifiku għal R. solanacearum.

3.3. Test ELISA pożittiv huwa miksub jekk il-qari ta’ l-ELISA miksub mill-kultivazzjoni tkun ta’ mill-anqas nofs dik miksuba għall-kontroll pożittiv.

4. Test PCR

4.1. Ipprepara taħlita ta’ ċelluli ta’ madwar 106 għal kull ml f’ilma sterili ta’ grad mollekulari.

4.2. Saħħan 100 µl tat-taħlita taċ-ċelluli f’tubi magħluqa f’heating block jew banjumarija jagħli f’temperatura ta’ 100 °C għal 4 minuti. Il-kampjuni jistgħu imbagħad jiġu maħżuna f’temperatura ta’ –16 sa –24 °C sakemm ikun hemm bżonn.

4.3. Applika proċeduri PCR xierqa sabiex tamplifika l-amplikoni ta’ speċifiċità R. solanacearum (eż Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).

4.4. Identifikazzjoni pożittiva ta’ R. solanacearum tinkiseb jekk l-amplikoni tal-PCR huma ta’ l-istess daqs u għandhom l-istess poliformiżmi ta’ tul ta’ restrizzjoni tal-framment bħal dak għall-varjazzjoni ta’ kontroll pożittiv.

5. Test FISH

5.1. Ipprepara taħlita ta’ madwar 106 ċeluli għal kull ml f’UPW.

5.2. Applika l-proċedura FISH (Sezzjoni VI.A.7.) b’għalmenu 2 2. Oligo Sondi speċifiċi għal. R. Solanacearum (Appendiċi 7).

5.3. Test FISH pożittiv hu miksub jekk l-istess reazzjonijiet huma miksuba mill-kultivazzjoni u l-kontroll pożittiv.

6. Identifikazzjoni skond it-tip ta’ aċidi grassi (FAP)

6.1. Kabbar il-kultivazzjoni fuq trypticase soy agar (Oxoid) għal 48 siegħa f’temperatura ta’ 28 °C.

6.2. Applika proċedura FAP xierqa (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Test FAP pożittiv jinkiseb jekk il-profil tal-kultivazzjoni preżunta huwa identiku għal dik tal-kontroll pożittiv. Il-preżenza ta’ aċidi grassi karatteristiċi huma 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH u 18:1 2OH u l-assenza ta’ 16:0 3OH hija indikattiva ħafna ta’ l-ispeċi Ralstonia.

7. Metodi ta’ karatterizzazzjoni tal-varjetà

Il-karatterizzazzjoni tal-varjetà permezz ta’ l-użu ta’ waħda mill-metodi li ġejjin hija irrikkmandata għal kull każ ġdid ta’ iżolazzjoni ta’ R. solanacearum.

Inkludi varjazzjonijiet ta’ referenza magħrufa fejn hu xieraq għal kull test imwettaq (ara l-Appendiċi 3.)

7.1. Determinazzjoni Biovar

R. solanacearum huwa sseparat f’biovars a bażi ta’ l-abilità li tutilizza u/jew tossidizza tliet disaccharides u tliet alkoliċi hexose (Hayward, 1964 and Hayward et al., 1990). Medja tal-koltivazzjoni għat-test bijovar huwa mfassal fl-Appendiċi 2. It-test jista’ jsir b’suċċess permezz ta’ innoklazzjoni billi l-medja tittniffed b’kulturi safja ta’ iżolati ta’ R. solanacearum u inkubati fi 28 °C. Jekk il-medji huma mqassma f’pjastri ta’ kultivazzjoni fejn iċ-ċelluli jitrabbew f’ħofor, li kull pjastra fiha 96-il ħofra sterili (200 µl għal kull ħofra) tibdil fil-kulur minn aħdar żebbuġa għal isfar jista’ jiġi osservat f’72 siegħa, li jindika riżultat pożittiv tat-test.

| Biovar |

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

L-utilizzazzjoni ta’ | |

Maltosju | – | + | + | – | + |

Lattosju | – | + | + | – | + |

D (+) Cellobiose | – | + | + | – | + |

Mannitol | – | – | + | + | + |

Sorbitol | – | – | + | + | – |

Dulcitol | – | – | + | + | – |

Testijiet oħrajn jiddifferenzjaw il-biovar 2 subfenotipi

| Biovar 2A (distribuzzjoni madwar id-dinja) | Biovar 2A (Li tinsab fiċ-Ċile u l-Kolombja) | Biovar 2T (Li tinsab f’spazji tropikali) |

Utilizzazzjoni tat-trehalose | – | + | + |

Utilizzazzjoni tal-meso-inositol | + | – | + |

Utilizzazzjoni ta’D ribose | – | – | + |

Attività Pektolitika [101] | baxxa | baxxa | għoli. |

7.2. Teħid tal-marki tas-swaba Genomic

Divrenzjar mollekulari ta’ varjazzjonijiet fil-kumpless R. solanacearum jistgħu jinkisbu permezz ta’ l-użu ta’ bosta tekniċi, inkluż:

7.2.1. L-analiżi restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Cook et al., 1989)

7.2.2. Sekwenza ripetittiva PCR permezz ta’ l-użu tal-primers REP, BOX u ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3. L-analiżi amplified fragment length polymorphism (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. Metodi PCR

Primers speċifiċi PCR (Pastrik et al, 2002; ara l-Appendiċi 6) jistgħu jintużaw sabiex jiddivrenzjaw varjazzjonijiet li jappartjenu lid-diviżjoni 1 (biovars 3, 4 ad 5) u diviżjoni 2 (biovars 1, 2A and 2T) ta’ R. solanacearum, kif definit oriġinarjament mill-analiżi RFLP (Cook et al., 1989) u s-sekwenzar 16S rDNA (Tagħavi et al., 1996).

C. TEST TA’ KONFERMA

It-test ta’ patoġeniċità għandu jkun eżegwit bħala konferma finali ta’ djanjosi ta’ R. solanacearum u għall-valutazzjoni ta’ l-aggessività tal-kultivazzjonijiet identifikati bħala R. solanacearum.

1) Ipprepara inokulu ta’ ċelluli ta’ madwar 106 għal kull ml minn kultivazzjoni ta’ bejn l-24-48 siegħa ta’ l-iżolat li għandha tiġi ttestjata u varjazzjoni ta’ kontroll pożittiva xierqa ta’ R. solanacearum (e.ż. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ara l-Appendiċi 3).

2) Laqqam 5-10 tadam suxxettibbli jew nebbieta tal-pjanta tal-brunġiel fit-tielet true leaf stage (ara Sezzjoni VI.A.9).

3) Poġġi f’inkubatur sa ġimgħatejn f’temperatura ta’ 25-28 °C u umdità relattiva għolja b’saqi xieraq sabiex jiġi evitat tifqigħ jew stress tat-tbiela. Fil-każ ta’ kultivazzjonijiet puri, tbiela tipika għandha sseħħ fi żmien 14-il ġurnata. Jekk wara dan il-perjodu s-sintomi m’humiex preżenti, il-kultivazzjoni ma tistax tiġi kkonfermata bħala forma patoġenika ta’ R. solanacearum

4) Osserva għal sintomi ta’ titbil, epinastija, klorożi u/jew twaqqif ta’ l-iżvilupp.

5) Iżola minn pjanti sintomatiċi billi tneħħi sezzjoni taz-zokk madwar 2 ċm fuq il-punt tat-tilqima. Farrak u ħallat f’volum żgħir t’ilma distillat sterili jew 50 mM buffer tal-fosfat (Appendiċi 4). Iżola mit-taħlita permezz tat-tifrix jew strikjar tas-sustanza dilwita fuq medju adattat, preferibbilment fuq medju magħżul (Appendiċi 2), poġġi f’inkubatur għal 48-72 siegħa f’temperatura ta’ 28 °C u osserva l-formazzjoni ta’ kolonji tipiċi ta’ R. solanacearum.

Appendiċi 1

Laboratorji involuti fl-ottimizzazzjoni u l-validazzjoni tal-protokolli

Laboratorju [] | Lokalità | Pajjiż |

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Vjenna u Linz | l-Awstrija |

Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Il-Belġju |

Plantedirektoratet | Lyngby | Id-Danimarka |

Central Science Laboratory | York | Ingilterra |

Scottish Agricultural Science Agency | Edinburgh | Skozja |

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Franza |

Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre | Le Rheu | Franza |

Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | il-Ġermanja |

Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | il-Ġermanja |

State Laboratory | Dublin | L-Irlanda |

Dipartimento di Scienze e tecnologie Agroambientali | Bologna | l-Italja |

Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Verona | l-Italja |

Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | L-Olanda |

Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | L-Olanda |

Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lisbona | il-Portugall |

Centro Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Spanja |

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Valencia | Spanja |

Swedish University of Agricultural Sciences | Uppsala | l-Isvezja |

Appendiċi 2

Medji għall-iżolazzjoni u kultivazzjoni ta’ R.solanacearum

(a) Medja ta’ tkabbir ġenerali

Nutrijent Agar (NA)

Nutrijent Agar (Difco) | 23,0 g |

Ilma distillat | 1,0 L |

Iddissolvi l-ingredjenti u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Yeast Peptone Glucose Agar (YPGA)

Estratt tal-lamtu (Difco) | 5,0 g |

Bacto-Peptone (Difco) | 5,0 g |

D(+) Glukosju (monoidratat) | 10,0 g |

Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |

Ilma distillat | 1,0 L |

Iddissolvi l-ingredjenti u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Sucrose Peptone Agar (SPA)

Zokkor tal-kannamieli | 20,0 g |

Bacto-Peptone (Difco) | 5,0 g |

K2HPO4 | 0,50 g |

MgSO4.7H2O | 0,25 g |

Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |

Ilma distillat | 1,0 L |

pH 7,2 - 7,4 | |

Iddissolvi l-ingredjenti u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Medju Tetrazolium ta’ Kelman

Aċidi Casamino (Difco) | 1,0 g |

Bacto-Peptone (Difco) | 10,0 g |

Destrosju | 5,0 g |

Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |

Ilma distillat | 1,0 L |

Iddissolvi l-ingredjenti u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Ħalli jiksaħ sa 50 °C u żid taħlita sterilkizzata permezz tal-filtru ta’ 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (Sigma) sabiex tottjeni konċentrazzjoni finali ta’ 50mg għal kull L.

(b) Medji ta’ tkabbir selettiv validat

Medju SMSA (Englebrecht, 1994 kif modifikat minn Elphinstone et al., 1996)

Medju Basal | |

Aċidi Casamino (Difco) | 1,0 g |

Bacto-Peptone (Difco) | 10,0 g |

Gliċerol | 5,0 ml |

Bacto-Agar (Difco) ara Nota 2. | 15,0 g |

Ilma distillat | 1,0 L |

Iddissolvi l-ingredjenti u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Kessaħ għal 50 °C u żid taħlita ta’ stokk ta’ l-ilma sterilizzat permezz tal-filtru ta’ l-ingredjenti li ġejjin sabiex tikseb il-konċentrazzjonijiet finali speċifikati:

Crystal Violet (Sigma) | 5,0 mg għal kull L |

Polymixin-B-Sulphate | (Sigma P-1004) 600000 U (madwar 100 mg) għal kull L |

Bacitracin (Sigma B-0125) | 1250 U (madwar 25.0 mg) għal kull L |

Chloramphenicol (Sigma C-3175) | 5,0 mg għal kull L |

Penicillin-G (Sigma P-3032) | 825 U (madwar 0.5 mg) għal kull L |

2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (Sigma) | 50mg għal kull L |

Nota:

1. L-użu ta’ reaġġenti oħra minbarra dawk speċifikati hawn fuq jistgħu jeffettwaw it-tkabbir ta’ R.solanacearum.

2. Oxoid Agar #1 jista’ jintuża minflok Bacto-Agar (Difco). F’dan il-każ it-tkabbir ta’ R.solanacearum se jkun aktar bil-mod, anki jekk it-tkabbir ta’ saprofiti li qed jikkompetu jista’ wkoll jiġi ridott. Kolonji tipiċi ta’ R.solanacearum jistgħu jieħdu minn ġurnata sa jumejn biex jiffurmaw u l-kolorazzjoni ħamra tista’ tkun aktar ċara u aktar diffuża minn fuq Bacto-Agar.

3. Żieda fil-konċentrazzjoni ta’ bacitracin għal 2500 U għal kull L jista’ jnaqqas il-popolazzjonijiet ta’ batterji li qed jikkompetu mingħajr ma jaffettwa t-tkabbir ta’ Ralstonia solanacearum.

Żomm il-medji u t-taħliliet stokk ta’ antibijotiċi f’temperatura ta’ 4 °C fid-dlam u uża fi żmien xahar.

Il-pjastri m’għandhux ikollhom kondensazzjoni fil-wiċċ qabel ma jintużaw.

Evita t-tnixxif eċċessiv tal-pjastri.

Il-kontroll tal-kwalità għandha ssir wara l-preparazzjoni ta’ kull numru ġdid ta’ medju permezz tat-tqegħid ta’ taħlita ta’ kultivazzjoni ta’ referenza ta’ R.solanacearum (ara l-Appendiċi 3) u permezz ta’ l-osservanza ta’ kolonji tipiċi wara l-inkubazzjoni f’temperatura ta’ 28 °C għal 2-5 ġranet.

SMSA Broth (Elphinstone et al., 1996)

Ipprepara bl-istess mod kif għall-medju SMSA selective agar iżda ħalli barra l-Bacto-Agar u t-2,3,5-tetrazolium chloride.

Modified Wilbrink broth (Caruso et al., 2002)

Zokkor tal-kannamieli | 10,0 g |

Proteose peptone | 5,0 g |

K2HPO4 | 0,5 g |

MgSO4 | 0,25 g |

NaNO3 | 0,25 g |

Ilma distillat | 1 L |

Sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta u kessaħ sa 50 °C

Żid taħlit ta’ stokk ta’ antibijotiċi bl-istess mod kif għall-SMSA broth.

Appendiċi 3

A. Materjal ta’ kontroll standardizzat kummerċjalment disponibbli

(a) Iżolanti batteriċi

L-iżolanti batteriċi li ġejjin huma rrikkmandati għall-użu bħala materjal ta’ referenza standard kemm bħala kontrolli pożittivi (Tabella 1) jew waqt l-ottimizzazzjoni tat-testijiet sabiex jiġu evitati reazzjonijiet bejniethom (Tabella 2). L-varjazzjonijiet huma disponibbli fil-kummerċ minn:

1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK

2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, the Netherlands.

3. Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, France.

Skeda 1 Panel ta’ referenza ta’ l-iżolati ta’ R.solanacearum

NCPPB 4161 | 76 | B3B | il-Ġermanja | 2 |

NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | USA | 1 |

Nota: L-awtentiċità tal-varjazzjonijiet ta’ hawn fuq jistgħu jiġu garantiti biss jekk ġew minn kollezzjoni ta’ kultivazzjoni awtentika.

Skeda 2 SMT reference panel of serologically-or genetically-related bacteria for use in optimisation of detection tests.

Kodiċi NCPPB | SMT # | Kodiċi ieħor | L-identifikazzjoni |

NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa [] |

NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis [] |

NCPPB 4164 | — | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia [] |

NCPPB 4165 | — | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii [] |

NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567 CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii [] |

NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618 PD 2778 | Ralstonia sp. [] |

NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis [] |

NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli [] |

NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia [] |

NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae [] |

NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii [] |

NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Il-batterju li jikkawża l-marda tat-taħsir tal-pjanta tal-banana [] [] [] |

NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619 IPO S339 | Enterobacter sp. [] |

NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. [] |

NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621 IPO S306 | Ochrobactrum anthropi [] [] |

NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622 IPO 1693 | Curtobacterium sp. [] [] |

NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp. [] |

NCPPB 4173 | — | PD 2318 | Aureobacterium sp. [] |

NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1844.06 | Flavobacterium sp. [] [] |

(b) Materjal ta’ kontroll standardizzat kummerċjalment disponibbli

Il-materjal ta’ kontroll standard li ġej huwa disponibbli mill-kollezzjoni tal-kultivazzjoni tal-NCPPB.

Estratt tar-residwu tal-patata mnixxef bil-kesħa minn tuberi ta’ patata b’saħħitha bħala kontroll negattiv għat-testijiet kollha.

Estratt tar-residwu tal-patata mnixxef minn 200 tuberu ta’ patata b’saħħitha li fih ċelluli 103 sa 104 u 104 sa 106R. solanacearum biovar 2 (varjetà NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) bħala kontrolli pożittivi għal testijiet seroloġiċi u PCR. Peress illi l-vijabilità taċ-ċellula hija affettwata matul it-tnixxif permezz tal-kesħa, dawn m’humiex adattati bħala kontrolli standard għat-testijiet ta’ iżolazzjoni u l-bioasssay.

Taħlit iffissat permezz tal-formalina ta’ R.solanacearum biovar 2 (varjetà NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) f’ċelluli 106 għal kull ml bħala kontrolli pożittivi għal testijiet seroloġiċi.

B. Preparazzjoni ta’ kontrolli pożittivi u negattivi għat-testijiet ewlenin ta’ screening tal-PCR/IF u FISH

Ipproduċi kultivazzjoni ta’ 48 siegħa ta’ varjetà aggressiva ta’ R.solanacearum race3/biovar2 (e.g. strain NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) fuq medju basal SMSA u ħallat f’10 nM ta’ buffer tal-fosfat sabiex tikseb densità taċ-ċellula ta’ madwar 2x108 cfu għal kull ml. Dan issoltu jinkiseb permezz ta’ sospensjoni li hija ftit imdardra li hija ekwivalenti għal densità ottika ta’ 0.15 fi 600 nm.

Neħħi l-qalba tan-naħa ta’ l-għarqub ta’ 200 tuberu meħud minn produzzjoni tal-varjetà tal-ġilda bajda magħrufa li hi nieqsa minn R.solanacearum.

Ipproċessa t-truf ta’ l-għarqub bħas-soltu u erġa’ ħallat ir-residwu f’10 ml.

Ipprepara 10 mikrovjali ta’ 1.5ml sterili b’900 µl tar-residwu li reġa’ ġie mħallat.

Ittrasferixxi 100 µl tat-taħlita ta’ R.solanacearum lill-ewwel mikrovjal. Vortex.

Stabbilixxi livelli deċimali ta’ kontaminazzjoni billi tiddilwi aktar fil-ħames mikrovjali li jmiss.

Is-sitt mikrovjali kkontaminati se jkunu wżati bħala kontrolli pożittivi. L-erba’ mikrovjali li mhux kontaminati se jkunu wżati bħala kontrolli negattivi. Ittikketta l-mikrovjali kif imiss.

Ipprepara alikwoti ta’ 100 µl f’mikrovjali sterili ta’ 1.5 ml li b’hekk tikseb 9 replikajiet ta’ kull kampjun ta’ kontroll. Aħżen f’temperatura ta’ –16 sa –24 °C sakemm jintużaw.

Il-preżenza u kwantifikazzjoni ta’ R.solanacearum fil-kampjuni ta’ kontroll għandhom l-ewwel jiġu kkonfermati minn IF.

Għat-test PCR, wettaq estratt tad-DNA mill-kampjuni pożittivi u negattivi b’kull serje ta’ kampjuni ta’ l-ittestjar.

Għat-testijiet IF u FISH, wettaq test ta’ verifikazzjoni tal-konċentrazzjoni fuq kampjuni tal-kontroll pożittivi u negattivi b’kull serje ta’ kampjuni tat-test.

Għat-testijiet ta’ verifikazzjoni tal-konċentrazzjoni IF, FISH u PCR, R.solanacearum għandu jkun osservat f’almenu 106 u 104 ċelluli/ml tal-kontrolli pożittivi u mhux f’kwalunkwe mill-kontrolli negattivi.

Appendiċi 4

Buffers għall-proċeduri tat-testijiet

ĠENERALI: Buffers sterilizzati li mhux miftuħa jistgħu jinħażnu sa sena

1. Buffers għall-proċedura ta’ estrazzjoni

1.1. Buffer ta’ estrazzjoni (50 mM phosphate buffer, pH 7.0)

Dan il-buffer jintuza għall-estrazzjoni tal-batterju mit-tessuti tal-pjanti permezz ta’ omoġenizzazzjoni jew taħlit.

Na2HPO4 (anhydrous) | 4.26 g |

KH2PO4 | 2.72 g |

Ilma distillat | 1.00 L |

Iddissolvi l-ingredjenti, ċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Komponenti addizzjonali jistgħu jkunu utli kif ġej:

| Skop | Kwantità (għal kull L) |

Biċċiet irqaq tal-Lubrol | Deflocculant [] | 0.5 g |

DC silicone antifoam | Aġent Anti-foam [] | 1.0 ml |

Tetrasodju pirofosfat | Anti-ossidant | 1.0 g |

Polyvinylpyrrolidone-40000 (PVP-40) | Binding ta’ inibituri tal-PCR | 50 g |

1.2. Buffer ta’ residwu (10 mM phosphate buffer, pH 7.2)

Dan il-buffer jintuża għat-taħlita mill-ġdid u s-sustanza dilwita ta’ tuberu tal-patata tal-qalba tan-naħa ta’ l-arqub ta’ estratti tal-patata wara l-konċentrazzjoni f’residwu permezz taċ-ċentrifugazzjoni.

Na2HPO4.12H2O | 2.70 g |

NaH2PO4.2H2O | 0.4 g |

Ilma distillat | 1.0 L |

Iddissolvi l-ingredjenti, ċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

2. Buffers għat-test IF

2.1. Buffer IF (10 mM phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2)

Dan il-buffer jintuża għad-dilwizzjoni ta’ l-antikorpi.

Na2HPO4.12H2O | 2.7 g |

NaH2PO4.2H2O | 0.4 g |

NaCL | 8.0 g |

Ilma distillat | 1.0 L |

Iddissolvi l-ingredjenti, ċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

2.2. IF-buffer-Tween

Dan il-buffer jintuża għall-ħasil ta’ pjastri.

Żid 0.1 % Tween 20 lill-IF buffer.

2.3. Phosphate buffered glycerol, pH 7.6

Dan il-buffer jintuża bħala likwidu montanti fuq l-aperturi ta’ pjastri IF sabiex ikabbar il-fluworexxenza.

Na2HPO4.12H2O | 3.20 g |

NaH2PO4.2H2O | 0.15g |

Gliċerol | 50 ml |

Ilma distillat | 100 ml |

Taħlil montanti ta’ kontra ċ-ċarar jinsab fil-kummerċ eż Vectashield® (Vector Laboratories) jew Citifluor® (Leica).

3. Buffers għat-testijiet ELISA Indiretti

3.1. Buffer tal-kisi ta’ saħħa doppja, pH 9.6.

Na2CO3 | 6,360 g |

NaHCO3 | 11,720 g |

Ilma distillat | 1,00 l |

Ħoll l-ingredjenti, ċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Sodju sulfat (0.2 %) jista’ jiġi miżjud bħala antiossidant jekk ikun hemm il-bżonn sabiex tiġi evitata ż-żieda ta’ kompożizzjonijiet aromatiċi ossidanti.

3.2. 10X Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4

NaCL | 80.0 g |

KH2PO4 | 2.0 g |

Na2HPO4.12H2O | 29.0 g |

KCl | 2.0 g |

Ilma distillat | 1.0 L |

3.3. PBS-Tween

10X PBS | 100 ml |

10 % Tween 20 | 5. ml |

Ilma distillat | 895 ml |

3.4. Buffer (antikorp) li jibblokka (għandu jiġi ppreparat frisk).

10X PBS | 10 ml |

Polyvinylpyrrolidone-44000 (PVP-44) | 2.0 g |

10 % Tween 20 | 0.5 ml |

Ħalib tat-trab | 0.5 g |

Ilma distillat | għamel sa 100 ml |

3.5. Taħlil ta’ sustrat ta’ fosfat alkaliniku, pH 9.8

Diethanolamine | 97 ml |

Ilma distillat | 800 ml |

Ħallat u aġġusta għal pH 9.8 b’HCl ikkonċentrat

Agħmel sa 1 L b’ilma distillat.

Żid 0.2 g MgCl2

Iddissolvi 2 pilloli phosphatase sustrate ta’ 5 mg (Sigma) għal kull 15-il ml ta’ taħlil.

4. Buffers għat-testijiet DASI ELISA

4.1. Buffer tal-kisi, pH 9.6.

Na2CO3 | 1.59 g |

NaHCO3 | 2.93 g |

Ilma distillat | 1000 ml |

iddissolvi l-ingredjenti u ċċekkja l-pH 9.6.

4.2. 10X Phosphate saline buffer(PBS) pH 7.2-7.4

NaCl | 80.0 g |

NaH2PO4.2 H2O | 4.0 g |

Na2HPO4.12H2O | 27.0 g |

Ilma distillat | 1000 ml |

4.3. PBS-Tween

10X PBS | 50 ml |

10 % Tween 20 | 5 ml |

Ilma distillat | 950 ml |

4.4. Buffer tas-sustrat, pH 9.8.

Diethanolamine | 100 ml |

Ilma distillat | 900 ml |

Ħallat u aġġusta għal pH 9.8 b’HCl ikkonċentrat

Appendiċi 5

Determinazzjoni tal-livell ta’ kontaminazzjoni fit-testijiet IF u FISH

1. Għodd in-numru medju ta’ ċelluli fluworixxenti tipiċi għal kull aspett viżwali mikroskopiku (c)

2. Ikkalkula n-numru ta’ ċelluli fluworixxenti tipiċi għal kull slide window ta’ mikroskopju (C)

C = c × S/s

fejn | S | = | l-erja tal-wiċċ ta’ l-apertura ta’ multispot slide |

u | s | = | l-erja tal-wiċċ ta’ l-objective field |

| | K | = | koeffiċjent tat-tubu (1 jew 1.25) |

| | G | = | tkabbir ta’ l-oġġettiv (100x, 40x eċċ.) |

3. Ikkalkula n-numru ta’ ċelluli fluworixxenti tipiċi għal kull ml ta’ residwi li reġgħu ġew imħallta.

N = C × 1000/y x F

fejn | y | = | volum ta’ residwu li reġa’ ġie mħallat fuq kull apertura |

u | F | = | fattur ta’ dilwizzjoni ta’ residwu li ġie mħallat mill-ġdid. |

Appendiċi 6

Protokolli u reaġġenti tal-PCR validati

Nota: L-Ittestjar preliminari għandu jippermetti detezzjoni reproduċibbli ta’ ċelluli 103 sa 104 ta’ R. solanacearum għal kull ml ta’ estratt ta’ kampjun.

L-Ittestjar preliminari għandu wkoll juri li m’hemm l-ebda riżultati pożittivi foloz b’panel ta’ varjetajiet batteriċi magħżula (ara l-Appendiċi 3).

1. Protokoll PCR ta’ Seal et al.(1993)

1.1. Oligonucleotide primers

Forward primer OLI-1 | 5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′ |

Reverse primer Y-2 | 5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′ |

Daqs ta’ l-amplikon mistenni minn R.solanacearum template DNA = 288 bp

1.2. Taħlita ta’ reazzjoni tal-PCR

Reaġġent | Kwantità għal kull reazzjoni | Konċentrazzjoni finali |

UPW Sterili | 17,65 µl | |

10X PCR buffer [] (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |

Taħlita ta’ dNTP (20mM) | 0,25 µl | 0,2 mM |

Primer OLI-1 (20 µM) | 1,25 µl | 1µM |

Primer Y-2 (20 µM) | 1,25 µl | 1µM |

Taq polymerase (5U/µl) [] | 0,1 µl | 0,5 U |

Volum tal-kampjun | 2,0 µl | |

Volum totali: | 25 µl | |

1.3. Kundizzjonijiet ta’ reazzjoni tal-PCR

Ħaddem il-programm li ġej:

ċiklu wieħed ta’: | (i) | 2 minuti f’temperatura ta’ 96 °C (denaturation of template DNA) |

35 ċiklu ta’: | (ii) | 20 minuti f’temperatura ta’ 94 °C (denaturation of template DNA) |

| (iii) | 20 sekonda f’temperatura ta’ 68 °C (annealing of primers) |

| (iv) | 30 sekonda f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni tal-kopja) |

ċiklu wieħed ta’: | (v) | 10 minuti f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni finali) |

| (vi) | żomm f’temperatura ta’ 4 °C |

Nota: Dan il-programm ġie sfruttat għall-użu b’ċiklatur termali Perkin Elmer 9600. Modifikazzjoni tad-dewmien tal-fażijiet taċ-ċikli (ii), (iii) and (iv) jistgħu jkunu meħtieġa għall-użu ma’ mudelli oħra.

1.4. Analiżi tar-restrizzjoni ta’ l-enzimi ta’ l-amplikon.

Prodotti PCR amplifikati mid-DNA R.solanacearum jipproduċu distinctive restriction fragment length polymorphism ma’ l-enzimi Ava II wara inkubazzjoni f’temperatura ta’ 37 °C

2. Protokoll PCR ta’ Pastrik and Maiss (2000)

2.1. Oligonucleotide primers

Forward primer OLI-1 | 5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′ |

Reverse primer Y-2 | 5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′ |

Daqs ta’ l-amplikon mistenni minn R.solanacearum template DNA = 553 bp

2.2. Taħlita ta’ reazzjoni tal-PCR

Nota: Ottimizzat oriġinarjament għat-termoċiklatur MJ Research PTC 200 b’Gibco Taq Polymerase

Perkin Elmer AmpliTaq u buffer jistgħu jintużaw wkoll fl-istess konċentrazzjonijiet

Reaġġent | Kwantità għal kull reazzjoni | Konċentrazzjoni finali |

UPW Sterili | 16,025 µl | |

10X PCR buffer [] | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |

BSA (fraction V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |

Taħlita d-nTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |

Primer Ps-1 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |

Primer Ps-2 (10 µM) | 0,5 µl | 0,2 µM |

Taq polymerase (5U/µl) [] | 0,1 µl | 0,5 U |

Volum tal-kampjun | 5,0 µl | |

Volum totali: | 25,0 µl | |

2.3. Kundizzjonijiet ta’ reazzjoni tal-PCR

Ħaddem il-programm li ġej:

ċiklu wieħed ta’: | (i) | 5 minuti f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) |

35 ċiklu ta’: | (ii) | 30 minuti f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) |

| (iii) | 30 sekonda f’temperatura ta’ 68 °C (annealing of primers) |

| (iv) | 45 sekonda f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni tal-kopja) |

ċiklu wieħed ta’: | (v) | 5 minuti f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni finali) |

| (vi) | żomm f’temperatura ta’ 4 °C |

Nota: Dan il-programm hu ottimizzat għall-użu b’ċiklatur termali MJ Research PTC 200. Modifikazzjoni tad-dewmien tal-fażijiet taċ-ċikli (ii), (iii) u (iv) jistgħu jkunu meħtieġa għall-użu ma’ mudelli oħra.

2.4. Analiżi tar-restrizzjoni ta’ l-enzimi ta’ l-amplikon.

Prodotti PCR apmlifikati mid-DNA R.solanacearum jipproduċu distinctive restriction fragment length polymorphism ma’ l-enzimi Ava II wara inkubazzjoni f’temperatura ta’ 65 °C għal 30 minuta. Il-frammenti ta’ restrizzjoni miksuba minn R.solanacearum-framment speċifiku huma 457 bp u 96 bp fid-daqs.

3. Protokoll Multiplex PCR b’kontroll PCR intern (Pastrik et al., 2002)

3.1. Oligonucleotide primers

Forward primer RS-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |

Reverse primer RS-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |

Forward primer NS-5-F | 5′-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3′ |

Reverse primer NS-6-R | 5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′ |

Daqs amplikon mistenni minn mudell ta’ R.solanacearum DNA = 718 bp (sett ta’ primer RS)

Daqs amplikon mistenni mill-kontroll PCR intern 18S rRNA = 310 bp (sett ta’ primer NS)

3.2. Taħlita ta’ reazzjoni tal-PCR

Reaġġent | Kwantità għal kull reazzjoni | Konċentrazzjoni finali |

UPW Sterili | 12,625 µl | |

10X PCR buffer [] (15 mM MgCl2) | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |

BSA (fraction V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |

Taħlita d-nTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |

Primer RS-1-F (10µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |

Primer RS-1-R (10µM) | 2,0 µl | 0,8 µM |

Primer NS-5-F (10µM) [] | 0,15 µl | 0,06 µM |

Primer NS-6-R (10µM) [] | 0,15 µl | 0,06 µM |

Taq polymerase (5U/µl) [] | 0,2 µl | 1,0 U |

Volum tal-kampjun | 5,0 µl | |

Volum totali: | 25,0 µl | |

3.3. Kundizzjonijiet ta’ reazzjoni tal-PCR

Ħaddem il-programm li ġej:

ċiklu wieħed ta’: | (i) | 5 minuti f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) |

35 ċiklu ta’: | (ii) | 30 sekonda f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) |

| (iii) | 30 sekonda f’temperatura ta’ 58 °C (annealing of primers) |

| (iv) | 45 sekonda f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni tal-kopja) |

ċiklu wieħed ta’: | (v) | 5 minuti f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni finali) |

| (vi) | żomm f’temperatura ta’ 4 °C |

Nota: Dan il-programm hu ottimizzat għall-użu b’ċiklatur termali MJ Research PTC 200. Modifikazzjoni tad-dewmien tal-fażijiet taċ-ċikli (ii), (iii) and (iv) jistgħu jkunu meħtieġa għall-użu ma’ mudelli oħra.

3.4. Analiżi tar-restrizzjoni ta’ l-enzimi ta’ l-amplikon.

Prodotti PCR amplifikati mid-DNA R.solanacearum jipproduċu distinctive restriction fragment length polymorphism ma’ l-enzimi Bsm I jew Isoschizomere (e.g. Mva 1269 I) wara inkubazzjoni f’temperatura ta’ 65 °C għal 30 minuta.

4. Protokoll PCR biovar-speċifiku ta’ R.solanacearum (Pastrik et al, 2001)

4.1. Oligonucleotide primers

Forward primer RS-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |

Reverse primer Rs-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |

Reverse primer Rs-3-R | 5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′ |

Daqs amplikon mistenni minn R.solanacearum template DNA:

b’Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

b’Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

4.2. Taħlita ta’ reazzjoni tal-PCR

(a) Biovar 1/2-speċifiku PCR

Reaġġent | Kwantità għal kull reazzjoni | Konċentrazzjoni finali |

UPW Sterili | 12,925 µl | |

10X PCR buffer [] | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |

BSA (frazzjoni V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |

Taħlita ta’ d-NTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |

Primer Rs-1-F (10 µM) | 2 µl | 0,8 µM |

Primer Rs-1-R (10 µM) | 2 µl | 0,8 µM |

Taq polymerase (5U/µl) [] | 0,2 µl | 1 U |

Volum tal-kampjun | 5,0 µl | |

Volum totali: | 25,0 µl | |

(b) Biovar 3/4-speċifiku PCR

Reaġġent | Kwantità għal kull reazzjoni | Konċentrazzjoni finali |

UPW Sterili | 14,925 µl | |

10X PCR buffer [] | 2,5 µl | 1X (1,5 mM MgCl2) |

BSA (fraction V) (10 %) | 0,25 µl | 0,1 % |

Taħlita ta’ dNTP (20mM) | 0,125 µl | 0,1 mM |

Primer Rs-1-F (10 µM) | 1 µl | 0,4 µM |

Primer Rs-3-R (10 µM) | 1 µl | 0,4 µM |

Taq polymerase (5U/µl) [] | 0,2 µl | 1 U |

Volum tal-kampjun | 5,0 µl | |

Volum totali: | 25,0 µl | |

4.3. Kundizzjonijiet ta’ reazzjoni tal-PCR

Ħaddem dan il-programm li ġej kemm għal biovar 1/2-u għal biovar 3/4/5-reazzjonijiet speċifiċi:

ċiklu wieħed ta’: | (i) | 5 minuti f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) |

35 ċiklu ta’: | (ii) | 30 sekonda f’temperatura ta’ 95 °C (denaturation of template DNA) |

| (iii) | 30 sekonda f’temperatura ta’ 58 °C (annealing of primers) |

| (iv) | 45 sekonda f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni tal-kopja) |

ċiklu wieħed ta’: | (v) | 5 minuti f’temperatura ta’ 72 °C (estensjoni finali) |

| (vi) | żomm f’temperatura ta’ 4 °C |

4.4. Analiżi tar-restrizzjoni ta’ l-enzimi ta’ l-amplikon.

Prodotti PCR amplifikati mid-DNA R.solanacearum permezz ta’ l-użu ta’ primers Rs-1-F u Rs-1-R jipproduċu distinctive restriction fragment length polymorphism ma’ l-enzimi Bsm I jew Isoschizomere (e.g. Mva 1269 I) wara inkubazzjoni f’temperatura ta’ 65 °C għal 30 minuta. Prodotti PCR amplifikati mid-DNA R.solanacearum permezz ta’ l-użu ta’ Rs-1-F u Rs-3-R m’għandhomx siti ta’ restrizzjoni.

5. Preparazzjoni tal-Loading buffer

5.1. Bromphenol blue (10 %-stock solution)

Bromphenol blue | 5 g |

Ilma distillat (bidest) | 50 ml |

5.2. Loading buffer

Gliċerol (86 %) | 3,5 ml |

Bromphenol blue (5,1) | 300 µl |

Ilma distillat (bidest) | 6,2 ml |

6. 10X Tris Acetate EDTA (TAE) buffer, pH 8.0

Tris buffer | 48,40 g |

Aċtu aċetiku glaċjali | 11,42 ml |

EDTA (disodium salt) | 3,72 g |

Ilma distillat | 1,00 l |

Iddilwi għal 1X qabel l-użu.

Jinsab ukoll fil-kummerċ (eż. Invitrogen jew ekwivalenti).

Appendiċi 7

Reaġġenti validati għat-test FISH

1. Oligo-sondi

R.solanacearum-speċifika OLI-1-CY3: 5′-ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Sonda Ewbatterika EUB-338-FITC li mhux speċifiku: 5′-gct gcc tcc cgt agg agt-3′

2. Taħlil fissattiv

[TWISSIJA! IL FISSATTIV FIH PARAFORMALDEHYDE LI HUWA TOSSIKU ILBES L-INGWANTI U TIħUX NIFS ’IL ĠEWWA U HUWA RRIKKMANDAT LI WIEħED JAħDEM ĠEWWA FUME CUPBOARD]

(i) Saħħan 9 ml ta’ ilma ta’ grad mollekulari (eż ilma pur (UPW)) għal xi 60 °C u żid 0.4 g paraformaldehyde. Il-Paraformaldehyde jiddissolvi ruħu wara li żżid 5 qatriet ta’ 1N NaOH u wara li tħawwat b’oġġett manjetiku li jiddawwar.

(ii) Irranġa l-pH sa 7.0 billi żżid 0.1 M buffer tal-fosfat (PB; pH 7.0 u 5 qattriet ta’ HCl 1N. Iċċekkja l-pH permezz ta’ strippi ta’ indikazzjoni u aġġusta, jekk ikun hemm bżonn b’HCl jew NaOH. [TWISSIJA! TUŻAX METRU PH F’TAĦLIL LI FIHOM PARAFORMALEDHYDE]

(iii) Iffiltra t-taħlil minn ġo membrane filter ta’ 0.22 µm u żomm nieqes mit-trab f’temperatura ta’ 4 °C sakemm jerġa’ jintuża.

3. 3X Hybmix

NaCl | 2.7 M |

Tris-HCl | 60 mM (pH 7.4) |

EDTA (sterilizzat bil-filter u autoclaved) | 15 mM |

Iddilwi sa 1X kif meħtieġ.

4. Taħlil ta’ Ibridizzazzjoni

1X Hybmix | |

Sodium dodecyl sulphate (SDS) | 0.01 % |

Formamide | 30 %, |

sonda EUB 338 | 5 ng/μl |

sonda OLI-1 or OLI-2 | 5 ng/μl |

Ipprepara kwantiitajiet ta’ soluzzjonijiet ta’ l-ibridizzazzjoni skond il-kalkoli tat-Tabella 1. Għal kull pjastra (li fiha duplikati ta’żewġ kampjuni differenti) 90 μl ta’ soluzzjonijiet ta’ l-ibridizzazzjoni huma meħtieġa. PERESS ILLI L- FORMADIDE HUWA TOSSIKU ĦAFNA ILBES INGWANTI U ĦU L-PREKAWZJONIJIET TA’ SIGURTÀ MEĦTIEĠA!

Skeda 1 Kwantitajiet suġġeriti għall-preparazzjoni tat-taħlita ta’ ibridizzazzjoni

Nota: Aħzen kull solution li fiha oligo-sondi sensittivi għad-dawl fid-dlam f’temperatura ta’ –20 °C.

Ipproteġi kontra d-dawl tax-xemx dirett jew dawl ta’ l-elettriku waqt l-użu.

Numru ta’ pjastri: | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |

UPW Sterili | 23.1 | 92.4 | 138.6 | 184.8 | 231.0 |

3x hybmix | 30.0 | 120.0 | 180.0 | 240.0 | 300.0 |

1 % SDS | 0.9 | 3.6 | 5.4 | 7.2 | 9.0 |

Formamide | 27.0 | 108.0 | 162.0 | 216.0 | 270.0 |

EUB 338 (100 ng/μl) | 4.5 | 18.0 | 27.0 | 36.0 | 45.0 |

Sonda OLI-1 jew OLI-2 (100 ng/μl) | 4.5 | 18.0 | 27.0 | 36.0 | 45.0 |

Volum totali (μl) | 90.0 | 360.0 | 540.0 | 720.0 | 900.0 |

5. 0.1M Phosphate buffer, pH 7.0

Na2HPO4 | 8.52 g |

KH2PO4 | 5.44 g |

Ilma distillat | 1.00 L |

Iddissolvi l-ingredjenti, ċċekkja l-pH u sterilizza permezz ta’ l-autoclaving f’temperatura ta’ 121 °C għal 15-il minuta.

Appendiċi 8

L-kultivazzjoni tal-brunġiel u tadam

Iżra’ żrieragħ tat-tadam (Lycopersicon esculentum) jew brunġiel (Solanum melongena) f’kompost taż-żerriegħa ppastorizzata. Aqla’ n-nebbieta minn postha u ħawwilha post ieħor permezz ta’ fully expanded cotyledons (10 sa 14-il ġurnata) f’kompost tal-qsari pastorizzat.

Brunġiel jew tadam għandhom jitkabbru f’serra bil-kundizzjonijiet ambjentali li ġejjin qabel ma jitlaqqmu:

Tul tal-ġurnata: | 14-il siegħa jew, jekk itwal, tul naturali tal-ġurnata; |

Temperatura: | ġurnata: 21 sa 24 °C, lejl: 14 sa 18 °C, |

Varjetà suxxettibbli ta’ tadam: | "Moneymaker" |

Varjetà suxxettibbli ta’ brunġiel: | "Black Beauty" |

Fornituri: | ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main |

REFERENZI

1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

ANNESS III

1. Għal kull okkorrenza suspettata li għaliha riżultat pożittiv fit-test(ijiet) ta’ skrining ġie identifikat skond, għall-materjal tal-pjanti mniżżel u għall-każijiet l-oħra kollha, il-metodi rilevanti li jinsabu fl-Anness II, u l-konfermazzjoni jew konfutazzjoni permezz tat-tlestija ta’ dawn il-metodi hi mistennija, għandu jkun hemm żamma u konservazzjoni xierqa ta’:

- t-tuberi kollha ta’ kampjun u, kull meta hu possibbli, il-pjanti kollha ta’ kampjun,

- kwalunkwe estratt li fadal u materjal addizzjonali ppreparat għat-testijiet ta’ skrining eż pjastri immunofluworexxenti, u

id-dokumentazzjoni rilevanti kollha,

- sat-tlestija ta’ dawn il-metodi.

Żamma tat-tuberi se tagħti s-setgħa li jsiru ttestjar ta’ varjetà fejn hu possibbili.

2. Fil-każ ta’ konfermazzjoni pożittiva ta’ l-organiżmu, għandu jkun hemm żamma u konservazzjoni xierqa ta’:

- il-materjal speċifikat fil-paragrafu 1,

- kampjun tal-materjal tat-tadam jew brunġiel infettat li huwa innokulat bl-estratt tat-tuberu jew tal-pjanta, fejn huwa xieraq,

- il-kultura iżolata ta’ l-organiżmu sa mhux iktar minn xahar wara l-proċedura tan-notifikazzjoni skond l-Artikolu 5(2).

ANNESS IV

L-elementi fl-investigazzjoni msemmija fl-Artikolu 5(1)(a)(i) fejn hu rilevanti se jinkludi:

(i) postijiet tal-produzzjoni,

- patata li qed tikber jew kibret, li hi relatata klonalment ma’ patata misjuba infettata bl-organiżmu, li qed tikber jew li tkabbret,

- tadam li qed jikber jew li tkabbar li huwa mill-itess sors bħat-tadam misjub infettat mill-organiżmu,

- patata jew tadam li qed jikbru jew li tkabbru u li tpoġġew taħt kontroll uffiċjali minħabba fl-okkorrenza sospetta ta’ l-organiżmu,

- patata li qed tikber jew li tkabbret, li hija mkabbra bl-istess mod bħal patata li tkabbret f’postijiet ta’ produzzjoni misjuba infettata bl-organiżmu,

- it-tkabbir ta’ patata jew tadam u llokalizzati fl-inħawi ta’ postijiet ta’ produzzjoni infettati, inklużi dawk il-postijiet ta’ produzzjoni li jaqsmu t-tagħmir u l-faċilitajiet tal-produzzjoni direttament jew permezz ta’ kuntrattur komuni,

- l-użu ta’ ilma tal-wiċċ għall-irrigazzjoni jew traxxix minn kwalunkwe sors kontaminat jew suspettat li hu kkontaminat bl-organiżmu,

- bl-użu ta’ ilma tal-wiċċ għall-irrigazzjoni jew traxxix minn sors użat in komuni ma’ postijiet ta’ produzzjoni infestat jew suspettat li hu infestat bl-organiżmu,

- mgħarraq jew li ġie mgħarraq b’ilma tal-wiċċ ikkontaminat jew suspettat li hu kkontaminat bl-organiżmu;

(ii) ilma tal-wiċċ użat għall-irrigazzjoni jew traxxix ta’, jew li għarraq għalqa jew għelieqi jew post(ijiet) ta’ produzzjoni kkonfermat(i) li huwa(huma) infestat(i) bl-organiżmu.

ANNESS V

1. L-elementi li għandhom jiġu kkunsidrati fid-determinazzjoni tal-miżura ta’ kontaminazzjoni probabbli taħt l-Artikolu 5(1)(c)(iii), għandhom jinkludu:

- il-materjal tal-pjanti elenkat mkabbra f’post tal-produzzjoni speċifikat bħala kontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii),

- post(ijiet) tal-produzzjoni jew postijiet tal-ħażna b’xi konnessjoni tal-produzzjoni mal-lista ta’ materjal tal-pjanti speċifikat bħala kontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii), inkluż dawk li jaqsmu t-tagħmir tal-produzzjoni u faċilitajiet direttament jew permezz ta’ kuntrattur komuni,

- il-materjal tal-pjanti elenkat prodotti fil-post(ijiet) tal-produzzjoni msemmija fl-inċiż ta’ qabel, jew li jinsab f’dawn il-post(ijiet) tal-produzzjoni matul il-perjodu meta l-materjal tal-pjanti elenkat speċifikat bħala kontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii), kien preżenti fil-post tal-produzzjoni msemmija fl-ewwel inċiż,

- postijiet li jimmanipoloaw il-materjal tal-pjanti elenkat mill-postijiet tal-produzzjoni li jissemmew fl-inċiżi hawn fuq;

- kwalunkwe makkinarju, vettura, bastiment, maħżen, jew unitajiet tagħhom, u kwalunkwe oġġett ieħor inkluż materjal għall-ippakkjar, li setgħa ġie f’kuntatt mal-materjal tal-pjanti elenkat speċifikat bħala kontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii),

- kwalunkwe materjal tal-pjanti elenkat maħżun fi, jew f’kuntatt ma’, kwalunkwe mill-istrutturi jew oġġetti elenkati fl-inċiż ta’ qabel, qabel it-tindif u d-disinfezzjoni ta’ strutturi u oġġetti bħal dawn,

- bħala riżultat ta’ l-investigazzjoni u l-ittestjar taħt l-Artikolu 5(1)(a)(i), fil-każ tal-patata, dawk it-tuberi jew pjanti b’relazzjoni ta’ klonaġġ ta’ aħwa jew ta’ ġenituri lejn, u fil-każ tat-tadam, dawk il-pjanti bl-istess sors bħall-materjal tal-pjanti elenkat speċifikat bħala kontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii) u li għal dan, għalkemm setgħu ttestjaw negattiv għall-organiżmu, jidher li kontaminazzjoni hija probabbli minn konnessjoni ta’ klonaġġ. Ittestjar tal-varjetà tista’ ssir sabiex tiġi vverifikata l-identità tat-tuberi jew pjanti kontaminati, u

- post(ijiet) tal-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti elenkat imsemmi fl-inċiż ta’ qabel,

- post(ijiet) tal-produzzjoni tal-materjal tal-pjanti elenkat permezz ta’ l-użu ta’ l-ilma għall-irrigazzjoni jew għat-traxxix li ġie speċifikat taħt l-Artikolu 5(1)(c)(ii),

- materjali ta’ pjanti elenkati f’għelieqi li huma mgħarrqa bl-ilma tal-wiċċ ikkonfermat li huwa kkontaminat.

2. L-elementi li għandhom jiġu kkunsidrati fid-determinazzjoni tal-firxa possibbli taħt l-Artikolu 5(1)(c)(iii), għandhom jinkludu:

(i) f’każijiet taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iv),

- il-viċinanza ta’ postijiet oħra tal-produzzjoni li jkabbru l-materjal tal-pjanti elenkat,

- il-produzzjoni u l-użu komuni ta’ stokkijiet taż-żerriegħa tal-patata,

- postijiet tal-produzzjoni li jużaw ilma tal-wiċċ għall-irrigazzjoni u t-traxxix tal-materjal tal-pjanti elenkat f’każijiet fejn hemm jew kien hemm riskju ta’ run-off ta’ l-ilma tal-wiċċ minn, jew ta’ għarqa ta’, post(ijiet) tal-produzzjoni speċifikat(i) bħala kontaminat(i) taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii).

(ii) f’każijiet fejn l-ilma tal-wiċċ ġie speċifikat bħala kontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(c)(ii):

- post(ijiet) tal-produzzjoni li jipproduċi(jipproduċu) materjal tal-pjanti elenkat maġenb, jew f’riskju ta’ għarqa minn, l-ilma tal-wiċċ speċifikat bħala kontaminat,

- kwalunkwe baċir ta’ l-irrigazzjoni diskret assoċjat ma’ l-ilma tal-wiċċ speċifikat bħala kontaminat,

- partijiet ta’ l-ilma f’kuntatt ma’ l-ilma tal-wiċċ speċifikat bħala kontaminat, meta tikkunsidra:

- id-direzzjoni u r-rata tal-fluss ta’ l-ilma speċifikat bħala kontaminat,

- il-preżenza ta’ pjanti ta’ provenjenza, slavaġ tal-familja Solanaceae.

3. In-notifika msemmija fl-ewwel subparagrafu ta’ l-Artikolu 5(2) għandha tkun ipprovduta kif gej:

- immedjatament wara l-konferma tal-preżenza ta’ l-organiżu permezz ta’ ttestjar mil-laboratorju, permezz ta’ l-użu tal-metodi msemmija fl-Anness II, almenu:

- għall-patata,

(a) l-isem tal-varjetà tal-lott,

(b) il-varjazzjoni (tip, żerriegħa, eċċ) u fejn hu applikabbli l-kategorija taż-żerriegħa,

- għall-pjanti tat-tadam, l-isem tal-varjetà tal-lott u, fejn hu applikabbli, il-kategorija.

- bla preġudizzju għall-kundizzjonijiet għan-notifika ta’ okkorrenza suspettata fl-Artikolu 4,(3), l-Istat Membru li fih l-okkorrenza ġiet ikkonfermata għandu, fejn ikun hemm riskju ta’ kontaminazzjoni ta’ materjal tal-pjanti elenkat minn jew għal ġewwa Stat(i) Membru(Membri) ieħor(oħra), jgħarraf immedjatament l-Istat(i) Membru(Membri) kkonċernat(i) b’informazzjoni neċessarja sabiex ikun(u) konformi għall-Artikolu 5.3, bħal:

(a) l-isem tal-varjetà tal-lott tal-patata,

(b) l-isem u l-indirizz ta’ dak li għamel il-kunsinja u tad-destinatarju,

(d) id-daqs tal-lott tal-patata jew tadam mqassma,

(e) kopja tal-passaport tal-pjanta jew almenu n-numru tal-passaport tal-pjanta fejn hu neċessarju u n-numru ta’ reġistrazzjoni tal-koltivatur jew tal-venditur u kopja ta’ l-avviż tal-kunsinja fejn hu neċessarju.

Il-Kummissjoni se tkun mgħarrfa immedjatament meta din l-informazzjoni tkun ġiet ipprovduta.

4. Id-dettalji tan-notifika addizzjonali msemmija fl-ewwel subparagrafu ta’ l-Artikolu 5(2) għandhom ikunu pprovduti kif ġej:

Wara l-finalizzazzjoni ta’ l-investigazzjonijiet kollha, għal kull każ:

(a) id-data li fiha kienet ġiet notifikata l-kontaminazzjoni,

(b) deskrizzjoni fil-qosor ta’ l-investigazzjoni li saret għall-identifikazzjoni tas-sorsi u t-tixrid possibbli tal-kontaminazzjoni, inklużi l-livelli ta’ kampjunar li saru,

(d) dettalji tal-miżura tal-kontaminazzjoni speċifikata, inkluż in-numru ta’ postijiet tal-produzzjoni u għall-patata, in-numru ta’ lotts b’indikazzjoni tal-varjetà u, jekk żerriegħa tal-patata, il-kategorija,

(e) dettalji tad-demarkazzjoni taż-żona, inkluż in-numru ta’ postijiet tal-produzzjoni, li mhumiex speċifikati bħala kontaminati, iżda inkluzi fiż-żona,

(f) dettalji ta’ l-ispeċifikazzjoni ta’ l-ilma, inkluż l-isem u l-lokalità ta’ l-organiżmu ta’ l-ilma u l-miżura tal-projbizzjoni fuq l-ispeċifikazzjoni/irrigazzjoni,

(g) għal kwalunkwe kunsinja ta’ pjanta tat-tadam jew lott speċifikat bħala kontaminat, iċ-ċertifikati preskritti fl-Artikolu 13(1) ii tad-Direttiva 2000/29/KE u n-numru tal-passaport, skond l-elenku fl-Anness V, Parti A, Sezzjoni I.2.2 tad-Direttiva 2000/29/KE,

(h) informazzjoni oħra relatata mat-tifqigħa kkonfermata kif jista’ jiġi rikjest mill-Kummissjoni.

ANNESS VI

1. Id-dispożizzjonijiet li jissemmew fl-Artikolu 6(1) għandhom:

- użu bħala għalf ta’ l-annimali wara trattament bis-sħana b’mod li ma jkun hemm l-ebda riskju li l-organiżmu jibqa’ jgħix,

jew

- jintremew f’sit apposta uffiċjali dedikat għal hekk fejn ma hemm ebda riskju identifikabbli ta’ ħarbien ta’ l-organiżmu fl-ambjent eż permezz ta’ nixxa fl-art agrikola jew kuntatt ma’ egħjun ta’ l-ilma li jistgħu jintużaw għall-irigazzjoni ta’ l-art agrikola,

jew

- inċinerazzjoni,

jew

- proċessar industrijali permezz ta’ tqassim dirett u immedjat lill-impjant ta’ pproċessar b’faċilitajiet ta’ rimi ta’ skart approvat li għalih ġie stabbilit li m’hemm l-ebda riskju identifikat li l-organiżmu jista’ jinfirex, u b’sistema ta’ tindif u disifezzjoni ta’ mill-anqas il-vetturi li jitilqu mis-sît,

jew

- miżuri oħrajn, bil-kondizzjoni li ġie stabbilit li ma hemm ebda riskju identifikabbli għat-tixrid ta’ l-organiżmu dawn il-miżuri l-ġustifikazzjoni tagħhom għandhom jiġu nnotifikati lill-Kummissjoni u lill-Istati Membri l-oħrajn.

Xi skart li jibqa’ assoċjat ma’ u riżultat ta’ l-għażliet hawn fuq għandu jintrema b’metodi li huma uffiċjalment approvati skond l-Anness VII ta’ din id-Direttiva.

2. L-użu jew rimi tal-materjal tal-pjanti elenkat imsemmi fl-Artikolu 6(2), taħt il-kontroll tal-korpi uffiċjali responsabbli ta’ l-Istat(i) Membru(Membri) kkonċernat(i), b’komunikazzjoni xierqa bejn korpi uffiċjali responsabbli biex jassiguraw kontroll bħal dan f’kull ħin u approvazzjoni mill-korpi uffiċjali responsabbli ta’ l-Istat Membru fejn il-patata għandha tkunu ppakkjata jew ipproċessata fil-każ tal-faċilitajiet ta’ rimi ta’ l-iskart imsemmija fl-ewwel u t-tieni inċiż, ser ikun:

(i) għal tuberi tal-patata,

- użu bħala patata ta’ varjazzjoni (ware potato) intiża għall-konsum, ippakkjata lesta għat-tqassim dirett u uża mingħajr ippakkjar mill-ġdid, f’sit b’faċilitajiet ta’ rimi ta’ l-iskart apposta. Patata intiża għat-tħawwil tista’ tiġi mmaniġġjata biss fl-istess sit, jekk dan isir separatament jew wara t-tindif u d-disinfettar,

jew

- użu bħala patata ta’ varjazzjoni intiża għall-ipproċessar industrijali, u intiża għat-tqassim dirett u immedjat lill-impjant ta’ ipproċessar b’faċilitajiet ta’ rimi ta’ l-iskart xieraq u sistema ta’ tindif u diżinfettar ta’ mill-anqas il-vetturi li jitilqu mis-sît,

jew

- użu jew rimi ieħor, bil-kundizzjoni li jkun stabbilit li m’hemmx riskju identifikabbli li l-organiżmu jinfirex u suġġett għall-approvazzjoni minn dawn il-korpi uffiċjali responsabbli.

(ii) għal partijiet oħra ta’ pjanti inkluż debris magħmul minn zkuk u weraq,

- distruzzjoni,

jew

- użi jew rimi ieħor, bil-kondizzjoni li ġie stabbilit li ma hemm ebda riskju identifikabbli għat-tixrid ta’ l-organiżmu u li huma soġġetti għall-approvazzjoni mill-korpi risponsabbli.

3. Il-metodi xierqa għad-dekontaminazzjoni ta’ l-oġġetti msemmija fl-Artikolu 6(3) għandhom ikunu t-tindif u, fejn hu xieraq, disinfezzjoni, b’mod li ma jkun hemm l-ebda riskju li l-organiżmu jinfirex u għandhom jinħadmu taħt is-sorveljanza tal-korpi uffiċjali responsabbli ta’ l-Istati Membri.

4. Is-serje ta’ miżuri li għandhom jiġu implimentati mill-Istati Membri fiż-żona (żoni) demarkata (demarkati) stabbiliti taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iv) u (c)(iii) u msemmija fl-Artikolu 6(4) għandhom jinkludu:

4.1. f’każijiet fejn postijiet tal-produzzjoni ġew speċifikati bħala kontaminati taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii):

(a) f’għalqa jew unità ta’ produzzjoni ta’ prodott tar-raba’ protett speċifikat bħala kontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii), jew

(i) matul għall-inqas l-erba’ snin ta’ żvilupp wara l-kontaminazzjoni speċifikata,

- miżuri għandhom jittieħdu sabiex jiġu eliminati pjanti tal-patata u tadam volontarji kif ukoll pjanti oħra ta’ provenjenza ta’ l-organiżmu inkluż ħaxix ħażin li jappartjeni għall-familja ta’ pjanti Solanacaeae,

- dawn li ġejjin m’għandhomx jiġu miżrugħa:

- tuberi ta’ patata, pjanti jew żrieragħ,

- pjanti u żerriegħ tat-tadam,

- meta tikkunsidra l-bijoloġija ta’ l-organiżmu,

- pjanti ta’ provenjenza oħrajn,

- pjanti ta’ l-ispeċji Brassica, li għalihom hemm riskju identifikat li l-organiżmu jibqa’ jgħix.

- prodotti tar-raba’ li għalihom hemm riskju identifikat li l-organiżmu jinfirex;

- fl-ewwel staġun ta’ ħiddma tal-patata jew tadam wara l-perjodu speċifikat fl-inċiż ta’ qabel, u b’kundizzjoni li l-għalqa instabet libera minn patata voluntiera u pjanti tat-tadam u pjanti ta’ provenjenza oħra inkluż ħaxix ħażin li jappartjeni lill-familja ta’ pjnati Solananacaeae waqt spezzjonijiet għal mill-anqas is-sentejn ta’ tkabbir konsekuttivi qabel it-tħawwil,

- fil-każ tal-patata, tista’ ssir biss il-produzzjoni tal-varjazzjoni tal-patata,

- fil-każ tal-patata u t-tadam, it-tuberi tal-patata, jew il-pjanti tat-tadam maħsuda, kif inhu l-każ, għandhom jiġu ttestjati skond il-proċedura mfissra fl-Anness II

- Fl-istaġun ta’ tkabbir tal-patata jew tadam li jiġi wara dak imsemmi fl-inċiż ta’ qabel u skond ċiklu ta’ rotazzjoni xieraq, għall-patata għall-produzzjoni taż-żerriegħ għandha tkun ta’ sentejn, u studju uffiċjali għandu jitmexxa kif imfisser fl-Artikolu 2(1);

jew

(ii) matul il-ħames snin ta’ tkabbir ta’ wara l-kontaminazzjoni speċifikata,

- l-għalqa għandha tkun stabbilita u miżmuma matul l-ewwel tliet snin jew, fi stat mhux maħdum jew, b’ċereali skond ir-riskju identifikat, jew, f’mergħa permanenti b’close cutting jew mergħa intensif jew, b’ħaxix għall-produzzjoni taż-żerriegħa, segwita minn tħawwil fis-sentejn ta’ wara b’pjanti li mhumiex ta’ provenjenza ta’ l-organiżmu li għalih m’hemm l-ebda riskju li l-organiżmu jibqa’ jgħix jew li jinfirex,

- fl-ewwel staġun ta’ tħawwil tal-patata jew tadam wara l-perjodu speċifikat fl-inċiż ta’ qabel, u b’kundizzjoni li l-għalqa instabet ħielsa minn patata voluntiera u pjanti tat-tadam u pjanti ta’ provenjenza oħra inkluż ħaxix ħażin li jappartjeni lill-familja ta’ pjanti Solananacaeae waqt spezzjonijiet għal mill-anqas is-sentejn ta’ tkabbir konsekuttivi qabel it-tħawwil,

- fil-każ tal-patata, tista’ ssir produzzjoni taż-żerriegħa jew tal-varjazzjoni tal-patata,

- fil-każ tal-patata u t-tadam, it-tuberi tal-patata, jew il-pjanti tat-tadam maħsuda, kif inhu l-każ, għandhom jiġu ttestjati skond il-proċedura mfissra fl-Anness II;

(b) fl-għelieqi l-oħrajn kollha tal-post ikkontaminat u bil-kondizzjoni li u b’kundizzjoni li l-korpi uffiċjali responsabbli huma sodisfatti li r-riskju li pjanti tal-patata u tat-tadam voluntiera u pjanti ta’ provenjenza oħra misjuba b’mod naturali ta’ l-organiżmu inluż ħaxix ħażin li jappartjeni għall-familja tal-pjanti solanacaeae kif inhu xieraq ġew eliminati:

- matul is-sena ta’ tkabbir ta’ wara l-kontaminazzjoni speċifikata,

- jew m’għandhomx jiġu mħawwla tuberi tal-patata jew żerriegħa ta’ veru, jew pjanti ta’ provenjenza oħra ta’ l-organiżmu,

jew

- fil-każ tat-tuberi tal-patata, patata taż-żrieragħ ċertifikati jistgħu jiġu kkoltivati għall-produzzjoni tal-varjazzjonijiet tal-patata

- fil-każ ta’ pjanti tat-tadam, pjanti tat-tadam li huma kkoltivati minn żrieragħ li jilħqu l-kundizzjonijiet tad-Direttiva 2000/29/KE jistgħu jiġu kkoltivati għall-produzzjoni tal-frott jekk,

- matul it-tieni sena tal-koltivazzjoni ta’ wara l-kontaminazzjoni speċifikata,

- fil-każ tal-patata, żerriegħa tal-patata ċċertifikata biss jew patata taż-żerriegħa ttestjata għan-nuqqas ta’ taħsir kannella u mkabbra taħt kontroll uffiċjali f’postijiet tal-produzzjoni ħlief dawk imsemmija f’4.1 għandhom ikunu miżrugħa għall-produzzjoni taż-żerriegħa jew tal-varjazzjoni,

- fil-każ tat-tadam, il-pjanti tat-tadam biss li huma kkoltivati minn żrieragħ li huma f’konformità mad-Direttiva 2000/29/KE jew, jekk huma ppropagati veġetattivament, minn pjanti tat-tadam li huma prodotti minn tali żrieragħ u kkoltivati taħt kontrolli uffiċjali f’postijiet ta’ produzzjoni li mhumiex dawkli jissemmew fi 4.1, għandhom ikunu kkoltivati għall-produzzjoni tal-pjanti jew tal-frott.

- għal mill-anqas it-tielet sena ta’ żvilupp wara l-kontaminazzjoni speċifikata,

- fil-każ tal-patata, tal-patata taż-żrieragħ iċċertifikata biss jew tal-patata taż-żrieragħ ikkoltivata taħt kontroll uffiċjali minn patata taż-żrieragħ iċċertifikata għandha tiġi miżrugħa għall-produzzjoni taż-żerriegħ jew tal-varjazzjoni,

- fil-każ tat-tadam, il-pjanti tat-tadam biss li huma kkoltivati minn żrieragħ li huma f’konformità mad-Direttiva 2000/29/KE jew pjanti tat-tadam li huma kkoltivati taħt kontroll uffiċjali minn tali pjanti għandhom jiġu kkoltivati għall-produzzjoni tal-frott jew tal-pjanti

- f’kull sena ta’ koltivazzjoni li tissemma fl-inċiżi ta’ qabel, il-miżuri għandhom jittieħdu sabiex jiġu eliminati pjanti tat-tadam voluntiera u pjanti ospitanti oħrajn li jeżistu naturalment ta’ organiżmi jekk huma preżenti u, spezzjoni uffiċjali tal-pjanti għandha ssir fi żminijiet xierqa f’kull għalqa ta’ patata, testjar uffiċjali tal-patata maħsuda għandu jsir skond il-proċedura mfassla fl-Anness II;

(c) immedjatament wara l-ispeċifikazzjoni ta’ kontaminazzjoni taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii) u wara l-ewwel sena ta’ tkabbir sussegwenti:

- il-faċilitajiet ta’ makkinarju u ta’ ħażna kollha li jinsabu fuq il-post tal-produzzjoni u involuti fil-produzzjoni tal-patata u tat-tadam għandhom jitnaddfu u, fejn hu xieraq, disinfettati permezz ta’ l-użu ta’ metodi xierqa, kif speċifikat fil-punt 3,

- kontrolli uffiċjali fuq il-programmi ta’ l-irrigazzjoni u l-bexx, inklużi l-projbizzjoni tagħhom, għandhom jiġu introdotti kif inhu xieraq sabiex issir prevenzjoni tat-tixrid ta’ l-organiżmu;

(d) f’unità tal-produzzjoni ta’ prodott ta’ l-għalqa protett speċifikat bħala kontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(a)(ii) fejn hi possibbli sostituzzjoni sħiħa tal-medju ta’ tkabbir,

- l-ebda tuberu jew pjanta, żrieragħ jew pjanti ta’ provenjenza oħra ta’ l-organiżmu inkluż pjanti tat-tadam u żerriegħa m’għandhom jinżergħu sakemm l-unità tal-produzzjoni ġiet soġġetta għal miżuri ta’ sorveljanza uffiċjali biex telimina l-organiżmu u biex tneħħi kull materjal tal-pjanta ta’ provenjenza, inkluż, mill-anqas, bidla kompluta fil-medju tat-tkabbir u ħasil u, ingħata sussegwentement l-approvazzjoni għall-produzzjoni tal-patata jew tat-tadam mill-korpi uffiċjali responsabbli,

- għall-produzzjoni tal-patata, din il-produzzjoni ser tkun minn zerriegħa tal-patata ċertifikati, jew minn tuberi żgħar jew mikro-pjanti derivati minn sorsi ttestjati,

- għall-produzzjoni tat-tadam, din il-produzzjoni għandha tkun minn żrieragħ li huma f’konformità mad-direttiva 2000/29/KE jew, jekk huma ppropagati veġetattivament, minn pjanti tat-tadam li huma prodotti minn tali żrieragħ u kkoltivati taħt kontroll uffiċjali,

4.2. fiż-żona demarkata, bla preġudizzju għall-miżuri mfissra taħt 4.1, l-Istati Membri għandhom:

(a) immedjatament wara l-kontaminazzjoni speċifikata, aċċerta li kull faċilità ta’ makkinarju u impjant ta’ ħażna li huma involuti fil-produzzjoni tal-patata jew tat-tadam f’din il-proprjetà jiġu mnaddfa u disinfettati, kif inhu xieraq, u permezz ta’ l-użu ta’ metodi xierqa, kif speċifikat f’3,

(b) immedjatament, u għal mill-anqas 3 snin ta’ tkabbir wara l-kontaminazzjoni speċifikata:

(ba) f’każijiet fejn iż-żona demarkata ġiet determinata taħt l-Artikolu 5(1)(a)(iv),

- assigura s-superviżjoni mill-korpi uffiċjali responsabbli mill-proprjetà li tkabbar, taħżen jew timmaniġġja tuberi tal-patata jew tadam, flimkien ma’ proprjetà li topera makkinarju għall-produzzjoni b’kuntratt tal-patata jew tadam,

- eżiġi t-tħawwil ta’ żerriegħa ċċerifikata biss jew ta’ żerriegħa mkabbra taħt kontroll uffiċjali għall-prodotti tal-patata f’dik iż-żona, u l-ittestjar wara l-ħsad ta’ prodotti tal-patata mkabbra f’postijiet tal-produzzjoni determinati bħala li huma probabbilment kontaminati taħt l-Artikolu Article 5(1)(a)(iii),

- eżiġi l-immaniġġjar separat ta’ stokkijiet taż-żerriegħa tal-patata minn dawk tal-varjazzjoni fuq kull proprjetà fiż-żona, jew sistema ta’ tindif u, fejn hu xieraq, disinfezzjoni li għandha ssir bejn l-immaniġġjar ta’ stokkijiet taż-żerriegħa u tal-varjazzjoni,

- itlob li ssir koltivazzjoni biss ta’ pjanti ta’ tadam li huma koltivati minn żrieragħ li huma f’konformità mal-kundizzjonijiet tad-Direttiva 2000/29/KE jew, jekk huma ppropagati veġetattivament, minn pjanti ta’ tadam li huma prodotti minn tali żrieragħ u kkoltivati taħt kontrolli uffiċjali, għal kull pjanta ta’ tadam f’dik iż-żona,

- mexxi studju uffiċjali kif imfisser fl-Artikolu 2(1),

(bb) f’każijiet fejn l-ilma tal-wiċċ ġie speċifikat bħala kkontaminat taħt l-Artikolu 5(1)(c)(ii) jew inkluż fl-elementi għall-firxa possibbli ta’ l-organiżmu skond lAnness V punt 2,

- mexxi studju annwali f’żminijiet xierqa inkluż it-teħid ta’ kampjuni ta’ l-ilma tal-wiċċ u fejn hu xieraq pjanti ta’ provenjenza li jappartjenu għall-familja ta’ pjanti solanacaeae fis-sorsi ta’ l-ilma rilevanti u l-ittestjar skond il-metodi rilevanti misjuba fl-Anness II għall-materjal tal-pjanti elenkat u għal każijiet oħra.

- introduċi kontrolli uffiċjali fuq il-programmi ta’ l-irrigazzjoni u t-traxxix, inkluż projbizzjoni fuq l-użu ta’ l-ilma speċifikat bħala kontaminat għall-irrigazzjoni u t-traxxix ta’ materjal tal-pjanti elenkat, u, fejn hu xieraq, pjanti ta’ provenjenza oħra sabiex jipprevjeni l-firxa ta’ l-organiżmu. Din il-projbizzjoni tista’ tiġi riveduta a bażi tar-riżultati miksuba fl-istudju annwali msemmi, u desinjazzjonijiet rivokati fejn il-korpi uffiċjali responsabbli huma sodisfatti li l-ilma tal-wiċċ m’għadux ikkontaminat. L-użu ta’ ilma li hu suġġett għal projbizzjoni jista’ jitħalla, taħt kontroll uffiċjali, għall-irrigazzjoni u t-traxxix ta’ pjanti ta’ provenjenza, fejn tekniki approvati uffiċjalment huma wżati li jeliminaw l-organiżmu u jipprevjenu l-firxa tiegħu.

- f’każijiet fejn ġew kontaminati ħruġ ta’ skart likwidu, introduċi kontrolli uffiċjali fuq ir-rimi ta’ skart jew ħruġ ta’ likwidu ta’ skart minn proprjetajiet ta’ pproċessar industrijali jew ta’ ppakkjar li jimmaniġġjaw materjal tal-pjanti elenkat.

(c) fejn hu xieraq, stabbilixxi programm għall-bdil ta’ l-istokkijiet kollha taż-żerriegħa tal-patata tul perjodu ta’ żmien xieraq.

ANNESS VII

Il-metodi ta’ skart li huma uffiċjalment approvati li jissemmew fl-Anness VI paragrafu 1, għandhom jikkonformaw mad-dispożizzjonijiet li ġejjin sabiex riskji identifikabbli ta’ tixrid ta’ organiżmi huma ovvjati:

(i) skart ta’ patata u tadam (inklużi patata rrifjutata u qxur u tadam) u kull skart solidu ieħor assoċjat mal-patata u t-tadam (inkluża ħamrija, ġebel u bċejjeċ) għandhom jiġu skartati jew,

- billi jintremew f’sit apposta uffiċjali dedikat għal hekk fejn ma hemm ebda riskju identifikabbli ta’ ħarbien ta’ l-organiżmu fl-ambjent eż permezz ta’ nixxa fl-art agrikola jew kuntatt ma’ egħjun ta’ l-ilma li jistgħu jintużaw għall-irrigazzjoni ta’ l-art agrikola. L-iskart għandu jitwassal direttament lejn is-sit taħt kondizzjonijet ta’ konteniment sabiex ma jkun hemm ebda riskju ta’ telf ta’ skart,

jew

- inċinerazzjoni,

jew

- miżuri oħrajn, bil-kondizzjoni li ġie stabbilit li ma hemm ebda riskju identifikabbli għat-tixrid ta’ l-organiżmu; tali miżuri għandhom jiġu nnotifikati lill-Kummissjoni u lill-Istati Membri l-oħrajn.

(ii) skart likwidu: qabel l-iskartar, skart likwidu li fih solidi sospiżi fih għandu jkun soġġett għall-filtrazzjoni jew proċessi ta’ separazzjoni sabiex jitneħħew tali solidi. Dawn is-solidi għandhom jiġu skartati kif stipolat fis-subparagrafu (i).

L-iskart likwidu għandu imbagħad:

- jissaħħan sa temperatura minima ta’ 60 °C fil-volum kollu matul mill-inqas 30 minuta qabel l-iskartar,

jew

- jiġi skartat skond approvazzjoni uffiċjali taħt kontrolli uffiċjali li ma hemm ebda riskju identifikabbli li l-iskart jista’ jiġi f’kuntatt ma’ art agrikola jew egħjun ta’ l-ilma li jistgħu jintużaw għall-irrigazzjoni ta’ art agrikola. dawn id-dettallji għandhom jiġu nnotifikati lill-Kummissjoni u lill-Istati Membri l-oħrajn.

L-għażliet deskritti f’dan l-Anness japplikaw ukoll għall-iskart li huwa assoċjat mal-ġestjoni, l-iskartar u l-ipproċessar ta’ lottijiet ikkontaminati.

[101] Ara Lelliott and Stead (1987)

[] Kuntatt tax-xjentisti: ara l-portal http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

[] Uża bħala referenza standard il-varjazzjoni ta’ R.solanacearum biovar 2 (razza 3).

[] Varjetà ta’ reazzjoni potenzjali bejniethom f’testijiet seroloġiċi (IF u/jew ELISA) b’antisjeri poliklonali.

[] Varjetà li minnha jista’ jiġi amplifikat prodott PCR f’xi laboratorji ta’ daqs simili għal dak mistenni mill-użu tal-primers speċifiċi OLI-1 u Y-2 (ara l-Appendiċi 6).

[] Li hu probabbli li joħloq reazzjoni bejniethom f’ħafna mit-testijiet iżda magħruf li jseħħ biss fil-banana ta’ l-Indonesia.

[] Għall-użu mal-metodu ta’ estrazzjoni omogenizzanti.

[] Il-metodu ġie vvalidat permezz ta’ l-użu ta’ polimerażi Taq minn Perkin Elmer (AmpliTaq) u Gibco BRL.

[] Konċentrażzjoni ta’ primers NS-5-F u NS-6-R kienu ottimizzati għall-estratt tal-qalba tan-naħa ta’ l-arqub tal-patata permezz tal-metodu omoġenizzanti u l-purifikazzjoni tad-DNA skond Pastrik (2000) (ara Sezzjoni VI.A.6.1.a.). L-ottimizzazzjoni mill-ġdid ta’ konċentrazzjonijiet ta’ reaġġenti se jkunu meħtieġa jekk estrazzjoni permezz ta’ taħlit jew metodi oħra ta’ iżolazzjoni tad-DNA huma wżati.

[] Il-metodu ġie vvalidat permezz ta’ l-użu ta’ polimerażi Taq minn Perkin Elmer (AmpliTaq) u Gibco BRL.

--------------------------------------------------

32006L0063