ΟΔΗΓΙΑ ΤΟΥ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟΥ της 29ης Μαρτίου 1977 περί επιβλέψεως με βιολογικά μέσα του πληθυσμού σχετικά με τον κίνδυνο από τον μόλυβδο

ΤΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος και ιδίως το άρθρο 235,

την πρόταση της Επιτροπής,

τη γνώμη της Συνελεύσεως(1),

τη γνώμη της Οικονομικής και Κοινωνικής Επιτροπής(2),

Εκτιμώντας:

ότι από τα βασικά καθήκοντα της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος είναι η προαγωγή της αρμονικής αναπτύξεως της οικονομικής δραστηριότητος στο σύνολο της Κοινότητος και η συνεχής και ισόρροπη επέκταση, αποστολές, οι οποίες δεν μπορούν να νοηθούν ανεξάρτητα από τον αγώνα εναντίον της μολύνσεως και των βλαβερών επιδράσεων επί του περιβάλλοντος και χωρίς τη βελτίωση της ποιότητος ζωής και της προστασίας του περιβάλλοντος-

ότι οι διάφορες χρήσεις του μολύβδου προκαλούν σήμερα μόλυνση εκ του μολύβδου μεγάλου αριθμού χώρων του περιβάλλοντος-

ότι οι πολλαπλές πηγές μολύβδου οι οποίες υπάρχουν στο περιβάλλον καθιστούν δυσχερή τον καθορισμό της συνολικής εκθέσεως ενός ατόμου σ' αυτή την ουσία ρυπάνσεως και ότι, κατά συνέπεια, η προστασία της ανθρώπινης υγείας επιβάλλει ένα έλεγχο όσο το δυνατό πιο ακριβή της συνολικής απορροφήσεως μολύβδου από το άτομο-

ότι πρέπει να πραγματοποιείται επίβλεψη με βιολογικά μέσα του πληθυσμού ως προς τον κίνδυνο από τον μόλυβδο και να αξιολογούνται τα αποτελέσματά της με σκοπό την πιθανή επεξεργασία νέων προτάσεων-

ότι πρέπει να καθορισθούν οι τεχνικές μέθοδοι και τα επίπεδα βιολογικής αναφοράς για αυτήν την επίβλεψη-

ότι ο προσδιορισμός της μολυβδιάσεως αποτελεί σήμερα το καλλίτερο μέσο εκτιμήσεως της δόσεως μολύβδου, η οποία απορροφήθηκε πρόσφατα από ένα άτομο, λόγω εκθέσεώς του σε μόλυβδο, που υπάρχει στο περιβάλλον και ότι η ενζυματική δράση της δενδρατάσης του δέλτα-αμινολεβυλινικού οξέος (ALAD), δύναται να χρησιμοποιηθεί σαν ενδεικτική ή συμπληρωματική εξέταση για τον προσδιορισμό της εκθέσεως στον μόλυβδο-

ότι το πρόγραμμα δράσεως των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων σε σχέση με το περιβάλλον(3) προβλέπει τον συντονισμό των εθνικών προγραμμάτων, τα οποία αποβλέπουν στη βελτίωση της ποιότητος ζωής και μία κατά προτεραιότητα δράση, όσον αφορά το μόλυβδο,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:

Άρθρο 1

Τα Κράτη μέλη λαμβάνουν τα απαραίτητα μέτρα για την εφαρμογή κοινής διαδικασίας επιβλέψεως με βιολογικά μέσα με σκοπό την εκτίμηση της εκθέσεως του πληθυσμού στον κίνδυνο από τον μόλυβδο, εκτός των τόπων εργασίας.

Άρθρο 2

Η κοινή αυτή διαδικασία της οποίας η εφαρμογή περιορίζεται σε τέσσερα έτη, βασίζεται επί της μετρήσεως της μολυβδιάσεως.

Προς τον σκοπό ενδεικτικής ή συμπληρωματικής εξετάσεως δύναται να γίνεται χρήση της μετρήσεως ALAD σύμφωνα με τις μεθόδους που προβλέπονται στα παραρτήματα ΙΙ και ΙΙΙ.

Άρθρο 3

1. Για την επίβλεψη αυτή με βιολογικά μέσα θα προσδιορισθούν τα εξής:

- οι μέθοδοι της δειγματοληψίας και της αναλύσεως,

- η συχνότητα της δειγματοληψίας.

2. Η σχετική αιμοληψία πραγματοποιείται σε εθελοντές.

Άρθρο 4

Η δειγματοληψία πραγματοποιείται σε:

- ομάδες 100 ατόμων τουλάχιστον σε αστικές περιοχές με άνω του μισού εκατομμυρίου κατοίκους,

- ομάδες τουλάχιστον 100 ατόμων - εφ' όσον ο αριθμός αυτός δύναται να επιτευχθεί - τα οποία επιλέγονται μεταξύ κατηγοριών πληθυσμού που εκτίθενται σε σημαντικές πηγές μολύνσεως από μόλυβδο,

- κρίσιμες ομάδες που καθορίζονται από τις αρμόδιες αρχές των Κρατών μελών.

Σε κάθε Κράτος μέλος και κατά τη διάρκεια κάθε περιόδου δειγματοληψίας θα πραγματοποιούνται τουλάχιστο 50 αναλύσεις, ανά εκατομμύριο κατοίκων.

Άρθρο 5

Η δειγματοληψία για τις ομάδες, οι οποίες αναφέρονται στο άρθρο 4, πραγματοποιείται σε κάθε εξεταζόμενη ζώνη κατά την διάρκεια του προγράμματος τουλάχιστον δύο περιόδων δειγματοληψίας, που χωρίζονται από ένα διάστημα τουλάχιστον εικοσιτεσσάρων μηνών. Η δεύτερη περίοδος δειγματοληψίας δεν αφορά αναγκαία τα ίδια άτομα με εκείνα της πρώτης περιόδου.

Άρθρο 6

Για την εκτίμηση των αποτελεσμάτων της επιβλέψεως με βιολογικά μέσα, εν όψει των ενεργειών που προβλέπονται στο άρθρο 8, θεωρούνται ταυτόχρονα ως επίπεδα αναφοράς οι ακόλουθες τιμές μολυβδιάσεως, στο αίμα, οι οποίες λαμβάνουν υπόψη τις σχέσεις μεταξύ ποσότητας και αποτελεσματικότητας, οι οποίες αναγράφονται στο παράρτημα Ι:

- 20 μικρογραμμάρια μολύβδου για 100 χιλιοστόλιτρα αίματος κατ' ανώτατο όριο, για το 50% της της ομάδας του πληθυσμού που εξετάσθηκε,

- 30 μικρογραμμάρια μολύβδου για 100 χιλιοστόλιτρα αίματος κατ' ανώτατο όριο, για το 90% της ομάδας του πληθυσμού που εξετάσθηκε,

- 35 μικρογραμμάρια μολύβδου για 100 χιλιοστόλιτρα αίματος κατ' ανώτατο όριο, για το 98% της ομάδας του πληθυσμού που εξετάσθηκε.

Άρθρο 7

Για τον καθορισμό της μολυβδιάσεως:

- τα Κράτη μέλη γνωστοποιούν στην Επιτροπή τα ονόματα των εργαστηρίων, τα οποία μετέχουν στο πρόγραμμα της επιβλέψεως με βιολογικά μέσα και τις χρησιμοποιούμενες μεθόδους αναλύσεως,

- η Επιτροπή σε συνεργασία με τα Κράτη μέλη, οργανώνει προγράμματα συγκρίσεως, στα οποία μετέχουν τα ανωτέρω εργαστήρια,

- η Επιτροπή σε συνεργασία με τα Κράτη μέλη, εξετάζει τα αποτελέσματα αυτών των προγραμμάτων με σκοπό την βελτίωση της δυνατότητας συγκρίσεως των μεθόδων αναλύσεως.

Άρθρο 8

Όταν το αποτέλεσμα των αναλύσεων εμφανίζει μία ή περισσότερες υπερβάσεις των επιπέδων αναφοράς, που προβλέπονται στο άρθρο 6, τα Κράτη μέλη:

- επαληθεύουν το έγκυρο των αποτελεσμάτων,

- αναζητούν τις πηγές εκθέσεως οι οποίες προκαλούν αυτές τις υπερβάσεις- αυτή η ενέργεια αφορά επίσης όλα τα άτομα τα οποία παρουσιάζουν μολυβδίαση ανώτερη των 35 μικρογραμμαρίων ανά 100 χιλιοστόλιτρα,

- λαμβάνουν, κατά την κρίση των αρμοδίων εθνικών αρχών τα κατάλληλα μέτρα.

Άρθρο 9

1. Τα Κράτη μέλη ορίζουν μέσα στους έξι μήνες, οι οποίοι ακολουθούν την κοινοποίηση της παρούσης οδηγίας, την αρμοδία εθνική αρχή η οποία γνωστοποιεί στην Επιτροπή:

- τα δεδομένα τα σχετικά με την επίβλεψη με βιολογικά μέσα των ομάδων του πληθυσμού που προβλέπονται στο άρθρο 4 τα οποία περιλαμβάνουν τις ενδείξεις, οι οποίες αναφέρονται στις μεθόδους αναλύσεως, στις εξετασθείσες ομάδες πληθυσμού και στις ζώνες, στις οποίες ελήφθησαν αυτά τα δείγματα- αυτά τα δεδομένα πρέπει να προσφέρουν όλες τις εγγυήσεις όσον αφορά το σεβασμό της ανωνυμίας των προσώπων που εξετάσθηκαν- ο τρόπος και η μορφή της διαβιβάσεως των δεδομένων αυτών καθορίζονται με κοινή συμφωνία μεταξύ της Επιτροπής και των Κρατών μελών,

- τις πληροφορίες τις σχετικές με τα αίτια ή τους παράγοντες, οι οποίοι τεκμαίρεται ότι προκαλούν την υπέρβαση των επιπέδων αναφοράς, τα οποία αναφέρονται στο άρθρο 6.

2. Η αρμόδια εθνική αρχή διαβιβάζει επί πλέον στην Επιτροπή, τα μέτρα, τα οποία λαμβάνονται δυνάμει του άρθρου 8, τρίτη παύλα.

Άρθρο 10

Η Επιτροπή συγκαλεί τουλάχιστον δύο φορές το χρόνο τους εκπροσώπους των κυβερνήσεων, των Κρατών μελών με σκοπό ιδίως:

- την εξασφάλιση της εναρμονισμένης εφαρμογής της επιβλέψεως με βιολογικά μέσα και ιδιαίτερα των διατάξεων, οι οποίες προβλέπονται στα άρθρα 4 και 5,

- την παρακολούθηση της δυνατότητος συγκρίσεως των αναλύσεων που πραγματοποιούνται,

- την εξέταση των πληροφοριών και την διευκόλυνση της ανταλλαγής πληροφοριών μεταξύ των Κρατών μελών επί των αποτελεσμάτων τα οποία προκύπτουν από την επίβλεψη με βιολογικά μέσα, καθώς και επί των μέτρων τα οποία λαμβάνονται δυνάμει του άρθρου 8.

Άρθρο 11

Επί τη βάσει των πληροφοριών οι οποίες συλλέγονται δυνάμει του άρθρου 9, η Επιτροπή καταρτίζει, σε συνδυασμό με τις αρμόδιες εθνικές αρχές:

- ετήσια συνοπτική έκθεση, περί της εφαρμογής αυτού του προγράμματος, η οποία διαβιβάζεται στα Κράτη μέλη, καθώς και στο Συμβούλιο και στη Συνέλευση,

- γενική έκθεση στο τέλος αυτού του προγράμματος, η οποία συνιστά τη βάση για την ενδεχόμενη προετοιμασία νέων προτάσεων, οι οποίες θα λάβουν επίσης υπόψη τις σημειωθείσες προόδους στις επιστημονικές και τεχνικές γνώσεις.

Άρθρο 12

Τα Κράτη μέλη λαμβάνουν τα μέτρα που είναι αναγκαία για να συμμορφωθούν προς την παρούσα οδηγία εντός προθεσμίας δώδεκα μηνών από την κοινοποίησή της και πληροφορούν περί αυτού αμέσως την Επιτροπή.

Άρθρο 13

Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη μέλη.

Έγινε στις Βρυξέλλες, στις 29 Μαρτίου 1977.

Για το Συμβούλιο

Ο Πρόεδρος

T. BENN

(1) ΕΕ αριθ. Α 28 της 9.2.1976, σ. 31.

(2) ΕΕ αριθ. Α 50 της 4.3.1976, σ. 9.

(3) ΕΕ αριθ. Α 112 της 20.12.1973, σ. 3.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

ΣΧΕΣΕΙΣ ΔΟΣΕΩΣ ΚΑΙ ΕΠΕΝΕΡΓΕΙΑΣ Οι τιμές μολυβδιάσεως, οι οποίες λαμβάνονται υπόψη για την εκτίμηση των αποτελεσμάτων της επιβλέψεως με βιολογικά μέσα προκύπτουν από την ανάλυση των επιστημονικών δεδομένων περί των διαφόρων τοξικών ενεργειών του μολύβδου. Η ανάλυση αυτή, η οποία λαμβάνει υπόψη τις κανονικές διακυμάνσεις των βιολογικών τιμών του πληθυσμού, επιτρέπει την σχεδόν ποσοτική συσχέτιση μεταξύ δόσεως και επενέργειας. Οι ακόλουθες σχέσεις δόσεως-επενέργειας λαμβάνονται υπόψη σαν βάση αναφοράς για την εφαρμογή της παρούσης οδηγίας:

Μία μείωση της δραστηριότητας ALAD στα ερυθρά αιμοσφαίρια, λόγω της εκθέσεως στον μόλυβδο, εφ' όσον δεν προκαλεί διατάραξη της αιμοποιητικής λειτουργίας, μπορεί να γίνει αποδεκτή ως προς τον πληθυσμό. Σήμερα θεωρείται ότι για τις μολυβδιάσεις τις κατώτερες των 15 20 μg/100 ml, η μείωση της δραστηριότητας ALAD δεν προκαλεί διαταραχή της αιμοποιητικής λειτουργίας.

Η αύξηση της περιεκτικότητας σε πρωτοπορφυρίνη (PPE) των ερυθρών αιμοσφαιρίων του αίματος είναι ενδεικτική επιβλαβούς επιδράσεως της χρησιμοποιήσεως του σιδήρου από τον οργανισμό με αποτέλεσμα να παρακωλύεται η αιμοσύνθεση. Η αύξηση της PPE, εμφανίζεται σε τιμές μολυβδιάσεως ανώτερες των 20-30 μg/100 ml. Η αύξηση της τιμής πάντως PPE μπορεί να οφείλεται σε άλλες αιτίες.

Βλαβερή επίδραση στην σύνθεση του γλουταθείου μπορεί να γίνει ανεκτή μόνο για πολύ μικρό τμήμα του πληθυσμού, αλλά και αυτό τότε μόνον όταν είναι πολύ μικρή και δεν παράγει άλλα παρακλινικά συμπτώματα. Η απαράδεκτα βλαβερή επίδραση στη σύνθεση του γλουταθείου, δεν εμφανίζεται εφ' όσον η τιμή της μολυβδιάσεως είναι κατώτερη των 30μg/100 ml.

Σημαντική αύξηση της εκκρίσεως του Δέλτα-Αμινολεβυλινικού οξέος στα ούρα (ALAU), είναι ένδειξη σημαντικής επιβλαβούς επιδράσεως επί του μεταβολισμού των πορφυρινών και επομένως αποτελεί ένδειξη κλονισμού της υγείας. Η σημαντική αύξηση από στατιστική άποψη του ALAU, δεν εμφανίζεται παρά για τιμές μολυβδιάσεως ανώτερες από 35μg/100ml.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II

ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΙΑ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ ΤΙΜΗΣ ΤΗΣ ΜΟΛΥΒΔΙΑΣΕΩΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΕΩΣ Κατά την έννοια του άρθρου 2 της παρούσης οδηγίας, η αντιστοιχία της τιμής της μολυβδιάσεως και της ενζυματικής δράσεως ALAD, η οποία μετράται σύμφωνα με την τυποποιημένη Ευρωπαϊκή μέθοδο (παράρτημα 3) είναι η ακόλουθη:

"" ID="1">35> ID="2">20"> ID="1">30> ID="2">25"> ID="1">20> ID="2">35">

Εφόσον οι καταμετρούμενες τιμές της ALAD είναι σημαντικά ανώτερες από τα όρια που αναφέρθηκαν ανωτέρω για τα διάφορα τμήματα του πληθυσμού δεν είναι αναγκαία η διενέργεια επιβεβαιωτικών νέων καταμετρήσεων των τιμών της μολυβδιάσεως.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΔΙΑΓΡΑΦΕΣ ΠΕΡΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΔΡΑΣΕΩΣ ALAD Τυποποιημένη ευρωπαϊκή μέθοδος για τον προσδιορισμό της δράσεως της δεϋδρατάσεως του δελτα-αμινολεβυλινικού οξέος

Η αρχή της μεθόδου που έχει υιοθετηθεί για τον προσδιορισμό της δράσεως της δεϋδρατάσεως του Δέλτα-Αμινολεβυλινικού οξέος είναι γνωστή. Βασίζεται επί της επωάσεως του ενζύμου με περίσσεια του Δέλτα-Αμινολεβυλινικού οξέος ως υποστρώματος. Το πορφοχολερυθρινογόνο το οποίο σχηματίζεται μετά από ορισμένο χρόνο, αναμιγνύεται με τροποποιημένο αντιδραστήριο του Ehrlich και ο χρωματισμός ο οποίος προκύπτει μετράται με τη βοήθεια ενός φωτομέτρου σε σύγκριση προς λευκό (ουδέτερο). Η ποσότητα του παραγομένου πορφοχολερυθρινογόνου αποτελεί το μέτρο της δράσεως ALAD.

ΜΕΘΟΔΟΣ Ενέργεια του φωτός Τα πρόσφατα πειράματα έδειξαν, ότι κυρίως το πορφοχολερυθρινογόνο είναι πολύ ευαίσθητο στο φως. Το σύνολο της αναλύσεως πρέπει να πραγματοποιείται χωρίς και το ελάχιστο άμεσο ηλιακό φως στο εργαστήριο (και όχι μόνο στο μέρος όπου πραγματοποιείται η ανάλυση).

Πρώτη φάση: Δειγματοληψία και διατήρηση του αίματος πριν από την ανάλυση

- Αιμοληψία 2 ml φλεβικού αίματος, με την βοήθεια μιας πλαστικής σύριγγας (που δεν έχει σταθεροποιηθεί με μόλυβδο) παρουσία ξηρής ηπαρίνης 5 mg).

- Άμεση προετοιμασία τεσσάρων δειγμάτων των 0,2 ml κατανεμημένων σε διαφορετικούς πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες (που δεν έχουν σταθεροποιηθεί με μόλυβδο) και που έχουν ψυχθεί σε 4o Κελσίου. Η σιφωνοποίηση πραγματοποιείται με βαθμολογημένα σιφώνια του τύπου Μάρμπουργκ.

- Αν η ανάλυση πραγματοποιείται μέσα σε διάστημα τριών ωρών, η ψύξη των δειγμάτων δεν είναι αναγκαία.

- Η ανώτατη διάρκεια της διατηρήσεως των δειγμάτων με θερμοκρασία 4o Κελσίου είναι 24 ώρες.

- Αμέσως πριν από την ανάλυση πρέπει όλα τα δείγματα να τοποθετούνται σε λουτρό παγωμένου ύδατος επί 10 λεπτά.

Παρατήρηση: Μεταξύ των πλαστικών υλικών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν είναι το πολυαιθυλαίνιο, το πολυστηρένιο και το πολυπροπυλαίνιο. Η διάρκεια της διατηρήσεως των 24 ωρών με θερμοκρασία 4o Κελσίου, προκύπτει μετά από προσεκτική εκτίμηση. Αυτό το χρονικό διάστημα είναι επαρκές για να επιτραπεί η μεταφορά του δείγματος για ανάλυση από τον τόπο της λήψεως του αίματος, σε ένα κεντρικό εργαστήριο. Από τα τέσσερα δείγματα αίματος, τρία πρέπει να χρησιμοποιηθούν για τον καθορισμό της ALAD και ένα για το διάλυμα αναφοράς.

Δεύτερη φάση: Καθορισμός της τιμής του αιματοκρίτη

Ο καθορισμός αυτός πρέπει να πραγματοποιείται:

- συγχρόνως με την αιμοληψία,

- σε μία τριχοειδή μέθοδο που χρησιμοποιεί δύο δείγματα.

Φυγοκέντρηση μετά το κλείσιμο του ενός άκρου, σε ταχύτητα τουλάχιστον 30 000 περιστροφών κατά λεπτό (όχι λιγότερο από πέντε λεπτά).

Παρατήρηση: Ο προσδιορισμός αυτός είναι προτιμότερο να πραγματοποιείται στον τόπο της δειγματοληψίας αλλ' όχι άνω των 24 ωρών μετά την αιμοληψία. Αν είναι δυνατόν συνιστάται η χρησιμοποίηση φυγοκεντρικής συσκευής, τύπου μικροαιματοκρίτου.

Τρίτη φάση: Αιμόλυση

- Αιμόλυση τριών δειγμάτων αίματος αφού προηγουμένως αποψυχθούν σε 1,3 ml αποσταγμένου ύδατος (το οποίο προηγουμένως είχε θερμανθεί στους 37o Κελσίου) κατά τη διάρκεια 10 λεπτών σε 37oC +- 0,2oC.

- Προσθέσατε ύδωρ κατά προτίμηση με τη βοήθεια ενός βαθμολογουμένου σιφωνίου 2 ml και αναμίξατε καλά.

- Στο στάδιο αυτό δεν επιτρέπεται να ανακινηθούν πλέον τα δείγματα.

Παρατήρηση:Έχει αποφασισθεί η χρησιμοποίηση ύδατος και όχι Triton X 100 για την αιμόλυση. Τα πειράματα της αιμολύσεως με Triton X 100, επιφέρουν μία σημαντική ανάσχεση της δράσεως ALAD, η οποία δεν κατορθώθηκε ακόμη να εξηγηθεί και η οποία μπορεί να αντιστοιχεί σε τεχνητό φαινόμενο.

Τέταρτη φάση: Πρόσθεση διαλύματος ALAD στην αιμόλυση

- Παρασκευή του διαλύματος ALA.

- Αυτό δεν πρέπει να παρασκευάζεται πριν από το πολύ 5 ώρες

- Θέρμανση του διαλύματος αυτού στους 37o Κελσίου κατά τη διάρκεια τουλάχιστο 10 λεπτών πριν από την πρόσθεση.

- Πρόσθεση 1 ml διαλύματος αυτού στον αιμολύτη κατά προτίμηση με τη βοήθεια ογκομετρικού σιφωνίου του 1 ml, ακολουθούμενη από ανάμιξη.

Παρατήρηση: Σαν βάση ελήφθη pH των 6,4, διότι τα πειράματα έδειξαν ότι αυτή είναι η τιμή pH, η οποία επιτρέπει για τους κανονικούς πληθυσμούς καλλίτερο συσχετισμό μεταξύ της δράσεως ALAD και των τιμών μολυβδιάσεως.Δεν απαιτείται να επιτευχθεί το ανώτατο της δράσεως (που πραγματοποιείται δι' αυξήσεως της τιμής pH) επειδή οι προς καθορισμό δράσεις είναι αρκετά υψηλές.

Πέμπτη φάση: Παρασκευή του διαλύματος αναφοράς

- 0,2 ml αίματος επεξεργασμένου όπως στη διαδικασία για τον καθορισμό ALAD, και μάλιστα μέχρι της στιγμής της προσθέσεως του διαλύματος ALA- στη θέση του προστίθεται 1 ml του διαλύματος HgCl2-TCA και κατόπιν 1 ml διαλύματος ALA. Στη συνέχεια ακολουθείται η ίδια διαδικασία όπως και για τον καθορισμό ALAD (πρβλ. κατωτέρω).

Παρατήρηση: Ένα μόνο διάλυμα αναφοράς συγκρίνεται σε μία σειρά τριών πειραμάτων για κάθε δείγμα αίματος. Εάν η οπτική πυκνότητα η οποία επιτυγχάνεται για διάλυμα αναφοράς είναι πολύ υψηλή, η διαδικασία επαναλαμβάνεται για έλεγχο.

Έκτη φάση: Επώαση

- 60 λεπτά σε διεκθερμαντήρα με 37oC +- 0,2oC.

- Ο χρόνος επωάσεως αρχίζει να μετράται από την πρόσθεση του διαλύματος ALA.

Παρατήρηση: Ο χρόνος επωάσεως των 60 λεπτών έχει επιλεγεί προκειμένου να αυξηθεί η δράση της ALAD με φυσικό τρόπο, δεδομένου ότι καμμία άλλη φάση δεν έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση της δράσεως με τεχνητά μέσα. Με τη βοήθεια πειραμάτων έχει αποδειχθεί ότι η σχέση χρόνος επωάσεως δραστηριότητας είναι γραμμική για τα χρονικά διαστήματα που υπερβαίνουν τις δύο ώρες.

- Η θερμοκρασία της επωάσεως διατηρήθηκε, για πρακτικούς λόγους στους 37oC.

Έβδομη φάση: Ανάσχεση της αντιδράσεως PBG

- Προστίθεται 1 ml διαλύματος HgCl2-TCA στο μίγμα της επωάσεως κατά προτίμηση με ογκομετρικό σιφώνιο του 1 ml.

Όγδοη φάση: Φυγοκέντρηση και διήθηση

- 30.000 περιστροφές ανά λεπτό.

- διήθηση επί χάρτου Whatman, αριθ. 54 ή ισότιμο (οξυανθεκτικό χαρτί).

Παρατήρηση: Η φυγοκέντρηση πρέπει να διαρκεί περίπου 10 λεπτά. Η φάση της διηθήσεως εισάγεται, για να αποφευχθεί ο σιφωνισμός των μικρών σωματιδίων στην επιφάνεια του επιπλέοντος υγρού. Τα σωματίδια αυτά φαίνεται ότι προκαλούν έγχρωμη αντίδραση με το αντιδραστήριο του Ehrlich. Πολλά πειράματα έδειξαν ότι η εισαγωγή της φάσεως της διηθήσεως, βελτιώνει την δυνατότητα αναπαραγωγής των αποτελεσμάτων. Η φάση της διηθήσεως μπορεί εν ανάγκη να αντικατασταθεί από μία δεύτερη φυγοκέντρηση.

Ένατη φάση: Αντίδραση με το αντιδραστήριο Ehrlich

- Αναμιγνύεται 1 ml του διηθημένου επιπλέοντος υγού, με 1 ml αντιδραστηρίου Ehrlich τροποποιημένου με τη βοήθεια ογκομετρικών σιφωνίων.

- Για την εξασφάλιση της ομοιογένειας γίνεται η ανάμιξη με αναμικτήρα τύπου Vortex.

- Αφήνεται ν' αντιδράσει επί 5 λεπτά, από τη μέτρηση της αποσβέσεως.

Παρατήρηση: Είναι πολύ σημαντικό για την εξασφάλιση της ομοιογένειας, να αναμιγνύεται καλά το διηθημένο επιπλέον υγρό με το αντιδραστήριο Ehrlich.

Δέκατη φάση: Μέτρηση της αποσβέσεως

- Το σπεκτροφωτόμετρο βαθμονομείται με τη βοήθεια μιας διαλύσεως φαινολοφθαλεΐνης εντός βασικού ρυθμιστικού διαλύματος.

- Καταμετρείται η απόσβεση των δειγμάτων σε σχέση προς το διάλυμα αναφοράς σε 555 nm μέσα σε κυψελίδα ενός εκατοστού (ή δύο εκατοστών αν η απορρόφηση είναι πολύ μικρή).

Ενδέκατη φάση: Υπολογισμός της ενζυματικής δράσεως

- Η εξίσωση η οποία επιτρέπει τον υπολογισμό της δράσεως είναι η ακόλουθη:

= mumoles ALA/mn/ml RBC = U/ml

όπου:

OD = μετρηθείσα απόσβεση,

60 = χρόνος επωάσεως,

35 = παράγων διαλύσεως,

62 = γραμμομοριακός συντελεστής αποσβέσεως σε cm2/μmol,

K = συντελεστής σπεκτροφωτομετρικής διορθώσεως.

Παρατήρηση: Οι προτεινόμενες μονάδες συμφωνούν προς τις συστάσεις, τις σχετικές με την ονοματολογία των ενζύμων της Διεθνούς Βιοχημικής Ενώσεως.

ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 1. Παρασκευή του διαλύματος ALA

Διάλυμα Α:

1,78 g Na2HRO4-2H2O διαλελυμένο σε 100 ml απεσταγμένου ύδατος (κατά προτίμηση αποϊοντοποιημένων).

Διάλυμα Β:

1,38 g NaH2PO4-1H2O διαλελυμένο σε 100 ml απεσταγμένου ύδατος.

29 ml διαλύματος Α και 71 ml διαλύματος Β δίδουν ένα βύσμα 0,1 Mel φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος με τιμή pH 6,4.

Αυτή η υψηλή ιονική συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος είναι αναγκαία για την παρεμπόδιση κάθε παραλλαγής της τιμής pH στο εν αντιδράσει διάλυμα.

167,6 mg ALA-HCL διαλύονται μέσα στο διάλυμα Β (πάντοτε σε οξύ περιβάλλον)- η τιμή pH ορίζεται σε 6,4 με τη βοήθεια του διαλύματος Α. Ο όγκος αναβιβάζεται τότε με 0,1 Mol του φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (τιμή pH 6,4) σε 100 ml. Αυτό το παρασκεύασμα παρέχει διάλυμα 0,01 Mol ALA/1.

2. Διάλυμα HgCl2-TCA

1,35 g HgCl2 διαλύεται σε 100 ml τριχλωροξικού οξέος TCA, 10%.

3. Διάλυμα του αντιδραστηρίου Ehrlich

Αντιδραστήρια:

2,5 g p-διμεθυλανιμοβενζαλδεΐδη (ΡΔΜΑΒ),

0,25 g HgCl2 διαλελυμένα σε 10 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος,

υπερχλωρικό οξύ, ειδικό βάρος 1,7,

κρυσταλλικό οξικό οξύ.

Παρασκευή:

Το pDMAB διαλύεται σε 50 ml οξικού οξέος.Προστίθενται 24,5 ml περχλωρικού οξέος και 4 ml διαλύματος HgCl2. Τούτο αναμιγνύεται, επαναψύχεται και φέρεται σε 100 χιλιοστόλιτρα με κρυσταλλικό οξικό οξύ, σε βαθμολογημένη φιάλη (1).

Έλεγχος της μεθόδου:

Ένας ετήσιος έλεγχος της μεθόδου σε κοινοτικό επίπεδο πρέπει να εκτελείται από εργαστήριο που ορίζεται από κοινού από τα Κράτη μέλη.

(1) Αν σ' αυτό το στάδιο εμφανισθεί φαιόχρους χρωματισμός, το αντιδραστήριο είναι ακατάλληλο.