Kommissionens forordning (EØF) nr. 2568/91 af 11. juli 1991 om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte metoder

EF-Tidende nr. L 248 af 05/09/1991 s. 0001 - 0083
den finske specialudgave: kapitel 3 bind 38 s. 0174
den svenske specialudgave: kapitel 3 bind 38 s. 0174

KOMMISSIONENS FORORDNING (EOEF) Nr. 2568/91 af 11. juli 1991 om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte metoder

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets forordning nr. 136/66/EOEF af 22. september 1966 om oprettelse af en faelles markedsordning for fedtstoffer (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 3577/90 (2), saerlig artikel 35a, og

ud fra foelgende betragtninger:

I bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF er der fastsat betegnelser for og definitioner paa olivenolie og olie af olivenpresserester, der afsaettes i de enkelte medlemsstater, i samhandelen mellem medlemsstaterne og i samhandelen mellem medlemsstaterne og tredjelande;

for at kunne skelne mellem de forskellige typer olie er det noedvendigt at definere de fysisk-kemiske kendetegn for hver type samt de organoleptiske kendetegn for jomfruolie, saaledes at produkternes renhed og kvalitet sikres uden at dette beroerer andre eksisterende bestemmelser paa omraadet;

kendetegnene for de forskellige typer olie boer fastlaegges ensartet for hele Faellesskabet; med henblik herpaa boer der fastlaegges EF-metoder for kemisk analyse og orgenoleptisk vurdering; i en overgangsperiode boer medlemsstaterne dog kunne anvende andre metoder, idet det dog skal fastsaettes, at det er resultatet af den faelles metode, der gaelder i tilfaelde af uoverensstemmelse;

definitionen af de fysisk-kemiske kendetegn for olivenolie og analysemetoder indebaerer, at de supplerende bestemmelser til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur skal tilpasses;

som led i metoden til bedoemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn skal der oprettes paneler af udvalgte og oevede smagsdommere; der boer afsaettes den fornoedne tid til etablering af en saadan struktur; i betragtning af de vanskeligheder, som visse medlemsstater vil faa med at oprette panelerne, boer det tillades disse medlemsstater at benytte de i andre medlemsstater eksisterende paneler;

for at ordningen med importafgift paa olivenpresserester kan fungere efter hensigten boer der fastlaegges en faelles metode til bestemmelse af olieindholdet i disse produkter;

for ikke at paafoere handelen skade, boer det fastsaettes, at det i en begraenset periode er tilladt at afsaette olie aftappet foer denne forordnings ikrafttraeden;

Kommissionens forordning (EOEF) nr. 1058/77 (3), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 1858/88 (4), boer ophaeves;

Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer har ikke afgivet udtalelse inden for den af formanden fastsatte frist -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING:

Artikel 1

1. Som jomfruolie (KN-kode 1509 10 90) efter punkt 1, litra a), b) og c), i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis respektive kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 1, 2 og 3 i bilag I til naervaerende forordning.

2. Som bomolie (KN-kode 1509 10 10) efter punkt 1, litra d), i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 4 i bilag I til naervaerende forordning.

3. Som raffineret olivenolie (KN-kode 1509 90 00) efter punkt 2 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 5 i bilag I til naevaerende forordning.

4. Som olivenolie (KN-kode 1509 90 00) efter punkt 3 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 6 i bilag I til naevaerende forordning.

5. Som raa olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 10) efter punkt 4 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 7 i bilag I til naervaerende forordning.

6. Som raffineret olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 90) efter punkt 5 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 8 i bilag I til naervaerende forordning.

7. Som olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 90) efter punkt 6 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 9 i bilag I til naervaerende forordning.

Artikel 2

1. Bestemmelsen af kendetegnene for de i bilag I fastsatte olier sker ved hjaelp af foelgende analysemetoder:

- til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre, metoden i bilag II

- til bestemmelse af peroxidtallet, metoden i bilag III

- til bestemmlese af indholdet af alfatiske alkoholer, metoden i bilag IV

- til bestemmelse af indholdet af steroler, metoden i bilag V

- til bestemmelse af indholdet af erytrodiol og uvaol, metoden i bilag VI

- til bestemmelse af indholdet af maettede fedtsyrer i 2-stillingen i triglycerider, metoden i bilag VII

- til bestemmelse af indholdet af trilinolcin, metoden i bilag VIII

- til den spektrofotometriske undersoegelse, metoden i bilag IX

- til bestemmelse af fedtsyrernes sammensaetning, metoden i bilag X A og X B

- til bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede oploesningsmidler, metoden i bilag XI

- til bestemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn, metoden i bilag XII, anvendt som omhandlet i stk. 2

- til bevis for raffinering, metoden i bilag XIII.

2. Analytikeren - eventuelt bistaaet af eksperter - bedoemmer de organoleptiske kendetegn efter proceduren beskrevet i det i bilag XII omhandlede smageskema. Hvis de gennem analysen fremkomne kendetegn afviger fra dem, der fremgaar af produktets betegnelse, undersoeges proeven af et smagspanel som omhandlet i bilag XII.

Den nye analyse foretages af panelet i overensstemmelse med naevnte bestemmelser.

Naar det gaelder bedoemmelsen af de organoleptiske kendetegn i forbindelse med foranstaltningerne under interventionsordningen, foretages den af smagspanelet i henhold til bilag XII.

Artikel 3

Indfoerelsen af de i artikel 2 fastsatte analysemetoder udelukker ikke, at medlemsstaterne indtil den 31. oktober 1992 kan anvende andre afproevede og videnskabeligt anerkendte metoder, hvis den frie bevaegelse af produkter, som ifoelge EF-metoderne opfylder de gaeldende bestemmelser, ikke hindres herved. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen disse andre metoder, inden de anvender dem.

Hvis en af de andre metoder giver et andet resultat end det, der foelger af EF-metoden, fastholdes resultatet fra EF-metoden.

Artikel 4

1. Med henblik paa vurderingen af de organoleptiske egenskaber opretter medlemsstaterne paneler af smagsdommere, der udvaelges og traenes efter reglerne i den i bilag XII beskrevne metode.

2. Hvis en medlemsstat har vanskeligheder med at oprette et panel paa sit omraade, kan den goere brug af et panel i en anden medlemsstat.

Artikel 5

Supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur erstattes af supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 i bilag XIV til denne forordning.

Artikel 6

1. Olieindholdet i presserester og andre restprodukter

fra udvinding af olivenolie (KN-kode 2306 90 11 og 2306 90 19) bestemmes efter metoden i bilag XV.

2. Det i stk. 1 omhandlede olieindhold udtrykkes i vaegtprocent af toerstoffet.

Artikel 7

EF-bestemmelserne vedroerende forekomsten af andre uoenskede stoffer end dem, der er omhandlet i bilag XI, finder anvendelse.

Artikel 8

1. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen, hvilke foranstaltninger de traeffer til anvendelse af denne forordning.

2. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen i begyndelsen af hvert halvaar en oversigt over analyseresultaterne i forbindelse med de bestemmelser, der er foretaget i loebet af det foregaaende halvaar.

Resultaterne gennemgaas af Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer efter proceduren i artikel 39 i forordning nr. 136/66/EOEF.

Artikel 9

Forordning (EOEF) nr. 1058/77 ophaeves.

Artikel 10

1. Denne forordning traeder i kraft paa tredjedagen efter offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Metoden i bilag XII anvendes dog fra den 1. januar 1992, undtagen i forbindelse med interventionsforanstaltninger.

2. Denne forordning anvendes ikke for olivenolie og olie af olivenpresserester, der aftappes inden datoen for denne forordnings ikrafttraeden, og som bringes i handelen inden den 31. oktober 1992.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 11. juli 1991.

Paa Kommissionens vegne

Ray MAC SHARRY

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. 172 af 30. 9. 1966, s. 3025/66.(2) EFT nr. L 353 af 17. 12. 1990, s. 23.(3) EFT nr. L 128 af 24. 5. 1977, s. 6.(4) EFT nr. L 166 af 1. 7. 1988, s. 10.

BILAG

Resumé Side

Bilag I:

Karakteristika ved olivenolie .

Bilag II:

Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer .

Bilag III:

Bestemmelse af peroxidtallet .

Bilag IV:

Bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer ved gaskromatografi paa kapillarsoejle .

Bilag V:

Bestemmelse af sammensaetningen og indholdet af steroler ved gaskromatografi paa kapillarsoejle .

Bilag VI:

Bestemmelse af erythrodiol og uvaol .

Bilag VII:

Bestemmelse af fedtsyrer i 2-positionen i triglycerider fra olier og fedtstoffer .

Bilag VIII:

Bestemmelse af indholdet af trilinolein .

Bilag IX:

Spektrofotometrisk undersoegelse ved ultraviolet lys .

Bilag XA:

Gaskromatografering af fedtsyremethylestere .

Bilag XB:

Fremstilling af fedtsyremethylestere .

Bilag XI:

Bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede oploesningsmidler i olivenolie .

Bilag XII:

Organoleptisk vurdering af jomfruolie .

Bilag XIII:

Raffineringsbevis .

Bilag XIV:

Supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur

Bilag XV:

Olieindhold i presserester af oliven .

Bilag XVI:

Bestemmelse af iodtal .

BILAG I

KARAKTERISTIKA VED OLIVENOLIE (¹)

Type

Surhedsgrad

Peroxidtal

meq O2/kg

Halogenerede

oploesningsmidler (²)

mg/kg

Alifatiske

alkoholer

mg/kg

Maettede

syrer

i 2-stillingen

i triglycerid

Erytrodiol

+ uvaol

Trilinolein

Kolesterol

Brassicasterol

Campesterol

Stigmasterol

â-sitosterol

% (³)

D-7stigmastenol

Steroler

i alt

mg/kg

1. Jomfruolie

ekstra

M 1,0

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

2. Jomfruolie

M 2,0

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

3. Jomfruolie

almindelig

M 3,3

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

4. Bomolie

> 3,3

> 20

> 0,20

M 400

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

m 93,0

M 0,5

m 1 000

5. Olivenolie raffineret

M 0,5

M 10

M 0,20

M 350

M 1,5

M 4,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

<Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

6. Olivenolie

M 1,5

M 15

M 0,20

M 350

M 1,5

M 4,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

7. Raa olivenolie

af presserester

m 2,0

M 1,8

m 12

M 0,5

M 0,2

M 4,0

m 93,0

M 0,5

m 2 500

8. Raffineret olivenolie af presserester

M 0,5

M 10

M 0,20

M 2,0

m 12

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 800

9. Olivenolie

af presserester

M 1,5

M 15

M 0,20

M 2,0

> 4,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 800

M = maximum, m = minimum.

(¹) En olie deklasseres, hvis blot en enkelt egenskab ligger uden for de fastsatte graenser.

(²) Total maksimalgraensevaerdi for detektorforbindelser pr. detektor ved elektronfangst. For de enkelte paaviste bestanddele er den maksimale graesevaerdi 0,10 mg/kg.

(³) D-5,23-stigmastadienol + Clerosterol + Sitosterol + Sitostanol + D-5-avenasterol + D-5,24-stigmastadienol.

Type

Fedtsyresammensaetning

Myristin

Linolen

Arachin

Eicosan

Behen

Lignocerin

K232

K270

K270 med

aluminiumoxyd

(¹)

Panelbedoemmelse

1. Jomfruolie

ekstra

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,40

M 0,20

M 0,10

M 0,01

86,5

2. Jomfruolie

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,50

M 0,25

M 0,10

M 0,01

85,5

3. Jomfruolie

almindelig

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,50

M 0,25

M 0,10

M 0,01

83,5

4. Bomolie

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,70

> 0,25

M 0,11

< 3,5

5. Olivenolie raffineret

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,40

M 1,20

M 0,16

6. Olivenolie

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,30

M 1,00

M 0,13

7. Raa olivenolie

af presserester

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

8. Raffineret olivenolie af presserester

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 5,50

M 2,50

M 0,25

9. Olivenolie

af presserester

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 5,30

M 2,00

M 0,20

(¹) Hvis olier med surhedsgrad paa over 3,3 % efter passage af aluminiumoxyd viser K270 paa over 0,11, foretages den i bilag XIII onhandlede raffineringsproeve. Med henblik paa at fastslaa renheden bestemmes K270 paa ny efter behandling med aluminiumoxyd, naar K270 overstiger graensen for den paagaeldende kategori.

BILAG II

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FRIE FEDTSYRER 1.

FORMAAL

Bestemmelse af frie fedtsyrer i olivenolie. Indholdet af frie fedtsyrer udtrykkes ved det vedtaegtsmaessigt beregnede syreindhold.

1.1.

Princip

En analyseproeve oploeses i en blanding af oploesningsmidler, hvorefter de tilstedevaerende frie fedtsyrer bestemmes ved hjaelp af en oploesning af kaliumhydroxid i ethanol.

1.2.

Reagenser

Samtlige reagenser skal vaere af anerkendt analysekvalitet, og der anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.

1.2.1.

Dietyhlether/ethanol, 95 % (v/v), blandet i forholdet 1:1 efter rumfang.

Note: Dietylether er meget let antaendelig og kan danne eksplosive peroxider. Under anvendelsen skal der traeffes saerlige forholdsregler.

Noejagtigt paa anvendelsestidspunktet neutraliseres med en oploesning af kaliumhydroxid (1.2.2) ved tilstedevaerelse af 0,3 ml phenolphtalein-oploesning (1.2.3) pr. 100 ml blanding.

Note: Hvis det ikke er muligt at anvende diethylether, kan en blanding af oploesningsmidler bestaaende af ethanol og toluen anvendes. Om noedvendigt kan ethanolen erstattes af 2-propanol.

1.2.2.

Indstillet oploesning af kaliumhydroxid i ethanol, c(KOH) ca. 0,1 mol/l eller om noedvendigt c(KOH) ca. 0,5 mol/l.

Den noejagtige koncentration af kaliumhydroxid-oploesningen i ethanol skal vaere kendt og verificeres umiddelbart foer brug. Der anvendes en oploesning, der er fremstillet mindst fem dage foer brugen, og dekanteret over i en flaske af brunt glas, lukket med en gummiprop. Oploesningen skal vaere farveloes eller straagul.

Note: En ufarvet stabil oploesning af kaliumhydroxid kan fremstilles paa foelgende maade: 1 000 ml ethanol med 8 g kaliumhydroxid og 0,5 g aluminiumspaaner bringes i kog og holdes kogende i 1 time med tilbageloeb. Derefter destilleres omgaaende, og den kraevede maengde kaliumhydroxid oploeses i destillatet. Man lader oploesningen henstaa i flere dage og dekanterer derefter den oeverste klare vaeske fra bundfaldet af kaliumcarbonat.

Oploesingen kan ogsaa fremstilles uden destillation paa foelgende maade: til 1 000 ml ethanol tilsaettes 4 ml aluminiumbutylat, hvorefter man lader blandingen henstaa i nogle dage. Derefter dekanteres den klare vaeske fra, og heri oploeses den kraevede maengde kaliumhydroxid. Denne oploesning er klar til brug.

1.2.3.

Phenolphtalein, oploesning med 10 g/l i 95-96 % (v/v) ethanol, eller alkaliblaat (i tilfaelde af staerkt farvede fedtstoffer), oploesning med 20 g/l i 95-96 % (v/v) ethanol.

1.3.

Apparatur

Saedvanligt laboratorieudstyr, herunder:

1.3.1.

Analysevaegt.

1.3.2.

250 ml Erlenmeyer-kolbe.

1.3.3.

10 ml burette med 0,05 ml inddelinger.

1.4.

Fremgangsmaade

1.4.1.

Forberedelse af analyseproeve

Analyseproeven forberedes i overensstemmelse med NF T 60-200. (Paa proeven som den er, hvis det samlede indhold af vand og urenheder ikke overstiger 1 %, ellers paa en filtreret proeve). Bestemmelsen foretages paa den filtrerede proeve. Hvis det samlede indhold af vand og urenheder er under 1 %, foretages bestemmelsen paa den ubehandlede proeve.

1.4.2.

Proeveudtagning

Ud fra det antagne syreindhold udtages en proeve efter angivelserne i foelgendetabel:

Antaget syreindhold

vaegtprocent

Proevens masse

i g

Proeven afvejes med en noejagtighed

i g paa

< 1

1- 4

4-15

15-75

> 75

20,

10,

2,5

0,5

0,1

0,05

0,02

0,01

0,001

0,0002

Proeven afvejes i Erlenmeyer-kolben (1.3.2).

1.4.3.

Bestemmelse

Proeven (1.4.2) oploeses i 50 - 150 ml af den paa forhaand neutraliserede blanding af diethylether/ethanol (1.2.1).

Under omroering titreres med kaliumhydroxidoploesning, 0,1 mol/l (1.2.2) (se note 2), indtil indikatoren slaar om (den rosa farve af phenolphtalein skal holde sig i mindst 10 sek.).

Note 1: Den indstillede oploesning af kaliumhydroxid i ethanol (1.2.2) kan erstattes af en vandig oploesning af kaliumhydroxid eller natriumhydroxid, naar den tilfoerte vandmaengde ikke medfoerer faseadskillelse.

Note 2: Hvis den noedvendige maengde 0,1 mol/l kaliumhydroxidoploesning overstiger 10 ml, anvendes i stedet en oploesning paa 0,5 mol/l.

Note 3: Bliver oploesningen uklar under titreringen, tilsaettes saa meget oploesningsmiddelblanding (1.2.1), at oploesningen bliver klar.

1.5.

Angivelse af syreindholdet i % oliesyre

Syreindholdet, udtrykt som vaegtprocent = V × c × 1 000 × 100 = V × c × M

Syreindholdet, udtrykt som vaegtprocent = V × c ×

1 000

100

V × c × M

10 × m

hvor:

V = rumfanget i ml af den forbrugte kaliumhydroxidoploesning

den noejagtige koncentration i mol/l af den anvendte kaliumhydroxidoploesning

den molvaegt i g/mol af syren, der er valgt til angivelse af resultatet (Moliesyre = 282 g/mol)

analyseproevens vaegt i gram.

Som resultat anvendes det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser.

BILAG III

BESTEMMELSE AF PEROXIDTALLET 1.

OMRAADE

Denne standard beskriver en metode til bestemmelse af peroxidtallet for olier og fedtstoffer.

ANVENDELSESOMRAADE

Denne standard finder anvendelse for animalske og vegetabilske olier og fedtstoffer.

DEFINITION

Peroxidtallet angiver den maengde stoffer i proeven, udtrykt som milliaekvivalenter aktivt oxygen pr. kg, som oxiderer kaliumiodid under de beskrevne forsoegsbetingelser.

PRINCIP

Analyseproeven, oploest i en blanding af eddikesyre og chloroform, behandles med en oploesning af kaliumiodid. Det frigjorte iod titreres med en indstillet natriumthiosulfatoploesning.

APPARATUR

Alt udstyr skal vaere fri for reducerende og oxiderende stoffer.

Note: Sliboverflader maa ikke indfedtes.

5.1.

3 ml glasske.

5.2.

Kolber med slib og prop, paa ca. 250 ml, som paa forhaand toerres og fyldes med ren, toer inert gas (nitrogen eller - helst - carbondioxid).

5.3.

25 eller 50 ml burette med 0,1 ml inddeling.

REAGENSER

6.1.

Analyseren chloroform, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, toer inert gas.

6.2.

Analyseren iseddike, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, toer inert gas.

6.3.

Maettet vandig oploesning af kaliumiodid, fremstillet umiddelbart foer brug og fri for iod og iodater.

6.4.

Natriumthiosulfat, 0,01 eller 0,002 N noejagtigt indstillet vandig oploesning, indstillet umiddelbart foer brug.

6.5.

Stivelsesoploesning, 10 g/l vandig opslaemning, fremstillet umiddelbart foer brug ud fra naturlig oploeselig stivelse.

PROEVE

Proeven udtages og opbevares beskyttet mod lys, holdes nedkoelet og opbevares i fuldstaendigt fyldte glasbeholdere, der er hermetisk tillukket med slibpropper af glas eller korkpropper.

FREMGANGSMAADE

Analysen udfoeres i diffust dagslys eller i kunstigt lys. I en glasske (5.1) eller i mangel heraf en kolbe (5.2) afvejes med en noejagtighed paa 0,001 g en proevemaengde i overensstemmelse med foelgende tabel, svarende til det forventede peroxidtal:

Forventet perioxidtal

(meq O2/kg)

Analyseproevens vaegt

(i g)

0 - 12

12 - 20

20 - 30

30 - 50

50 - 90

5,0 - 2,0

2,0 - 1,2

1,2 - 0,8

0,8 - 0,5

0,5 - 0,3

Proppen tages af en kolbe (5.2), og analyseproeven i glasskeen overfoeres til kolben. Der tilsaettes 10 ml chloroform (6.1), og analyseproeven oploeses hurtigt ved omrystning. Derefter tilsaettes 15 ml eddikesyre (6.2), efterfulgt af 1 ml kaliumiodidoploesning (6.3). Saa saettes proppen hurtigt i, og der omrystes i 1 min., hvorefter man lader kolben henstaa i noejagtigt 5 min. i moerke ved en temperatur paa 15 - 25o C.

Der tilsaettes ca. 75 ml destilleret vand, og det frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatoploesning (6.4) (0,002 N oploesning for forventede vaerdier under 12, og 0,01 N oploesning for forventede vaerdier over 12) under kraftig omrystning og med anvendelse af stivelsesoploesning (6.4) som indikator.

Der udfoeres to bestemmelser paa samme analyseproeve.

Samtidig udfoeres en blindproeve. Hvis resultatet af blindproeven overstiger 0,05 ml 0,01 N natriumthiosulfatoploesning (6.4), udskiftes de urene reagenser.

ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Perioxidtallet (P.V.), udtrykt i milliaekvivalenter aktivt oxygen pr. kg, er givet ved formlen:

P.V. = V × T × 1 000

P.V. =

V × T × 1 000

hvor:

V = antal ml forbrugt indstillet natriumthiosulfatoploesning (6.4) ved analysen, korrigeret for resultatet af blindproeven

den noejagtige normalitet af den anvendte natriumthiosulfatoploesning (6.4),

analyseproevens vaegt i g.

Som resultat angives det aritmetiske gennemsnit af de to udfoerte bestemmelser.

BILAG IV

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ALIFATISKE ALKOHOLER VED GASKROMATOGRAFI PAA KAPILLARSOEJLE 1.

OMRAADE

Metoden beskriver en fremgangsmaade til at bestemme indholdet af de enkelte alifatiske alkoholer og det samlede indhold af alifatiske alkoholer i fedtstoffer.

METODENS PRINCIP

Fedtstoffer, tilsat 1-eicosanol som intern standard, forsaebes med kaliumhydroxid i ethanoloploesning, hvorefter de ikke-forsaebelige stoffer ekstraheres med diethylether.

Alkoholfraktionen separeres fra ekstrakten af ikke-forsaebelige stoffer ved kromatografi paa basiske kiselgelplader. De alkoholer, der er indvundet fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved gaskromatografi paa kapillarsoejle.

APPARATUR

3.1.

250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib.

3.2.

500 ml skilletragte.

3.3.

250 ml kolber.

3.4.

Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm glasplader.

3.5.

Ultraviolet lampe med en boelgelaengde paa 366 eller 254 nm.

3.6.

100 ml og 500 ml mikrosproejter.

3.7.

En cylindrisk filtertragt med et G3 poroest septum (poroesitet 15-40 mm), med en diameter paa ca. 2 cm og en dybde paa ca. 5 cm, med en befaestelsesdel, der er egnet til filtrering under vakuum, og en samlingsdel med et 12/21 udvendig konisk glasslib.

3.8.

En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 invendig konisk glasslib, som filtertragten (3.7) kan monteres paa.

3.9.

Et 10 ml proeveroer med konisk bund og taetsluttende prop.

3.10.

En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsoejle, forsynet med et spaltningssystem, der bestaar af:

3.10.1.

Et termostatkammer til soejler, som kan opretholde den oenskede temperatur med en noejagtighed paa

p1o C.

3.10.2.

En inddampningsenhed med temperaturindstilling, med et fordampningselement af silanglas.

3.10.3.

En flammeioniserings-detektor og en omformer-forstaerker.

3.10.4.

En integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-forstraekeren (3.10.3), og som har en svartid paa ikke over ét sekund og variabel papirhastighed.

3.11.

En kapillarsoejle af glas eller kvartsglas, med en laengde paa 20-30 m, en indre diameter paa 0,25-0,32 mm, indvendig overtrukket med SE-52 eller SE-54 vaeskefase eller tilsvarende i en ensartet tykkelse paa mellem 0,10 og 0,30 mm.

3.12.

En 10 ml gaskromatografi-mikrosproejte med haerdet kanyle.

REAGENSER

4.1.

Kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanoloploesning. 130 g kaliumhydroxid (minimum titer 85 %) oploeses i 200 ml destilleret vand under afkoeling, og der fyldes op med ethanol til 1 liter. Oploesningen opbevares i veltilproppede, moerke glasflasker.

4.2.

Diethylether, analyseren.

4.3.

Vandfrit natriumsulfat, analyserent.

4.4.

Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescens-indikator, tykkelse 0,25 mm (kan faas brugsfaerdige i handelen).

4.5.

Kaliumhydroxid, ca. 0,2 N, i ethanoloploesning. 13 g kaliumhydroxid oploeses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter.

4.6.

Benzen, til kromatografi (5.2.2).

4.7.

Acetone, til kromatografi (5.2.2).

4.8.

Hexan, til kromatografi (5.2.2).

4.9.

Diethylether, til kromatografi (5.2.2).

4.10.

Chloroform, analyseren.

4.11.

Referenceoploesning til tyndtlagskromatografi: En 5 % oploesning af en blanding af alkoholer fra C20 til C28 i chloroform.

4.12.

2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % oploesning i ethanol. Goeres svagt basisk ved tilsaetning af nogle faa draaber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidoploesning.

4.13.

Vandfri pyridin til kromatografi.

4.14.

Hexamethyldisilazan.

4.15.

Trimethylchlorsilan.

4.16.

Testoploesninger af trimethylsilylethere (TMSE) af de alifatiske alkoholer fra C20 til C28, friskfremstillede ud fra blandinger af rene alkoholer.

4.17.

1-eicosanol, 0,1 % (m/v) oploesning i chloroform (intern standard).

4.18.

Baeregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren.

4.19.

Hjaelpegasser:

- Hydrogen, gaskromatografiren

- Luft, gaskromatografiren.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Forberedelse af de ikke-forsaebelige stoffer

5.1.1.

Et rumfang 0,1 % 1-eicosanoloploesning i chloroform (4.17), der indeholder en maengde 1-eicosanol (man kan ligeledes anvende 1-eneicosanol) svarende til ca. 10 % af indholdet af alifatiske alkoholer i den del af proeven, der er taget ud til bestemmelsen, overfoeres til 250 ml kolben ved hjaelp af 500 ml mikrosproejten. F.eks. saettes til 5 g af proeven 250 ml 0,1 % 1-eicosanoloploesning, hvis undersoegelsen gaelder olivenolier eller froeolier, og 1 500 ml, hvis det gaelder olie fra olivenpresserester.

Proeven inddampes til toerhed i en nitrogenstroem, hvorefter 5 g af den toerrede, filtrerede proeve afvejes noejagtigt og overfoeres til den samme kolbe.

5.1.2.

50 ml 2 N oploesning af kaliumhydroxid i ethanol tilsaettes, refluxsvaleren paasaettes, og vaesken opvarmes til svag kogning paa vandbad under vedvarende, kraftig omroering, indtil forsaebningen sker (oploesningen bliver klar). Opvarmningen fortsaettes i endnu 20 minutter, derefter tilsaettes 50 ml destilleret vand fra den oeverste del af svaleren, svaleren tages af, og kolben afkoeles til ca. 30o C.

5.1.3.

Kolbens indhold overfoeres kvantitativt til en 500 ml skilletragt, idet der skylles flere gange med destilleret vand, ialt ca. 50 ml. Ca. 80 ml diethylether tilsaettes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og faar lov til at henstaa (note 1).

Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt. Yderligere to ekstraktioner foretages paa den vandige fase paa samme maade, idet der bruges 60-70 ml diethylether hver gang.

Note 1: Eventuel emulsion kan oedelaegges ved tilsaetning af smaa maengder ethyl- eller methylalkohol ved hjaelp af en spray.

5.1.4.

Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destilleret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral reaktion.

Naar vaskevandet er fjernet, toerres ekstrakterne med vandfrit natriumsulfat og filtreres over vandfrit natriumsulfat ned i en paa forhaand vejet 250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med smaa maengder diethylether.

5.1.5.

Etheren destilleres ned til nogle faa ml og bringes derefter til toerhed under et let undertryk eller i en nitrogenstroem, toerres fuldstaendigt i en ovn ved 100o C i ca. 15 minutter, og vejes saa efter afkoeling i en ekssikkator.

5.2.

Separation af alkoholfraktionen

5.2.1.

Forberedelse af de basiske plader. Kiselgelpladerne (4.4) nedsaenkes fuldstaendig i 0,2 N oploesningen af kaliumhydroxid i ethanol (4.5) i 10 sekunder. Derefter faar de lov at toerre i et stinkskab i 2 timer og saettes tilsidst i en ovn ved 100o C i 1 time.

Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssikkator, til de skal bruges (plader, der er behandlet paa denne maade, skal anvendes inden 15 dage).

Note 2: Naar basiske kiselgelplader benyttes til at separere alkoholfraktionen, er det ikke noedvendigt at behandle de ikke-forsaebelige stoffer med aluminiuoxid. Paa denne maade holdes alle sure forbindelser (fede syrer og andre) tilbage paa basislinien, og de alifatiske og terpene alkoholers baand er klart adskilt fra sterolbaandet.

5.2.2.

En 95:5 (v/v) benzen/acetoneblanding anbringes i kromatografikammeret til en hoejde paa ca. 1 cm. Som et alternativ kan en 65:35 (v/v) hexan/diethyletherblanding bruges. Kammeret lukkes med det dertil passende daeksel og efterlades saaledes i ca. en halv time, saa at der opnaas ligevaegt mellem vaeske og damp. Strimler af filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringes paa kammerets indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet og regelmaessig eluering af komponenterne.

Note 3: Kromatografiblandingen boer udskiftes for hver test for at opnaa fuldstaendig reproducerbare elueringsbetingelser.

5.2.3.

Der tilberedes en ca. 5 % oploesning af de ikke-forsaebelige stoffer (5.1.5) i chloroform. Med 100 ml mikrosproejten afsaettes med 0,3 ml af denne oploesning paa en kromatografiplade (5.2.1), ca. 2 cm fra den ene ende, en streg, som er saa tynd og ensartet som muligt. Paa linie med strengen placeres 2-3 ml af alkoholreferenceoploesningen (4.11) i den ene ende af pladen, saa de alifatiske alkoholers baand kan identificeres efter eluering.

5.2.4.

Pladen anbringes i kromatografikammeret, der er forberedt som angivet i 5.2.2. Temperaturen boer holdes mellem 15 og 20o C. Kammeret lukkes straks med daekslet, og det faar lov til at eluere, indtil oploesningsmidlets forkant naar ca. 1 cm fra pladens oeverste kant. Derpaa fjernes pladen fra kromatografi-kammeret, og man lader oploesningsmidlet fordampe i en stroem af varm luft eller ved at lade pladen staa en kort tid i stinkskab.

5.2.5.

Pladen sproejtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluoresceinoploesningen. Naar pladen undersoeges under ultraviolet lys, identificeres de alifatiske alkoholers baand ved at bringes paa linie med den plet, der er opnaaet med referenceoploesningen, og alle de alifatiske alkoholers baand, tillige med det baand, der ligger umiddelbart ovenfor, og som svarer til de triterpene alkoholer, markeres med en sort blyant.

Note 4: Instruktionen om at samle alle de alifatiske alkoholers baand og de triterpene alkoholers baand skyldes, at under denne metodes betingelser er betydelige maengder af alifatiske alkoholer inkluderet i de triterpene alkoholers baand.

5.2.6.

Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede omraade. Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten (3.7). 10 ml varm chloroform tilsaettes, man blander omhyggeligt med metalspatelen og filtrerer under vakuum, filtratet opsamles i den koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten.

Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme koniske kolbe, der er forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af ca. 4-5 ml. Den tilbagevaerende oploesning overfoeres til det paa forhaand vejede 10 ml proeveroer (3.9), det inddampes til toerhed med let opvarmning i en bloed stroem af nitrogen, der fyldes atter op med nogle faa draaber acetone, det inddampes igen til toerhed, roeret placeres i en ovn ved 105o C i ca. 10 minutter, derefter lader man det svale af i en ekssikkator og vejer det.

Den rest, der findes i proeveroeret, bestaar af alkoholfraktionen.

5.3.

Forberedelse af trimethylsilyletherne

5.3.1.

Til proeveroeret, der indeholder alkoholfraktionen, saettes silyleringsreagenset, der bestaar af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 5), i forholdet 50 ml for hvert milligram alkohol, idet enhver optagelse af fugt undgaas (note 6).

Note 5: Brugsfaerdige oploesninger kan faas i handelen. Man kan ogsaa faa andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med et lige saa stort rumfang vandfrit pyridin.

5.3.2.

Proeveroeret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i vejret paa det), indtil alkoholerne er fuldstaendig oploest. Man lader det staa i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det saa i nogle faa minutter. Den klare oploesning er parat til gaskromatografisk analyse.

Note 6: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller fremkommer en lyseroed farve, er det tegn paa tilstedevaerelsen af fugt eller svaekkelse af reagensen. Hvis det forekommer, maa proeven gentages.

5.4.

Gaskromatografisk analyse

5.4.1.

Forberedende operationer, pakning af soejlen

5.4.1.1.

Soejlen monteres i gaskromatografen, idet indloebsenden forbindes med fordamperen, der staar i forbindelse med spaltningssystemet, og udloebsenden forbindes med detektoren.

Man foretager en generel kontrol af gaskromatografienheden (laekager fra gaskredsloebene, detektorens effektivitet, spaltningssystemets og registreringssystemets effektivitet osv.)

5.4.1.2.

Hvis soejlen skal bruges for foerste gang, anbefales det, at den underkastes en konditionering. Man lader en svag gasstroem passere gennem soejlen og taender saa for gaskromatografienheden, derefter begynder man gradvis at varme op til en temperatur 20o C over driftstemperaturen (note 7). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer, derefter saettes hele systemet i driftstilstand (justering af gasstroemme og spaltning, antaendelse af flammen, forbindelse til den elektroniske skriver, justering af soejlekammeret, detektorens og injektorens temperatur osv.), og derefter optegnes signalet med en foelsomhed, der er mindst to gange stoerre end den, man agter at anvende til analysen. Basisliniens forloeb skal vaere lige, uden toppe af nogen art, og den maa ikke glide.

Negativ glidning af en lige linie tyder paa laekage fra soejlens forbindelser, positiv glidning tyder paa utilstraekkelig konditionering af soejlen.

Note 7: Konditioneringstemperaturen skal altid vaere mindst 20o C lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den anvendte stationaere fase.

5.4.2.

Valg af driftsbetingelser

5.4.2.1.

De anbefalede driftsbetingelser er som foelger:

- soejletemperatur: indledende isoterm i 8 minutter ved 180o C, derefter programmeret til 5o /minut op til 260o C, og saa 15 minutter ved 260o C

- fordampertemperatur: 280o C

- detektortemperatur: 290o C

- baeregassens lineaere hastighed: helium 20-35 cm/s, hydrogen 30-50 cm/s

- spaltingsforhold: fra 1:50 til 1:100

- instrumentets foelsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale daempning

- registreringsfoelsomhed: 1-2 mV fuld skala

- papirhastighed: 30-60 cm/time

- maengde stof injiceret: 0,5-1 ml TMSE-oploesning.

Disse betingelser kan varieres i lyset af soejlens og gaskromatografens egenskaber, saa man opnaar kromatogrammer, der opfylder foelgende krav:

- retentionstiden for C26 alkohol boer vaere 18 p5 minutter

- toppen for C22 alkohol boer vaere 80 p20 % af fuld skala for olivenolie og 40 p20 % af fuld skala for froeolier.

5.4.2.2.

For at kontrollere ovenstaaende krav foretages gentagne injektioner af proeveblandinger af alkoholTMSE, og driftsbetingelserne justeres, saa de bedste resultater opnaas.

5.4.2.3.

Integrationsparametrene for toppe maa fastsaettes saadan, at de giver en korrekt vurdering af de undersoegte toparealer.

5.4.3.

Analytisk fremgangsmaade

5.4.3.1.

Med 10 ml mikrosproejten optages 1 ml hexan, derefter suges foerst 0,5 ml luft og derefter 0,5-1 ml af proeveoploesningen op. Stemplet traekkes hoejere op, saa kanylen toemmes. Kanylen trykkes gennem injektionsenhedens membran, og efter 1-2 sekunder injiceres hurtigt, derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder.

5.4.3.2.

Optegnelsen fortsaettes, indtil de tilstedevaerende alkoholers TMSE er fuldstaendig elueret.

Basislinien skal til stadighed opfylde kravene. (5.4.1.2).

5.4.4.

Identifikation af toppene

De enkelte toppe identificeres paa basis af retentionstiderne og ved sammenligning med blandinger af alkohol-TMSE, der er analyseret under de samme betingelser.

Figur 1 viser et kromatogram for alkoholfraktionen af en jomfruolie.

5.4.5.

Kvantitativ vurdering

5.4.5.1.

Toparealerne for 1-eicosanol og de alifatiske alkoholer fra C22 til C28 beregnes ved hjaelp af den integrerende taeller.

5.4.5.2.

Koncentrationen af hver enkelt alkohol beregnes i mg/100 g fedtstof som foelger:

alkohol x = Ax × ms × 100

alkohol x =

Ax × ms × 100

As × m

hvor:

Ax = toparealet for alkohol x i kvadratmillimeter

arealet af 1-eicosanoltoppen i kvadratmillimeter

massen af tilsat 1-eicosanol i milligram

massen af den proeve, der bruges til bestemmelsen, i gram.

RAPPORTERING AF RESULTATERNE

Koncentrationerne af de enkelte alifatiske alkoholer angives som mg/100 g fedtstof og deres sum som »total maengde alifatisk alkohol«.

APPENDIX Bestemmelse af gassens lineaere hastighed

Med gaskromatografen indstillet paa normale driftsbetingelser injiceres 1 - 3 ìl methan (eller propan), og man maaler den tid, det tager for gassen at passere gennem soejlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen fremkommer (tM). Den lineaere hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er soejlens laengde i cm, og tM er den maalte tid i sekunder.

BILAG V

BESTEMMELSE AF SAMMENSAETNINGEN OG INDHOLDET AF STEROLER VED GASKROMATOGRAFI PAA KAPILLARSOEJLE 1.

OMRAADE

Metoden beskriver en fremgangsmaade til bestemmelse af indholdet af de enkelte steroler og det samlede sterolindhold i fedtstoffer.

METODENS PRINCIP

Fedtstoffer, med a-cholestanol tilsat som en intern standard, forsaebes med kaliumhydroxid i ethanoloploesning, og de bestanddele, der ikke kan forsaebes, ekstraheres derefter med diethylether.

Sterolfraktionen adskilles fra ekstrakten af stoffer, som ikke kan forsaebes, ved kromatografi paa en basisk kiselgelplade. De steroler, som genvindes fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved hjaelp af gaskromatografi paa kapillarsoejle.

APPARATUR

3.1.

250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib.

3.2.

500 ml skilletragte.

3.3.

250 ml kolber.

3.4.

Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm glasplader.

3.5.

Ultraviolet lampe med en boelgelaengde paa 366 eller 254 nm.

3.6.

100 ml og 500 ml mikrosproejter.

3.7.

3.8.

En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendig konisk glasslib, som filtertragten (3.7) kan monteres paa.

3.9.

Et 10 ml proeveroer med konisk bund og taetsluttende prop.

3.10.

En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsoejle, forsynet med et spaltningssystem, der bestaar af:

3.10.1.

Et termostatkammer til soejler, som kan opretholde den oenskede temperatur med en noejagtighed paa

p1o C.

3.10.2.

En inddampningsenhed med temperaturindstilling, med et fordampningselement af silanglas.

3.10.3.

En flammeioniserings-detektor og en omformer-forstaerker.

3.10.4.

En integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-forstaerkeren (3.10.3), og som har en svartid paa ikke over ét sekund og variabel papirhastighed.

3.11.

En kapillarsoejle af glas eller kvartsglas, med en laengde paa 20-30 m, en indre diameter paa 0,25-0,32 mm, helt overtrukket med SE-52 eller SE-54 vaeske eller tilsvarende i en ensartet tykkelse paa mellem 0,10 og 0,30 mm.

3.12.

En 10 ml gaskromatografi-mikrosproejte med haerdet kanyle.

REAGENSER

4.1.

4.2.

Diethylether, analyseren.

4.3.

Vandfrit natriumsulfat, analyserent.

4.4.

Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescensindikator, tykkelse 0,25 mm (kan faas brugsfaerdige i handelen).

4.5.

Kaliumhydroxid, 0,2 N, i ethanoloploesning. 13 g kaliumhydroxid oploeses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter.

4.6.

Benzen, til kromatografi (5.2.2).

4.7.

Acetone, til kromatografi (5.2.2).

4.8.

Hexan, til kromatografi (5.2.2).

4.9.

Diethylether, til kromatografi (5.2.2).

4.10.

Chloroform, analyseren.

4.11.

Referenceoploesning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phytosteroler, 5 % oploesning i chloroform.

4.12.

2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % oploesning i ethanol. Goeres svagt basisk ved tilsaetning af nogle faa draaber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidoploesning.

4.13.

Vandfri pyridin til kromatografi.

4.14.

Hexamethyldisilazan.

4.15.

Trimethylchlorsilan.

4.16.

Referenceoploesninger af sterol-trimethylsilylethere (TMSE). Friskfremstillet ud fra rene steroler eller blandinger af steroler udvundet af sterolholdige olier.

4.17.

a-cholestanol, 0,2 % oploesning (m/v) i chloroform (intern standard).

4.18.

Baeregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren.

4.19.

Hjaelpegasser:

- Hydrogen, gaskromatografiren

- Luft, gaskromatografiren.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Forberedelse af de ikke-forsaebelige stoffer

5.1.1.

Et rumfang 0,2 % a-cholestanoloploesning i chloroform (4.17), der indeholder en maengde a-cholestanol svarende til ca. 10 % af sterolindholdet i den del af proeven, der er taget ud til bestemmelsen, indfoeres i 250 ml kolben ved hjaelp af 500 ml mikrosproejten. F.eks. saettes til 5 g af proeven 500 ml 0,2 % a-cholestanoloploesning, hvis undersoegelsen gaelder olivenolie, og 1 500 ml, hvis det gaelder froeolier eller olie fra olivenpresserester.

Proeven inddampes til toerhed i en nitrogenstroem, hvorefter 5 g af den toerrede, filtrerede proeve afvejes noejagtigt og overfoeres til den samme kolbe.

Animalske eller vegetabilske olier og fedtstoffer, der indeholder betydelige maengder cholesterol, kan vise en top, der har den samme retentionstid som a-cholestanol. Hvis det forekommer, maa sterolfraktionen analyseres to gange med og uden intern standard.

5.1.2.

50 ml 2 N kaliumhydroxid i ethanoloploesning tilsaettes, refluxsvaleren paasaettes, og vaesken opvarmes til svag kogning paa vandbad under vedvarende, kraftig omroering, indtil forsaebningen sker (oploesningen bliver klar). Opvarmningen fortsaettes i endnu 20 minutter, derefter tilsaettes 50 ml destilleret vand fra den oeverste del af svaleren, svaleren tages af, og kolben afkoeles til ca. 30o C.

5.1.3.

Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt. Yderligere to ekstraktioner foretages paa den vandige fase paa samme maade, idet der bruges 60-70 ml diethylether hver gang.

Note 1: Eventuel emulsion kan oedelaegges ved tilsaetning af smaa maengder ethyl- eller methylalkohol ved hjaelp af en spray.

5.1.4.

Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destilleret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral reaktion.

Naar vaskevandet er fjernet, toerres ekstrakterne med vandfrit natriumsulfat og filtreres paa vandfrit natriumsulfat ned i en paa forhaand vejet 250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med smaa maengder diethylether.

5.1.5.

5.2.

Separation af sterolfraktionen

5.2.1.

Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssikkator, til de skal bruges (plader, der er behandlet paa denne maade, skal anvendes inden 15 dage).

Note 2: Naar basiske kiselgelplader benyttes til at separere sterolfraktionen, er det ikke noedvendigt at behandle de ikke-forsaebelige stoffer med aluminiumoxid. Paa denne maade holdes alle sure forbindelser (fede syrer og andre) tilbage paa basislinien, og sterolbaandet er klar adskilt fra de alifatiske og triterpene alkoholers baand.

5.2.2.

Note 3: Kromatografiblandingen boer udskiftes for hver test for at opnaa fuldstaendig reproducerbare elueringsbetingelser.

5.2.3.

Man tilbereder en ca. 5 % oploesning af de ikke-forsaebelige stoffer (5.1.5) i chloroform. Med 100 ml mikrosproejten afsaetter man paa en kromatografiplade (5.2.1) med 0,3 ml, ca. 2 cm fra den ene ende, en streg, som er saa tynd og ensartet som muligt. Paa linie med stregen placeres 2-3 ml af sterol-referenceoploesningen (4.11) i den ene ende af pladen, saa sterolbaandet kan identificeres efter eluering.

5.2.4.

Pladen anbringes i kromatografikammeret, som er forberedt som angivet i 5.2.2. Den omgivende temperatur boer holdes mellem 15 og 20o C. Kammeret lukkes straks med daekslet, og det faar lov til at eluere, indtil oploesningsmidlets forkant naar ca. 1 cm fra pladens oeverste kant. Derpaa fjernes pladen fra kromatografikammeret, og man lader oploesningsmidlet fordampe i en stroem af varm luft eller ved at lade pladen staa en kort tid i et stinkskab.

5.2.5.

Pladen sproejtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluorosceinoploesningen. Naar pladen observeres under ultraviolet lys, kan sterolbaandet identificeres ved, at det bringes paa linie med den plet, der er opnaaet fra referenceoploesningen. Baandets graenser langs fluoroscenses kanter markeres med en sort blyant.

5.2.6.

Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede omraade. Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten (3.7). 10 ml varm chloroform tilsaettes, man blander omhyggeligt med metalspatelen og filtrerer under vakuum; filtratet opsamles i den koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten.

Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af 4-5 ml, den tilbagevaerende oploesning overfoeres til det paa forhaand vejede 10 ml proeveroer (3.9), det inddampes til toerhed med let opvarmning i en bloed stroem af nitrogen, der fyldes atter op med nogle faa draaber acetone, der inddampes igen til toerhed, roeret placeres i en ovn ved 105o C i ca. 10 minutter, derefter lader man det svale af i en ekssikkator og vejer det.

Den rest, der findes i proeveroeret, bestaar af sterolfraktionen.

5.3.

Forberedelse af trimethylsilyletherne

5.3.1.

Til proeveroeret, der indeholder sterolfraktionen, saettes silyleringsreagenset, der bestaar af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 4), i forholdet 50 ml for hvert milligram sterol, idet enhver optagelse af fugt undgaas (note 5).

Note 4: Brugsfaerdige oploesninger kan faas i handelen. Man kan ogsaa faa andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med et lige saa stort rumfang vandfrit pyridin.

5.3.2.

Proeveroeret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i vejret paa det), indtil sterolerne er fuldstaendig oploest. Man lader det staa i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det saa i nogle faa minutter. Den klare oploesning er parat til gaskromatografisk analyse.

Note 5: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller fremkommer en lyseroed farve, er det et tegn paa tilstedevaerelsen af fugt eller svaekkelse af reagensen. Hvis det forekommer, maa proeven gentages.

5.4.

Gaskromatografisk analyse

5.4.1.

Forberedende operationer, pakning af soejlen

5.4.1.1.

Soejlen monteres i gaskromatografen, idet indloebsenden forbindes med fordamperen, der staar i forbindelse med spaltningssystemet, og udloebsenden forbindes med detektoren.

Man foretager en generel kontrol af gaskromatografen (laekager fra gaskredsloebene, detektorens effektivitet, spaltningssystemetsog registreringssystemets effektivitet osv.)

5.4.1.2.

Hvis soejlen skal bruges for foerste gang, anbefales det, at den underkastes en konditionering. Man lader en svag gasstroem passere gennem soejlen og taender saa for gaskromatografienheden, derefter begynder man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20o C over driftstemperaturen (note 6). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer, derefter saettes hele enheden i driftstilstand (justering af gasstroemme og spaltning, antaendelse af flammen, forbindelse til den elektroniske skriver, justering af soejlekammeret, detektorens og injektorens temperatur osv.), og derefter optegens signalet med en foelsomhed, der er mindst to gange stoerre end den, man agter at anvende til analysen. Basisliniens forloeb skal vaere lige, uden toppe af nogen art, og den maa ikke glide.

Negativ glidning af en lige linie tyder paa laekage fra soejlens forbindelser, positiv glidning tyder paa utilstraekkelig konditionering af soejlen.

Note 6: Konditioneringstemperaturen skal altid vaere mindst 20o C lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den anvendte stationaere fase.

5.4.2.

Valg af driftsbetingelser

5.4.2.1.

De anbefalede driftsbetingelser er som foelger:

- soejletemperatur: 260o C p5o C

- fordampertemperatur: 280o C

- detektortemperatur: 290o C

- baeregassens lineaere hastighed: helium 20-35 cm/s, hydrogen 30-50 cm/s

- spaltningsforhold: fra 1:50 til 1:100

- instrumentets foelsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale daempning

- registreringsfoelsomhed: 1-2 mV fuld skala

- papirhastighed: 30-60 cm/time

- maengde stof injiceret: 0,5-1ml TMSE-oploesning.

Disse betingelser kan varieres i lyset af soejlens og gaskromatografens egenskaber, saa man opnaar kromatogrammer, der opfylder foelgende krav:

- retentionstiden for b-sitosterol boer vaere 20 p5 minutter

- campesteroltoppen boer vaere: for olivenolie (gennemsnitsindhold 3 %) 15 p5 % af hel skala; for soyaolie (gennemsnitsindhold 20 %) 80 p10 % af hel skala

- alle tilstedevaerende steroler skal adskilles. Desuden skal toppene ogsaa vaere fuldstaendig oploest, dvs. hver tops spor skal gaa tilbage til basislinien, foer sporet gaar op til den naeste top. Ufuldstaendig oploesning kan dog tolereres, saafremt toppen ved TRR (relativ retentionstid) 1,02 kan bestemmes kvantitativt ved brug af den vinkelrette linie.

5.4.3.

Analytisk fremgangsmaade

5.4.3.1.

Med 10 ml mikrosproejten optages 1 ml hexan, derefter traekkes foerst 0,5 ml luft og derefter 0,5-1 ml af proeveoploesningen op. Stemplet traekkes hoejere op, saa kanylen toemmes. Kanylen trykkes gennem injektionsenhedens membran, og efter 1-2 sekunder injiceres hurtigt, derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder.

5.4.3.2.

Optegnelsen fortsaettes, indtil de tilstedevaerende sterolers TMSE er fuldstaendig elueret.

Basislinien skal til stadighed opfylde kravene (5.4.1.2).

5.4.4.

Identifikation af toppene

De enkelte toppe identificeres paa basis af retentionstiderne og ved sammenligning med blandinger af sterol-TMSE, der er analyseret under de samme betingelser.

Sterolerne elueres i foelgende raekkefoelge: cholesterol, brassicasterol, 24-methylencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, D-7-campesterol, D-5,23-stigmastadienol, clerosterol, b-sitosterol, sitostanol, D-5-avenasterol, D-5,24-stigmastadienol, D-7-stigmastenol, D-7-avenasterol.

Retentionstiderne for b-sitosterol for SE 52 og SE 54 soejler er vist i tabel 1.

Figur 1 og 2 illustrerer typiske kromatogrammer for nogle olier.

5.4.5.

Kvantitativ vurdering

5.4.5.1.

Arealerne for a-cholestanol- og steroltoppene beregnes ved hjaelp af den integrerende taeller. Der ses bort fra toppene for eventuelle forbindelser, der ikke er blandt dem, der er opregnet i tabel 1.

5.4.5.2.

Koncentrationen af hver enkelt sterol beregnes i mg/100 g fedtstof som foelger:

sterol x = Ax × ms × 100

sterol x =

Ax · ms · 100

As · m

hvor:

Ax = toparealet for sterol x i kvadratmillimeter

arealet af á-cholestanoltoppen i kvadratmillimeter

massen af tilsat á-cholestanol i milligram

massen af den proeve, der bruges til bestemmelsen, i gram.

RAPPORTERING AF RESULTATERNE

6.1.

De individuelle sterolkoncentrationer angives som mg/100 g fedtstof og deres sum som »total sterolmaengde«.

6.2.

Den procentvise andel af de individuelle steroler beregnes paa grundlag af forholdet mellem arealet af den tilsvarende top og summen af arealerne af sterolernes toppe.

sterol % x = Ax × 100

% sterol x =

Ax × 100

ÓA

hvor:

Ax = arealet af top x

ÓA

summen af arealerne af alle toppe.

APPENDIX Bestemmelse af gassens lineaere hastighed

Med gaskromatografen indstillet paa normale driftsbetingelser injiceres 1-3 ml methan (eller propan), og man maaler den tid, det tager for gassen at passere gennem soejlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen fremkommer (tM).

Den lineaere hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er soejlens laengde i cm, og tMer den maalte tid i sekunder.

Tabel 1

Relative retentionstider for steroler

AE-5,23-stigmastadienol

Top

Identifikation

Relativ retentionstid

SE 54

soejle

SE 52

soejle

cholesterol

D-5-cholesten-39B>b-ol

0,67

0,63

cholestanol

59A>a-cholestan-39B>b-ol

0,68

0,64

brassicasterol

[24S]-24-methyl9D>D-5,22-cholestadien-39B>b-ol

0,73

0,71

24-methylen-cholesterol

24-methylen9D>D-5,24-cholestadien-39B>b-ol

0,82

0,80

campesterol

[24R]-24-methyl9D>D-5-cholesten-39B>b-ol

0,83

0,81

campestanol

[24R]-24-methyl-cholestan-39B>b-ol

0,85

0,82

stigmasterol

[24S]-24-ethyl9D>D-5,22-cholestadien-39B>b-ol

0,88

0,87

D-7-campesterol

[24R]-24-methyl9D>D-7-cholesten-39B>b-ol

0,93

0,92

D-5,23-stigmastadienol

[24R,S]-24-ethyl9D>D-5,23-cholestadien-39B>b-ol

0,95

chlerosterol

[24S]-24-ethyl9D>D-5,25-cholastadien-39B>b-ol

0,96

b-sitosterol

[24R]-24-ethyl9D>D-5-cholestan-39B>b-ol

1,00

sitostanol

24-ethyl-cholestan-39B>b-ol

1,02

D-5-avenasterol

[24Z]-24-ethyliden9D>D-5-cholesten-39B>b-ol

1,03

D-5,24-stigmastadienol

[24R,S]-24-ethyl9D>D-5,24-cholestadien-39B>b-ol

1,08

D-7-stigmastenol

[24R,S]-24-ethyl9D>D-7,24-cholestadien-39B>b-ol

1,12

D-7-avenasterol

[24Z]-24-ethyliden9D>D-7-cholesten-39B>b-ol

1,16

BILAG VI

BESTEMMELSE AF ERYTHRODIOL OG UVAOL INDLEDNING

Erythrodiol (almindeligvis forstaaet som totalindholdet af diolerne erythrodiol og uvaol) er en uforsaebelig bestanddel, som er karakteristisk for visse arter af fedtstoffer. Den findes i betydeligt hoejere koncentration i ekstraheret olivenolie end i de andre olier, som den findes i (presset olivenolie, vindruekerneolie), hvorfor bestemmelsen heraf kan anvendes til at konstatere tilstedevaerelsen af ekstraheret olivenolie.

FORMAAL

At beskrive fremgangsmaaden til bestemmelse af erythrodiol i fedtstoffer.

PRINCIP

Fedtstoffer forsaebes med kaliumhydroxid i ethanoloploesning, og de uforsaebelige bestanddele ekstraheres derefter med diethylether og renses paa en kolonne af aluminiumoxid.

De uforsaebelige bestanddele fraktioneres ved tyndtlagskromatografi paa kiselgel, hvorved baandet med sterolfraktionen adskilles fra baandet med erythrodiolfraktionen.

Sterolfraktionen og erythrodiolfraktionen fra pladen omdannes til trimethylsilylethere, hvorefter blandingen analyseres ved gaskromatografi.

Resultatet angives i procent erythrodiol i forhold til det samlede indhold af erythrodiol plus steroler.

APPARATUR

3.1.

Det apparatur, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolindholdet).

REAGENSER

4.1.

De reagenser, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolindholdet).

4.2.

Referenceoploesning af erythrodiol, 0,5 % oploesning i chloroform.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Femstilling af de uforsaebelige stoffer

Der gaas frem som beskrevet i afsnit 5.1.2 i bilag V.

5.2.

Separation af erythrodiol og steroler

5.2.1.

Se afsnit 5.2.1 i bilag V.

5.2.2.

Se afsnit 5.2.2 i bilag V.

5.2.3.

Der fremstilles en 5 % oploesning i chloroform af de uforsaebelige stoffer.

Med en mikrosproejte paa 100 ml anbringes paa en kromatografiplade ca. 1,5 cm fra den nederste kant 0,3 ml af denne oploesning i en streg, der er saa tynd og ensartet som muligt. Paa den ene ende af pladen anbringes som reference nogle mikroliter af oploesningen af cholesterol og erythrodiol.

5.2.4.

Pladen anbringes i kromatografikarret, der er klargjort som angivet i 5.2.2 i bilag V. Den omgivende temperatur holdes paa ca. 20o C. Karret lukkes straks, og der elueres, indtil oploesningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra pladens oeverste kant. Derpaa fjernes pladen fra kromatografikarret, og man lader oploesningsmidlet fordampe i en stroem af varm luft.

5.2.5.

Pladen sproejtes ensartet med en alkoholoploesning af 2,7-dichlorfluorescein. Naar pladen observeres under ultraviolet lys, fremstaar sterol- og erythrodiolbaandene ud for pletterne fra referenceoploesningen, og de afmaerkes med et punkt lidt uden for det fluorescerende baands kanter.

5.2.6.

Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede omraade af. Det afskrabede materiale fra pladen overfoeres til en kolbe paa 50 ml. Der tilsaettes 15 ml varm chloroform, omrystes omhyggeligt og filtreres paa glasfilter, idet siliagelen overfoeres til selve filteret. Der vaskes tre gange med 10 ml portioner varm chloroform, idet filtratet opsamles i en rundbundet kolbe paa 100 ml. Filtratet inddampes til et rumfang paa 4-5 ml og overfoeres til et tareret spidsbundet centrifugeglas paa 10 ml, og der inddampes til toerhed under let opvarmning i en svag stroem af nitrogen, hvorefter der vejes.

5.3.

Forberedelse af trimethylsilyletherne (TMSE)

Der gaas frem som beskrevet i afsnit 5.3 i bilag V.

5.4.

Gaskromatografi

Der gaas frem som beskrevet i afsnit 5.4 i bilag V.

Arbejdsbetingelserne for gaskromatograferingen skal vaelges saaledes, at de udover at opfylde kravene for analyse af sterolerne ogsaa foerer til separation af TMSE af erythrodiol og uvaol.

Efter injektion af proeven lader man skriveren koere indtil alle tilstedevaerende steroler, erythrodiol og uvaol er elueret. Derefter identificeres toppene (erythrodiol og uvaol har i forhold til b-sitosterol en relativ retentionstid paa henholdsvis ca. 1,45 og 1,55), og arealerne beregnes som angivet for sterolerne.

ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Erythrodiol % = A1 + A2 + ÓAsteroler × 100

Erythrodiol % =

A1 + A2

A1 + A2 + ÓAsteroler

× 100

hvor:

A1 = toparealet for erythrodiol i mm²

= toparealet for uvaol i mm²

ÓAsteroler = summen af arealerne for de tilstedevaerende steroler i mm²

Resultatet angives med én decimal.

BILAG VII

BESTEMMELSE AF FEDTSYRER I 2-POSITIONEN I TRIGLYCERIDER FRA OLIER OG FEDTSTOFFER 1.

OMFANG

I denne standard beskrives en metode til bestemmelse af sammensaetningen af den del af fedtsyrerne i en olie eller et fedtstof, som er forestret til glycerolens 2-position.

ANVENDELSESOMRAADE

Denne standard finder som foelge af pankreas-lipases saerlige virkning anvendelse paa olie og fedtstoffer med et smeltepunkt paa under 45o C. Den kan ikke uden videre anvendes paa olier og fedtstoffer, der indeholder betydelige maengder fedtsyrer med 12 eller faerre kulstofatomer (kokos- og palmekerneolie, smoerfedt), staerkt umaettede fedtsyrer (med mere end fire dobbeltbindinger), med 20 eller flere kulstofatomer (fiskeolie og marine olier) eller fedtsyrer indeholdende andre oxygenerede grupper end syregruppen.

PRINCIP

Eventuel neutralisering af sure olier og fedtstoffer i oploesning. Rensning paa kolonne af aluminiumoxid. Delvis hydrolyse af triglycerider ved hjaelp af pankreas-lipase inden for et bestemt tidsrum. Separation af de dannede monoglycerider ved tyndtlagskromatografi og methanolyse af disse monoglycerider. Analyse af methylesterne ved gas/vaeskekromatografi.

APPARATUR

4.1.

100 ml rundbundet kolbe.

4.2.

25 ml rundbundet kolbe med slib.

4.3.

1 m lang svaler, som passer til kolben 4.2.

4.4.

250 ml Erlenmeyer-kolbe.

4.5.

50 ml baegerglas.

4.6.

500 ml skilletragt.

4.7.

Kromatografisoejle af glas, 13 mm indvendig diameter og 400 mm lang, forsynet med glasfilter og hane.

4.8.

10 ml centrifugeglas med slibprop.

4.9.

5 ml burette med 0,05 ml inddelinger.

4.10.

1 ml injektionssproejte med tynd kanyle.

4.11.

Mikrosproejte, som kan levere draaber paa 3-4 ml.

4.12.

Udstrygningsapparat til tyndtlagskromatografi.

4.13.

Glasplader til tyndtlagskromatografi, 20 × 20 cm.

4.14.

Elueringskar til tyndtlagskromatografi med slebet glaslaag egnet til 20 × 20 cm plader.

4.15.

Spray til tyndtlagskromatografi.

4.16.

Ovn indstillet til 103 p2o C.

4.17.

Termostat, som mellem 30 og 45o C kan reguleres med en noejagtighed paa 0,5o C.

4.18.

Rotationsfordamper.

4.19.

Elektrisk rysteapparat, som muliggoer en kraftig omrystning af centrifugeglasset.

4.20.

UV-lampe til undersoegelse af tyndtlagsplader.

Til kontrol af lipaseaktiviteten:

4.21.

pH-meter.

4.22.

Spiralomroerer.

4.23.

5 ml burette.

4.24.

Stopur.

For eventuel fremstilling af lipase:

4.25.

Laboratorieomroerer, egnet til dispergering og blanding af heterogene materialer.

REAGENSER

5.1.

n-hexan, eller i mangel heraf petroleumsether (kogepunkt 30-50o C), kromatografikvalitet.

5.2.

2-propanol eller ethanol 95 % (v/v), analyseren kvalitet.

5.3.

2-propanol eller ethanol, 1:1 vandig oploesning.

5.4.

Diethylether, peroxidfri.

5.5.

Acetone.

5.6.

Myresyre, mindst 98 % (m/m).

5.7.

Elueringsoploesning: blanding af n-hexan (5.1), diethylether (5.4) og myresyre (5.6) i forholdet 70/30/1 (v/v/v).

5.8.

Aktiveret aluminiumoxid til kromatografi, neutral, Brockmann I.

5.9.

Silicapulver med bindemiddel, af egnet kvalitet til tyndtlagskromatografi.

5.10.

Pankreas-lipase af egnet kvalitet (note 1, note 2).

5.11.

Natriumhydroxid, vandig oploesning med 120 g/l.

5.12.

Saltsyre, 6 N vandig oploesning.

5.13.

Calciumchlorid (CaCl2), vandig oploesning med 220 g/l.

5.14.

Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig oploesning med 1 g/l.

5.15.

Bufferoploesning: pH af en 1 M vandig oploesning af trishydroxymethylaminomethan bringes op paa 8 ved tilsaetning af saltsyre (5.12) (kontrolleres med potentiometer).

5.16.

Phenolphthalein, oploesning med 10 g/l i 95 % (v/v) ethanol.

5.17.

2,7-dichlorfluorescein, oploesning med 2 g/l i 95 % (v/v) ethanol, gjort svagt alkalisk ved tilsaetning af 1 draabe 1 N natriumhydroxidoploesning pr. 100 ml.

Til kontrol af lipase-aktiviteten:

5.18.

Neutraliseret olie.

5.19.

Natriumhydroxid, 0,1 N vandig oploesning.

5.20.

Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig oploesning med 200 g/l.

5.21.

Gummi arabicum, vandig oploesning med 100 g/l.

PROEVEFORBEREDELSE

Hvis proevens syreindhold er under 3 %, bestemt efter bilag II, renses den direkte paa aluminiumoxid som beskrevet under 6.2.

Er syreindholdet i proeven over 3 %, bestemt efter bilag II, neutraliseres der med alkali ved tilstedevaerelse af et oploesningsmiddel som beskrevet under 6.1, efterfulgt af passage over aluminiumoxid som beskrevet under 6.2.

6.1.

Neutralisering med alkali ved tilstedevaerelse af oploesningsmiddel.

Der anbringes ca. 10 g af den raa olie i en skilletragt (4.6), hvorefter der tilsaettes 100 ml hexan (5.1), 50 ml 2-propanol (5.2), nogle faa draaber phenolphthaleinoploesning (5.16) og en maengde natriumhydroxidoploesning (5.11) svarende til den frie syremaengde i olien, plus 0,3 % i overskud. Der omrystes kraftigt i 1 min., tilsaettes 50 ml destilleret vand og omrystes igen, hvorefter man lader oploesningen staa og bundfaelde.

Efter separation fjernes saebelaget paa bunden, ligesom eventuelle mellemlag (slim, uoploeseligt stof) fjernes. Hexanoploesningen af den neutraliserede olie vaskes i flere omgange med 2-propanoloploesning (5.3) i portioner paa 25-30 ml, indtil phenolphthaleinets lyseroede farve forsvinder.

Det meste af hexanen fjernes ved destillation under vakuum i rotationsfordamperen (4.18), hvorefter olien toerres ved 30-40o C under vakuum ved hjaelp af en stroem af ren nitrogen, indtil hexanen er fjernet fuldstaendigt.

6.2.

Rensning paa aluminiumoxid

15 g aktiveret aluminiumoxid (5.8) opslaemmes i 50 ml hexan (5.1), og suspensionen haeldes i kromatografisoejlen (4.7) under omroering. Man lader aluminumoxidet bundfaelde sig og lader oploesningsmidlets niveau falde til 1-2 mm over adsorbenten. Derefter haeldes forsigt en oploesning af 5 g olie i 25 ml hexan (5.1) paa soejlen, og hele eluatet opsamles i en rundbundet kolbe (4.1).

FREMSTILLING AF KROMATOGRAFIPLADER

Glaspladerne (4.13) renses grundigt med ethanol, petroleumsether og acetone, saa alle spor af fedtstof fjernes.

I en Erlenmeyer-kolbe (4.4) anbringes 30 g silicapulver (5.9), og der tilsaettes 60 ml destilleret vand. Derefter tilproppes kolben og rystes kraftigt i 1 min., hvorefter opslaemningen omgaaende overfoeres til udstrygningsapparatet (4.12), og de rene plader belaegges med et 0,25 mm tykt lag.

Pladerne lufttoerres i 15 min. og derefter i 1 time i ovnen (4.16) ved 103 p2o C. Pladerne afkoeles til stuetemperatur i ekssikkator foer brug. Faerdigfremstillede plader faas i handelen.

FREMGANGSMAADE

8.1.

Hydrolyse med pankreas-lipase

I centrifugeglasset (4.8) afvejes ca. 0,1 g af den forberedte proeve. Hvis proeven bestaar af flydende olie, gaas direkte frem som beskrevet nedenfor. Bestaar den af fast fedt, oploeses den i 0,2 ml hexan, om noedvendigt under forsigtig opvarmning.

Der tilsaettes 20 mg lipase (5.10) og 2 ml bufferoploesning (5.15). Der omrystes forsigtigt men omhyggeligt og tilsaettes 0,5 ml natriumcholatoploesning (5.14) og 0,2 ml calciumchloridoploesning (5.13). Glasset lukkes med slibprop, rystes forsigtigt (undgaa at fugte proppen) og anbringes derefter omgaaende i termostaten (4.17), som holdes paa en temperatur paa 40 p0,5o C, og rystes i haanden i noejagtigt 1 min.

Glasset fjernes fra termostaten og omrystes kraftigt ved hjaelp af rysteapparatet (4.19) i noejagtigt 2 min.

Derefter koeles omgaaende i rindende vand. Saa tilsaettes 1 ml saltsyre (5.12) og 1 ml diethylether (5.4). Glasset tilproppes, og der blandes grundigt ved hjaelp af det elektriske rysteapparat. Derefter lader man glasset henstaa og fjerner det organiske lag ved hjaelp af sproejten (4.10), om noedvendigt efter centrifugering.

8.2.

Separation af monoglyceriderne ved tyndtlagskromatografi

Ekstraktet anbringes paa kromotografipladen med mikrosproejten (4.11) ca. 1,5 cm fra den nederste kant i en tynd ensartet linje saa smal som mulig. Pladen anbringes i det godt maettede elueringskar (4.14), og der elueres med elueringsvaesken (5.7) ved ca. 20o C op til ca. 1 cm fra pladens oeverste kant.

Pladen lufttoerres ved karrets temperatur og sproejtes med 2,7-dichlorfluoresceinoploesning (5.17). Monoglyceridbaandet identificeres (Rf ca. 0,035) under ultraviolet lys (4.20).

8.3.

Analyse af monoglyceriderne ved gas/vaeskekromatografi

Det under 8.2 fremkomne baand fjernes ved hjaelp af en spatel (undgaa at fjerne restbestanddele paa basislinjen) og overfoeres til methyleringskolben (4.2).

Det afskrabede silica behandles noejagtigt som beskrevet i bilag X B, saa monoglyceriderne omdannes til methylestere, hvorefter esterne undersoeges ved gaskromatografi som beskrevet i bilag X A.

ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Sammensaetningen af fedtsyrer i 2-positionen beregnes med én decimals noejagtighed (note 3).

10.

NOTER

Note 1: Test for lipaseaktivitet

I en passende mixer tilberedes en olieemulsion ved omroering af en blanding af 165 ml gummi arabicum-oploesning (5.21), 15 g knust is og 20 ml neutraliseret olie (5.18).

10 ml af denne emulsion haeldes i et baergerglas (4.5), efterfulgt af 0,3 ml natriumcholatoploesning (5.20) og 20 ml destilleret vand.

Baegerglasset saettes i en termostat, der er indstillet til 37 p0,5o C (note 4), og elektroderne til et pH-meter (4.21) og en omroerer (4.22) nedsaenkes i baegerglasset.

Med en burette (4.23) tilsaettes draabevis natriumhydroxidoploesning (5.19), indtil der er opnaaet et pH

paa 8,5.

Der tilsaettes en tilstraekkelig maengde vandig suspension af lipase (se nedenfor). Saa snart pH-meteret viser en pH-vaerdi paa 8,3, startes stopuret (4.24), og der tilsaettes draabevis natriumhydroxidoploesning (5.19) med en saadan hastighed, at pH holdes fast paa 8,3. Den forbrugte maengde natriumhydroxidoploesning aflaeses hvert minut.

De aflaeste vaerdier afsaettes i et diagram med tiden som abscisse og den maengde alkalioploesning, der kraeves til fastholdelse af en konstant pH-vaerdi, som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje.

Den ovenfor omtalte lipasesuspension er en 1 (m/m) suspension i vand. Til hver test boer der anvendes tilstraekkeligt af denne suspension til, at der forbruges ca. 1 ml natriumhydroxidoploesning paa 4 - 5 min. Almindeligvis er der brug for 1 - 5 mg pulver.

Lipaseenheden er defineret som den maengde enzym, der frigoer 10 ì-aekvivalenter syre pr. minut. Aktiviteten A af det anvendte pulver, maalt i lipaseenheder pr. mg, beregnes efter formlen:

Note 1: A = V × 10

A =

V × 10

hvor:

V = antal ml natriumhydroxidoploesning (5.19) forbrugt pr. minut, beregnet ud fra diagrammet

= lipasetestportionens masse i mg.

Note 2: Fremstilling af lipase

Lipaser med tilfredstillende lipaseaktivitet kan faas i handelen, men de kan ogsaa fremstilles i laboratoriet paa foelgende maade: 5 kg frisk svinepankreas afkoeles til 0o C. Alt omgivende fedt og bindevaev fjernes, og pankreasvaevet finddeles i en blender, indtil der opnaas en flydende pasta. Denne omroeres med omroereren (4.25) i 4 - 6 timer med 2,5 l vandfri acetone og centrifugeres derefter. Bundfaldet ekstraheres yderligere tre gange med den samme maengde acetone, derefter to gange med en blanding af lige dele acetone og diethylether (v/v) og til sidst to gange med diethylether.

Efter toerring af bundfaldet i vakuum i 48 timer opnaas et stabilt pulver, som boer opbevares i koeleskab.

Note 3: I alle tilfaelde tilraades det at bestemme sammensaetningen af proevens samlede indhold af fedtsyrer, eftersom sammenligningen med sammensaetningen af syrer i 2-positionen vil hjaelpe med ved fortolkningen af de fundne data.

Note 4: Hydrolysetemperaturen er fastsat til 37o C, eftersom der anvendes en flydende olie. Den er dog fastsat til 40o C for analyseproeven, saa der bliver mulighed for at undersoege fedtstoffer med smeltepunkter paa op til 45o C.

BILAG VIII

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF TRILINOLEIN 1.

OMFANG

Bestemmelse af sammensaetningen af triglycerider i flydende vegetabilske olier, udtrykt ved deres aevivalente kulstoftal, ved hoejtryks vaeskekromatografi.

I denne standard beskrives en metode til separation og kvantitativ bestemmelse af triglyceridsammensaetningen af vegetabilske olier, udtrykt ved deres molekylvaegt og grad af umaettethed som funktion af deres aekvivalente kulstoftal (note 1).

ANVENDELSESOMRAADE

Denne standard finder anvendelse paa alle vegetabilske olier indeholdende triglycerider af langkaedede fedtsyrer. Metoden er specielt anvendelig til paavisning af smaa maengder ikke-toerrende (linolsyreholdige) olier i de vegetabilske olier, hvor oliesyre er den fremherskende umaettede festsyrer, saasom olivenolie.

PRINCIP

Separation af triglycerider efter deres aekvivalente kulstoftal ved hoejt ydende vaeskekromatografi (med omvendt fase) og tolkning af kromatogrammerne.

APPARATUR

4.1.

Hoejtydende vaeskekromatograf med mulighed for termostatisk kontrol af kolonnetemperaturen.

4.2.

Injektionsenhed for portioner paa 10 ml.

4.3.

Detektor: differentialrefraktometer. Foelsomheden boer vaere mindst 10-4af fuldt udslag.

4.4.

Kolonne: roer af rustfrit staal, laengde 250 mm og indvendig diameter 4,5 mm, fyldt med silicapartikler med en diameter paa 5 mm og med 22-23 % kulstof i form af octadecylsilan (note 2).

4.5.

Skriver og/eller integrator.

REAGENSER

Reagenserne skal vaere af analysekvalitet. Elueringsvaeskerne skal vaere afluftede og kan recirkuleres adskillige gange uden indflydelse paa separationerne.

5.1.

Chloroform.

5.2.

Acetone.

5.3.

Acetonitril.

5.4.

Elueringsvaeske: acetonitril + acetone (i et indbyrdes forhold, som foerer til den oenskede separation; der begyndes med en blanding i forholdet 50:50).

5.5.

Oploesningsmiddel for analyseproeven: acetone eller en blanding af acetone/chloroform i forholdet 1:1.

5.6.

Referencetriglycerider: enten anvendes glycerider, som faas i handelen (tripalmitin, triolein osv.), hvis retentionstider afsaettes mod det aekvivalente kulstoftal, eller der anvendes et referencekromatogram af soyaolie (se note 3 og 4 og figur 1 og 2).

PROEVEFORBEREDELSE

Der fremstilles en 5 % oploesning af de proever, der skal analyseres, ved, at der afvejes 0,5 p0,001 g af proeven i en 10 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes op til 10 ml med oploesningsmiddel for analyseproeven (5.5).

FREMGANGSMAADE

7.1.

Kromatografisystemet goeres klar, og der pumpes elueringsvaeske (5.4) igennem med en hastighed af 1,5 ml/min. til rensning af hele systemet. Der ventes, indtil basislinjen er blevet stabil.

Derefter indsproejtes 10 ml af proeven forberedt som under (6).

BEREGNING OG ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Der anvendes intern standard, dvs. at summen af toparealerne svarende til de forskellige triglycerider saettes lig med 100 %. Den procentvise andel af hvert triglycerid beregnes efter formlen:

% triglycerid = summen af alle toparealer × 100

% triglycerid =

topareal

summen af alle toparealer

× 100

idet resultatet angives med én decimal.

Note 1: Elueringsraekkefoelgen kan bestemmes ved beregning af de aekvivalente kulstoftal, ofte defineret ved udtrykket ECN = CN - 2n, hvor CN er kulstoftallet, og n er antallet af dobbeltbindinger. Det kan beregnes mere noejagtigt, hvis der tages hensyn til dobbelbindingens oprindelse. Hvis no, nl og nl n er antallet af dobbeltbindinger i henholdsvis olie-, linol- og linolensyre, kan det aekvivalente kulstoftal beregnes efter formlen:

ECN = CN - do no - dl nl - dl n nl n

hvor koefficienterne do, dl og dln kan beregnes ved hjaelp af referencetriglyceriderne. Under de betingelser, der er specificeret ved denne metode, vil resultatet ligge taet ved

ECN = CN - [2,60 no] - [2,35 nl] - [2,17 nln]

Note 2: Eksempler: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333

Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 eller lignende.

Note 3: Med adskillige referencetriglycerider er det ogsaa muligt at beregne oploesningsevnen med hensyn til triolein,

Note 3: a = RTmolein

á =

RTm

RTmolein

ved hjaelp af den reducerede retentionstid RTm = RT-RToploesningsmiddel

Ud fra en afbildning af log á mod f (antal dobbeltbindinger) kan retentionsvaerdierne for alle de triglycerider af fedtsyrer, som findes i referenctriglyceriderne, bestemmes - se figur 2.

Note 4: Kolonnen skal vaere saa effektiv, at toppene af LLL (trilinolein) adskilles helt fra toppene af triglyceriderne med naesten samme retentionstid.

Monoglycerider

og diglycerider

POO

PPO

+ 0,5

+ 0,25

- 0,25

- 0,5

BILAG IX

SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSOEGELSE VED ULTRAVIOLET LYS INDLEDNING

Spektrofotometrisk undersoegelse ved ultraviolet lys kan give oplysninger om et fedtstofs kvalitet, dets konserveringstilstand og om forandringer i det, frembragt ved teknologiske processer.

Absorptionen ved de boelgelaengder, der er specificeret i metoden, skyldes tilstedevaerelsen af konjugerede dien- og triensystemer. Disse absorptioner er udtrykt som specifikke ekstinktioner E 1 % 1 cm (ekstinktionen for en 1 % oploesning af fedtstoffet i det angivne oploesningsmiddel i et 1 cm tykt vaeskelag), saedvanligvis betegnet ved K, (ogsaa kaldet ekstinktionskoefficienten).

OMRAADE

Metoden beskriver fremgangsmaaden til udfoerelse af en spektrofotometrisk undersoegelse af fedtstoffer ved ultraviolet lys.

METODENS PRINCIP

Fedtstoffet oploeses i det specificerede oploesningsmiddel, og oploesningens ekstinktion bestemmes saa ved de fastsatte boelgelaengder i forhold til rent oploesningsmiddel. De specifikke ekstinktioner beregnes ud fra aflaesningerne paa spektrofotometeret.

APPARATUR

3.1.

Et spektrofotometer til maaling af ekstinktion i ultraviolet lys mellem 220 og 360 nm, med mulighed for aflaesning ved hver hele nanometer.

3.2.

Firkantede kvartskuvetter med laag, med en optisk vejlaengde paa 1 cm. Naar kuvetterne er fyldt med vand eller et andet passende oploesningsmiddel, boer der ikke vaere forskelle paa mere end 0,01 ekstinktionsenheder mellem dem.

3.3.

25 ml maalekolber.

3.4.

En kromatografisoejle med en laengde paa 540 mm og en diameter paa 35 mm, med et udloebsroer med en diameter paa ca. 10 mm.

REAGENSER

4.1.

Isooctan (2,2,4-trimethylpentan) af spektrofotometrikvalitet med en transmittans paa ikke mindre end 60 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller

- cyclohexan af spektrofotometrikvalitet med en transmittans paa ikke mindre end 40 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller

- et andet egnet oploesningsmiddel, som kan oploese fedtstoffet fuldstaendigt (f.eks. ethanol til ricinusolie).

4.2.

Basisk aluminiumoxid til soejlekromatografi, tilberedt og kontrolleret som beskrevet i appendix 1.

4.3.

n-hexan til kromatografi.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Proeven skal vaere fuldstaendig homogen og fri for urenheder i suspension. Olier, som er flydende ved stuetemperatur, filtreres paa papir ved en temperatur paa ca. 30o C; faste fedtstoffer homogeniseres og filtreres ved en temperatur paa hoejst 10o C over smeltepunktet.

5.2.

Ca. 0,25 g af den saaledes forberedte proeve afvejes noejagtigt i en 25 ml maalekolbe, der fyldes op til maerket med det angivne oploesningsmiddel, og oploesningen homogeniseres. Den fremkomne oploesning skal vaere fuldstaendig klar. I modsat fald filtreres hurtigt paa papir.

5.3.

En kuvette fyldes med oploesningen, og ekstinktionerne maales ved en passende boelgelaengde mellem 232 og 276 nm med oploesningsmiddel som reference.

De aflaeste ekstinktionsvaerdier skal ligge inden for omraadet 0,1-0,8. Goer de ikke det, gentages maalingerne, idet der benyttes mere koncentrerede eller mere fortyndede oploesninger.

5.4.

Naar bestemmelse af en specifik ekstinktion skal ske efter passage over aluminiumoxid, gaar man frem paa foelgende maade: 30 g basisk aluminiumoxid opslaemmet i hexan haeldes paa kromatografisoejlen. Efter at adsorbenten har bundfaeldet sig, tappes den overskydende hexan af, indtil overfladen er ca. 1 cm over aluminiumoxidet.

10 g af fedtstoffet, homogeniseret og filtreret som beskrevet (5.1), oploeses i 100 ml hexan, og oploesningen haeldes paa soejlen. Eluatet opsamles, og alt oploesningsmiddel dampes af under vakuum ved en temperatur under 25o C.

Man gaar straks videre som beskrevet i (5.2) med dette fedtstof.

ANGIVELSE AF RESULTATERNE

6.1.

Man opgiver den specifikke ekstinktion (ekstinktionskoefficient) ved de forskellige boelgelaengder, som beregnes efter:

Kl = c × s

Kl =

Eë

c × s

hvor:

Kë = den specifikke ekstinktion ved boelgelaengden ë

Eë

den ekstinktion, der er maalt ved boelgelaengden ë

oploesningens koncentration i g/100 ml

kuvettens tykkelse i cm.

Resultaterne angives med to decimaler.

6.2.

Spektrofotometrisk analyse af olivenolie i henhold til den officielle metode, der er angivet i EF-forordningerne, kraever bestemmelse af den specifikke ekstinktion i isooctanoploesning ved boelgelaengderne 232 og 270 nm samt bestemmelse af DK, som er givet ved:

DK = Km - Km - 4 + Km + 4

DK = Km -

Km - 4 + Km + 4

hvor Km er den specifikke ekstinktion ved boelgelaengden m, den boelgelaengde paa ca. 270 nm der giver maksimal absorption.

APPENDIX I Tilberedning af aluminiumoxidet og kontrol af dets aktivitet A 1.1.

Tilberedning af aluminiumoxidet

Aluminiumoxid, som paa forhaand er toerret i en ovn ved 380-400o C i 3 timer, anbringes i en beholder, der kan lukkes hermetisk, hvorefter der tilsaettes 5 ml destilleret vand pr. 100 g aluminiumoxid, og beholderen lukkes oejeblikkeligt. Den rystes flere gange og faar saa lov til at staa i mindst 12 timer foer brugen.

A 1.2.

Kontrol af aluminiumoxidets aktivitet

En kromatografisoejle med 30 g aluminiumoxid klargoeres. Efter fremgangsmaaden i afsnit (5.4) lader man en blanding, der bestaar af:

- 95 % jomfruolie med en specifik ekstinktion paa under 0,18 ved 268 nm

- 5 % jordnoedolie, der er behandlet med blegejord ved raffineringen, og som har en specifik ekstinktion paa ikke under 4 ved 268 nm,

passere gennem soejlen.

Hvis blandingen efter passage gennem soejlen har en specifik ekstinktion paa over 0,11 ved 268 nm, er aluminiumoxidet acceptabelt; hvis ikke maa hydratiseringsgraden oeges.

APPENDIX II Kalibrering af spektrofotometeret A 2.

Udstyret skal kontrolleres med regelmaessige mellemrum (mindst hver sjette maaned), baade for korrekt boelgelaengde og for udslagets noejagtighed.

A 2.1.

Boelgelaengden kan kontrolleres ved hjaelp af en kviksoelvlampe eller med egnede filtre.

A 2.2.

Ved kontrol af fotocellens og fotomultiplikatorroerets respons gaar man frem paa foelgende maade: 0,2 g ren kaliumchromat til spektrofotometri afvejes og oploeses i 0,05 N kaliumhydroxidoploesning i en 1 000 ml maalekolbe, og der fyldes op til maerket. Man overfoerer praecis 25 ml af denne oploesning til en 500 ml maalekolbe og fortynder op til maerket med den samme kaliumhydroxidoploesning.

Derefter maaler man denne oploesnings ekstinktion ved 275 nm med kaliumhydroxidoploesningen som reference. Den maalte ekstinktion med en 1 cm kuvette skal vaere 0,200 p0,005.

BILAG X A

GASKROMATOGRAFERING AF FEDTSYREMETHYLESTERE 1.

FORMAAL

Denne standard giver generelle retninglinjer for gaskromatografisk bestemmelse med pakket kolonne eller kapillarkolonne af den kvalitative og kvantitative sammensaetning af en blanding af fedtsyremethylestere fremstillet i henhold til bilag X B.

Metoden gaelder ikke for polymeriserede fedtsyrer.

REAGENSER

2.1.

Baeregas

Inaktiv gas (nitrogen, helium, argon, hydrogen etc.) vel toerret og indeholdende mindre end 10 mg oxygen/kg.

Note 1: Hydrogen, der kun benyttes som baeregas, naar det gaelder kapillarkolonner, goer det muligt at foretage analysen dobbelt saa hurtigt, men indebaerer en risiko. Der forefindes sikkerhedsanordninger.

2.2.

Hjaelpegasser

2.2.1.

Hydrogen (renhedsgrad ·99,9 %), fri for organiske urenheder.

2.2.2.

Luft eller oxygen, fri for organiske urenheder.

2.3.

Referencestandard

En methylesterblanding af rene fedtsyrer eller methylesterne af et fedtstof, der saa vidt muligt har samme sammensaetning som det fedtstof, der skal analyseres.

Iltning af polyumaettende fedtsyrer maa undgaas.

APPARATUR

Instruktionerne angaar det saedvanlige udstyr til gaskromatografering med pakket kolonne og/eller kapillarkolonne og flammeionisationsdetektor. Alt udstyr, som kan give den i 4.1.2. definerede ydeevne og oploesning, kan anvendes.

3.1.

Gaskromatograf

Gaskromatografen skal omfatte foelgende elementer:

3.1.1.

Injektionssystem

Der benyttes enten et injektionssystem

a) med pakkede kolonner med det mindst mulige doedvolumen (i dette tilfaelde skal injektionssystemet kunne opvarmes til en temperatur, som er 20-50o C hoejere end kolonnens) eller

med kapillarkolonner, hvor injektionssystemet skal vaere specielt udformet til anvendelse med saadanne kolonner. Injektoren kan vaere med eller uden split.

Note 2: Er der ikke tale om fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer, kan der benyttes injektor med faldende naal (moving needle injector).

3.1.2.

Ovn

Ovnen skal vaere i stand til at opvarme kolonnen til en temperatur paa mindst 260o C og holde den valgte temperatur inden for 1o C, naar der er tale om en kapillarkolonne. Det sidste krav er saerlig vigtigt, da der benyttes et roer af sintret kvarts.

Det anbefales i alle tilfaelde at anvende temperaturprogrammeret opvarmning, navnlig til fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer.

3.1.3.

Pakket kolonne

3.1.3.1.

Kolonnen skal vaere kontrueret af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (dsv. glas eller rustfrit staal), af foelgende dimensioner:

a) Laengde: 1-3 m. En relativt kort kolonne anvendes ved tilstedevaerelse af langkaedede fedtsyrer (over C20). Ved analyse af syrer med 4 eller 6 kulstofatomer anbefales det at anvende en kolonne paa 2 m.

Indre diameter: 2-4 mm.

Note 3: Ved tilstedevaerelse af polyumaetterde forbindelser med mere end tre dobbeltbindinger er der risiko for, at de nedbrydes i en kolonne af rustfrit staal.

Note 4: Der kan anvendes et system med to pakkede kolonner.

3.1.3.2.

Fyldmateriale bestaaende af foelgende elementer:

Baerer: kiselgur, syrevasket og silanbehandlet, eller andet egnet inaktivt baeremateriale med et snaevert kornstoerrelsesinterval (25 mm i omraadet 125 mm-200 mm), idet middelvaerdien vaelges efter kolonnens indre diameter og laengde.

Stationaer fase: polaer vaeske af polyestertype (f.eks. diethylenglycolpolysuccinat, butandiolpolysuccinat, ethylenglycolpolyadipat mv.), cyanosiliconer eller enhver anden vaeske, der giver den kraevede kromatografiske adskillelse (4). Den stationaer fase boer udgoere 5 % (m/m)-20 % (m/m) af fyldmaterialet. En ikke-polaer fase kan anvendes til visse adskillelser.

3.1.3.3.

Konditionering af kolonnen

Efter at kolonnen om muligt er adskilt fra detektoren, opvarmes ovnen gradvis til 185o C, og en stroem af inaktiv gas ledes gennem den netop fremstillede kolonne med en hastighed paa 20-60 ml/min. i mindst 16 timer ved denne temperatur og derpaa i 2 timer ved 195o C.

3.1.4.

Kapillarkolonne

3.1.4.1.

Roeret skal vaere af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (normalt glas eller sintret kvarts). Den indre diameter skal vaere paa mellem 0,2 mm og 0,8 mm. Den indvendige overflade skal undergaa en passende behandling (f.eks. forbehandling, deaktivering), inden den stationaere fasebelaegning paafoeres. En laengde paa 25 m er tilstraekkelig i de fleste tilfaelde.

3.1.4.2.

Stationaer fase: normalt af typen polyglycol [poly(ethylenglycol) 20 000], polyester (butandiolpolysuccinat) eller polaer polysiloxan (cyanosiliconer). Bundne (tvaerbundne) kolonner er velegnede.

Note 5: Der er risiko for, at polaere polysiloxaner goer det vanskeligt at identificere og adskille linolensyre og C20 syrer.

Belaegningerne skal vaere tynde, dvs. 0,1 mm-0,2 mm.

3.1.4.3.

Samling og konditionering af kolonnen

Der traeffes de normale forholdsregler ved samlingen af kapillarkolonner, dvs. placering af kolonnen i ovnen (baerer), valg og montering af samlinger (taethed), anbringelse af kolonnens ender i injektoren og detektoren (reduktion af doedvolumener). Kolonnen anbringes under en stroem af baeregas (f.eks. 0,3 bar (30 kPa) for en kolonne med en laengde paa 25 m og en indre diameter paa 0,3 mm).

Kolonnen konditioneres ved temperaturprogrammering af ovnen ved 3o C/min. fra den omgivende temperatur til en temperatur paa 10o C under den stationaere fases dekomponeringsgraense. Ovnen holdes paa denne temperatur i 1 time, indtil basislinjen har stabiliseret sig. Den genindstilles paa 180o C, saa der opnaas isotermiske betingelser.

Note 6: Korrekt praekonditionerede kolonner faas i handelen.

3.1.5.

Detektoren skal helst kunne opvarmes til en temperatur, som er hoejere end ovnens.

3.2.

Injektionssproejte

Injektionssproejten skal have en maksimumskapacitet paa 10 ml med 0,1 ml inddelinger.

3.3.

Skriver

Hvis den optegnede kurve skal anvendes til at beregne sammensaetningen af den analyserede blanding, skal skriveren vaere et meget praecist elektronisk instrument, som er foreneligt med det anvendte apparatur. Skriveren skal have foelgende specifikationer:

a) responstid mindre end 1,5 sek. og helst 1 sek. (responstiden er den tid, der forloeber, fra skriveren modtager et pludseligt signal paa 100 %, og indtil den giver et udslag paa 90 %)

papirbredde: minimum 20 cm

papirhastighed: regulerbar fra 0,4-2,5 cm/min.

3.4.

Integrator

Anvendelse af elektronisk integrator giver en hurtig og praecis beregning. Den skal give et lineaert udslag med tilstraekkelig foelsomhed, og korrektionen for forstyrrelser paa basislinjen skal vaere tilfredsstillende.

FREMGANGSMAADE

4.1 til 4.3 angaar anvendelse af en flammeionisationsdetektor.

Alternativt kan anvendes en gaskromatograf med katarometerdetektor (registrerer aendringer af varmeledningsevne). I saa fald aendres arbejdsbetingelserne som angivet i 6.

4.1.

Proevebetingelser

4.1.1.

Bestemmelse af de optimale arbejdsbetingelser

4.1.1.1.

Pakket kolonne

Foelgende variabler indgaar i valget af arbejdsbetingelser:

kolonnes laengde og diameter

den stationaere fases art og maengde

kolonnens temperatur

baeregassens hastighed

den oenskede oploesning

proevens stoerrelse valgt paa en saadan maade, at detektoren og elektrometret i forening giver et lineaert udslag

analysetiden.

Almindeligvis vil vaerdierne i tabel 1 og tabel 2 give de oenskede resultater, dvs. for methylstearat mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m kolonnelaengde og en elueringstid paa ca. 15 min.

Hvis apparaturet goer det muligt, skal injektoren have en temperatur paa omkring 200o C og detektoren en temperatur, som er lig med eller hoejere end kolonnes.

Forholdet mellem hydrogenstroemmen til flammeionisationsdetektoren og baeregassens hastighed ligger normalt paa 1:2 til 1:1 alt efter kolonnens diameter. Oxygenstroemmen er ca. 5-10 gange stoerre end hydrogenstroemmen.

Tabel 1

Kolonnes indre diameter

Baeregassens hastighed

ml/min.

15-25

20-40

40-60

Tabel 2

Den stationaere fases koncentration

% (m/m)

Kolonnens temperatur

o C

175

180

185

4.1.1.2.

Kapillarkolone

Kapillarkolonnens ydeevne og permabilitet er ensbetydende med, at adskillelsen mellem bestanddelene og analysetiden stort set afhaenger af baeregassens hastighed i kolonnen. Det vil derfor vaere noedvendigt at skabe de bedst mulige driftsbetingelser ved ad foelge dette parameter (eller blot rette sig efter kolonnens tryktab) alt efter, om man oensker at opnaa bedre adskillelser eller foretage en hurtig analyse.

4.1.2.

Bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og oploesning

(Se figur 1).

Analysen gennemfoeres med en blanding af methylstearat og methyloleat i nogenlunde lige store maengder (f.eks. methylestere af kakaosmoer).

Kolonnens temperatur og baeregassens hastighed vaelges saaledes, at methylstearattoppens maksimum resistreres ca. 15 min. efter oploesningsmiddeltoppen. Der anvendes en tilstraekkelig maengde af methylesterblandingen til, at methylstearattoppen svarer til ca. ³/4 af fuldt udslag.

Antallet af teoretiske bunde, n (ydeevne), beregnes ud fra formelen:

n = [ 16 × dù ]²

n = [ 16 ×

dù

ù1

]²

og oploesningen, R, ud fra formelen:

R = ù1 + ù2

R =

2 × D

ù1 + ù2

hvor

dù = retentionsafstanden i mm maalt fra kromatogrammets start til det relative maksimum for methylstearattoppen

ù1 og ù2 = methylstearat- og methylolealtoppenes bredde i mm maalt mellem basislinjens skaeringspunkter med kurvens vendetangenter

afstanden i mm mellem methylstearat- og methyloleattoppenes maksima.

Betingelserne vaelges saaledes, at de for methylstearat giver mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m kolonnelaengde og en oploesning paa mindst 1,25.

4.2.

Proeve

Med injektionssproejten (3.2) udtages 0,1-2 ml af methylesteroploesningen, der er fremstillet i henhold til bilag X B, og indsproejtes i kolonnen.

Naar det gaelder ikke oploeste estere, fremstilles i heptan til kromatografi en oploesning paa 100 mg/ml, og 0,1-1 ml af denne oploesning indsproejtes.

Ved analyse af bestanddele, der kun er til stede som spor, kan proeveudtagningen foroeges (op til ti gange).

4.3.

Analyse

Normalt vil driftsbetingelserne vaere de samme som dem, der er fastlagt i (4.1.1).

Det er dog muligt at arbejde med en lavere kolonnetemperatur, naar fedtsyrer med mindre end 12 kulstofatomer skal bestemmes, eller en hoejere temperatur, naar fedtsyrer med mere end 20 kulstofatomer skal bestemmes. Det et muligt at anvende temperaturprogrammering i begge tilfaelde. Hvis proeven f.eks. indeholder fedtsyremethylestere med mindre end 12 kulstofatomer, indsproejtes proeven ved 100o C (eller 50-60o C, hvis der er smoersyre til stede), hvorefter temperaturen straks oeges med 4-8o C/min, indtil den optimale temperatur naas. I visse tilfaelde kan de to fremgangsmaader kombineres.

Efter den programmerede opvarmning fortsaettes elueringen ved konstant temperatur, indtil alle bestanddelene er elueret. Hvis apparatet ikke arbejder med programmeret opvarmning, arbejdes der med to faste temperaturer mellem 100o C og 195o C.

Om noedvendigt anbefales det at foretage en analyse paa to stationaere faser med forskellig polaritet for at sikre sig, at der ikke forekommer maskerede toppe, hvilket kan vaere tilfaeldet ved samtidig tilstedevaerelse af C18:3 og C20:0 eller af C18:3 og C18:2 konjugeret.

4.4.

Udarbejdelse af referencekromatogrammet og referencediagrammer

Referencestandardblandingen (2.3) analyseres under de samme driftsbetingelser som for proevens vedkommende, og retentionstiderne eller retentionsafstandene for de tilstedevaerende fedtsyrer maales. Paa semilogaritmisk papir afbildes logaritmen til retentionstiden eller -afstanden mod antallet af kulstofatomer for alle grader af umaettethed; under isotermiske betingelser skal de punkter, der repraesenterer ligekaedede syrer med samme umaettethedsgrad, ligge paa rette linjer, der er nogenlunde parallelle.

Det er noedvendigt at undgaa betingelser, hvor der fremkommer »maskerede toppe«, dvs. hvor oploesningen er utilstraekkelig til at adskille to bestanddele.

ANGIVELSE AF RESULTATER

5.1.

Kvalitativ analyse

Proevens methylestertoppe identificeres ud fra diagrammerne, der er udarbejdet i 4.4, om noedvendigt ved interpolation.

5.2.

Kvantitativ analyse

5.2.1.

Bestemmelse af sammensaetningen

Bortset fra undtagelsestilfaelde anvendes den interne normaliseringsmetode, dvs. det forudsaettes, at samtlige bestanddele i proeven er repraesenteret paa kromatogrammet, saaledes at toppenes samlede areal udgoer 100 % af bestanddelene (total eluering).

Hvis apparaturet omfatter en integrator, anvendes resultaterne fra denne. Hvis ikke, bestemmer man arealet af hver enkelt top ved at multiplicere toppens hoeje med dens bredde i halv hoejde og tager i givet fald hensyn til de forsekllige daempningsindstillinger under registreringen.

5.2.2.

Beregningsmetode

5.2.2.1.

Generelt

Indholdet af en given bestanddel i, udtrykt i vaegtprocent methylestere, beregnes ved, at man bestemmer den procentdel, som den tilsvarende top udgoer i forhold til summen af arealerne af samtlige toppe, ud fra foelgende formel:

Ó A × 100

× 100

hvor

Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i

niÓA

= summen af arealerne af samtlige toppe.

Resultatet anfoeres med en decimal.

Note 7: I dette generelle tilfaelde betragtes resultatet af beregningen, som er baseret paa relative arealer, som en vaegtprocent. I de tilfaelde, hvor man ikke kan arbejde med denne antagelse, henvises til 5.2.2.2.

5.2.2.2.

Anvendelse af korrektionsfaktorer

I visse tilfaelde, f.eks. ved tilstedevaerelse af fedtsyrer med mindre end otte kulstofatomer eller syrer med andre funktionelle grupper, boer der, naar man anvender varmeledningsevnedetektorer, eller naar den stoerst mulige praecision er specielt paakraevet, anvendes korrektionsfaktorer for at omsaette bestanddelenes procentvise toparealer til vaegtprocent.

Korrektionsfaktorerne bestemmes ved hjaelp af et kromatogram af en referenceblanding af methylestere med kendt sammensaetning under samme betingelser som for proevens vedkommende.

For denne referenceblanding udtrykkes vaegtprocent bestanddel i ud fra formlen

Ó m × 100

× 100

hvor

mi = massen af bestanddel i i referenceblandingen

niÓm

= summen af masserne af referenceblandingens forskellige bestanddele.

Ud fra referenceblandingens (4.4) kromatogram beregnes procentdelen (areal/areal) af bestanddel i som foelger:

Ó A × 100

× 100

hvor

= arealet af den top, der svarer til bestanddel i

niÓA

= summen af arealerne af samtlige toppe.

Korrektionsfaktoren beregnes derpaa som:

Ki = mi × ÓA

Ki =

mi×

ÓA

Ai ×

Óm

Almindeligvis saettes korrektionsfaktorerne i relation til KC 1 6, saa de relative faktorer bliver:

Kmi = KC 1 6

Kmi=

KC 1 6

For proeven er maengden af hver bestanddel i, udtrykt i vaegtprocent methylestere,

S (Kmi × Ai) × 100

Kmi× Ai

(Kmi × Ai)

× 100

Resultatet anfoeres med en decimal.

5.2.2.3.

Anvendelse af en intern standard

I forbindelse med visse analyser (f.eks. naar det ikke er alle fedtsyrerne der er elueret, som det er tilfaeldet, naar syrer med 4 og 6 kulstofatomer er til stede sammen med syrer med 16 og 18 kulstofatomer, eller naar det er noedvendigt at bestemme den absolutte maengde af en fedtsyre i en proeve), er det noedvendigt at anvende en intern standard. Der benyttes ofte fedtsyrer med 5, 15 eller 17 kulstofatomer. Den eventuelle korrektionsfaktor for den interne standard bestemmes.

Vaegtprocent bestanddele i, udtrykt som methylestere, betemmes ud fra formlen

ms × Kmi × Ai × 100

ms× Kmi× Ai

m × Kms× As

× 100

hvor

Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i

= arealet af den top, der svarer til den interne standard

Kmi

= korrektionsfaktoren for bestanddel i (i forhold til KC16)

Kms

= korrektionsfaktoren for den interne standard (i forhold til KC16)

= massen i mg af proeven

= massen i mg af den interne standard.

Resultaterne anfoeres med en decimal.

SAERLIGE TILFAELDE - ANVENDELSE AF KATAROMETERDETEKTORER (REGISTRERER AENDRINGER AF VARMELEDNINGSEVNE)

En gaskromatograf med detektor, der registrerer aendringer af varmeledningsevne (et katarometer) kan ogsaa anvendes til bestemmelse af den kvalitative og kvantitative sammensaetning af en blanding af fedtsyremethylestere. I saa fald aendres betingelserne i (3) og (4) som vist i tabel 3.

Til kvantitativ analyse anvendes korrektionsfaktorerne i (5.2.2.2).

Tabel 3

Variabel

Vaerdi/betingelse

Kolonne

Laengde: 2-4 m

Indre diameter: 4 mm

Baerer

Kornstoerrelse mellem 160 og 200 ìm

Maengde stationaer fase

15 % (m/m) - 25 % (m/m)

Baeregas

Helium eller i mangel heraf hydrogen med lavest mulige indhold af oxygen

Hjaelpegasser

Ingen

Indsproejtningstemperatur

40-60 oC hoejere end kolonnens temperatur

Kolonnens temperatur

180-200 oC

Baeregassens hastighed

Normalt mellem 60 og 80 ml/min.

Indsproejtet proevemaengde

Normalt mellem 0,5 og 2 ìl

PROEVERAPPORT

Proeverapporten skal indeholde en beskrivelse af de metoder, der er anvendt til fremstilling af methylesterne og til gaskromatograferingen, samt de opnaaede resultater. Den skal ogsaa indholde alle de enkeltheder, der ikke er naevnt i denne standard, eller som betragtes om valgfri, samt en redegoerelse for eventuelle forhold, der kan have haft indflydelse paa resultaterne.

Rapporten skal indeholde alle oplysninger, der er noedvendige for en noejagtig identifikation af proeven.

BILAG X B

FREMSTILLING AF FEDTSYREMETHYLESTERE I OVERENSSTEMMELSE MED BILAG VI, PUNKT I OG II, TIL FORORDNING (EOEF) Nr. 72/77 ELLER I OVERENSSTEMMELSE MED DEN NEDENFOR BESKREVNE METODE FORORD

Metodevalget afhaenger af det paagaeldende fedtstofs fedtsyresammensaetning og surhedsgrad og af gaskromatograferingen, der skal foretages.

Naermere bestemt

- skal der anvendes forseglede glas eller dimethylsulfat til fedtstoffer, der indeholder fedtsyrer med mindre end 12 kulstofatomer

- skal der anvendes methanolsaltsyre eller dimethylsulfat til fedtstoffer med en surhedsgrad paa over 3 %

- skal der anvendes natriummethylat eller dimethylsulfat til gaskromatografering af transisomerer

- skal der anvendes methanol-hexan-svovlsyre til fremstilling af methylestere af smaa maengder fedtstoffer, der er adskilt ved hjaelp af tyndtlagskromatografi.

Man kan se bort fra ikke-forsaebelige stoffer, hvis maengde ikke overstiger 3 %. I modsat fald maa methylesterne fremstilles af fedtsyrerne.

FORMAAL OG ANVENDELSESOMRAADE

Der beskrives fem metoder til fremstilling af methylestere af fedtstoffer:

med natriummethylat

med natriummethylat i et forseglet glas

med methanolsaltsyre i et forseglet glas

med dimethylsulfat

med methanol-hexan-svovlsyre.

Metode A

PRINCIP

Fedtstoffet, der analyseres, opvarmes med tilbagesvaling med methanol og natriummethylat. Methylesterne ekstraheres med ethylether.

APPARATUR

3.1.

100 ml slibekolbe med svaler med et natriumhydroxidroer i toppen.

3.2.

50 ml maaleglas.

3.3.

5 ml maalepipette med 0,1 ml inddeling.

3.4.

250 ml skilletragte.

3.5.

200 ml kolbe.

REAGENSER

4.1.

Vandfrit methanol.

4.2.

En oploesning af ca. 1 % natriummethylat i methanol. Den fremstilles ved, at 0,34 g natrium oploeses i 100 ml vandfrit methanol.

4.3.

Diethylether.

4.4.

10 % natriumchloridoploesning.

4.5.

40-60o C petroleumsether.

FREMGANGSMAADE

5.1.

I 100 ml kolben anbringes 2 g fedtstoffet, som foerst er blevet toerret over natriumsulfat og filtreret. Der tilsaettes 35 ml methanol, svaleren paasaettes, og blandingen koges med tilbagesvaling nogle faa minutter.

5.2.

Opvarmningen standses, svaleren fjernes, og der tilsaettes hurtigt 3,5 ml natriummethylatoploesning. Svaleren paasaettes igen, og blandingen koges med tilbagesvaling i mindst 3 timer. Methyleringen er komplet, naar alt fedtstoffet er oploest, og reagensblandingen er helt klar ved stuetemperatur.

5.3.

Reagensblandingen afkoeles og haeldes i en 250 ml skilletragt, der tilsaettes 35-40 ml diethylether, 100 ml vand og 5-6 ml 10 % natriumchloridoploesning. Blandingen omrystes og henstaar, til lagene er adskilt. Den vandige fase overfoeres til en anden skilletragt og ekstraheres paa ny med 25 ml diethylether.

50 ml 40-60o C petroleumsether tilsaettes de samlede etherekstrakter. Vandet skilles da ud og kan fjernes.

Etherfasen skylles tre gange med 10-15 ml vand, toerres over natriumsulfat og filtreres gennem papir, idet filtratet opsamles i 200 ml kolben.

Oploesningsmidlet destilleres, og processen afsluttes over et vandbad i en stroem af rent nitrogen.

Metode B

PRINCIP

Fedtstoffet, der analyseres, behandles med natriummethylat i en methanoloploesning i et forseglet glas ved 85-90o C.

APPARATUR

3.1.

Et solidt glas til forsegling med en kapacitet paa ca. 5 ml (hoejde 40-45 mm, diameter 14-16 mm).

3.2.

1 ml maalepipette med 0,1 ml inddeling.

REAGENSER

4.1.

En oploesning paa ca. 1,5 % natriummethylat i methanol. Den fremstilles ved, at 0,50 g natrium oploeses i 100 ml vandfrit methanol.

FREMGANGSMAADE

5.1.

I glasset anbringes 2 g af fedtstoffet, som foerst er blevet toerret over natriumsulfat og filtreret. Der tilsaettes 0,3 g (ca. 0,4 ml) natriummethyloploesning, og glasset varmeforsegles.

5.2.

Glasset neddyppes i 2 timer ved 85-90o C. Det omrystes med mellemrum. Esterificeringsprocessen er afsluttet, naar glassets indhold er klart, efter at glycerinet og reagensresterne har bundfaeldet sig.

5.3.

Der afkoeles til stuetemperatur. Glasset aabnes, naar methylesterne skal bruges. De kraever ikke yderligere behandling, foer de indfoeres i gaskromatografen.

Metode C

PRINCIP

Fedtstoffet, der analyseres, behandles med methanolsaltsyre i et forseglet glas ved 100o C.

APPARATUR

3.1.

Et solidt glas til forsegling med en kapacitet paa ca. 5 ml (hoejde 40-45 mm, diameter 14-16 mm).

3.2.

1 og 2 ml kalibrerede pipetter.

REAGENSER

4.1.

En oploesning af saltsyre i 2 % methanol. Den fremstilles af chlorbrinte og vandfrit methanol (note 1).

4.2.

Hexan til gaskromatografering.

Note 1: Det er nemt at fremstille smaa maengder chlorbrinte i laboratoriet ved simpel uddrivning fra handelsoploesningen (d = 1,18) ved tildrypning af koncentreret svovlsyre (d = 1,84). Den frigjorte chlorbrinte toerres nemt ved, at man lader den boble gennem koncentreret svovlsyre. Da saltsyre meget hurtigt absorberes af methanol, anbefales det at traeffe de saedvanlige forholdsregler, naar man oploeser den, f.eks. lede chlorbrinten igennem en lille omvendt tragt, hvis rand lige netop roerer vaeskens overflade. Store maengder methanolsaltsyreoploesning kan fremstilles paa forhaand, da den holder sig fint i flasker, der er forsynet med glasprop og opbevares i moerke.

FREMGANGSMAADE

5.1.

I glasset anbringes 2 g fedtstoffet, som foerst er blevet toerret over natriumsulfat og filtreret, og 2 ml saltsyremethanoloploesning tilsaettes. Glasset varmeforsegles.

5.2.

Glasset neddyppes ved 100o C i 40 minutter.

5.3.

Glasset afkoeles under rindende vand, aabnes, og 2 ml destilleret vand og 1 ml hexan tilsaettes. Blandingen centrifugeres, og hexanfasen, som er klar til brug, fjernes.

Metode D

PRINCIP

Fedtstoffet, der analyseres, forsaebes med en oploesning af kaliumhydroxid i methanol og behandles derpaa med dimethylsulfat. Naar der tilsaettes saltsyre, udskilles de methylestere, der har dannet sig, automatisk. Der opnaas meget rene methylestere ved efterfoelgende behandling med aluminiumoxid.

APPARATUR

3.1.

Et solidt reagensglas med en kapacitet paa ca. 20 ml med 10/19 glasslib og slibklemmer.

3.2.

5-kammersvalere med 10/19 glasslib.

3.3.

Sintrede glasfiltre, stoerrelse G 2, 20 mm diameter.

3.4.

Spidsbundet reagensglas med en kapacitet paa ca. 10 ml.

3.5.

1 ml og 5 ml sproejter.

REAGENSER

4.1.

Kaliumhydroxid, 10 % oploesning i methanol til gaskromatografering.

4.2.

Groen bromkresolindikator, 0,50 % oploesning i methanol.

4.3.

Dimethylsulfat (d = 1,335 ved 15o C).

4.4.

Koncentreret saltsyre, d = 1,19, fortyndet i forholdet 1 : 1 med methanol til gaskromatografering.

4.5.

Brockman aluminiumoxid til adsorbtionskromatografi.

FREMGANGSMAADE

5.1.

I 20 ml reagensglasset anbringes ca. 2,2 ml af fedtstoffet, som foerst er blevet toerret over natriumsulfat og filtreret. Der tilsaettes 5 ml kaliumhydroxidoploesning og nogle faa kvartskorn for at kontrollere kogningen. Svaleren paasaettes, der opvarmes ved lavt blus i 5 minutter under omrystning. Forsaebningen er afsluttet, naar oploesningen er klar. Til slut afkoeles under rindende vand, og svaleren fjernes.

5.2.

Der tilsaettes 2 draaber af indikatoren og ved hjaelp af en sproejte langsomt 1 ml dimethylsulfat. Reagensglasset forsegles hermetisk og omrystes i 2-3 minutter, idet reagensglassets bund neddyppes i et kogende vandbad med hyppige mellemrum. Reaktionen er afsluttet, naar indikatoren skifter fra blaat til gult. Til slut afkoeles reagensglasset under rindende vand, der aabnes, og der tilsaettes 5 ml af saltsyre-methanoloploesningen.

5.3.

Efter omrystning i nogle faa sekunder saettes reagensglasset paa skraa, og der bankes let paa det. Dette hjaelper med at bringe methylesterne op til overfladen i form af en olieagtig masse (note 2).

Methylesterne fjernes med en sproejte og anbringes i et spidsbundet reagensglas, der tilsaettes en maengde aluminiumoxid svarende til ca. ;/4 af methylestermaengden, omrystes og filtreres paa filtrerpapir.

Note 2: Hvis methylesterne ikke udskiller sig spontant, tilsaettes reagensglasset 5 ml vand, og der omrystes.

Metode E

PRINCIP

Fedtstoffet, der analyseres, opvarmes med tilbagesvaling med methanol-hexan-svovlsyre. Methylesterne ekstraheres med petroleumsether.

APPARATUR

3.1.

Reagensglas med glasslib og med en kapacitet paa ca. 20 ml forsynet med en ca. 1 m lang luftsvaler.

3.2.

5 ml kalibreret pipette.

3.3.

50 ml skilletragt.

3.4.

10 ml og 25 ml maaleglas.

3.5.

15 ml spidsbundet reagensglas.

REAGENSER

4.1.

Methyliseringsreagens: vandfri methanol-hexan-koncentreret svovlsyre (d = 1,84) i forholdet 75 : 25 :1 (v/v/v).

4.2.

40-60o C petroleumsether.

4.3.

Vandfrit natriumsulfat.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Stoffet, der er taget fra pladen, anbringes i 20 ml reagensglasset, og der tilsaettes 5 ml methyliseringsreagens.

5.2.

Svaleren paasaettes, og der opvarmes i 30 minutter i et kogende vandbad (note 3).

5.3.

Blandingen overfoeres kvantitativt til en 50 ml skilletragt ved hjaelp af 10 ml destilleret vand og 10 ml petroleumsether. Der omrystes kraftigt, og blandingen henstaar, til faserne adskilles, den vandige fase fjernes, og etherlaget skylles to gange med 20 ml destilleret vand. Skilletragten tilsaettes en lille maengde vandfrit natriumsulfat, der omrystes, blandingen henstaar i nogle faa minutter og filtreres, idet filtratet opsamles i et 15 ml spidsbundet reagensglas. Oploesningsmidlet afdampes over et vandbad med en stroem af nitrogen.

Note 3: For at kontrollere kogningen indsaetter man en glasstang i reagensglasset og begraenser vandbadets temperatur til 90o C.

BILAG XI

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FLYGTIGE HALOGENE OPLOESNINGSMIDLER I OLIVENOLIE 1.

PRINCIP

Analyse ved gaskromatografi ifoelge teknikken med luftrummet over vaesken (head space).

APPARATUR

2.1.

Gaskromatografiapparat udstyret med en elektronindfangningsdetektor (ECD).

2.2.

Apparatur for luftrummet over vaesken (head space).

2.3.

Gaskromatografisoejle af glas med laengde paa 2 m og med 2 mm diameter, stationaer fase

10 % OV101 paa chromosorb WLA

DMOS granulometri 80-100 Mesh.

2.4.

Transportluftart og hjaelpeluftart: nitrogen.

2.5.

10 til 15 ml glaskolber med en foring af teflon og en aluminiumsprop med en aabning til udtagning med sproejte.

2.6.

Tang til hermetisk lukning.

2.7.

Sproejte til luftarter paa 0,5 til 2 ml.

REAGENSER

Flygtige halogene oploesningsmidler med en renhedsgrad, der egner sig til gaskromatografi.

Pentan med en renhedsgrad, der egner sig til gaskromatografi.

ANALYSEMETODE

4.1.

Der afvejes med noejagtighed ca. 3 g olie i en glaskolbe (der ikke maa genbruges), og kolben tilproppes indtil den hermetiske lukning. Kolben anbringes i en termostat ved 70o C i en time. Der udtages med akkuratesse ved hjaelp af sproejten en maengde paa 0,2 til 0,5 ml af luftrummet over vaesken. Det indsproejtes i gaskromatografisoejleapparatet, der er indstillet saaledes:

- injektortemperatur: 150o C

- soejletemperatur: 70 til 80o C

- detektortemperatur: 200 til 250o C.

Andre temperaturer kan ogsaa anvendes, saafremt resultaterne er aekivalente.

4.2.

Referenceoploesninger. Der tilberedes standardoploesninger ved brug af raffineret olivenolie uden spor af oploesningsmidler til variable koncentrationer af flygtige halogene oploesningsmidler mellem 0,05 og 1 ppm og i forhold til det formodede indhold af proeven. En eventuel fortynding af flygtige halogene oploesningsmidler skal ske ved hjaelp af pentan.

4.3.

Maengdemaessig vurdering. Forholdet fastlaegges mellem overfladerne eller toppene paa proeverne og den standardoploesning, der har den naermeste formodede koncentration. Hvis den forholdsvise forskel er over 10 %, er det noedvendigt at gentage analysen ved sammenligning med en ny standardoploesning, indtil dens koncentration overholder ovennaevnte forholdsvise forskel. Indholdet af flygtige halogene oploesningsmidler bestemmes paa grundlag af et gennemsnit af elementaere indsproejtninger.

4.4.

Udtryk for resultaterne. Resultaterne udtrykkes i ppm (mg/kg). Metodens paavisningsgraense er 0,01 mg/kg.

BILAG XII

ORGANOLEPTISK VURDERING AF JOMFRUOLIE 1.

FORMAAL

Formaalet med denne metode er at fastlaegge de noedvendige kriterier for vurdering af jomfruolies duft- og smagsegenskaber (»flavour«) og at udvikle den noedvendige metodologi for vurderingen.

ANVENDELSESOMRAADE

Den beskrevne metode er kun anvendelig til den organoleptiske vurdering og klassifikation af jomfruolie, der kan bruges til direkte fortaering. Den begraenser sig til klassifikation af jomfruolien efter en numerisk skala i relation til opfattelsen af dens duft- og smagsstimuli efter et skoen udoevet af en gruppe udvalgte smagere, der arbejder som et panel.

ALMINDELIG GRUNDORDLISTE FOR SENSORISK ANALYSE

Der henvises til »Sensorisk analyse: almindelig grundordliste«.

SPECIEL ORDLISTE FOR OLIVENOLIE

Agurk: duft og smag, der fremkommer, naar en olie er pakket hermetisk i for lang tid, isaer i blikbeholdere, og som tilskrives dannelsen af 2,6-nonadienal.

»Atrojado« (muggen): karakteristisk lugt og smag ved olie, der er udvundet af oliven, der er opbevaret i bunker, og som har naaet et fremskredet stadium af gaering.

Bitter: karakteristisk smag ved olier, der er udvundet af groenne oliven eller oliven, der er lige ved at skifte farve. Den kan vaere mere eller mindre behagelig afhaengig af intensiteten.

Esparto: karakteristisk lugt og smag ved olie udvundet fra oliven, der er presset i nye maatter af espartograes. Smagen kan vaere forskellig, alt efter om maatterne er lavet af groent eller toerret espartograes.

Fedtet: lugt af olivenolie, der er ekstraheret i et anlaeg, hvor rester af jordolie, fedt eller mineralsk olie ikke er fjernet ordentligt fra maskineriet.

Flad eller glat: duft og smag af olivenolie, hvis organoleptiske karakteristika er meget svage paa grund af tabet af dens aromatiske bestanddele.

Frugtagtig: duft og smag, som minder om baade lugten og smagen af sund, frisk frugt, plukket paa dens optimale modenhedstrin.

Gammel: karakteristisk lugt og smag af olie, der er blevet opbevaret for laenge i lagerbeholdere. Kan ogsaa forekomme i olie, der har vaeret pakket i overordentlig lang tid.

Grov: en karakteristisk fornemmelse ved visse olier, som, naar man smager paa dem, giver en tyk, pastaagtig fornemmelse i munden.

Graes: karakteristisk duft og smag ved visse olier, der minder om nyslaaet graes.

Groenne blade (bitter): duft og smag af olie udvundet af alt for groenne oliven eller oliven, der er blevet knust sammen med blade og kviste.

Groensagsvand: karakteristisk smag og lugt, som olien faar som foelge af daarlig dekantering og langvarig kontakt med groensagsvand.

Harsk: karakteristisk lugt og smag, som er faelles for alle olier og fedtstoffer, der har undergaaet en auto-oxideringsproces som foelge af langvarig kontakt med luften. Denne lugt og smag er ubehagelig og kan ikke korrigeres.

Hoe: karakteristisk duft og smag ved visse olier, minder mere eller mindre om toerret graes.

Jordet: karakteristisk lugt og smag ved olie udvundet af oliven, der er opsamlet med jord eller mudder paa overfladen, og som ikke er blevet vasket. Kan undertiden vaere ledsaget af en muggen-fugtig lugt og smag.

Larvebefaengt: karakteristisk lugt og smag af olie udvundet af oliven, der har vaeret haardt angrebet af larver af olivenfluen (Dacus Oleae).

Mandel: denne duft og smag kan forekomme i to former: den, der er typisk for friske mandler, og den, der er saeregen for toerrede, sunde mandler, og som kan forveksles med begyndende harskhed. En distinkt smag bemaerkes som en eftersmag, naar olien forbliver i kontakt med tungen og ganen. Den forbindes med soede olier, der har en flad lugt.

Metallisk: duft og smag, der minder om metal. Karakteristisk for olier, der under uheldige omstaendigheder har vaeret i langvarig kontakt med foedevarer eller metaloverflader under knusning, blanding, presning eller opbevaring.

Moden frugt: duft og smag af olivenolie udvundet af modne frugter, den har i almindelighed en lidt flad duft og en soedlig smag.

Mudret bundfald: karakteristisk lugt og smag ved olie, der er udvundet af dekanteret bundfald i kar og underjordiske tanke.

Mug-fugt: karakteristisk lugt og smag af olie udvundet af frugter, hvori store maengder svampe og gaer har udviklet sig, fordi de har vaeret opbevaret i adskillige dage i bunker i fugtige omgivelser.

Ophedet eller braendt: karakteristisk lugt og smag af olier, foraarsaget af overdreven og/eller langvarig opvarmning under bearbejdningen, isaer naar pastaen blandes termisk, hvis det goeres under uegnede betingelser.

Pressemaatte: karakteristisk lugt og smag af olie fra oliven, der er blevet presset i snavsede pressemaatter, hvori der har vaeret forgaerede rester.

Presserester: karakteristisk lugt og smag, der minder om oliven-presserester.

Saltlage: duft og smag af olier ekstraheret fra oliven, der har vaeret konserveret i saltoploesninger.

Skarp: karakteristisk fornemmelse ved visse olier som, naar man smager paa dem, giver en sammensnerpende reaktion i munden.

Saebeagtig: lugt og smag, som giver en fornemmelse, der minder om groen saebe.

Soed: behagelig smag, som ikke er direkte sukkeragtig, men som findes i olier, hvor de bitre, sammensnerpende og skarpe egenskaber ikke er dominerende.

Vinagtig - eddikeagtig: karakteristisk duft og smag af visse olier, som minder om vin eller eddike. Skyldes hovedsagelig dannelsen af eddikesyre, ethylacetat og ethanol i stoerre maengder end normalt i olivenoliens aroma.

AEble: duft og smag af olivenolie, der minder om denne frugt.

GLAS TIL OLIESMAGNING

Der henvises til »Glas til oliesmagning«.

PROEVELOKALE

Der henvises til »Vejledning i indretning af proevelokale«.

APPARATUR

Foelgende apparatur, som er noedvendigt for at smageren kan udfoere sin opgave rigtigt, skal anbringes i hver baas og skal vaere inden for nem raekkevidde:

- glas (standardiserede), som indeholder proeverne, maerket med en inskription bestaaende af to tilfaeldigt valgte tal eller af to tal og bogstaver. Maerkningen skal foretages med en lugtfri blyant, hvis skrift ikke kan slettes

- urglas med identiske maerker til at daekke glassene med

- klassificeringsskema (se figur 2), med brugsanvisning

- blyant eller pen

- smaa bakker med aeble skaaret i skiver

- et glas vand ved stuetemperatur.

METODOLOGI

Dette afsnit forudsaetter de noedvendige forkundskaber til at udfoere den sensoriske analyse af jomfruolie, og det forsoeger at standardisere den adfaerd og den metode, som forventes af de smagere, der deltager i saadanne proever, og som maa vaere opmaerksomme paa baade de generelle og de specifikke anbefalinger for smagning af olivenolie.

8.1.

De pligter, der paahviler panelets organisator eller tilsynsfoerende

Organisatoren skal vaere en tilstraekkelig traenet, kyndig person, som er ekspert i de typer olie, han vil stoede paa under sit arbejde. Han er noeglefiguren i panelet og er ansvarlig for dets organisation og virke. Han skal sammenkalde smagerne i tilstraekkelig god tid og skal opklare alle tvivlsspoergsmaal, smagerne kan have med hensyn til proevernes udfoerelse; men han skal afstaa fra at paavirke deres mening om proeverne.

Organisatoren skal vaere ansvarlig for at foere en fortegnelse over apparaturet og for at sikre, at det er tilstraekkelig rengjort, for at tilberede og kode proeverne og for at praesentere dem for smagerne i overensstemmelse med forsoegsplanen, samt for at indsamle de opnaaede data og behandle dem statistisk, saa de bedste resultater opnaas med den mindste anstrengelse.

Den opgave, der paahviler den tilsynsfoerende, kraever sensorisk faerdighed, omhu ved forberedelsen og tilrettelaeggelsen af proeverne, og dygtighed og taalmodighed ved planlaegningen og udfoerelsen af proeverne. Det er den tilsynsfoerendes opgave at stimulere paneldeltagernes moral ved at anspore deres interesse, nysgerrighed og konkurrenceaand. Han skal sikre, at hans egen mening ikke er kendt, og han skal forhindre mulige ledertyper i at haevde deres kriterier over for de oevrige smagere. Han skal ogsaa vaere ansvarlig for at traene, udvaelge og overvaage smagerne for at konstatere, om de lever op til et passende niveau med hensyn til dygtighed.

8.2.

Testbetingelser

8.2.1.

Proevens stoerrelse

Hvert glas skal indeholde 15 ml olie.

8.2.2.

Testtemperatur

De olieproever, der skal undersoeges, skal opbevares i glas ved 28o C p2o C. Denne temperatur er valgt, fordi det er den bedste temperatur til at observere organoleptiske forskelle ved, ved normal temperatur, naar olier bruges som krydderi. En anden faktor, der taler for denne vaerdi, er, at ved lavere eller hoejere temperaturer vil enten de aromatiske komponenter naeppe fordampe, eller der vil dannes flygtige komponenter, der er specielle for ophedede olier.

8.2.3.

Tider for smagningens afholdelse

Morgenen er det bedste tidspunkt for smagning af olie. Det er bevist, at der i dagens loeb forekommer optimale perceptionsperioder med hensyn til lugt og smag.

Forud for maaltiderne gaar der en periode, hvor foelsomheden for lugt og smagsindtryk er foroeget, hvorimod foelsomheden aftager efter maaltidet.

Dette hensyn boer dog ikke foere til overdrivelser, hvor sult kan distrahere smagerne og dermed nedsaette deres evne til at skelne og isaer deres kriterier for, hvadde foretraekker eller kan acceptere.

SMAGERE

De personer, der skal virke som smagere ved organoleptiske bedoemmelser af oliven-spiseolie, skal traenes og udvaelges i overensstemmelse med deres evne til at skelne mellem proever, der ligner hinanden; man boer erindre, at deres evne til at skelne noejagtigt vil forbedres ved traening (se afsnit herom).

Der kraeves 8 - 12 smagere til en test; det er dog klogt at holde nogle ekstra smagere i reserve, saa de kan gaa ind i tilfaelde af fravaer.

9.1.

Generelle anbefalinger for kandidater og smagere

Disse anbefalinger gaelder kandidaternes og smagernes adfaerd under arbejdet.

Naar en smager indkaldes af panelets organisator for at deltage i en organoleptisk test, boer han vaere i stand til at moede paa den forud fastsatte tid, og han skal overholde foelgende regler:

9.1.1.

Han skal undlade at ryge i mindst 30 minutter foer det tidspunkt, der er fastsat for smagningen.

9.1.2.

Han maa ikke bruge nogen parfume, kosmetik eller saebe, hvis duft ville kunne holde sig til tidspunktet for smagningen. Han skal bruge en uparfumeret eller svagt parfumeret saebe til at vaske haenderne med, og han skal derefter skylle og toerre haenderne saa ofte, som det er noedvendigt for at fjerne en eventuel duft.

9.1.3.

Han skal faste i mindst en time, foer smagningen udfoeres.

9.1.4.

Hvis smageren foeler sig fysisk utilpas, og isaer hvis hans smags- eller lugtesans er paavirket, eller hvis han er under en psykologisk paavirkning, der forhindrer ham i at koncentrere sig om sit arbejde, skal han underrette den tilsynsfoerende om det, saa han eventuelt kan traekke sig tilbage fra testen, eller der kan traeffes passende beslutninger, idet man maa vaere opmaerksom paa den deviation i middelvaerdierne for resten af panelet, der kan opstaa.

9.1.5.

Naar smageren har opfyldt ovenstaaende krav, skal han tage plads i den baas, der er tildelt ham, paa en saa rolig og ordentlig maade som muligt.

9.1.6.

Naar smageren har taget plads, skal han kontrollere, at han har det rigtige apparatur, og at det er rigtigt arrangeret, og han skal sikre sig, at inskriptionen paa glasset svarer til inskriptionen paa urglasset.

9.1.7.

Smageren skal omhyggeligt laese de instruktioner, der er givet paa klassificeringsskemaet, og han maa ikke begynde at undersoege proeven, foer han foeler sig helt sikker paa den opgave, han skal udfoere. Hvis der opstaar nogen som helst tvivl, skal han diskutere vanskelighederne med den tilsynsfoerende i enrum.

9.1.8.

Smageren skal tage glasset op, og idet han holder det daekket med urglasset, skal han holde det lidt skraat; han skal saa dreje glasset helt rundt i denne stilling, saa en saa stor del af indersiden som muligt bliver fugtet. Naar dette stadium er overstaaet, skal han fjerne urglasset og lugte til proeven, idet han tager jaevne, langsomme, dybe indaandinger, til han har dannet sig et indtryk af den olie, der skal vurderes. Lugtefasen maa ikke overstige 30 sek. Hvis han ikke er kommet til nogen konklusion inden for dette tidsrum, skal han hvile en kort tid, foer han proever igen. Naar den olfaktoriske test er udfoert, skal smageren bedoemme oliens »flavour«, dvs. det generelle lugte-, smags- og foeleindtryk. For at goere dette skal han tage et lille nip af olien, ca. 3 ml. Det er meget vigtigt, at olien fordeles ud over hele mundhulen, fra den forreste del af munden og tungen langs siderne til den bageste del af tungen og ganen, da det er velkendt, at opfattelsen af de fire primaere smagskvaliteter, soedt, salt, surt og bittert, varierer i intensitet over de forskellige omraader af tungen og ganen.

Det boer understreges, at det er afgoerende, at en tilstraekkelig maengde olie spredes meget langsomt over den bageste del af tungen og ned mod halsen, mens smageren koncentrerer sig om den raekkefoelge, i hvilken de bitre og skarpe stimuli fremkommer; hvis dette ikke sker, kan begge disse stimuli undgaa smagerens opmaerksomhed ved visse olier, eller den bitre stimulus kan blive tilsloeret af den skarpe stimulus.

At tage korte aandedrag lige efter hinanden, idet luften traekkes ind gennem munden, saetter smageren i stand til ikke blot at sprede proeven ud over hele mundhulen, men ogsaa at opfatte de flygtige aromatiske komponenter via den bageste del af naesen.

Foelesansen skal ogsaa tages i betragtning, Derfor skal letflydenhed, klaebrighed og skarphed eller brod noteres ned, naar de observeres, og hvis det kraeves til den paagaeldende test, skal deres intensitet angives kvantitativt.

9.1.9.

Naar der foretages organoleptisk vurdering af en jomfruolivenolie, maa der kun vurderes én proeve ad gangen for at undgaa den kontrastvirkning, der kunne opstaa, hvis andre proever skulle smages umiddelbart efter.

Da flere paa hinanden foelgende smagninger fremkalder traethed eller nedsat foelsomhed, er det vigtigt at bruge et produkt, der kan fjerne resterne af olie fra den forudgaaende smagning fra munden.

Det kan anbefales at bruge et lille stykke aeble (ca. 15 g), som, efter at man har tygget det, kan spyttes ud i spytkummen. Derefter skylles munden med lidt vand ved stuetemperatur. Der skal hengaa mindst 15 minutter mellem afslutningen af én smagning og paabegyndelsen af den naeste.

9.2.

Bedoemmelse af kandidater

Dette stadium skal gennemfoeres af organisatoren, som personligt skal tale med kandidaterne for at goere sig fortrolig med deres personlighed og miljoe. De fysio-psykologiske krav, som skal opfyldes, er ikke saerlig strenge, da teoretisk enhver normal person skulle vaere i stand til at deltage. Faktorer som koen, alder, specielle vaner (rygning) osv. er nutildags afloest af andre som f.eks. helbred og personlig interesse samt at kandidaten har tid til raadighed til arbejdet.

Under samtalen skal organisatoren forklare kandidaten opgavens art og hvor megen tid det omtrent vil tage. Han skal saa samle oploesninger fra kandidaten, der goer det muligt for ham at vurdere kandidatens interesse og motivation samt hvor megen tid han reelt har til raadighed. Foelgende spoergeskema kan vaere til hjaelp som reference.

SPOERGESKEMA

De bedes besvare foelgende spoergsmaal

q Nej

Har De lyst til at blive engageret i arbejdet med dette emne?

Nej

Mener De, at dette arbejde kan bidrage til at forbedre foedevarers kvalitet paa hjemmemarkedet og internationalt?

Nej

Hvis ja, hvorfor (¹) .

De maa vaere klar over, at De skal smage olie, naar De bliver bedt om det. Er De parat til at goere det?

Nej

Har De lyst til at sammenligne Deres evne til at lugte og smage med Deres kollegers?

Nej

Har De tid til raadighed? Er De tilstraekkelig uafhaengig til, at De kan organisere Deres daglige arbejde, som De vil?

Nej

Hvis De er afhaengig af en overordnet, tror De saa, at hvis De skal vaere borte fra Deres saedvanlige arbejde i op til en halv time ved flere lejligheder i nogle dage efter hinanden, at De ville faa lov til at goere det?

Nej

Ville De vaere i stand til at indhende den tid, De taber paa Deres arbejdsplads ved at deltage i den sensoriske analyse?

Nej

Mener De, at De burde faa et vederlag for dette arbejde?

Nej

10)

Paa hvilken maade? .

(¹) Beskriv, hvad der vil kunne vindes ved organoleptisk bedoemmelse af et eller andet naeringsmiddel, eller, hvis De oensker det, olivenolie.

Organisatoren skal bruge disse oplysninger til at sortere kandidaterne, og han skal afvise dem, der kun viser ringe interesse for denne type arbejde, ikke har tid til raadighed, eller ikke er i stand til at udtrykke sig klart.

9.3.

Bestemmelse af gruppens »gennemsnitlige taerskel« for »karakteristiske egenskaber«

Udvaelg omhyggeligt fire olier, der hver anses for repraesentativ for én af foelgende smagsegenskaber: »atrojado« (muggen), vinagtig, harsk og bitter, og som har saa stor og klar en intensitet som muligt.

Tag en del af hver olie og forbered proever, hvis koncentration varierer med en faktor 2, saa der opstaar flere, stadig svagere fortyndinger efter hinanden, i et passende fortyndingsmiddel, indtil der ikke kan opfattes nogen forskel mellem det glas, der kun indeholder fortyndingsmidlet, og de sidste to eller tre fortyndinger. Det sidste par skal vaere to glas med fortyndingsmiddel.

Serien kompletteres med glas, der indeholder hoejere koncentrationer, indtil et samlet antal af otte glas er naaet.

Der skal forberedes tilstraekkelige maengder af de forskellige koncentrationer til, at hver kandidat kan faa en komplet serie af hver smagsegenskab.

For at fastlaegge kandidaternes »gennemsnitlige taerskel« for hver smagsegenskab skal de hver have et glas med 15 ml af én af de forberedte koncentrationer og et glas, der udelukkende indeholder 15 ml af fortyndingsmidlet. Naar kandidaten har udfoert proeven, skal han angive, om indholdet af de to glas er ens eller forskelligt.

Den samme proeve gentages for de oevrige koncentrationer af den smagsegenskab, der er under betragtning.

Antallet af korrekte svar, der opnaas fra alle smagerne for hver koncentration, noteres, og dette tal angives som en procentdel af antallet af udfoerte proever.

Derefter dannes et koordinatsystem, hvor der paa abscisseaksen afsaettes de afproevede koncentrationer i stigende raekkefoelge, og paa ordinataksen afsaettes procentdelen af korrekte svar. Sammenhoerende vaerdier af koncentration og procent korrekte svar afsaettes i dette koordinatsystem.

Figur 1 er et praktisk eksempel paa denne fremgangsmaade. Detektionstaersklen findes ved at traekke en linie fra det punkt paa kurven, der svarer til ordinatvaerdien 75 %, ned paa abscisseaksen.

Denne »taerskelkoncentration«, som kan vaere forskellig for hver oprindelig olie, fordi den afhaenger af den tilstedevaerende smagsegenskabs intensitet, boer vaere meget naer den samme for de forskellige grupper af kandidater til de forskellige paneler; den er ikke forbundet med nogen vane eller forkaerlighed. Derfor er den et referencepunkt, som er faelles for enhver normal gruppe af mennesker, og den kan bruges til at homogenisere de forskellige paneler udelukkende efter deres foelsomhed for lugt og smag.

Paa grundlag af den taerskelkoncentration, der er opnaaet for gruppen, gaar man frem paa foelgende maade:

Man forbereder en serie af stigende og aftagende koncentrationer paa en saaden maade, at »taerskelkoncentrationen« indtager plads nr. 10 paa denne skala. Den 11. og 12. koncentration vil naturligvis vaere mere fortyndede, hvorfor det vil vaere vanskeligere at opfatte tilstedevaerelsen af den olie, der har den valgte smagsegenskab.

Idet man tager C10 koncentrationen som udgangspunkt, kan de oevrige proever tilberedes i henhold til foelgende formel:

C10 × an, hvor a er en konstant, fortyndingsfaktoren, som er lig med 1,5, og n er eksponenten, der varierer mellem 9 og -2.

Eksempel: Vi forudsaetter, at taersklen for harsk olie er 0,32; C10 = 0,32, da a = 1,5, vil serien af proever have foelgende koncentrationer:

Proeve

Koncentration

12,30

8,20

5,47

3,65

2,43

1,62

1,08

0,72

0,48

0,32

0,21

0,14

Hvis denne procedure gentages for de tre andre smagsegenskaber paa grundlag af deres respektive taerskler, der beregnes som ovenfor angivet, opnaas skalaer med lignende aromatiske intensiteter for hver stimulus for alle laboratorier, selv om manglerne ved de oprindelige olier kan vaere maerkbare ved forskellige intensiteter.

9.4.

Udvaelgelse af smagere ved intensitetsvurderingsmetoden

Ved udvaelgelsesproceduren boer der vaere to-tre gange saa mange kandidater, som der kraeves til panelet, for at de personer, der har den bedste foelsomhed og evne til at skelne, kan udvaelges. Det er altid tilraadeligt at anvende det samme produkt som det, der senere skal analyseres (derfor vil olivenolie altid blive anvendt).

Ved valg af metode maa man ikke overse, at foruden at vaere effektiv boer den anvendte fremgangsmaade vaere saa oekonomisk som muligt med hensyn til maengden af olie, antallet af proever, der skal sendes, og den tid, der bruges til udvaelgelsen. En udvaelgelsesprocedures effektivitet ligger i valget af de optimale niveauer for foelgende tre afhaengige variable:

a) omkostninger bestemt af antallet af proever,

det forholdsmaessige antal potentielt egnede kandidater, som ved et tilfaelde bliver udelukket ved udvaelgelsen, og

det forholdsmaessige antal kandidater, som ved et tilfaelde kommer igennem udvaelgelsesprocessen, skoent de ikke er egnede.

Fire punkter af den valgte udvaelgelsesprocedure, intensitetsvurderingstesten, som er beskrevet i ASTM (American Society for Testing and Materials), STP (Special Technical Publication) nr. 440, side 53, er blevet modificeret ved:

1) at nedsaette antallet af proever i serien

2) at udvide raekken af stimuli med henblik paa at foroege antallet af olfaktoriske og gustatoriske (lugt- og smags-) noter, som udvaelgelsen baseres paa, saa de tilpasses til de mest almindelige mangler, man finder i olivenolie

3) at variere koncentrationsforholdene i serierne

4) at behandle resultaterne statistisk.

Noedvendigt apparatur

1 500 ml flasker eller glaskolber.

moerke smageglas

proeveroer med 10, 15, 1 000 og 1 500 ml inddeling.

Noedvendige produkter

- Merck paraffin (reference 7.160, DAB 8, USP XX) eller fortyndingsmiddel i form af en olie uden lugt eller smag (nyraffineret olivenolie eller anden lignende olie).

- Olier: »atrojado« (muggen), vinagtig, harsk og bitter.

0,04

0,08

0,16

0,32

0,64

1,28

2,56

5,12

9.4.1.

Fremgangsmaade

Efter at have tilberedt fortyndingerne gaar man videre til udvaelgelsen, hvor man begynder med 25 kandidater og proever dem i overensstemmelse med foelgende metodologi for hver stimulus:

1) Man forbereder serier paa 12 proeveglas, maerket med en kode (én serie pr. kandidat). 15 ml af hver af de forskellige koncentrationer, der er tilberedt efter formlen C10 × an, haeldes i hver sit proeveglas.

2) Naar proeveglassene er blevet fyldt, boer de staa daekket med et urglas i smagelokalet ved en temperatur paa 20-22o C i mindst en time, foer proeven paabegyndes, for at bringe deres temperatur paa niveau med den omgivende temperatur.

3) Organisatoren skal saa stille de 12 proeveglas i hver serie op i en raekke, arrangeret efter aftagende koncentration.

Naeste trin er at bede hver kandidat om at udfoere proeven paa egen haand efter foelgende instruktion:

9.4.2.

Instruktion til kandidater

De 12 smageglas, der staar paa raekke foran kandidaten, indeholder fortyndinger af ét af de fire stimuli: »atrojado« (muggen), vinagtig, harsk og bitter. Den faktor, der goer det muligt at skelne mellem indholdet af glassene, er lugtens intensitet. Det glas med den mest intense lugt staar yderst til venstre, og resten af glassene er placeret i raekkefoelge efter aftagende intensitet fra venstre mod hoejre. Det sidste smageglas til hoejre kan have saa svag en lugt, at det maaske er umuligt at opfatte den.

Gaa frem paa foelgende maade: Goer Dem fortrolig med lugten af hvert af glassene i serien. Begynd fra hoejre (nr. 12), og proev paa at huske alle lugtenes intensitet uden at blive overtraet.

Naar De foeler, at De er blevet vant til koncentrationsskalaen for lugte, gaar De ud af lokalet.

I mellemtiden skal organisatoren fjerne ét af glassene i serien og saette det paa niveau med det sidste paa hoejre side og flytte alle de andre, saa pladserne til venstre fyldes. De skal saa komme tilbage til lokalet og fortsaette med proeven.

Proeven omfatter foelgende:

Det smageglas, der er blevet fjernet fra serien, skal saettes tilbage paa sin rigtige plads. For at goere det skal De lugte til det og sammenligne det med de andre saa ofte, som De oensker. De skal huske, at hvis det skal saettes rigtigt paa plads, skal det lugte staerkere end proeven umiddelbart til hoejre for det og svagere end proeven umiddelbart til venstre. Denne proeve vil blive gentaget med tre andre glas.

For at lette proeven og indsamlingen af svarene skal der til hver kandidat udleveres en formular i forbindelse med de instruktioner, der er beskrevet her.

UDVAELGELSE AF KANDIDATER

Proeve nr. .

Smagsegenskab .

Det udtagne glas hoerer til position nr. .

Dato .

Navn .

9.4.3.

Optegnelse af resultater

Organisatoren skal optegne data for hver af kandidaterne paa foelgende maade:

Kandidatens navn

Studeret

smagsegenskab

Tildelt nr.

i raekkefoelge

(Kí)

Korrekt nr.

i raekkefoelge

(K)

Bedoemmelse

(Kí-K)²

9.4.4.

Statistisk bedoemmelsesprocedure

I dette saerlige tilfaelde skal de smageglas, der skal saettes tilbage paa deres rette plads, vaere de samme for alle kandidaterne. Ifoelge de statistiske beregninger, der er udfoert til dette formaal, skal de svare til foelgende positioner i raekkefoelgen med hensyn til hver smagsegenskab:

»Atrojado« -

muggen (M)

Vinagtig (V)

Harsk (H)

Bitter (B)

Glas nr.

(10, 5, 7, 2)

(11, 3, 8, 6)

(7, 4, 10, 2)

(6, 3, 11, 9)

Det nummer, der svarer til glassets position i raekkefoelgen, maa ikke varieres, da de statistiske beregninger for denne test er udfoert med henblik paa sandsynligheden for, at glassene tilfaeldigt bliver sat tilbage i deres rigtige positioner.

For i videst muligt omfang at sikre, at oplysninger ikke overgives fra den ene kandidat til den anden, skal organisatoren sikre sig:

1. At der ikke er nogen mulighed for kontakt mellem kandidaterne. Der skal bruges forskellige inskriptioner til hver af kandidaterne.

2. At der ikke er nogen maade, hvorpaa kandidaterne kan finde ud af, hvilken position de glas, der er fjernet, havde.

3. Selv om alle kandidaterne skal have forelagt de samme glas som tidligere angivet, skal den raekkefoelge, hvori de overraekkes til kandidaten, variere.

Til hver kandidat skal der saa gives en karakter, der afhaenger af hans udfoerelse af opgaven paa foelgende maade:

Lad ei1, ei2, ... ei12 vaere de 12 glas med de 12 koncentrationer af duft- og smagsegenskaben »i« (i kan vaere en hvilken som helst af de fire egenskaber »atrojado« - muggen, vinagtig, harsk og bitter), arrangeret efter aftagende intensitet.

Lad eiK vaere ét af de udtagne glas og Kí vaere den position, som kandidaten giver det, naar han saetter det paa plads i serien. Vaerdierne af K og Kí er derfor hele tal mellem 1 og 12 inklusive, svarende til henholdsvis det virkelige pladsnummer for det valgte glas og det pladsnummer, som kandidaten giver det.

Lad T (den maksimale tilladte afvigelse) vaere en forud fastlagt vaerdi, som i vort tilfaelde er = 3, saa at hvis | Kí-K | > T, bliver kandidaten automatisk vraget (1).

Hvis derimod | Kí- | § T, er kandidaten teoretisk godkendt og kan gaa videre med proeven, da han eller hun er i stand til at saette den paagaeldende stimulus tilbage til dens rigtige position eller i det mindste meget naer ved den.

I dette tilfaelde skal den karakter, der er givet til en kandidat, der har vurderet en bestemt stimulus (koncentration), for eksempel i »atrojado« - muggen serien, vaere lig med kvadratet paa differensen mellem glassets rigtige nummer i raekkefoelgen og den position, kandidaten har placeret det i. Det vil sige PMh = (Kí-K)2.

Da denne operation skal udfoeres af hver kandidat paa fire stimuli (koncentrationer) af hver duft- og smagsegenskab, vil den partielle karakter for egenskaben (f.eks. M) vaere

ZM = PMh + PMj + PMl + PMm

Nedenfor er der givet nogle eksempler for at lette forestaaelsen af denne operation.

Eksempel 1:

Lad os antage, at de svar, kandidat A har givet for de fire stimuli, der er fjernet fra serien for egenskab (i) er som foelger:

Korrekt position for glasset i serien

(K)

Position, som kandidaten satte det

tilbage i

(Kí)

Afvigelse fra den korrekte position

(Kí-K)

7-7 = -0

4-5 = -1

10-6 = -4 (¹)

2-4 = -2

(¹) Denne kandidat afvises, fordi han har opnaaet T > 3 i proeven.

Eksempel 2:

Lad os antage, at en kandidat placerer glassene for en bestemt egenskab saaledes:

Korrekt position for glasset i serien

(K)

Position, som kandidaten satte det

tilbage i

(Kí)

Afvigelse fra den korrekte position

(Kí-K)

7-7 = -0

4-4 = -0

10-7 = -3

2-3 = -1

Denne kandidat afvises ikke. Han har opnaaet en karakter paa:

Zi = O2 + O2 + 32 + (-1)2 = 10

Kandidatens endelige karakter, der afgoer hans godkendelse eller afvisning som smager, og som afhaenger af hans svar paa de fire egenskaber, der undersoeges, vil blive som foelger:

PMh + PMj + PMi + PMm = Z = ZM + ..... + ZB

PMh

+ PMj

+ PMl

+ PMm

= ZM

PVh

+ PVj

+ PVl

+ PVm

= ZV

PHh

+ PHj

+ PHl

+ PHm

= ZH

PBh

+ PBj

+ PBl

+ PBm

= ZB

Endelig Z-vaerdi:

= Z = ZM + ..... + ZB

hvor: M

hvor:

= »Atrojado« - Muggen

= Vinagtig

= Harsk

= Bitter

Det gaelder nu om at afgoere, op til hvilken maksimal vaerdi kandidaten kan anses for at have et tilstraekkelig hoejt niveau for opfattelse, hukommelse for lugtindtryk og intellektuel organisation. Det er klart, at Z aldrig kan have en negativ vaerdi, og at Z = 0 betyder, at kandidaten paa korrekt maade har reorganiseret og kvantificeret alle de 16 intensiteter, han har faaet forelagt (fire for hver egenskab). Z-vaerdier, der afviger fra 0, angiver, at kandidaten har genkendt de omraader af skalaen, som de valgte intensiteter er taget fra, men inden for disse omraader har han vaeret ude af stand til at finde den noejagtige position, fordi hans evne til at skelne mellem de intensiteter, der er blevet forelagt ham, ikke har vaeret tilfredsstillende.

Det er derfor noedvendigt at bestemme en kritisk vaerdi (Zc), saaledes at hvis kandidaten ved et tilfaelde skulle saette alle glassene tilbage inden for de omraader, han havde undersoegt i forvejen, har sandsynligheden for at faa en slutkarakter Z, der er mindre end Zc, en tilstraekkelig ringe vaerdi (á), som kan fastsaettes paa forhaand. Med andre ord, det maa sikres, at sandsynligheden for ved denne procedure at vaelge en smager, som ikke har tilstraekkelig evne til at skelne intensiteten af de stimuli, der bruges til udvaelgelsesprocessen, er mindre end á.

Naar vaerdien for á er fastsat, (i vores tilfaelde til 0,05), faas Zc af sandsynlighedsdistributionen for den variable Z, som igen afhaenger af sandsynlighedsdistributionen for de variable P (Kí).

Ifoelge de relevante statistiske beregninger bliver Zc = 34.

Naar Z-vaerdierne for alle kandidater er udregnet, skal alle kandidater, hvis Z-vaerdi ligger over 34, udelukkes.

Som eksempel vises Z-vaerdierne for kandidaterne A og B:

ZV = 34 ZV = 34

Egenskab

Kandidat A

Kandidat B

»Atrojado« - Muggen (M)

= 10

= 12

Vinagtig (V)

= 10

= 11

Harsk (H)

= 10

= 15

Bitter (B)

= 4

= 0

= 34

= 38

Da de to kandidater har Z-vaerdier paa henholdsvis 34 og 38, vil kandidat A blive godkendt, medens kandidat B vil blive forkastet. Naar alle kandidater med en Z-vaerdi over 34 er blevet elimineret, skal resten klassificeres i henhold til deres Z-vaerdier, indtil de 12 bedste kandidater er blevet udvalgt.

9.5.

Traening

Hovedformaalene med traeningsstadiet er:

a) at goere smagerne fortrolie med de mange olfaktorisk-gustatorisk-taktile varianter (dvs. varianter, der kan erkendes med lugte-, smags- og foelesansen), der findes inden for olivenolier

at goere smagerne fortrolige med den saerlige sensoriske metodologi

at hoejne den individuelle evne til at genkende, identificere og kvantificere de sensoriske egenskaber og

at forbedre foelsomheden og hukommelsen med hensyn til de forskellige smags- og duftegenskaber, saa slutresultatet bliver praecise og ensartede vurderinger.

Traeningsstadiet omfatter normalt et antal moeder afhaengig af de muligheder, der staar aabne for panelet og studiet. Efter at have analyseret olierne individuelt skal smagerne her diskutere de vanskeligheder, de er stoedt paa, med organisatoren, og de skal kommentere de givne bedoemmelser, saa kriterier og meninger kan blive ensartede.

Den standard, der er naaet ved traening efter et fastsat antal moeder, vurderes ud fra den procentiske foroegelse af noejagtige svar - hvis der anvendes diskriminatoriske proever - eller ved at analysere variansen i panelets gennemsnitlige individuelle bedoemmelser, naar der foretages proever med brug af en skala.

Den praktiske nytte af denne traeningsperiode har vaeret diskuteret frem og tilbage, men for tiden anses den for at vaere meget effektiv og endog vaesentlig, hvis man skal opnaa noejagtige sensoriske data.

9.6.

Praestationskontrol

Paneler af gamle og erfarne smagere udfoerer normalt smagninger paa en regelmaessig og vedvarende basis, hvad der indebaerer sensoriske proever, som kraever store anstrengelser af dem. Beslutninger af stor teknologisk og kommerciel betydning afhaenger i overordentlig mange tilfaelde af deres skoen. Derfor boer smagernes praestationer kontrolleres efter udvaelgelse og traening for at sikre, at deres resultater er praecise.

Efter at panelerne er sammensat og har gennemgaaet rutineproeverne, vil det vaere noedvendigt at kontrollere deres praestationer regelmaessigt med passende mellemrum.

10.

FREMGANGSMAADE VED ORGANOLEPTISK BEDOEMMELSE AF JOMFRUOLIE

Naar ovenstaaende standarder er opfyldt, de noedvendige faciliteter til raadighed og panelet udvalgt, skal hver smager lugte til og smage paa (2) den olieproeve, der er i smageglasset. Smageren analyserer de olfaktoriske, gustatoriske, taktile og kinaestetiske indtryk ved hjaelp af det i figur 2 viste skema. Paa dette ark optegnes de »noter«, der er til stede, og deres intensitet. Dernaest bedoemmes oliens kvalitet.

10.1.

Brug af skemaet i figur 2

Nogle af de mest karakteristiske lugt- og smagsegenskaber, som hyppigt findes i olivenolie, og som beskriver dens »flavour«, er opfoert i skemaets venstre side. Hvis smageren finder andre stimuli, der ikke svarer til de anfoerte beskrivelser, optegnes de under »andet«, idet der bruges en beskrivelser, der definerer dem saa noejagtigt som muligt.

De stimuli, der kan opfattes, vurderes i forhold til deres intensitet, som angives ved et kryds (x) i det tilhoerende felt efter foelgende kriterier:

1 = knap maerkbar

2 = mindre

3 = middel

4 = stor

5 = meget stor

I skemaets hoejre side er afsat en skala, der gaar fra 1 til 9 points (9 for usaedvanlig god kvalitet og 1 for den ringeste kvalitet), som smagerne bruger til at give en enkelt, generel bedoemmelse af de karakteristika, der er fundet ved den olie, der undersoeges. Bedoemmelsen skal vaere i overensstemmelse med de gode punkter og de mangler ved olien, som allerede er anfoert i skemaets venstre side.

Bedoemmelsesskemaets foerste spalte (mangler) er delt op i fem rubrikker. Foelgelig skal klassificeringen af olien foerst og fremmest baseres paa det totale fravaer af eller tilstedevaerelsen af daarligt lugt og smag og paa, hvor alvorlige og intense saadanne faenomener er. Da skalaen gaar op til 9 points, boer der ogsaa medregnes visse nuancer eller aspekter, der kan hjaelpe til en endelig bestemmelse af den samlede kvalitetsbedoemmelse som beskrevet i anden spalte med overskriften »karakteristika«.

10.2.

Endelig bedoemmelse

Den person, der foerer tilsyn med panelet, skal indsamle de bedoemmelser, der er udfoert af hver af smagerne. Han skal kontrollere, at de egenskaber og smagsintensiteter, smageren har opfattet og anfoert paa sit profilark, paa acceptabel vis modsvarer den vaerdi, olien er anfoert til i klassifikationstabellen.

Hvis der er en paafaldende forskel, skal den tilsynsfoerende bede smageren revidere sit profilark.

Om noedvendigt skal smageren gentage proeven.

Endelig skal den, der foerer tilsyn med panelet, udarbejde en tabel med hele panelets bedoemmelser og beregne gennemsnittet heraf og standardafvigelsen (for gennemsnittet).

Hvis standardafvigelsen er hoejere end den metodiske fejl, skal proeven gentages af hele panelet.

Det er kun i tilfaelde af analyse i revisionsoejemed, at panelet skal gentage proeverne for at faa tre bedoemmelser af olieproeven. Den endelige bedoemmelse er gennemsnittet af de tre bedoemmelser angivet med én decimal.

Hvis gennemsnitsbedoemmelsen af bitterhed og/eller skarphed er hoejere end 2,5, boer olien maerkes tilsvarende, og det boer optegnes, at den er bitter eller skarp.

Angivelse af resultaterne: Den tilsynsfoerende bestemmer paa grundlag af gennemsnitskarakteren den kategori, hvori proeven klassificeres, under hensyntagen til graenserne i bilag I. I analyserapporten oplyses kun om denne kategori.

NB: Olieproeverne boer opbevares i koeleskab, indtil de analyseres, og igen anbringes i koeleskab, indtil proeven er udfoert tre gange.

(3) Streg det/de ord ud, der ikke gaelder.

(4) 0 = manglende (5)

1 = kun lige akkurat maerkbar

2 = let

3 = middel

4 = stor

5 = meget stor

(6) Ved manglende indtryk, marker med »X« i den paagaeldende kasse.

Bedoemmelsesskema

Mangler

Karakteristika

Samlet

bedoemmelse

Points

Ingen

Lugt og smag af oliven

eller anden frisk frugt

Mindre eller knap maerkbare

Afsvaekket lugt og

smag, uanset art

Maerkbare

Noget mangelfuld lugt og smag eller

abnorm lugt og smag

Tydelige, paa graensen af det acceptable

Klart mangelfuld, ubehagelig lugt og smag

Store og/eller alvorlige, klart maerkbare

Lugt og smag fuldstaendigt utilladelige til fortaering

Bemaerkninger .

Smagerens navn .

Proevens nr. .

Dato .

SENSORISK ANALYSE: ALMINDELIG GRUNDORDLISTE 1.

FORMAAL

Formaalet med denne standard er at samle de generelle termer, der bruges ved sensorisk analyse, og angive deres definitioner.

ORDLISTE

2.1.

Almindelig terminologi

Sensorisk analyse (substantiv):

undersoegelse af et produkts organoleptiske egenskaber ved hjaelp af sanseorganerne.

Opfattelse (substantiv):

sensorisk bevidsthed om ydre genstande eller begivenheder.

Organoleptisk (adjektiv) (attribut):

beskriver en egenskab ved et produkt, som kan opfattes med sanseorganerne.

Ekspert (substantiv):

(med hensyn til undersoegelse af organoleptiske egenskaber)

smager, som har specialiseret sig i sensorisk analyse af et specifikt produkt og har en grundlaeggende forstaaelse for produktets fremstilling og forbrugernes praeference.

Smager (substantiv):

klarsynet, foelsom, traenet person, som er udvalgt til at vurdere et naeringsmiddels organoleptiske egenskaber med sanseorganerne.

Panel:

gruppe af vurderingsmaend, som er specielt udvalgt og traenet, og som traeder sammen for at foretage den sensoriske analyse af produktet under kontrollerede forhold.

Fornemmelse (substantiv):

subjektivt faenomen, der fremkommer som resultat af stimulering af et sanseorgan. Dette faenomen kan skelnes subjektivt eller defineres objektivt ved det involverede sanseorgan, afhaengig af stimulus' karakter og intensitet.

Foelsomhed (substantiv):

evne til at opfatte en stimulus af ringe intensitet eller smaa forskelle mellem stimuli, baade kvantitativt og kvalitativt ved hjaelp af sanseorganerne.

Smagning (substantiv):

arbejde, der omfatter opfattelse, analyse og bedoemmelse af et levnedsmiddels organoleptiske egenskaber, isaer de olfaktoriske, gustatoriske, taktile og kinaestetiske egenskaber, dvs. egenskaber, der kan opfattes med lugte-, smags- og foelesansen og muskelfoelelsen.

Accept (substantiv):

et individs eller en befolknings velvillige modtagelse af et produkt.

Harmoni (substantiv):

egenskab ved et produkt, som giver anledning til en generel behagelig fornemmelse. Denne fornemmelse fremkaldes af opfattelsen af produktets komponenter som olfaktoriske, gustatoriske, taktile og kinaestetiske stimuli, fordi de er til stede i passende koncentrationsforhold.

Acceptabilitet (substantiv):

tilstand hos et produkt, som modtages velvilligt af et individ eller en befolkning med hensyn til dets organoleptiske egenskaber.

Skelnen (substantiv):

kvalitativ og/eller kvantitativ differentiering mellem to eller flere stimuli.

Kompensation (substantiv):

resultat af vekselvirkningen mellem en kombination af stimuli, saaledes at hver af dem opfattes med mindre intensitet, end hvis den virkede alene.

Aspekt (substantiv):

kombination af organoleptiske egenskaber, der opfattes visuelt: stoerrelse, form, farve, turbiditet, renhed, fluiditet, skum og mousseren. Denne term boer foretraekkes fremfor termen udseende.

Attribut (substantiv):

en karakteristisk egenskab, som kan opfattes.

2.2.

Fysiologiske termer

Stimulus (substantiv):

fysisk eller kemisk stof/middel, der fremkalder en specifik respons fra de eksterne eller interne sensoriske receptorer.

Smag (substantiv):

(smagssans)

sans, hvis receptorer er lokaliseret til mundhulen, isaer paa tungen, og som aktiveres af forskellige forbindelser i oploesning.

Gustatorisk (adjektiv):

beskriver den egenskab ved et produkt, der kan aktivere smagssansen ved at vaekke de fornemmelser, der hoerer til én eller flere af de fire primaere smage: soedt, salt, surt og bittert.

Receptor (substantiv):

specifik struktur i et sanseorgan, som kan vaekkes og kan modtage en stimulus og omdanne den til en nerveudladning.

Bemaerk: Receptorer klassificeres efter den type energi, der er forbundet med den paagaeldende stimulus (lys, varme, lyd osv.).

Lugten (substantiv):

lugtesansens funktion med at opfatte og skelne mellem de molekyler, der naar den i luftform fra det ydre miljoe, direkte eller indirekte gennem naesen.

Intensitet (substantiv):

stoerrelsen af den energi ved et attribut, der kan maales efter en kvantitativ vaerdiskala over taerskelvaerdien.

Tilpasning (substantiv):

midlertidig aendring af foelsomheden til opfattelse af sensoriske stimuli paa grund af vedvarende, gentagen udsaettelse for en given stimulus eller en, der ligner den.

Haemning (substantiv):

mangel paa reaktion fra et sanseorgan eller en del deraf, til trods for, at det bliver udsat for paavirkning fra en egnet stimulus, hvis intensitet er over taersklen.

Reaktion (substantiv):

handling, hvor de sensoriske celler reagerer paa paavirkning fra én eller flere stimuli med relation til et givet sanseorgan.

Krop (substantiv):

beroeringsfornemmelse, der opfattes i mundhulen, og som giver en fornemmelse af et produkts taethed, viskositet, konsistens eller kompakthed.

Vellugt (substantiv):

frisk, behagelig, dejlig duft.

At lugte (verbum):

(aktiv form anvendt paa lugt)

beskriver den handling at opfatte en lugt.

Objektiv (adjektiv):

a) beskriver det, der giver en sand fremstilling, som kan verificeres, af genstanden ved at minimere de menneskelige faktorer (f.eks. praeference, vane, tilboejelighed)

beskriver den teknik, der enten ved hjaelp af sensoriske eller instrumentelle metoder minimerer selvinducerede fejl.

Bemaerk: Brugen af termen »instrumentel« som synonym kan ikke tilraades.

Subjektiv (adjektiv):

beskriver det, der fremkalder en opfattelse, der er paavirket ikke alene af stimulus, men ogsaa af vores maade at taenke og foele paa.

Muskelfoelelse (substantiv):

fornemmelser, der fremkommer som resultat af tryk paa proeven frembragt ved bevaegelser i mundhulen eller med fingrene (f.eks. ved at trykke paa ost med fingrene).

Taerskel (substantiv):

Absolut taerskel:

den mindste vaerdi af en sensorisk stimulus, der giver anledning til:

- fremkomsten af en fornemmelse (stimulustaerskel eller detektionstaerskel)

- eller identifikation af fornemmelsen (genkendelsestaerskel).

Differenstaerskel:

den mindste vaerdi af en sensorisk stimulus, der giver anledning til en maerkbar forskel i fornemmelsens intensitet.

Terminaltaerskel:

den stoerste vaerdi af en stimulus, over hvilken en foroegelse af intensiteten ikke opfattes.

Praeferencetaerskel:

den mindste kvantitative vaerdi af en stimulus eller kritiske overtaerskelvaerdi af den samme stimulus, ved hvilken en tiltraeknings- eller afvisningsreaktion fremkommer i relation til en neutral stimulus, f.eks. ved valget mellem en sukkeroploesning og vand.

Bemaerk: Der boer skelnes mellem en absolut praeferencetaerskel og en differential praeferencetaerskel.

Under-taerskel (adjektiv):

under den absolutte taerskel.

Over-taerskel (adjektiv):

over den absolutte taerskel.

Sensorisk udmattelse:

specifik form for sensorisk tilpasning, hvor der forekommer en nedsaettelse af foelsomheden.

Kompensation (substantiv):

resultat af en vekselvirkning mellem en kombination af stimuli, saaledes at hver af dem opfattes med mindre intensitet, end hvis den virkede alene.

Synergisk (adjektiv):

samlet effekt eller paavirkning af givne stoffer, hvor intensiteten af de organoleptiske attributter, der fremkommer som et resultat af kombinationen, overstiger summen af intensiteterne af attributterne taget hver for sig.

Kontrastvirkning:

foroegelse af reaktionen paa forskelle mellem to stimuli, der optraeder samtidig eller lige efter hinanden. Modsat konvergensvirkning.

Konvergensvirkning:

reduktion af reaktionen paa forskelle mellem to stimuli, der optraeder samtidig eller lige efter hinanden. Modsat kontrastvirkning.

2.3.

Terminologi i relation til organoleptiske egenskaber

Sur (adjektiv):

a) beskriver den primaere smag, der fremkaldes af fortyndede vandige oploesninger af de fleste sure stoffer (f.eks. citronsyre, maelkesyre, vinsyre)

beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, som frembringer denne smag.

Det tilsvarende substantiv er surhed.

Sur (adjektiv):

beskriver den lugt- og smagsfornemmelse, hvor de syrer, der generelt fremkommer ved gaering, er fremherskende, samt de naeringsmidler, der fremkalder denne fornemmelse.

Nogle faktorer, der bidrager til denne fornemmelse, staar i forbindelse med gaering, for eksempel maelkesyregaering eller eddikesyregaering, i et naeringsmiddel.

Bitter (adjektiv):

a) beskriver den primaere smag, der fremkaldes af fortyndede vandige oploesninger af forskellige stoffer som f.eks, kinin, koffein og visse alkaloider

beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, der fremkalder denne smag.

Det tilsvarende substantiv er bitterhed.

Salt (adjektiv):

a) karakteristisk fornemmelse, der opfattes med smagssansen, det mest typiske eksempel herpaa fremkaldes af natriumchloridoploesning

beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, der fremkalder denne smag.

Det tilsvarende substantiv er salthed.

Soedt (adjektiv):

a) beskriver den primaere smag, der fremkaldes af vandige oploesninger af forskellige stoffer som f.eks. sakkarose

beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, der fremkalder denne smag.

Det tilsvarende substantiv er soedme.

Astringerende:

a) beskriver den komplekse fornemmelse, der fremkaldes i mundhulen af en fortyndet vandig oploesning af produkter som f.eks. nogle tanniner (garvesyre) (for eksempel kakitannin og slaaentannin)

beskriver den egenskab ved rene stoffer eller blandinger, der fremkalder denne fornemmelse.

Det tilsvarende substantiv er astringens.

Flavour (substantiv):

»flavour« betyder den kombination af olfaktoriske, gustatoriske, taktile og kinaestetiske fornemmelser, som goer det muligt for en vurderingsmand at identificere og etablere et gunstigt eller ugunstigt kriterium paa flere niveauer.

Smag (substantiv):

a) fornemmelse der opfattes, naar smagspapillerne stimuleres af oploeselige stoffer

egenskab hoerende til den specifikke fornemmelse, der fremkaldes af saadanne stoffer.

Primaersmag (substantiv):

enhver af de karakteristiske smage, som der menes at vaere fire af: soedt, salt, surt og bittert.

Lugt (substantiv):

a) kombination af fornemmelser, der opfattes af lugteorganet ved indsnusning af flygtige stoffer

egenskab ved den specifikke fornemmelse, der fremkaldes af ethvert af de ovennaevnte stoffer.

Aroma (substantiv):

a) behagelige fornemmelser, som opfattes indirekte af lugteorgenet, naar man smager paa madvarer

inden for parfumeriet og i ikke-specialiseret sprog bruges denne term ogsaa om de samme fornemmelser opfattet direkte gennem naesen.

Eftersmag, restsmag (substantiv):

kombination af fornemmelser opfattet efter at stimulus er forsvundet fra mundhulen, og som afviger fra de fornemmelser, der opfattedes foer.

Aromatisk (adjektiv):

a) beskriver egenskaben ved rene stoffer eller blandinger, som, naar de smages, fremkalder de fornemmelser, der kaldes aroma

beskriver de produkter, som naar de undersoeges direkte via naesen, fremkalder fornemmelser af vellugt og friskhed.

Stofvirkning (substantiv):

karakteristika ved et produkts faste eller rheologiske tilstand, som i kombination kan stimulere de mekaniske receptorer under smagningen, isaer de receptorer, der er lokaliseret til mundhulen.

Bemaerk: Denne term refererer udelukkende til de objektive egenskaber, ikke til de fornemmelser, der fremkommer, og som betegnes ved generelle termer som f.eks. konsistens, traevlethed, fedtethed osv.

Mundskylning:

handling, hvorved foede, der er til stede i munden, kommer i kontakt med alle de foelsomme omraader i munden, saa at alle de fornemmelser, den fremkalder, kan opfattes.

Bemaerk: Denne ordliste kan udvides ved at studere ISO standard 5492, del I til V, og andre publikationer som f.eks. J. L. Magnens publikation med titlen »Les cahiers techniques du Centre National de Coordination des Études et Recherches sur la Nutrition et l'Alimentation«.

GLAS TIL OLIESMAGNING 1.

FORMAAL

Denne standards formaal er at beskrive de karakteristiske egenskaber ved de glas, der er beregnet til brug ved den organoleptiske analyse af spiseolier (lugt, smag, flavour).

Desuden beskriver den det varmeaggregat, der er noedvendigt for at naa og opretholde den rette temperatur til denne analyse.

BESKRIVELSE AF GLASSET

Tegningen i figur 1 forsoeger at fastlaegge de optimale karakteristika for et stykke apparatur af denne art, som kan specificeres saaledes:

a) maksimal stabilitet for at forhindre, at glasset vipper og olien spildes

en basis, der passer til fordybningerne i varmeaggregatet, saa bunden af glasset opvarmes jaevnt

en form, der er bredest ved basis, saa oliens flygtige komponenter let kan frigoeres, men som indsnaevres ved glassets munding, saa de samme komponenter let koncentreres; derved sikres det, at de opfattes og identificeres bedre af naesen

glasset er lavet af moerkt glas for at forhindre smageren i at opfatte oliens farve; derved elimineres eventuelle fordomme, og dannelsen af forudfattede meninger eller tendenser hindres.

2.1.

Dimensioner

Glasset er skitseret i figur 1, og det har foelgende dimensioner:

total kapacitet 130 ml p10 ml

total hoejde 60 mm p1 mm

diameter ved munding 50 mm p1 mm

diameter paa det videste sted 70 mm p1 mm

diameter ved basis 35 mm p1 mm

glassets tykkelse paa siderne 1,5 mm p0,2 mm

basis' tykkelse 5 mm p1 mm

Hvert glas skal vaere udstyret med et urglas, hvis diameter skal vaere 10 mm stoerre end glassets munding. Dette urglas skal bruges som laag for at forebygge tab af aroma og tilgang af stoev.

2.2.

Fremstillingskarakteristika

Glasene skal vaere lavet af modstandsdygtigt glas; det skal vaere moerkt, saa indholdets farve ikke kan skelnes, og det skal vaere frit for ridser og bobler.

Kanten skal vaere jaevn, glat og afrundet.

Glasset skal vaere haerdet, saa det kan taale de temperaturforandringer, det kommer ud for under proeverne.

2.3.

Brugsanvisning

Glassene skal rengoeres med uparfumeret saebe eller opvaskemiddel, og de skal skylles flere gange, indtil rensemidlet er fuldstaendig fjernet. Den sidste skylning skal vaere med destilleret vand, hvorefter glassene skal staa og loebe af og derefter toerres i en toerreovn.

Der maa hverken benyttes koncentrerede syrer eller blandinger med kromsyre.

Glassene skal enten staa i ovnen, indtil de skal bruges, eller de skal opbevares i et skab, hvor de skal vaere beskyttet mod forurening fra eventuel udefra kommende lugt.

Foer brugen skal der lugtes til hvert glas for at sikre, at der ikke er nogen udefra kommende lugt til stede. Mens proeven forberedes, skal man soerge for at optegne inskriptionen paa hvert glas og hvilken olie, det indeholder. Organisatoren skal vaere den eneste, der kender denne relation mellem inskription og olie.

ANORDNING TIL OPVARMNING AF PROEVER

Proeverne skal underkastes organoleptisk undersoegelse ved en fastsat temperatur, som for olier skal vaere 28 p2o C. Til dette formaal skal der installeres en opvarmningsanordning (se figur 2) inden for smagerens raekkevidde i hver baas. Den bestaar af en aluminiumblok nedsaenket i et termostatreguleret vandbad, hvor der opretholdes en konstant temperatur. Denne blok har en raekke fordybninger, som glassenes bund passer ned i. Temperaturforskellen mellem opvarmningsanordningen og den olie, der er i de glas, der er indsat i fordybningerne i de forskellige blokke, maa ikke vaere stoerre end p2o C.

280

240

280

100

VEJLEDNING I INDRETNING AF ET PROEVELOKALE 1.

INDLEDNING

Proevelokalet udformes, saa det giver det panel, der deltager i de sensoriske proever, et egnet, behageligt, standardiseret miljoe, der letter arbejdet og hjaelper med til at forbedre resultaternes repeterbarhed og reproducerbarhed.

FORMAAL

Denne standards formaal er at specificere de basale betingelser, der skal opfyldes ved indretningen af et proevelokale.

GENERELLE SPECIFIKATIONER FOR INDRETNINGEN

Lokalerne skal, uanset deres stoerrelse (se 3.1), opfylde foelgende specifikationer:

De skal vaere behagelige og passende oplyst (se 3.2), men i neutral stil. Til dette formaal anbefales en beroligende, klar, lys farve til vaeggene, saa der skabes en afslappet atmosfaere (;).

Lokalerne skal vaere lette at rengoere, og de skal vaere adskilt fra eventuelle stoejkilder, derfor skal de helst vaere lydisolerede. De skal ogsaa holdes fri for udefra kommende lugte; derfor skal de, hvis det er muligt, udstyres med effektiv ventilation. Hvis svingningerne i den ydre temperatur goer det noedvendigt, skal proevelokalet vaere udstyret med air conditioning for at holde temperaturen taet paa 20-22o C.

3.1.

Dimensioner

Lokalernes dimensioner afhaenger ofte af laboratoriets eller firmaets muligheder. Generelt boer de vaere tilstraekkelig rummelige til at muliggoere indretningen af ti baase og et omraade til tilberedning af proeverne.

Det er dog klart, at jo stoerre et areal, der reserveres til indretning af proevelokalet, des bedre, da hjaelpeomraader saa kan indrettes, f.eks. til rengoering af apparatur, til kulinariske forberedelser og til samlingssted for aabne paneler.

3.2.

Belysning

Den almindelige belysning, hvad enten den kommer fra sollys eller lamper (f.eks. lysstofroer), skal vaere ensartet, kontrollerbar og diffus.

3.3.

Temperatur- og fugtighedsforhold

Lokalerne skal konstant holdes paa en behagelig temperatur og under behagelige hygrometriske betingelser. Bortset fra helt specielle omstaendigheder anbefales en temperatur paa 20-22o C og hygrometriske betingelser paa 60-70 % relativ fugtighed.

BESKRIVELSE AF BAASENE

4.1.

Almindelige karakteristika

Baasene til sensorisk analyse skal vaere placeret ved siden af hinanden i lokalerne. De skal vaere ens, og de skal vaere adskilt af skillevaegge, som skal vaere tilstraekkelig hoeje og brede til at isolere smagerne, naar de sidder i baasene.

Baasene kan vaere lavet af et hvilket som helst egnet materiale, som er let at rengoere og vedligeholde (f.eks. trae, glasovertrukket krydsfiner, lamineret trae og lignende). Hvis der benyttes maling, skal den vaere fuldstaendig lugtfri, naar den er toer.

Stolene i baasene skal vaere behagelige, og de skal kunne indstilles i hoejden.

Hver baas skal ogsaa have individuel belysning, hvis retning og intensitet kan indstilles.

Det maa staerkt anbefales, at baasene udstyres med en knap, der staar i forbindelse med en udvendig lampe, saa smageren kan meddele den tjenstgoerende udenfor, at han er faerdig med proeven, oensker flere proever, savner et stykke apparatur, har bemaerket en eller anden uregelmaessighed eller har behov for oplysninger osv., uden at distrahere de andre smagere.

(;) Lokalets farveskema og dets belysning kan paavirke resultaterne af den sensoriske analyse.

4.2.

Dimensioner

Baasene skal vaere tilstraekkelig store og komfortable. I almindelighed skal de have foelgende dimensioner:

- bredde:

0,75 m (uden vask)

0,85 m (med vask)

- laengde:

0,50 m (bord)

0,20 m ekstra til skillevaeg

- skillevaeggenes hoejde:

mindst 0,60 mfra bord

- bordets hoejde:

0,75 m.

4.3.

Indretning

Bordoverfladen skal vaere let at rengoere.

En del af denne overflade skal benyttes til en vask forsynet med rindende drikkevand. Hvis dette ikke kan lade sig goere, kan denne plads dog benyttes til en spyttebakke, spytkumme eller lignende.

Naar proeverne skal opbevares ved en konstant temperatur over eller under stuetemperatur, mens smagningen forgaar, er det tilraadeligt at have en egnet anordning til dette formaal (vandbad, varmeplade e.lign.).

Der kan ogsaa saettes en hylde op i en hoejde af ca. 1,10 meter fra gulvet til placering af forskelligt tilbehoer (glas, smaa apparater osv.).

Hvis indretningen af baasene i proevelokalet goer det muligt, kan det betale sig at installere en anordning til at lette praesentationen af proeverne. Den kan vaere i form af en skydelem (figur 1), en drejelig lodret anordning, som egner sig til glas eller kopper (hoeje beholdere) (figur 2), eller en luge, der aabnes horisontalt, naar de beholdere, der indeholder proeverne, er smaa (figur 3). Det er simpelt hen et spoergsmaal om at sikre, at aabningen er stor nok til, at bakker og glas med proever kan passere igennem den.

EKSTRA LOKALER

Hvis der er tilstraekkelig plads, er det tilraadeligt at indrette saerlige lokaler til tilberedning af proever (kulinarisk eller paa anden maade), til at arrangere glas eller apparatur og til diskussioner foer eller efter smagningen. Hvis saadanne lokaler er til raadighed, skal de holdes rene, og lugte, stoej eller samtaler fra disse lokaler maa paa ingen maade forstyrre smagernes arbejde i proevelokalet.

Et eksempel paa et proevelokale med yderligere lokaler ses paa figur 4.

Bemaerk: Her er ideelle forhold beskrevet. Hvis det ikke er muligt at holde en saadan installation udelukkende til sensorisk analyse, kan proeverne dog udfoeres i lokaler, der opfylder de minimumskrav, der her er beskrevet (belysning, temperatur, stoej, lugte), ved at der opsaettes transportable baase, fremstillet af foldeelementer, saaledes at de i det mindste isolerer smagerne fra hinanden.

(1) Organisatoren boer presse kandidaten til at gaa fornuftigt frem, dvs. uden at miste foelsomhed paa grund af udmattelse af lugtesansen.(2) Smageren kan afstaa fra at smage, hvis vedkommende finder intenst ubehagelige egenskaber ved lugten; i saa fald noteres dette paa bedoemmelsesskemaet som en eksceptionel haendelse.

BILAG XIII

RAFFINERINGSBEVIS 1.

NEUTRALISATION OG BLEGNING AF OLIVENOLIE I LABORATORIET

1.1.

Neutralisation af olie

1.1.1.

Apparatur

- hoejt 300 ml baegerglas

- laboratoriecentrifuge med 100 ml reagensglas

- 250 ml baegerglas

- 100 ml kolber

- dekantertragt til 1 liter.

1.1.2.

Reagenser

- vandig natriumhydroxidoploesning paa 12 %

- ethanoloploesning paa 1 % af phenolphtalin

- analyseren hexan

- analyseren isopropylalkohol.

1.1.3.

Fremgangsmaade

a) Olier af en surhedsgrad, udtrykt i oliesyre, paa under 30 %

50 g raaolie haeldes i et hoejt 300 ml baegerglas og opvarmes til 65o C i vandbad. Under langsom bevaegelse tilsaettes en maengde natriumhydroxid paa 12 % svarende til oliens indhold af frie fedtsyrer, med et overskud paa 5 %. Omroeringen fortsaettes i fem minutter, idet der opretholdes en temperatur paa 65o C.

Det hele omhaeldes i 100 ml reagensglas til centrifugering og saebemassen udskilles ved centrifugering. Den dekanterede olie haeldes i et 250 ml baegerglas og vaskes med 50-60 ml destilleret kogende vand, idet det vandholdige lag fjernes ved hjaelp af en haevert. Vaskningerne gentages, indtil sporene af saeberester er fuldstaendig forsvundet (indtil phenolphtaleinets rosa farve er forsvundet).

Olien centrifugeres for at fjerne de smaa restmaengder af vand.

Olier af en surhedsgrad, udtrykt i oliesyre, paa over 30 %

I en dekantertragt til en liter haeldes 50 g raaolie, 200 ml hexan, 100 ml isopropylalkohol, og en saa stor maengde natriumhydroxidoploesning paa 12 %, som svarer til oliens indhold af frie fedtsyrer, med et overskud paa 0,3 %. Der omroeres kraftigt i 1 minut. Derefter tilsaettes 100 ml destilleret vand; der omroeres paa ny, og man lader vaesken staa.

Efter lagdelingen lader man det nederste lag, der indeholder saeberne, loebe af. Mellem de to lag (olieholdigt foroven og vandholdigt forneden) dannes der ofte et mellemlag, som bestaar af planteslim og uoploeselige stoffer, og som ligeledes skal fjernes.

Derefter vaskes hexanoploesningen af syrefri olie med portioner, bestaaende af 50-60 ml af en oploesning af isopropylalkohol og destilleret vand i forholdet 1 : 1 (v/d), indtil phenolphtaleinets rosa farve forsvinder. Derpaa fjernes hexanet fuldstaendigt ved afdestillering i vakuum (for eksempel ved hjaelp af en rotationsfordamper).

1.2.

Blegning af den neutraliserede olie

1.2.1.

Apparatur

- 250 ml kolbe med tre slebne halse, der goer det muligt at indsaette:

a) et gradinddelt termometer, der kan aflaeses op til 90o C

et mekanisk roereapparat med 250-300 omdrejninger i minuttet og udstyret til at fungere i vakuum

et forbindelsesstykke til vakuumpumpen

- vakuumpumpe udstyret med manometer og i stand til at give residualtryk paa 15-30 milibar.

1.2.2.

Fremgangsmaade

I trehalsekolben afvejes ca. 100 g af den neutraliserede olie. Termometret og roereapparatet indsaettes; vakuumpumpen tilsluttes og olien opvarmes under omroering indtil 90o C. Denne temperatur holdes under stadig omroering, indtil den olie, der skal analyseres, er fuldstaendig befriet for sit vandindhold (ca. 30 minutter).

Vakuum brydes og der tilsaettes 2 à 3 g aktiveret jord. Vakuum genoprettes, indtil der opnaas et residualtryk paa 15-30 milibar, og der omroeres stadig ved en temperatur paa 90o C i 30 minutter med ca. 250 omdrejninger i minuttet.

Dernaest filtreres ved varme i et termostatisk reguleret toerreskab (50-60o C).

BILAG XIV

SUPPLERENDE BESTEMMELSE NR. 2, 3 OG 4 TIL KAPITEL 15 I DEN KOMBINEREDE NOMENKLATUR 1. Bestemmelse 2.A: Som »olivenolie« (KN-kode 1509 og 1510) betragtes kun olie, som udelukkende er fremstillet af oliven, bortset fra re-esterificeret olivenolie og blandinger af olivenolie med anden olie.

Tilstedevaerelsen af re-esterificeret olivenolie eller andre olier paavises ved hjaelp af metoderne, der er beskrevet i bilag V, VII, IX, X og XII. De analytiske karakteristika ved sterol- og fedtsyresammensaetningen i alle olivenolier i KN-kode 1509 og 1510 er anfoert i nedenstaaende tabel.

Fedtsyresammensaetning

. Bestemmelse 2.A:

Tabel I - Syreindhold i %

Tabel II - Sterolindhold i %

MyristinsyreM 0,1

KolesterolM 0,5

LinolensyreM 0,9

BrassicasterolM 0,2

ArachinsyreM 0,7

CampesterolM 4,0

EicosansyreM 0,5

Stigmasterol§ Campesterol

BehensyreM 0,3

b-sitosterol (¹)m 93,0

LignocerinsyreM 0,5

D-7-stigmasterolM 0,5

M = maksimum

= minimum

(¹) D-5,23-stigmasterol+kolesterol+b-sitosterol+sitostanol+D-5-avenasterol+D-5,24-stigmastadienol

Bestemmelse 2.B: Som »jomfruolie« betragtes olie, som udelukkende er udvundet af oliven ved mekaniske eller andre fysiske processer under betingelser, isaer termiske betingelser, der ikke medfoerer nogen forringelse af olien, og som ikke har undergaaet anden behandling end skylning, dekantering, centrifugering eller filtrering, men ikke olie, der er udvundet af oliven ved hjaelp af oploesningsmidler (KN-kode 1510), jf. punkt I og II nedenfor.

II. Som »bomolie« (KN-kode 1509 10 10), uanset surhedsgrad, betragtes olivenolie med

a) et indhold af alifatiske alkoholer paa ikke over 400 mg/kg

et erytrodiol- og uvaolindhold paa ikke over 4,5 %

et indhold af maettede fedtsyrer i 2-stillingen i triglyceriderne paa ikke over 1,3 %

og/eller et af foelgende karakteristika:

- 1) et peroxidtal paa over 20 meq O2/kg

- 2) et indhold af flygtige halogenerede oploesningsmidler paa over 0,2 mg/kg i alt og paa over 0,1 mg/kg for hvert enkelt oploesningsmiddel

- 3)

en ekstinktionskoefficient K270, der er over 0,25, og som efter behandling med aktiveret aluminiumoxid ikke er over 0,11. I saa fald skal de efter neutralisation og blegning i laboratoriet have foelgende karakteristika:

. Bestemmelse 2.A:

- en ekstinktionskoefficient K270 paa ikke over 1,20

- en variation (DK) i ekstinktionskoefficienten i boelgelaengdeomraadet omkring 270 nm paa over 0,01, men ikke 0,16

AEK = Km-0,5 (Km-4 + Km + 4)

hvor

Km = ekstinktionskoefficenten ved boelgelaengden for absorptionskurvens maksimum omkring 270 nm

Km-4 og Km + 4 = ekstinktionskoefficienterne ved boelgelaengder, der er henholdsvis 4 nm mindre og stoerre end boelgelaengden for Km.

- 4)

organoleptiske egenskaber, der indbefatter paaviselige mangler, som overstiger graenserne for det acceptable, og en panelbedoemmelse, som giver under 3,5 points.

II.

Som »jomfruolie« (KN-kode 1509 10 90) betragtes olivenolie med foelgende karakteristika:

et indhold af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre, paa ikke over 3,3 g pr. 100 g

et peroxidtal paa ikke over 20 meq O2/kg

et indhold af alifatiske alkoholer paa ikke 300 mg/kg

et indhold af flygtige halogenerede oploesningsmidler paa ikke over 0,2 mg/kg i alt og paa ikke over 0,1 mg/kg for hvert enkelt oploesningsmiddel

ekstinktionskoefficient (DK) K270, der ikke er over 0,25 og som efter behandling af olieproeven med aktiveret aluminiumoxid ikke er over 0,10 (1)

variation i ekstinktionskoefficienten (DK) i boelgelaengdeomraadet omkring 270 nm paa ikke over 0,01

organoleptiske egenskaber, som kan indbefatte paaviselige mangler inden for graenserne af det acceptable, og en panelbedoemmelse, der giver over 3,5 points

et erytrodiol- og uvaolindhold paa ikke over 4,5 %

et indhold af maettede fedtsyrer i 2-stillingen i triglyceriderne paa ikke over 1,3 %.

Bestemmelse 2.C:

Til KN-kode 1509 90 00 henfoeres olivenolie, der er fremkommet ved behandling af olivenolier henhoerende under KN-kode 1509 10 10 eller 1509 10 90, ogsaa blandet med jomfruolie, og som har foelgende karakteristika:

a) et syreindhold, beregnet som oliesyre, paa ikke over 3,3 g pr. 100 g

et indhold af alifatiske alkoholer paa ikke over 350 mg/kg

en ekstinktionskoefficient K270 paa over 0,25, men ikke over 1,2, og som efter behandling af olieproeven med aktiveret alumuniumoxid er over 0,10

variation i ekstinktionskoefficienten (DK) i boelgelaengdeomraadet omkring 270 nm paa over 0,01, men ikke over 0,16

et erytrodiol- og uvaolindhold paa ikke over 4,5 %

et indhold af maettede fedtsyrer i 2-stillingen paa ikke over 1,5 %.

Bestemmelse 2.D:

Til KN-kode 1510 00 10 henfoeres »raa olie«, bl.a. olie af presserester, der har foelgende karakteristika:

et syreindhold, udtrykt som oliesyre, paa over 2 g pr. 100 g

et erytrodiol- og uvaolindhold paa over 12 %

et indhold af maettede fedtsyrer i 2-stillingen i triglyceriderne paa ikke over 1,8 %.

»Bestemmelse 2.E:

Til KN-kode 1510 00 90 henfoeres olier, der er fremkommet ved behandling af olier henhoerende under pos. 1510 00 10, ogsaa blandet med jomfruolie, og som ikke har de i punkt I og II omhandlede oliers karakteristika, hvis de har et indhold af maettede fedtsyrer i 2-stillingen i triglyceriderne paa ikke over 2 %.«

2. »Bestemmelse 3: KN-kode 1522 00 31 og 1522 00 39 omfatter ikke:

a) restprodukter fra behandlingen af fedtstoffer og fede olier, som indeholder olie, hvis iodtal bestemt efter metoden i bilag XVI er under 70 eller over 100

restprodukter fra behandlingen af fedtstoffer og fede olier, som indeholder olie, hvis iodtal er mellem 70 og 100, men hvor arealet af den top, der svarer til retentionsvolumenet (retentionstiden) for b-sitosterol, og som er bestemt efter bilag V til den nedenfor naevnte forordning, udgoer mindre end 93 % af summen af steroltoppenes arealer.«

»Bestemmelse 4:

Til bestemmelse af ovennaevnte karakteristika anvendes de i bilagene til forordning (EOEF) nr. 2568/91 beskrevne analysemetoder.«

(1) Naar K270 er over 0,25, foretages en ny bestemmelse efter behandling med aluminiumoxid; K270 maa ikke overstige 0,10.

BILAG XV

OLIEINDHOLD I PRESSERESTER AF OLIVEN

1.1.

Apparatur

- Egnet ekstraktionsapparat, forsynet med en 200-250 ml kolbe.

- Elektrisk opvarmet bad (sandbad, vandbad, osv.) eller varmeplade.

- Analysevaegt.

- Ovn, der er indstillet til hoejst 80o C.

- Elektrisk ovn med temperaturregulering, der kan indstilles til 103o C p2o C, og som muliggoer luftindblaesning eller vakuum.

- Mekanisk moelle, der er let at rengoere, egnet til olivenoliekager, og som er i stand til at male uden opvarmning eller maerkbar reduktion af indholdet af vand, af flygtige stoffer og af stoffer, der kan uddrages ved hjaelp af hexan.

- Ekstraktionshylster og vat eller filterpapir, fri for substanser, der kan uddrages ved hjaelp af hexan.

- Ekssikkator.

- Sigte med huller paa 1 mm i diameter.

- Pimpsten i smaa korn, toerret.

1.2.

Reagens

Teknisk n-hexan, hvis fordampningsrest ved fuldstaendig fordampning er mindre end 0,002 g/100 ml.

FREMGANGSMAADE

2.1.

Tilberedning af proeven

Om noedvendigt males analyseproeven i den mekaniske moelle, der skal vaere omhyggeligt rengjort paa forhaand, saaledes at proeven kan reduceres til smaa partikler, der kan passere sien fuldstaendigt.

Ca. en tyvendedel af proeven anvendes til en fuldstaendig rengoering af moellen; denne formalede del bortkastes, og resten males, opsamles og blandes med omhu, hvorefter analysen straks foretages.

2.2.

Proevemaengde

Der afvejes med 0,01 g noejagtighed ca. 10 g af analyseproeven til proevemaengde, naar formalingen er afsluttet.

2.3.

Tilberedning af ekstraktionshylstret

Proevemaengden anbringes i hylstret, og dette lukkes med vandsugende vat. Saafremt der anvendes filterpapir, indpakkes proeven i dette papir.

2.4.

Fortoerring

Hvis presseresterne er meget fugtige (indhold af vand og flygtige stoffer paa over 10 %), foretages der en fortoerring, idet det fyldte hylster (eller filterpapir) anbringes en passende tid i ovnen, der hoejst kan opvarmes til 80o C, saaledes at indholdet af vand og flygtige stoffer bringes ned under 10 %.

2.5.

Tilberedning af kolben

Kolben, der indeholder 1 à 2 pimpstenskorn, og som paa forhaand er toerret i ovnen ved en temperatur paa 103o C p2o C og derefter afkoelet mindst 1 time i ekssikkatoren, vejes med 1 mg noejagtighed.

2.6.

Foerste ekstraktion

Hylstret (eller filterpapiret), der indeholder proevemaengden, anbringes i ekstraktionsapparatet. Den noedvendige maengde hexan haeldes i kolben. Kolben tilsluttes ekstraktionsapparatet, og det hele anbringes i det elektrisk opvarmede bad. Opvarmningen reguleres saaledes, at tilbageloebsmaengden udgoer mindst tre draaber i sekundet (moderat, ikke staerk kogning).

Efter fire timers ekstraktion foretages afkoeling. Hylstret udtages af ekstraktionsapparatet og anbringes i en luftstroem for at fjerne stoerstedelen af det indeholdte oploesningsmiddel.

2.7.

Anden ekstraktion

Hylstret toemmes i mikromoellen, og der males saa fint som muligt.

Anbring maengdemaessigt blandingen paany i hylstret og dette i ekstraktionsapparatet.

Ekstraktionen begyndes paany, og den fortsaettes endnu to timer, idet kolben med forrige ekstraktion anvendes.

Den oploesning, der opnaas i ekstraktionskolben, skal vaere gennemsigtig. Saafremt dette ikke er tilfaeldet, filtreres der paa et stykke filterpapir, idet den foerste kolbe og filterpapiret gentagne gange vaskes med hexan. Filtratet og afvaskningsoploesningen opsamles i en saerskilt kolbe, der paa forhaand er toerret og vejet med 1 mg noejagtighed.

2.8.

Eliminering af oploesning og vejning af ekstraktet

Stoerstedelen af oploesningsmidlet fjernes ved destillation i elektrisk opvarmet vandbad. De sidste rester af oploesningsmidlet fjernes ved at opvarme kolben i ovnen ved 103o C p2o C i 20 minutter. Fordampningen fremskyndes enten ved indblaesning af luft eller, bedre, inaktiv gas fra tid til anden eller ved anvendelse af vakuum.

Kolben afkoeles i ekssikkatoren i mindst 1 time, og den vejes med 1 mg noejagtighed.

Der opvarmes paa ny i 10 min. under samme forhold, hvorefter kolben afkoeles i ekssikkator og vejes.

Forskellen mellem to vejninger maa ikke overstige 10 mg. I modsat fald opvarmes der paa ny i perioder paa ti minutter med efterfoelgende afkoeling og vejning, indtil forskellen i masse er hoejst 10 mg. Den sidste vejning af kolben noteres.

Der foretages to bestemmelser.

UDFORMNING AF RESULTATER

3.1.

Beregning og formler

a) Ekstraktet udtrykt i masseprocent af produktet som leveret er lig med:

a) S = m1 × 100

S = m1 ×

100

hvor:

S = masseprocent af produktet som leveret

= massen i gram af den udtagne proevemaengde

= massen i gram af ekstraktet efter toerring

Som resultat tages det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser, saafremt ingen gentagelse af bestemmelsen er noedvendig.

Resultatet udtrykkes med en decimal

Ekstraktet kan udtrykkes i relation til toerstoffet ved anvendelse af foelgende formel:

a) S = 100 - U = ekstrakt i % fedtstof/toerstof

S ×

100

100 - U

= ekstrakt i % fedtstof/toerstof

hvor:

S = masseprocent for ekstraktet af produktet som leveret (jf. a))

= indhold af vand og flygtige stoffer.

3.2.

Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af de to samtidigt eller umiddelbart efter hinanden af samme analytiker foretagne bestemmelser, maa ikke overstige 0,2 g ekstrakt ved hexan for 100 g proeve.

I modsat fald gentages analysen paa to andre proevemaengder. Hvis forskellen ogsaa denne gang overstiger 0,2 g, tages som resultat det aritmetiske gennemsnit af de fire bestemmelser.

BILAG XVI

BESTEMMELSE AF IODTAL 1.

ANVENDELSESOMRAADE

Denne internationale standard specificerer en metode til bestemmelse af iodtallet i animalske og vegetabilske fedtstoffer og olier, i det foelgende benaevnt fedtstoffer.

DEFINITION

Ved anvendelsen af denne internationale standard gaelder foelgende definition.

2.1.

Iodtal: den maengde iod, der absorberes af proeven under de arbejdsbetingelser, der er specificeret i denne internationale standard.

Iodtallet udtrykkes som g iod pr. 100 g proeve.

PRINCIP

En proeve oploeses i oploesningsmiddel, og der tilsaettes Wijs reagens. Efter en naermere fastsat tid tilsaettes kaliumiodidoploesning og vand, og det frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatoploesning.

REAGENSER

Alle reagenser skal vaere anerkendt analysekvalitet.

4.1.

Vand, skal opfylde kravene i ISO 3696, grad 3.

4.2.

Kaliumiodid - 100 g/l oploesning, der ikke indeholder iodat eller frit iod.

4.3.

Stivelseoploesning.

5 g oploeselig stivelse blandes i 30 ml vand, denne blanding tilsaettes 1 000 ml kogende vand efterfulgt af kogning i 3 min. og afkoeling.

4.4.

Natriumthiosulfat - standardoploesning.

c(Na2S2O3×5H2O) = 0,1 mol/l, som er standardiseret hoejst syv dage inden brug.

4.5.

Oploesningsmiddel - tilberedes ved blanding af lige dele cyclohexan og eddikesyre.

4.6.

Wijs reagens - indeholder iodmonochlorid i eddikesyre. Der benyttes kommercielt Wijs reagens.

APPARATUR

Normalt laboratorieudstyr og navnlig foelgende:

5.1.

Vejeskeer af glas, der passer til proeven og kan anbringes i kolberne (5.2).

5.2.

Erlenmeyer-kolber, 500 ml, der er forsynet med slebne glaspropper og er helt toerre.

FORBEREDELSE AF ANALYSEPROEVEN

Den homogeniserede proeve toerres paa natriumsulfat og filtreres.

FREMGANGSMAADE

7.1.

Proeven

Proevens stoerrelse varierer alt efter dens forventede iodtal, jf. tabel 1.

Tabel 1

Forventet iodtal

Proevens stoerrelse

under 5

5- 20

21- 50

51-100

101-150

151-200

3,00 g

1,00 g

0,40 g

0,20 g

0,13 g

0,10 g

Proeven afvejes til naermeste 0,1 mg i en glasske (5.1).

7.2.

Bestemmelse

Proeven kommes i en 500 ml kolbe (5.2). Der tilsaettes 20 ml oploesningsmiddel (4.5) for at oploese fedtstoffet. Der tilsaettes noejagtig 25 ml Wijs reagens (4.6), proppen saettes i, indholdet omrystes med en roterende bevaegelse, og kolben anbringes i moerke. Der maa ikke benyttes mundpipette til Wijs reagenset.

Paa tilsvarende maade forberedes der en blindproeve med oploesningsmidlet og reagenset, men proeven udelades.

Naar det gaelder proever med et iodtal paa under 150, skal kolberne henstaa i moerke i 1 time. Naar det gaelder proever med et iodtal paa over 150, polymeriserede produkter eller kraftigt iltede produkter, skal kolberne henstaa i 2 timer.

Derefter tilsaettes hver af kolberne 20 ml kaliumiodidoploesning (4.2) og 150 ml vand (4.1).

Der titreres med natriumthiosulfat i standardoploesning (4.4), indtil den gule farve, der skyldes iodet, naesten er forsvundet. Der tilsaettes nogle faa draaber stivelsesoploesning (4.3), og titreringen fortsaetter, indtil den blaa farve lige akkurat forsvinder efter meget kraftig omrystning.

Note: Potentiometrisk bestemmelse af slutpunktet kan tillades.

7.3.

Antal bestemmelser

Der foretages to bestemmelser af samme proeve.

ANGIVELSE AF RESULTATER

Iodtallet angives som 12,96 × c × (V1-V2)

Iodtallet angives som

12,69 × c × (V1-V2)

hvor

c1 = den numeriske vaerdi af den eksakte koncentration (mol/l) af den benyttede natriumthiosulfat-standardoploesning (4.4)

den numeriske vaerdi af den til blindproeven benyttede maengde (ml) natriumthiosulfat-standardoploesning (4.4)

den numeriske vaerdi af den til bestemmelsen benyttede maemgde (ml) natriumthiosulfat-standardoploesning (4.4)

den numeriske vaerdi af proevens stoerrelse (g) (7.1).

Resultatet betragtes som det artimetiske gennemsnit af de to bestemmelser under forudsaetning af, at repeterbarhedskravet er opfyldt.

31991R2568